UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
AVALIAÇÃO DE UM ENSAIO DE qPCR IN HOUSE NO DIAGNÓSTICO DE Chlamydia trachomatis COMPARADO A UM TESTE COMERCIAL
CAMILA GURGEL DOS SANTOS
MANAUS 2016
CAMILA GURGEL DOS SANTOS
AVALIAÇÃO DE UM ENSAIO DE qPCR IN HOUSE NO DIAGNÓSTICO DE Chlamydia trachomatis COMPARADO A UM TESTE COMERCIAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientadora: Profa. Dra. Adele Schwartz Benzaken Co-orientadora: Profa. Dra. Meritxell Sabidó
MANAUS 2016
Ficha Catalográfica S237 Santos, Camila Gurgel dos.
Avaliação de um ensaio de qPCR in house no diagnóstico de Chlamydia trachomatis comparado a um teste comercial ./Camila Gurgel dos Santos. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2016.
xiii, 77f. : il.
Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2016.
Orientadora: Profa. Dra. Adele Schwartz Benzaken Co-orientadora: Profa. Dra. Meritxell Sabidó
1.Chlamydia trachomatis 2 Doenças sexualmente transmissível. 4. Amazonas Título.
CDU: 616.9(811.3)(043)
Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N Silva,lotada na Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA
FOLHA DE JULGAMENTO
AVALIAÇÃO DE UM ENSAIO DE qPCR IN HOUSE NO DIAGNÓSTICO DE Chlamydia trachomatis COMPARADO A UM TESTE COMERCIAL
CAMILA GURGEL DOS SANTOS
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
______________________________________ Dra. Adele Schwartz Benzaken
Presidente
______________________________________ Dr. João Vicente Braga de Souza
Membro
______________________________________ Dra. Maria Cristina Borborema dos Santos
AGRADECIMENTOS
A Deus, por mais uma vitória conquistada em minha vida.
A meus pais, Anne e Paulo, à minha irmã Thalita e à minha avó Maria, que são os principais incentivadores para todas as conquistas almejadas por mim, e que nos momentos difíceis sempre foram minha força e suporte.
À minha orientadora Dra. Adele Schwartz Benzaken, pela orientação, apoio, incentivo e por sua confiança no meu trabalho.
À minha co-orientadora Dra Meritxell Sabidó, pela orientação, atenção e grande apoio à conclusão desta pesquisa.
Ao Msc. André Leturiondo, da Fundação Alfredo da Matta, que acima de tudo confiou e acreditou em mim, sempre me apoiando ao longo de toda a pesquisa, e que sem sua ajuda eu não teria conseguido concluir tudo isso.
Aos colegas da Fundação Alfredo da Matta, Thielle, Thiago, Yuri, Ariani, Emily Monik, a Msc. Cynthia e a Dra. Fabíola, pelo apoio e porque de forma direta ou indireta ajudaram no meu crescimento pessoal e profissional.
Aos amigos do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, pelo apoio e amizade, sempre dispostos a ajudar.
Aos funcionários da secretaria do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, por sempre estarem disponíveis em nos ajudar.
À Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) e a Universidade do Estado do Amazonas (UEA), pela oportunidade e conhecimento adquirido.
RESUMO
O Sistema Único de Saúde oferece o teste de DNA Digene® Captura Híbrida II (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá) (CHII CT-ID), como o teste diagnóstico de Chlamydia trachomatis (C. trachomatis). No entanto, o rastreamento desta infecção não é realizado no Brasil. Além disso, o teste de CHII CT-ID possui baixo rendimento quando em comparado ao teste de reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (qPCR). Para se ter na rotina e possivelmente no rastreamento das infecções causadas por C. trachomatis, é necessário um método diagnóstico preciso, acessível e de baixo custo. O objetivo deste estudo é desenvolver e avaliar o desempenho e os custos de um novo ensaio de qPCR in house para o diagnóstico de infecção por C. trachomatis. As amostras utilizadas para avaliação do teste de qPCR eram de mulheres assintomáticas com idade entre 14-25 anos que foram atendidas no serviço primário de saúde em Manaus, selecionadas a partir do resultado obtido pelo teste de CHII CT-ID. Após o cálculo amostral, um subconjunto de amostras cervicais foi separado. Essas amostras tiveram seu DNA extraídos, sendo avaliadas pelo teste de qPCR in house e para o qPCR Artus Plus, o qual foi utilizado como teste de referência. Para desenvolvimento da qPCR in house, um par de iniciadores e uma sonda foram desenhados com base na sequência do plasmídio críptico (PC). Uma avaliação econômica foi conduzida a partir da perspectiva do provedor. Os iniciadores foram considerados específicos para a C. trachomatis, pois não apresentaram amplificações com outras infecções sexualmente transmissíveis ou DNA humano, para quais foram testadas. Em geral, 292 amostras foram testadas pelo kit comercial e pelo qPCR in house. Apenas uma amostra não apresentou amplificação e foi excluída da análise. A sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos do teste de qPCR in house foram de 99,5% (95% intervalo de confiança [CI]: 97,1-100), 95,1% (IC 95%: 89-98,4), 97,4% (95% IC: 94-99,1), e 99,0% (95% CI: 94,5-100), respectivamente. O custo por caso de C. trachomatis foi de US $ 0,55 para CHII CT-ID, $ 1,45 para qPCR Artus Plus e $ 1,33 qPCR in house. O novo ensaio de qPCR in house foi avaliado e padronizado em amostras cervicais, tendo como alvo Plasmídio Críptico, demonstrando excelente acurácia e menor custo quando comparado ao kit comercial. Pode ser utilizado na rotina do diagnóstico e ainda auxiliar na introdução de programas de rastreamento de infecção por C. trachomatis.
Palavras Chaves: Chlamydia trachomatis, reação em cadeia da polimerase em tempo real, estudos de validação, Amazonas.
ABSTRACT
Brazilian unified public health system currently offers the Digene® Hybrid Capture II DNA test (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada) (HCII CT-ID), as the sole molecular test for Chlamydia trachomatis screening test. However, routine screening is not currently performed. In addition, HCII CT-ID has low performance when compared to polymerase chain reaction (qPCR) assays. To improve screening of C. trachomatis in Brazil, an accurate and affordable method is needed. The objective of this study was to develop and assess the performance and costs of a new in-house real time polymerase chain reaction (qPCR) assay for the diagnosis of C. trachomatis infection. Asymptomatic women aged 14-25 years who attended primary health services in Manaus, Brazil, were screened for C. trachomatis using the HCII CT-ID. A subset of cervical specimens were tested using an in house qPCR and a commercial qPCR (qPCR Artus Plus), which was used as a reference test. A pair of primers and a probe based on the sequence of cryptic plasmid was designed. An economic evaluation was conducted from the provider’s perspective. The primers were considered specific for C. trachomatis because they did not amplify any product from non-sexually transmitted infections (STI) tested species. Overall, 292 specimens were tested by both the commercial kit and the in house qPCR. Of those, one resulted in no amplification and was excluded from the analysis. The sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of in the in house qPCR were 99.5% (95% confidence interval [CI]: 97.1-100), 95.1% (95% CI: 89-98.4), 97.4% (95% CI: 94-99.1), and 99.0% (95% CI: 94.5-100), respectively. The cost per case of C. trachomatis was $0.55 for HCII, $1.45 for qPCR and $1.33 for in house qPCR. We have standardized an in house qPCR to detect cervical C. trachomatis targeting cryptic plasmid primers. The in house qPCR had shown excellent accuracy and was more affordable than the qPCR commercial kit. This can help introducing C. trachomatis screening programs in Brazil and reduce the burden of the infection and its secondary transmission.
Keywords: Chlamydia trachomatis, real-time polymerase chain reaction, validation studies, Amazonas.
RESUMO LEIGO
O Sistema Único de Saúde oferece o teste chamado Captura Híbrida II para verificar a presença de uma bactéria chamada Chlamydia trachomatis (C. trachomatis). Essa bactéria pode ser transmitida pelo sexo sem camisinha e pode causar problemas de saúde. O teste oferecido pelo SUS somente é feito quando as pessoas procuram por atendimento em hospitais. Dessa forma as pessoas que não tem nenhuma queixa, continuam com a bactéria e podem transmitir para outras pessoas. Porém, esse teste realizado nos centros de saúde pode liberar resultados falsos. Já existem outros testes que são melhores e que apresentam menos resultados falsos, no entanto esses testes são mais caros, impedindo seu uso no dia a dia. Por essa razão o estudo procurou desenvolver e avaliar o desempenho e os custos de um novo teste para detectar a presença de Chlamydia trachomatis. As amostras utilizadas para avaliação do novo teste eram de mulheres sem sintomas com idade entre 14-25 anos que foram atendidas em UBSs de Manaus, selecionadas a partir do resultado do teste de Captura Híbrida. Para avaliar o novo teste, os resultados encontrados foram comparados com um teste de referência, que se chama qPCR Artus Plus, que tem uma ótima qualidade, com poucos resultados falsos, mas muito caro para ser utilizado no dia a dia. Em geral, o teste de referência e o novo teste desenvolvido foram realizados em 292 amostras. Não foi possível obter resultados apenas de uma amostra. A capacidade do novo teste de identificar amostras positivas para Chlamydia trachomatis foi tão boa quanto o teste de referência, porém o novo teste é mais barato que o teste de referência, dessa forma, o novo teste desenvolvido poderia ser aplicado no dia a dia, podendo substituir o teste de Captura Híbrida.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida de C. trachomatis...03 Figura 2. Estimativas de Incidência e Prevalência de C. trachomatis no mundo...07 Figura 3. Fluxo de seleção e avaliação das amostras...25
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Doenças e complicações por C. trachomatis...05 Tabela 2. Vantagens e desvantagens dos métodos de pesquisas de ácidos nucléicos e cultura...19 Tabela 3. Identificação das cepas e código GenBank utilizadas no desenho dos iniciadores e sonda do alvo Plasmídio críptico...27 Tabela 4. Oligonucleotideos iniciadores para o plasmídio críptico...28 Tabela 5. Acurácia dos resultados de Captura Híbrida versus qPCR Artus Plus...34
Tabela 6. Acurácia dos resultados de qPCR in house versus qPCR Artus Plus...35
Tabela 7. Avaliação econômica do rastreamento de C. trachomatis utilizando os testes CH II CT-ID (Digene), qPCR Artus Plus ou qPCR in house entre jovens mulheres assintomáticas (14-25 anos) em Manaus, Brasil ...36
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA $ - Dólar °C – graus Celsius µg - micrograma µL - microlitro µM - micromolar
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATP – Adenosina tri fosfato
BLAST – Basic Alignment Search Tool
CDC – Center for Diseases Control and Prevention CE – corpúsculo elementar
CEP – Comité de ética em pesquisa CH II CT-ID – Captura Híbrida CR – Corpúsculo reticular CT – Chlamydia trachomatis Ct - Cycle threshold
DAS – Amplificação por deslocamento de cadeia DFA – Imunoflorescência direta
DIP – Doença inflamatória pélvica DNA – Ácido desoxirribonucleico EIA - Enzimaimunoensaio
FDA – Food and Drug Administration FUAM – Fundação Alfredo da Matta HIV – Vírus da imunodeficiência humano HPV – Papiloma vírus humano
IC – Intervalo de confiança ID - Identificação
IDT – Integrated DNA Technologies IFI – Imunofluorescencia indireta IgA – Imunoglobulina A
IgG – Imunoglobulina G IgM– Imunoglobulina M
IST – Infecções sexualmente transmissíveis LCR – Reação em Cadeia da Ligase
LGV – Linfogranuloma venéreo M - Molar
mL - mililitro
MMWR – Morbidity and Mortality Weekly Report MOMP – Major outer membrane protein
NAAT – Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos NCBI – National Center for Biotechnology Information NG – Neisseria gonorrheae
OMS – Organização Mundial da Saúde pb – pares de bases
PC – plasmídio críptico
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase pH – Potencial de Hidrogênio
QCMD – Quality Control for Molecular Diagnostic
qPCR – Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real RG- Rotor Gene
RLU – Relative Light Unit RNA – Ácido ribonucleico RPM – Rotações por minuto SUS – Sistema Único De Saúde
TCLE – Termo De Consentimento Livre E Esclarecido Tm – Temperatura De Melting
TMA – Amplificação Mediada Por Transcrição UBS – Unidade Básica De Saúde
UKNeqas – United Kingdom National External Qualy Assessment VPN – Valor Preditivo Negativo
VPP – Valor Preditivo Positivo ΔG – Energia Livre De Gibbs
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO _______________________________________________ 1 1.1. Chlamydia trachomatis ____________________________________ 2 1.2. Epidemiologia __________________________________________ 5 1.3. Manifestações Clínicas ___________________________________ 8 1.4. Diagnóstico ____________________________________________ 9 1.4.1. Cultura ______________________________________________ 9 1.4.2. Pesquisa de antígenos _________________________________ 10 1.4.3. Pesquisa de Anticorpos ________________________________ 11 1.4.4. Testes Moleculares ___________________________________ 12 2. OBJETIVOS ______________________________________________ 21 2.1. Objetivo Geral _________________________________________ 21 2.2. Objetivos Específicos ____________________________________ 21 3. MATERIAL E MÉTODOS ____________________________________ 22 3.1. Tipo de Estudo _________________________________________ 22 3.2 Local de Estudo ________________________________________ 22 3.3 População de Estudo ____________________________________ 22 3.4 Amostras do estudo _____________________________________ 23 3.5 Seleção das amostras ___________________________________ 23 3.6 Extração de DNA para qPCR in house e comercial _____________ 26 3.7 Amplificação de DNA por qPCR ___________________________ 26 3.7.1 Detecção de C. trachomatis por qPCR Artus Plus ____________ 26 3.7.2 Desenvolvimento e padronização da qPCR In house _________ 26 3.7.3 Desenho dos iniciadores e sondas. _______________________ 26 3.7.4 Características e interpretação dos resultados do teste de qPCR in house
28 3.8 Análise Estatística ______________________________________ 29 3.9 Cálculo Amostral _______________________________________ 29 3.10 Aspectos Éticos ________________________________________ 31 3.11 Análise econômica ______________________________________ 31 3.12 Metodologia adicional ___________________________________ 32
3.12.1 Metodologia realizada para as amostras remanescente do teste de CHII CT-ID 32
4. RESULTADOS ____________________________________________ 33 4.1 Padronização da reação de PCR em Tempo Real In house (qPCR) 33 4.2 Resultados da qPCR Artus Plus ___________________________ 33 4.2.1 Comparação de qPCR Artus Plus versus CHII CT-ID ___________ 34 4.3 Resultado qPCR in house ________________________________ 34 4.3.1 Comparação de qPCR Artus Plus versus qPCR in house _______ 35 4.4 Análise de Custos ______________________________________ 35 4.5 Resultados da metodologia adicional________________________ 36 5. DISCUSSÃO ______________________________________________ 37 5.1 Análise de custos _______________________________________ 39 5.2 Análise da metodologia adicional ___________________________ 40 5.3 Limitações ____________________________________________ 40 6. CONCLUSÃO _____________________________________________ 41 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ____________________________ 43 ANEXOS ____________________________________________________ 50 Anexo I ____________________________________________________ 50 Anexo II____________________________________________________ 52 Anexo III ___________________________________________________ 53 Anexo IV ___________________________________________________ 54 Anexo V ___________________________________________________ 55 Anexo VI ___________________________________________________ 56 Anexo VII __________________________________________________ 57 Anexo VIII __________________________________________________ 58 Anexo IX ___________________________________________________ 59 Anexo X ___________________________________________________ 60
1. INTRODUÇÃO
As infecções sexualmente transmissíveis (IST) são muito frequentes em todo o mundo, tornando-se um grande problema de saúde pública. Dentre quatro IST curáveis, Chlamydia trachomatis (Clamídia), Neisseria gonorrhoeae (gonorreia), Trichomonas vaginalis (tricomoníase) e Treponema pallidum (sífilis), a IST que ocupa a segunda posição em estimativas de casos é a infecção causada por C. trachomatis, com 131 milhões de novos casos em 2015 (1).
A C. trachomatis apresenta tropismo por células epiteliais presentes na superfície dos tecidos da cérvix, uretra, reto, nasofaringe e conjuntiva, sendo o agente patogênico causador de tracoma, infecções urogenitais, retais e ainda infecções nos linfonodos inguinais, conhecidas como Linfogranuloma Venéreo (LGV) (2).
A infecção por C. trachomatis pode causar diversos danos e lesões tubárias severas ao sistema reprodutor feminino. Também pode afetar homens e crianças. A infecção por C. trachomatis é caracterizada por ser assintomáticas em até 70% dos casos, dificultando sua detecção, seu diagnóstico e controle (3,4).
Considerando os diversos danos e possíveis sequelas resultantes da infecção por C. trachomatis, é muito importante destacar os custos relacionados ao tratamento da infecção e sequelas. De acordo com um trabalho realizado nos Estados Unidos em 2008, a estimativa de gastos com o tratamento de C. trachomatis foram de $ 516,7 milhões [$258.3-$775.0], sendo que entre as IST curáveis, esta foi a que apresentou maior custo (5).
Dadas as características da infecção ocasionada por C. trachomatis, é recomendado o rastreamento dessa bactéria em países desenvolvidos, como os Estados Unidos da América (EUA), onde mulheres de até 25 anos de idade devem realizar o teste anualmente. Além disso, existem nesse país, programas
de prevenção que visam à diminuição das possíveis sequelas decorrentes dessa patologia (6).
Encontram-se disponíveis diversos métodos para detecção de C. trachomatis. Além da cultura que era considerada “padrão ouro”, também são utilizadas técnicas imunológicas e métodos de diagnóstico molecular, destacando-se entre os testes moleculares, a amplificação de ácidos nucléicos, como Reação da Cadeia de Polimerase (PCR) e a Reação da Cadeia da polimerase em Tempo Real (qPCR) por apresentarem maior sensibilidade e especificidade quando comparadas aos métodos de cultura e imunológicos (2,7,8).
No Brasil não é realizado o rastreamento de C. trachomatis como rotina. No entanto, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) aprovou um teste molecular para o diagnóstico deste agente e incluiu o teste na tabela de procedimentos do Sistema Único de Saúde (SUS) (Captura Híbrida (CHII CT-ID DNA Test Version 2.0 - QIAGEN Mississauga, Ontário, Canadá). Porém, considerando que a maioria dos infectados são assintomáticos, este teste apresenta uma sensibilidade moderada (em torno de 75%) e que por ser um kit comercial, possui alto custo e por essa razão faz-se necessário otimizar novos protocolos moleculares, com melhor custo-benefício e que possibilite prevenir os agravos resultantes desta infecção (7,9,10).
1.1. Chlamydia trachomatis
A espécie Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) pertence ao grupo de bactérias Gram – negativas, parasitas intracelulares obrigatórios, por ser incapaz de sintetizar nutrientes essenciais para multiplicar-se. Tem um ciclo de vida único, e duas formas distintas, o Corpúsculo Elementar (CE) infectante, metabolicamente inativa, extracelular e a os Corpúsculos Reticulares (CR) não infectantes, capazes de multiplicação, por ser a forma intracelular da bactéria (Figura 1) (11–13).
A infecção inicia-se pelo contato dos CE com o epitélio e, ao penetrar na célula, permanece em vesículas endocíticas que são modificadas pela presença dos CE, onde irá ocorrer todo o desenvolvimento da bactéria, diferenciando-se em CR e tornando-se metabolicamente ativa. Algumas horas depois, dada a multiplicação exponencial da CR, são utilizados os nutrientes e adenosina tri - fosfato (ATP) da célula infectada para que os CR voltem a forma de CE, ocorrendo a liberação da forma infectante com a ruptura da célula para que ocorra a infecção das células próximas (2,11).
Figura 1. Ciclo de Vida da C. trachomatis Fonte: Redgrove e Mclaughlin (11)
O genoma da C. trachomatis consiste em um cromossomo circular de 1.042.519 pb e também possui plasmídio críptico, no qual pode estar presente até dez copias desse plasmídio, uma pequena partícula de ácido desoxirribonucleico (DNA) circular de 7.493 pb, com similaridade genética de 99% entre os vários genótipos (14). No entanto, sabe-se da existência de cepas selvagens ou clínicas que não possuem tal plasmídio, tornando a bactéria menos patogênica. Também já foi descrito, na Suécia, uma nova variante, que apresenta deleção de 377 pb no plasmídio críptico (15,16).
A C. trachomatis possui a proteína externa de membrana majoritária (MOMP - major outer membrane protein (Principal proteína de membrana externa)) em sua superfície, que apresenta variabilidade antigênica possibilitando diferenciá-la em diferentes genótipos (2). A MOMP é codificada pelo gene ompA (omp1) e a partir das sequências variantes presentes neste gene, a C. trachomatis está dividida nos seguintes genótipos: A, B, Ba, C, D, Da, E, F, G, H, I, Ia, J, Ja, K, L1, L2, L2a e L3 (17,18).
Cada um desses genótipos está relacionado com um sítio de infecção e/ou sinais da doença. Os genótipos de A – C são os mais associados ao tracoma; de D – K encontram-se nas infecções urogenitais; e, por fim, os L1 – L3 estão relacionados ao Linfogranuloma Venéreo (LGV) (2). Contudo, sabe-se que as infecções por C. trachomatis são, na maioria dos casos, assintomáticas, em cerca de 70% dos infectados, o que dificulta seu diagnóstico, rastreamento e controle. Essa situação se faz preocupante, uma vez que a C. trachomatis pode causar severos danos ao sistema reprodutor feminino e masculino, além da possibilidade de transmissão vertical durante o parto, causando conjuntivite e pneumonia neonatal (Tabela 1) (19,20).
TABELA 1. Doenças e complicações causadas por C trachomatis.
Genótipo Sexo Doenças Complicações
A, B, Ba, C Ambos Tracoma, conjuntivite. Cegueira
D, Da, E, F, G, Ga, H, I, Ia, J, Ja, K Feminino Cervicite, Endometrite, salpingite, Doença inflamatória pélvica.
Gravidez ectópica,
infertilidade, dor pélvica crônica.
Masculino Uretrite não gonocócica
Epididimite, prostatite, infertilidade.
Ambos Conjuntivite, síndrome de Reiter
L1, L2, L2a, L3 Ambos Linfogranuloma Venéreo (LGV)
Fonte: Adaptado de Bébéar e Barbeyrac (2).
No Brasil, em alguns trabalhos realizados entre mulheres e homens, verificou-se que o genótipo mais frequente nessas populações é o F, seguido dos genótipos J, E, I e D. Entre os menos frequentes estão o K, H e B, que também podem ser identificados nas populações descritas anteriormente (21– 23).
1.2. Epidemiologia
A infecção causada por C. trachomatis é uma das IST curáveis mais prevalentes no mundo. Os pacientes assintomáticos são potenciais reservatórios e podem propagar a infecção. Esses conjuntos de fatores tornam a infecção por C. trachomatis um grande problema de saúde pública, agravada pelas possíveis sequelas que podem acometer o sistema reprodutor em ambos os sexos (24,25).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima uma ocorrência de 105,7 milhões de novos casos ao ano, afetando principalmente indivíduos que estão
na faixa etária de 15 a 45 anos (Figura 2) (24,26). Em 2012, um estudo estimou a ocorrência de 131 milhões de casos novos de infecção por C. trachomatis por ano. A diferença, entre os dados da OMS e desse estudo, ocorre provavelmente pela falta de representatividade, quantidade e qualidade dos dados, além de possíveis vieses nas informações relacionados à infecção por C. trachomatis, uma vez que esta não é notificada em todo o mundo, indicando que essas estimativas podem estar sendo subestimadas (1).
Nos EUA, C. trachomatis é notificada desde os anos 90 e reportada pelo Centers for Deseases Control and Prevention (CDC), recomendando que todas as mulheres sexualmente ativas, com idade inferior a 25 anos, dentro de grupo de risco devem realizar o teste pelo menos uma vez ao ano. Foram notificados, só no ano de 2013, 1.401.906 casos de C. trachomatis entre jovens adultos, principalmente nas idades entre 19 - 25 anos. Entre esses casos, 993.348 são mulheres, representando uma taxa de 623,1 / 100.000 mulheres e 262,6 / 100.000 em homens (6,27). O rastreamento de C. trachomatis na Europa, também no ano de 2010, foi de 344.491 casos da infecção, 140.563 (145/ 100.000 homens) e 203 / 100.000 eram mulheres (28).
Mesmo com os dados obtidos pelo rastreamento da infecção nos EUA e Europa, essas taxas ainda podem ser maiores devido ao número de infecções assintomáticas e também pelo fato de que muitos homens não realizam o teste diagnóstico e não têm sua infecção notificada (6,29).
No Brasil, não há cálculos oficiais de incidência ou prevalência de C. trachomatis pois não é realizado o rastreamento da infecção. Dados relacionados à C. trachomatis são escassos no país. Contudo, podem ser destacados estudos isolados que buscam estimar a prevalência da infecção entre populações específicas.
Figura 2. Estimativas de Incidência e Prevalência de C. trachomatis no mundo, 2008.
Fonte: Adaptado da Organização Mundial da Saúde (24)
Em um estudo realizado pelo Ministério da Saúde envolvendo seis cidades brasileiras (Manaus, Fortaleza, Goiânia, Rio de Janeiro, Porto Alegre e São Paulo), no período de 2002 a 2005, foi avaliada a prevalência da infecção por C. trachomatis entre grupos específicos. Foram incluídos ao estudo: 3303 gestantes, 2329 homens trabalhadores de indústrias e um grupo de 2801 homens e mulheres que buscavam atendimento em clínicas de IST e observou-se a prevalência de 9,4%, 3,4% e 9%, respectivamente. A faixa etária que apresentou maior frequência entre os três grupos avaliados foi de 15 - 20 anos, o que corrobora com as características encontradas nos países desenvolvidos onde é feito o rastreamento da infecção (30).
No Amazonas, de acordo com um estudo realizado entre 1169 mulheres assintomáticas, testada por CH II CT-ID, 13,1% (153/1169) foram diagnosticadas com C. trachomatis (10). Outros dados sobre a frequência dessa infecção foram obtidos no boletim epidemiológico da Fundação Alfredo da Matta – FUAM, no ano de 2014 em que foram diagnosticados com C. trachomatis 6,42% (214 / 3330) dos casos atendidos na clínica de IST. A FUAM é um centro de referência em IST e possui estrutura laboratorial para diagnóstico dessas infecções. Dessa maneira, esses dados são referentes aos
I: Incidência P: Prevalência
indivíduos que buscam atendimento por apresentarem sinais e/ou sintoma de quaisquer IST (31).
Em outros estudos realizados em diferentes cidades do Brasil, por Borborema-Alfaia et al. (2013), Jalkh et al. (2014) e Lima et al. (2014), com o objetivo de estimar a prevalência de C. trachomatis em mulheres gestantes, homens HIV positivo e mulheres sexualmente ativas, respectivamente, utilizando métodos de amplificação de ácidos nucleicos (Reação em Cadeia da Polimerase - PCR), observaram uma variação na prevalência de 9,5% - 12%, muito semelhante aos resultados do estudo realizado pelo Ministério da Saúde em 2005 (32–34).
Os principais fatores de risco que podem ser observados para esta infecção são: o início precoce da atividade sexual, idade inferior a 25 anos, múltiplos parceiros, sem uso de preservativos, uso de contraceptivo oral e ter tido contato prévio com C. trachomatis ou outra IST. Esses fatores são similares aos obtidos em diferentes países, tanto na América Latina quanto em países desenvolvidos (35,36).
1.3. Manifestações Clínicas
A infecção por C. trachomatis é em 70% dos casos assintomática, aproximadamente 75% das mulheres e 50% dos homens infectados, dificultando o diagnóstico precoce e o tratamento adequado, podendo resultar em severas sequelas e lesões no trato urogenital masculino e feminino (Tabela 1) (2,20,37).
Quando há sinais ou sintomas da infecção, nas mulheres, as manifestações clínicas incluem presença de corrimento vaginal e síndrome uretral aguda, uretrite, bartolinite, cervicite, dor pélvica e infecção no trato genital alto (endrometites e salpingite) (11). As complicações mais comuns, causadas por C. trachomatis não tratada, são relacionadas à reprodução,
devido Doença Inflamatória Pélvica (DIP), que pode resultar em sequelas como infertilidade, gravidez ectópica e dor pélvica crônica (37,38).
A infecção por C. trachomatis também pode causar sérios transtornos durante a gravidez, como abortamento espontâneo, trabalho de parto prematuro, baixo peso do neonato e também óbito fetal e neonatal. Se o parto for natural e a mãe estiver com a infecção em atividade, estima-se que há chance de 50 – 75% de o neonato adquirir a infecção e cerca de 30 – 50 % dos recém-nascidos adquirir conjuntivite clamidial, infecção nasofarígea, sendo muito comum tal infecção evoluir para pneumonia clamidial (2,20,37).
Entre os homens, a infecção por C. trachomatis também pode ser assintomática. Contudo, a uretrite é uma das manifestações clínicas mais comuns, podendo ocorrer disúria e corrimento uretral, além de epididimite testicular e problemas na próstata e na vesícula seminal. Essas manifestações podem resultar na infertilidade, por afetar diretamente os espermatozóides, alterando sua densidade, morfologia, mobilidade e viabilidade (12,37,39,40).
Devido a algumas práticas sexuais extras urogenitais, é possível haver contaminação orofaríngea e anorretal, especialmente entre homens que fazem sexo com homens. Os sintomas são corrimento retal, dor, vermelhidão, sensação de queimação ou coceira e a prostatite. No entanto, a assintomatologia também é característica comum nesse sitio de infecção (41).
1.4. Diagnóstico
1.4.1. Cultura
O primeiro método diagnóstico para a detecção de C. trachomatis e considerado “padrão ouro” foi a cultura de células. Esta técnica consiste na inoculação da amostra em monocamadas de células McCoy ou células Vero com 2 µg/ml de ciclohexamida, meios escolhidos por suportarem o crescimento
de C. trachomatis (42). As monocamadas são adicionadas às amostras de células de anticorpos monoclonas conjugados à fluorescência, espécie-específico (preferencialmente direcionada à MOMP). Após 24 – 72 horas de incubação, as células infectadas são visualizadas por microscopia de fluorescência, devido à presença dos CR e CE da bactéria (Tabela 2) (2,43).
A cultura de C. trachomatis era a técnica de maior especificidade, chegando a 100%. No entanto, não é recomendada para rotina, devido a sua baixa sensibilidade, sua complexidade técnica, longo período de realização e cuidados necessários desde a coleta, armazenamento até o transporte das amostras. De acordo com o Recommendations for the Laboratory – Based Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae, Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR), do CDC é recomendado a realização da cultura de C. trachomatis em casos de suspeita de abuso sexual e infecção extragenital (19–22).
1.4.2. Pesquisa de antígenos
Existem testes que consistem na detecção de antígenos, que no caso da C. trachomatis, tem como principal alvo a MOMP específica da espécie e presente em grande quantidade na superfície da bactéria, diminuindo as chances de resultados falsos negativos. Dentre eles, podem-se citar:
a. Imunofluorescência direta (DFA) – esta técnica utiliza um ou mais anticorpos monoclonais fluorescentes direcionados ao antígeno de superfície dos CE da C. trachomatis, possibilitando a identificação por microscopia de fluorescência.
b. Enzimaimunoensaio (EIA) – na presença do antígeno ocorre reação com anticorpos mono ou policlonais marcados com uma enzima fluorescente, direcionados especificamente à MOMP. Seu resultado é visualizado por espectrofotometria. Pode ser realizado em equipamentos automatizados e apresentar maior sensibilidade que o DFA (4, 25 – 27).
Entre essas técnicas é muito comum a reação cruzada com outros microrganismos que, além de ser um método que exige experiência ao microscópio, exige perícia na interpretação dos resultados. Outro limitante é não ser adequado no processamento de grandes números de amostras. Além disso, não possui alta sensibilidade e especificidade se comparada a testes moleculares (Tabela 2) (37,42).
1.4.3. Pesquisa de Anticorpos
As técnicas de pesquisa de anticorpos possibilitam a detecção de anticorpos do tipo IgG, IgA e IgM, que reagem ao antígeno de superfície de C. trachomatis, e são dosados separadamente (Tabela 2). Mas apesar de uma alta resposta imunológica à infecção, a sorologia não é o melhor método diagnóstico, pois é passiva de resultados falsos positivos. Os principais tipos são:
a. Imunofluorescência indireta (IFI) - possibilita a detecção de anticorpos gênero-específico, pela utilização de células infectadas com o genótipo L2, que reagem na presença de CR e CE.
b. Microimunofluorescência indireta – técnica espécie e subespécie-específica que se assemelha à IFI, porém com menor quantidade de antígenos, representando todos os genótipos de C. trachomatis (42–44).
Como são testes imunológicos de detecção de anticorpos, não é possível diferenciar se é uma infecção nova ou se é resposta imune remanescente do tratamento. Por essa razão, não são testes recomendados no rastreamento da infecção por C. trachomatis (42).
1.4.4. Testes Moleculares
Entre os testes de diagnóstico molecular estão o de hibridização de sondas de DNA, como a Captura Hibrida (CHII CT-ID DNA Test Version 2.0 - QIAGEN Mississauga, Ontário, Canadá) e as Técnicas de Amplificação de Ácidos Nucléicos (NAAT). O primeiro utiliza sondas de RNA especificas para as sequências de DNA genômico e do plasmídio críptico da C. trachomatis e o segundo, possibilita a amplificação exponencial do DNA ou RNA do microrganismo (2,37,43).
A partir destas metodologias é possível realizar a detecção molecular direta do patógeno, mesmo que presente em mínimas concentrações nas amostras. São técnicas que possuem alta sensibilidade e especificidade quando comparadas a outras metodologias já descritas, uma vez que são direcionadas ao DNA / RNA do microrganismo de interesse (2,43,45–47).
As NAAT para a detecção de C. trachomatis se baseiam na técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional e/ou em Tempo Real (qPCR), Reação em Cadeia da Ligase (LCR) e Amplificação por Deslocamento de Cadeia (DAS), que são técnicas que consistem na amplificação de DNA (42). O gene alvo para o diagnóstico de C. trachomatis é o plasmídio críptico, seguido do gene omp1, usado tanto para o diagnóstico quanto para a genotipagem. Mas há, também, técnicas que utilizam partes do genoma completo (2,45–47).
Nos países desenvolvidos, como EUA e os alguns países europeus, já é realizado o rastreamento e controle de C. trachomatis. Os testes utilizados para o diagnóstico de C. trachomatis devem ser aprovados por agências como Food and Drug Administration (FDA) e avaliados por empresas como a United Kingdom National External Quality Assessment (UKNeqas) e Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD) (42,48,49).
Nos EUA, de acordo com o CDC, os testes que devem ser realizados na rotina laboratorial para o diagnóstico de C. trachomatis são os de amplificação de ácidos nucleicos. Pelas recomendações do MMWR, já não se faz necessário realizar teste de cultura ou imunológicos para confirmação de resultados por testes moleculares, devido à sensibilidade de NAATs ser de 20% a 35% maior que os demais testes diagnósticos (42).
Os testes comerciais recomendados pelo MMWR, e que a FDA aprova para o diagnóstico de C. trachomatis, são o Abbott RealTime m2000 CT/NG (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, Illinois), Amplicor e Cobas CT/NG Test (Roche Molecular Diagnostics, Branchburg, New Jersey); Aptima, (Hologic/Gen-Probe, San Diego, California); BD ProbeTec ET e Qx (Becton Dickinson, Sparks, Maryland), e Xpert CT/ NG Assay (Cepheid, Sunnyvale, California) (42).
Na Europa, entre os testes avaliados, pela UKNeqas e QCMD, estão os testes: Cobas TaqMan CT/NG test (Roche Diagnostics), Abbott Real Time CT/NG test (Abbott Laboratories) BD ProbeTec ET (Becton Dickinson), the Aptima CT (Gen-Probe) Kit Artus C. trachomatis RG Plus (Qiagen), CT. Q - PCR Alert Kit (Nanogen). Foram citados alguns testes desenvolvidos in-house, porém para sua avaliação, estes testes precisam ser validados por um teste comercial (48,49).
A metodologia aplicada nas técnicas comerciais, aprovados pelo FDA e UKNeqas e QCMD, consiste em qPCR nos kits da Roche, Abbott, Cepheid, Nanogen e Qiagen, Amplificação Mediada por Transcrição (TMA) no kit da Gen-Probe e DAS no kit da Becton (42,48,49).
No presente estudo, os testes que serão abordados em detalhe são a PCR em Tempo Real (qPCR), seja pela padronização de ensaios in-house ou pelo uso de testes comerciais, como o Kit Artus PCR C. trachomatis RG Plus (qPCR Artus Plus –Qiagen – Hilden, Germany). Além desses, também será abordada a técnica de Captura Híbrida para C.trachomatis (CHII CT-ID) (Qiagen, Mississauga, Ontário, Canadá).
1.4.4.1. Captura Híbrida
A Captura Híbrida (CHII CT-ID) é um teste comercial de amplificação de sinais que utiliza como alvo 39,300 pb do genoma completo de C. trachomatis e 100% do plasmídio críptico, sem a necessidade de realizar a etapa de extração de DNA, pois durante o procedimento de armazenamento do material coletado, já ocorre a etapa de lise que libera o DNA da célula (Tabela 2) (50,51).
Esta metodologia exige, além do kit dos equipamentos e acessórios da Hybrid Capture System In vitro Diagnostic, a especificação do tipo de amostra mais viável para o teste, que é o esfoliado urogenital, coletado com uma escovinha a UCM Collector (QIAGEN, Mississauga, Ontário, Canadá), e validada somente para o sexo feminino.
A partir de amostras, onde o DNA alvo esteja presente, ocorre a hibridação de sondas de RNA específicas a C. trachomatis, formando um híbrido DNA:RNA. Em placas marcadas, com anticorpos específicos para esses híbridos, ocorrem a captura dos mesmos na superfície dos poços. Em seguida, um segundo anticorpo conjugado a fosfatase – alcalina, é direcionado aos híbridos imobilizados na placa. Essa reação é detectada por um substrato quimioluminescente, onde múltiplos conjugados se ligam aos híbridos capturados, resultando em uma amplificação de sinal significativo. Com a quebra do substrato, ocorre após sua ligação à fosfatase – alcalina. Assim, a luz é emitida. A mensuração de luz é dada em unidade relativa de luz (Relative Light Unit - RLUs) através de um Quimioluminomêtro. A intensidade de luz emitida indica presença ou ausência do DNA da C. trachomatis, ou seja, RLU acima de 2,5 RLU/CO indica testes positivos, entre 1,0 a 2,5 RLU/CO, é uma zona indefinida, necessitando nova coleta e, abaixo de 1,0 RLU/CO, é negativo. Este teste é realizado em placas, 88 amostras e 8 controles (negativos e positivos) (50).
Diversos trabalhos já avaliaram a utilização de CHII CT-ID para detecção de C. trachomatis a partir de amostras endocervicais em mulheres atendidas
em clínicas especializadas em IST. Em todos os trabalhos, esta técnica apresentou sensibilidade que variou de 95% - 99% e, especificidade de 97% - 100%, quando comparada a cultura e o teste de EIA (51–54).
Entre as vantagens da CHII CT-ID, destacadas por diversos autores, estão a confiabilidade e a reprodutibilidade do teste e sua possível utilização na rotina laboratorial, uma vez que possuí um boa sensibilidade e especificidade. No entanto, isso ocorre apenas quando comparada à cultura. A técnica é considerada relativamente fácil, rápida e eficiente de ser realizada para a detecção de C. trachomatis (51–55).
Mesmo que possam ser observadas várias vantagens na CHII CT-ID, é muito importante destacar que essas publicações são do período em que a técnica foi desenvolvida, entre os anos de 1999 a 2002. Como foi comparada às técnicas de cultura ou testes imunológicos, fica evidente que a CHII CT-ID apresenta superioridade na sensibilidade e especificidade, por ser um teste molecular.
Com o advento das NAATs, como a PCR/ qPCR (comercial ou não), sabe-se que o limite de detecção dessas técnicas, por número de organismos, é 1 cópia do microrganismo, enquanto que a CHII tem um limite máximo de detecção a partir de > 100 cópias, ou seja, é possível que indivíduos infectados não sejam diagnosticados se não apresentarem o nível de detecção do teste (20).
Esta técnica não é mais recomendada pelo FDA para o diagnóstico de C. trachomatis, por não ser amplamente disponível e já possuir testes mais sensíveis e específicos que a CHII CT-ID, como as NAATs. Contudo, a CHII CT-ID é o teste disponibilizado na rotina para o diagnóstico de C. trachomatis pelo Sistema Único de Saúde (SUS) no Brasil.
1.4.4.2. PCR em Tempo Real
A PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica altamente sensível que permite amplificação e quantificação de uma sequência específica de ácido nucleico, com a detecção do produto de PCR em tempo real. O sistema é baseado na utilização de corantes fluorescentes que se ligam a cadeia de fita dupla de DNA ou de sondas específicas das sequências marcadas com fluorescência.
A técnica de qPCR apresenta maior sensibilidade e especificidade quando comparada a técnicas como a cultura ou aos métodos imunológicos como o EIA e DFA, chegando a uma sensibilidade e especificidade de aproximadamente 100% (Tabela 2) (45).
A qPCR multiplex é uma variação da técnica que possibilita detectar, em uma única reação, mais de um alvo do mesmo agente ou de diferentes. Na qPCR multiplex para C. trachomatis, utiliza-se, comumente, iniciadores específicos para o plasmídio críptico e gene omp1, aumentando a especificidade da reação. Não há o manuseio da reação pós-amplificação e, por utilizar um sistema fechado, minimiza as chances de reações cruzadas (45,56).
Trata-se de uma técnica realizada de forma mais rápida que as outras, podendo inclusive se trabalhar com volumes pequenos de amostras e efetuar coletas de formas não invasivas, como o primeiro jato de urina e swabs vulvovaginais sem influenciar na sua sensibilidade e especificidade (44,45,57).
Os protocolos de qPCR para a detecção de C. trachomatis são principalmente comerciais, plataformas fechadas, padronizadas e validadas, com um custo muito elevado, tornando inacessíveis para a rotina laboratorial (45). Por essa razão, tornou-se comum, pesquisadores independentes, desenvolverem técnicas com o mesmo princípio dos comerciais, que são denominadas in house. A técnica de qPCR in house também possibilita
quantificar o número de cópias presente na amostra. É aplicada a estudos epidemiológicos de diferentes regiões e populações e também genotipagem, utilizando, principalmente, o plasmídio críptico ou o gene omp1 como alvo (45,47,58).
Como já foi descrito por Ripa et. al, há a existência de uma nova variante de C. trachomatis na Suécia e cepas que não possuem o plasmídio críptico. É comum a realização de qPCR multiplex para que não sejam perdidas as cepas que apresentem essas variâncias (15,59).
Nas recomendações da MMWR, quando se trata de testes in house, por não serem técnicas bem estabelecidas e com controle de qualidade rígido, o MMWR indica apenas o uso de técnicas aprovadas pelo FDA (42).
1.4.4.3. Kit Artus PCR C. trachomatis RG Plus (qPCR Artus Plus - Qiagen)
A qPCR utilizando o kit Artus C. trachomatis RG Plus (qPCR Artus Plus – Qiagen – Hilden, Germany) contém reagentes e enzimas para a amplificação de fragmento de 106 pb do genoma completo e 111pb do plasmídio críptico da bactéria, além de um controle interno para identificar possíveis inibidores de PCR e um controle positivo. Este teste permite não somente a utilização de amostras de urina, swabs de olhos, endocervical, uretral, como também permite a possibilidade de utilização de amostras de sêmen.
É recomendado pelo fabricante a extração de DNA da amostra pelo QIAamp DNA Mini kit (Qiagen), pois a sua sensibilidade está relacionada com o grau de purificação da amostra. O teste desenvolvido somente pode ser realizado no equipamento Rotor-Gene Q (RG - Qiagen – Hilden, Germany).
O resultado é determinado pela detecção de sinais fluorescentes em cada canal de cor, onde a amostra (DNA) e o controle positivo são lidos pelo canal verde, e o controle interno pelo canal amarelo. Ou seja, ao ser detectado o
sinal pelo canal verde, nesta amostra, indica presença de DNA de C. trachomatis. A detecção no canal amarelo indica ausência de inibidores ou falha na reação (60,61).
O qPCR Artus Plus foi avaliado por Eickhoff et. al em 2006 utilizando três tipos de amostras: swabs uretrais, vaginais e cervicais, em amostras de urina e de sêmen. Ele comparou seus resultados, tendo como testes padrão o kit comercial Cobas Amplicor (reação de PCR – Roche) e também com resultados obtidos a partir de uma reação de qPCR in house. A qPCR Artus Plus mostrou sensibilidade e especificidade de 100% nas amostras de sêmen e quando aplicado às amostras de urina e swabs uretrais, vaginais e cervicais demonstrou sensibilidade de 98% e especificidade de 99%. Concluiu-se que a técnica pode ser utilizada em diferentes tipos de amostras mantendo a sensibilidade e especificidade, e ainda considera o teste método de escolha para o diagnóstico da infecção (61).
Esta metodologia não foi testada pelo FDA e está disponível somente em alguns países, mas foi avaliada pelo UKNeqas e QCMD, no qual foi destacada por ser uma qPCR multiplex, com dois alvos, o genoma e o plasmídio críptico da C. trachomatis e, também, por ser capaz de detectar a cepa variante que possui deleção no plasmídio críptico (48,49).
TABELA 2. Vantagens e desvantagens dos métodos de pesquisa de Ácidos Nucléicos e cultura
Teste
Tempo de
Realização Vantagens Desvantagens
Captura Híbrida 4 horas Fácil realização Alto custo Resultado rápido PCR, qPCR (in house ou comercialmente disponível) 2 - 4 horas Alta sensibilidade e especificidade. Pode utilizar swab uretral e
cervical e urina
Alto custo, possível contaminação e
inibição
Cultura 72 horas
Era o teste padrão para C. trachomatis, maior especificidade Baixa reprodutibilidade, altas chances de contaminação e necessidade de microrganismo viável Testes de pesquisa
de antígenos 2 - 3 horas Testes automatizados
Experiência ao microscópio, subjetividade na interpretação Teste de pesquisa de anticorpos 25 minutos Dosagem de anticorpos separadamente Passivo de falsos positivos, não recomendado em rastreamento da infecção Adaptado de Bèbèar et. al, Mares e Seadi et. al
Dos diversos testes diagnósticos para detecção de C. trachomatis é consenso seguir as recomendações dadas pelo CDC ou UKNeqas, que sugerem diversos testes moleculares comerciais. Porém, apesar de ser recomendado pelo CDC, o alto custo dos testes moleculares comerciais, inviabiliza sua aplicação na rotina e rastreamento da infecção, principalmente quando se trata de países em desenvolvimento.
No Brasil, apesar de não ser realizado o rastreamento e também não ser uma infecção de notificação compulsória, o Sistema Único de Saúde (SUS) disponibiliza para seu diagnóstico o teste de CHII CT-ID.
A CHII CT-ID, embora seja uma técnica de diagnóstico molecular, pode apresentar algumas desvantagens quando comparada com técnicas mais atuais, uma vez que os métodos disponíveis já possuem superioridade na acurácia para detecção de C. trachomatis.
Quando se trata de qPCR, principalmente em trabalhos realizados no Brasil, são utilizadas reações já padronizadas e oligonucelotídeos iniciadores já publicados, uma vez que, mesmo sendo desenvolvida in house, permanece oferecendo alta sensibilidade e especificidade.
Uma vantagem da técnica de qPCR in house é o menor custo, visto que kits comerciais possuem valores muito mais altos, tornando-os cada vez mais inacessíveis para a rotina e até mesmo podendo impossibilitar sua utilização no rastreamento da infecção por C. trachomatis.
Considerando as possíveis sequelas resultantes da infecção causada por C. trachomatis, somados a elevados casos assintomáticos e, especialmente o alto custo de testes moleculares comerciais para o seu diagnóstico, faz-se necessário o desafio de desenvolver novos protocolos de qPCR, com novos alvos genéticos e que possam oferecer melhor custo-benefício que os kits comerciais. O desenvolvimento de um protocolo que possa oferecer a acurácia necessária para um teste diagnóstico, implicará na possibilidade do rastreio da C. trachomatis em populações de risco (gestantes, adolescentes, pessoas com outras IST) e implantação na rotina laboratorial, levando a um tratamento mais digno aos usuários de Sistema Único de Saúde (SUS).
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Desenvolver e avaliar o desempenho e os custos de um protocolo de qPCR in house para a detecção de C. trachomatis comparando com teste comercial.
2.2. Objetivos Específicos
Padronizar uma reação de qPCR in house, utilizando plasmídio críptico como alvo para a detecção de C. trachomatis.
Desenhar iniciadores e sonda específicos para o alvo plasmídio críptico.
Comparar os resultados da qPCR in house com teste comercial, Kit Artus PCR C. trachomatis RG Plus 96 CE (QIAGEN). Para determinar sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo do teste de qPCR in house proposto.
Avaliar o custo dos testes realizado, a fim de estimar os valores de suas execuções no diagnóstico de C. trachomatis.
Otimizar a recuperação do DNA de C. trachomatis, a partir do kit coletor de espécimes cervicais, após a realização do teste de Captura Híbrida II CT ID.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Tipo de Estudo
Trata-se de um estudo descritivo, transversal, de validação de uma metodologia de diagnóstico para C. trachomatis.
3.2 Local de Estudo
Os ensaios moleculares foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular da Fundação Alfredo da Matta (FUAM), no período de novembro de 2014 a março de 2016.
3.3 População de Estudo
As amostras pertencem ao projeto “Custo-efetividade do rastreamento de clamídia, em jovens de 14 a 25 anos de idade, na cidade de Manaus, estado do Amazonas (RASCLAM)”, financiado pelo Programa PRO-ESTADO da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM), coordenado pela Dra. Adele Schwartz Benzaken. Este tinha como objetivo simular o rastreamento de Clamídia entre os usuários do SUS, atendidos em Unidades Básicas de Saúde (UBS) do Disa Oeste, na cidade de Manaus, Amazonas, entre outubro 2012 e dezembro 2013.
O rastreamento para C. trachomatis foi oferecido durante a coleta da colpocitologia para câncer de colo uterino por profissional de saúde (médico ou enfermeiros) (N=1187). Foram incluídas mulheres assintomáticas, entre 14 e 25 anos de idade que aceitaram assinar o TCLE. Foram excluídas mulheres grávidas e aquelas que tinham usado antibiótico durante os quinze dias prévios.
A coleta das amostras cervicais foi realizada utilizando o Digene cervical sampler brush (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada). Este foi colocado no kit UCM Collector (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada), que continha 1 mL do Specimen Transport Medium (QIAGEN). As amostras foram armazenadas em
temperatura ambiente e ao final de cada semana eram transportadas para o laboratório de Biologia Molecular da FUAM.
Antes da realização do teste de CH II CT-ID, foi retirada uma alíquota de 500 µL do material de cada paciente e armazenada em microtubo de 1,5 mL, a -20° C. (50).
3.4 Amostras do estudo
Para o presente estudo foi selecionado um grupo de amostras cervicais com os seguintes critérios:
Critérios de Inclusão
Amostras de pacientes com resultados positivos para C. trachomatis, detectada por meio da CHII CT-ID.
Amostras de pacientes com resultados negativos para C. trachomatis por meio da CHII CT-ID, selecionadas aleatoriamente.
Critérios de Exclusão
Amostras de pacientes que não apresentaram amplificação no qPCR in house para o gene humano constitutivo (β-actina).
Amostras que não estavam de acordo com o controle de qualidade do kit qPCR Artus Plus, ou seja, não apresentaram amplificação no teste e nem no controle interno.
3.5 Seleção das amostras
Foram previstas a utilização de 153 amostras positivas no teste CHII CT-ID e o mesmo número de amostras negativas. No entanto, apenas 146 amostras positivas foram encontradas e selecionadas para o estudo. Por essa
razão, 146 amostras negativas também foram selecionadas aleatoriamente, totalizando 292 amostras. Tais amostras foram codificadas e organizadas de modo que o pesquisador responsável por realizar as técnicas de qPCR (in house ou kit) não identificasse quais amostras eram positivas e negativas pelo teste CHII CT-ID, a fim de evitar erros sistemáticos na escolha e no tratamento das amostras (Figura 2).
Figura 3. Fluxo de seleção e avaliação de amostras
Mesmas Amostras
3.6 Extração de DNA para qPCR in house e comercial
A extração de DNA das alíquotas retiradas antes do teste de CHII CT-ID foi realizada de acordo com a recomendação da qPCR Artus Plus, que indica a utilização do QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN – Hilden, Germany). As amostras tiveram seu DNA quantificado utilizado o equipamento Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc, Wilmigton), as amostras tiveram concentração média de 35,68 ng/µL.
3.7 Amplificação de DNA por qPCR
3.7.1 Detecção de C. trachomatis por qPCR Artus Plus
A reação foi realizada, seguindo as orientações do fabricante, utilizando o equipamento Rotor Gene Q 5plex Plataform. (QIAGEN - Hilden, Germany). Os resultados foram interpretados de acordo com as orientações do fabricante e também do apoio técnico oferecido pela empresa QIAGEN.
3.7.2 Desenvolvimento e padronização da qPCR In house
A qPCR in house foi desenhada para a detecção de DNA de C. trachomatis, sintetizando um novo par de iniciadores específicos para o plasmídio críptico e uma sonda marcada com um corante fluorescente (FAM). Para a execução do ensaio de PCR em Tempo Real com TaqMan, foi utilizado o equipamento STEP ONE PLUS, da Applied Biosystems® (Foster City, Califórnia).
3.7.3 Desenho dos iniciadores e sondas.
O desenho dos iniciadores e da sonda baseou-se nas sequências conservadas do plasmídio críptico (Tabela 3), disponíveis no banco de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/). Para o alinhamento foi utilizado o programa de bioinformática Bioedit 7.5.2, que possibilitou selecionar
a região mais conservada do plasmídio críptico, incluindo as cepas descritas por Rippa et al 2006 (15).
Tabela 3. Identificação das Cepas e código GenBank utilizadas no desenho dos iniciadores e sonda do alvo do plasmídio críptico.
Cepa Genótipo GenBank ID*
L2b/CS784/08 L2b NZ_CP009926.1 Ia/CS190/96 Ia NZ_CP010572.1 Cepa Sweden3, E FM865440.1 Cepa Sweden4 F FM865441.1 Cepa Sweden5 F FM865442.1 Cepa Sweden2 E FM865439.1 * Identificação da sequência
Iniciadores e as sondas específicas foram desenhados utilizando o aplicativo on line do Integrated DNA Technologies (IDT tools -
www.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/). O OligoAnalyzer 3.1 (IDT tools - www.idtdna.com//calc/analyzer) foi utilizado para avaliar os parâmetros dos iniciadores e sondas, incluindo a temperatura de melting (Tm), a diferença de temperaturas de melting entres os pares de iniciadores (ΔTm), proporções de GC (GC%), força para formação de self-dimers, harpins, estruturas de hetero-dimers, sequência repetidas e energia livre de Gibbs (ΔG).
Para testar possíveis interações inespecíficas, utilizou-se a ferramenta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), disponível no National Center for Biotechnology Information (NCBI), para selecionar as combinações que não apresentaram interações inespecíficas para com o DNA Humano ou outros microrganismos presentes na microbiota cervical e vaginal.
A partir da avaliação dos parâmetros, citados previamente, foram selecionados um par de iniciadores e uma sonda (FAM) para o plasmídio críptico, como demonstrado na tabela 4.
A mesma metodologia citada acima para o desenho de iniciadores e sonda para o plasmídio críptico, também foi realizado para o gene omp1, utilizando todos as sequências dos genótipos disponíveis no banco de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/).
3.7.4 Características e interpretação dos resultados do teste de qPCR in house
Na realização da reação de qPCR in house, as amostras incluídas no estudo, mais o controle positivo e o branco (reação adicionado agua estéril) foram testadas em triplicatas, utilizando o aparelho STEP ONE PLUS (Applied Biosystems®, Foster City, Califórnia). As amostras eram consideradas positivas caso apresentassem amplificação em pelo menos duas das três triplicatas testadas. Todos os testes eram analisados em treshold de 0,02.
3.7.4.1 Reação de q PCR in house para C. trachomatis
A reação de qPCR foi otimizada para um volume final de 10 µL, utilizando 1µL de DNA e com as seguintes concentrações finais de reagentes: Taqman universal PCR Master Mix SEM UNG a 1X (Applied Biosystem®, Foster City, Califórnia) e iniciadores) e sonda da Invitrogen Paisley, Reino Unido, estavam na concentração de 200 µM. As condições de termociclagem iniciavam-se com 2 minutos a 50ºC e 10 minutos a 95ºC, seguidos de 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos e, 60ºC por um minuto.
Tabela 4. Oligonucleotídios iniciadores para o Plasmídio Críptico (PC)
Primer Senso 5´- CTAGGCGTTTGTACTCCGTC – 3´
Sonda 5´- TTGCAGCTTGTAGTCCTGCTTGAGA – 3´ FAM Primer
Antisenso
Nas amostras que não apresentaram amplificação para C. trachomatis, foram testadas, para o gene constitutivo humano, β-actina (ANEXO VIII) para verificar se a extração de DNA foi satisfatória ou se houve presença de inibidores de PCR. Tal reação foi padronizada para um volume final de 5µL. As concentrações finais utilizadas foram: Taqman universal PCR Master Mix SEM UNG a 1X (Applied Biosystem®, Foster City, Califórnia), iniciadores na concentração de 300 µM e a sonda a 100µM. O volume de DNA foi de 1 µL e as condições de termociclagem iniciavam-se com 2 minutos a 50ºC e 10 minutos a 95ºC, seguidos de 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos e, 60ºC por um minuto.
3.8 Análise Estatística
Os resultados obtidos de cada teste molecular foram armazenados em um banco de dados Excel, especificando o resultado codificado em 0 e 1 (0= negativo e 1= positivo).
A acurácia (sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo) dos testes de CH II CT-ID e qPCR in house foi avaliada em relação a um teste comercial (qPCR Artus Plus). Para avaliação da concordância entres os testes foi calculado o índice Kappa, interpretado pela tabela de concordância (62), calculados pelo método padrão, considerando intervalo de confiança de 95% (IC). Todas as análises foram realizadas por meio da ferramenta bioestatística STATA/SE v.13 (StataCorp, College Station, TX).
3.9 Cálculo Amostral
Para determinar o tamanho da amostra necessário para testar a acurácia do teste de qPCR in house, foi utilizado o cálculo do tamanho amostral para uma proporção binomial (63).
O tamanho amostral (n) dependeu de:
Z score, é 1.96 para o intervalo de confiança de 95%
Sensibilidade esperada do teste de qPCR in house: p
Precisão desejada da proporção esperada: L
Prevalência de C. trachomatis em mulheres entre 14-25 anos
A fórmula para o cálculo do tamanho amostral é a seguinte:
n= (1.96)2 x p x (1-p) / L2
Espera-se que a sensibilidade da qPCR in house seja de 98%, igual a sensibilidade apresentada pela técnica qPCR Artus Plus em amostras cervicais. Aceita-se uma precisão de 10% (intervalo da sensibilidade entre 60% - 80%) (61). O número de infecções necessárias para testar a acurácia do teste de qPCR in house foi:
n= (1.96)2 x 0.98 x 0.02 /0.102 =7.5 ou 8 (amostras com resultado positivo)
Como dado para a prevalência de C. trachomatis, em mulheres jovens assintomáticas, tomou-se como referência um estudo comunitário realizado em uma amostra aleatória de 1072 mulheres jovens (14-25 anos) assintomáticas de 3 cidades (Ceres, Catalão e Inhumas), no estado de Goiás. A prevalência obtida usando PCR foi de 9.6% (34).
Levando em consideração esta prevalência, o tamanho amostral encontrado foi 8/0.096 = 83.3 amostras positivas. Neste estudo, incrementamos o tamanho amostral para que todas as amostras positivas pelo teste de CHII CT-ID (n=153) e o mesmo número de negativas fossem analisadas a fim de atingir maior precisão nas estimativas.
