VALÉRIA BATTISTELLA AMADO DOS SANTOS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO HOSPITAL UNIVERSITÁRIO CLEMENTINO FRAGA FILHO

FACULDADE DE MEDICINA DA UFRJ

INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO

VALÉRIA BATTISTELLA AMADO DOS SANTOS

SEGURANÇA DO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS

MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA EM PACIENTES COM ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL ISQUÊMICO SUBAGUDO

RIO DE JANEIRO 2009

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Livros Grátis

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VALÉRIA BATTISTELLA AMADO DOS SANTOS

SEGURANÇA DO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA EM PACIENTES COM ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL

ISQUÊMICO SUBAGUDO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Clínica Médica, com área de atuação em Neurologia

Orientadores: Charles André

Rosália Mendez-Otero Gabriel Rodriguez de Freitas

Rio de Janeiro 2009

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B336 Battistella, Valéria

Segurança do transplante autólogo de células monucleares da medula óssea em pacientes com acidentes vascular cerebral isquêmico sub-agudo. / Valéria Battistella. – 2009

75 f.

Dissertação (Mestrado em Clínica Médica) –Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Hospital Clementino Fraga Filho, Rio de Janeiro, 2009. Orientador: Charles André.

1.Clínica médica – Teses. 2. AVC isquêmico. 3.Célula Tronco. 4. Medula óssea. I. André, Charles. II. Universidade

Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Pós-Graduação em Clínica Médica. III. Título.

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Valéria Battistella Amado dos Santos

SEGURANÇA DO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA EM PACIENTES COM ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL

ISQUÊMICO SUBAGUDO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Clínica Médica, com área de atuação em Neurologia.

_____________________________________________ Prof. Dr. Charles André

Universidade Federal do Rio de Janeiro

_____________________________________________ Profª Drª Lea Miriam Barbosa da Fonseca

_____________________________________________ Prof. Dr. Marcos Raymundo Gomes de Freitas

Universidade Federal Fluminense

_____________________________________________ Prof. Dr. Maurice Vincent

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, pela minha vida.

Aos meus pais, Paulo e Ieda, pelo esforço desempenhado com minha educação.

Aos meus irmãos, Wagner e Wander, e madrinha Edinéa, pelo estímulo constante aos estudos. Ao meu marido Cesar pelo amor e companheirismo nos últimos 15 anos e à minha filha Beatriz, simplesmente por existir.

A toda a equipe multiprofissional envolvida neste projeto, pelo carinho e dedicação em sua realização: Daniel Mercante, Juliana Dias, Regina Goldenberg, Thais Kazai-Binswick, Bianca Gutfien, Cláudia Lopes, Eduardo Wajnberg, Soniza Vieira e Lea Miriam Barbosa da Fonseca. Aos meus orientadores, Charles, Rosália e Gabriel, pela atenção e orientação a mim dispensada, nesta importante fase da vida acadêmica.

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RESUMO

O Acidente vascular cerebral (AVC) permanece a principal causa de incapacidade no mundo e há poucos estudos clínicos avaliando formas efetivas de melhorar a incapacidade residual (CRAMER, 2008). Nos últimos anos, muitos estudos investigaram o potencial papel restaurador de células-tronco, de diferentes fontes, em modelos animais de isquemia cerebral (MENDEZ-OTERO; de FREITAS; MENDONÇA; ANDRÉ, 2007). Este é um estudo clínico fase 1, para averiguar a segurança e exequibilidade do transplante autólogo de células mononucleares da medula óssea (CMMO), em pacientes com acidente vascular cerebral (AVC) isquêmico, em território da artéria cerebral média (ACM), ocorrido até 90 dias antes da infusão. Dez por cento das células a serem injetadas foram marcadas com 99mtecnécio para avaliação da cinética das CMMO após a injeção. Sete pacientes (idade entre 24 e 65 anos) preencheram todos os critérios de inclusão. Foi realizado aspirado de medula óssea pela crista ilíaca, sob sedação e anestesia local. As CMMO foram isoladas do aspirado utilizando gradiente Ficoll; 10% das células foram separadas e marcadas com 99mtecnécio e reinjetadas na ACM responsável pelo AVC (mínimo de 1 x 108 e máximo de 5 x 108 células injetadas), por técnica de Seldinger. Imagens cintilográficas foram realizadas duas e 24 horas após o procedimento. Eletroencefalograma foi feito nos primeiros sete dias após o transplante. Os pacientes foram avaliados utilizando hemograma e bioquímica e avaliação de escalas neurológicas (escala de AVC do Instituto Nacional de Saúde Americano, Escala modificada de Rankim e Índice de Barthel), antes da infusão das CMMO e 1, 3, 7, 30, 60, e 120 dias após. Não houve qualquer complicação ou eventos adversos ligados diretamente ao procedimento. Em seis pacientes não houve piora evolutiva das escalas neurológicas até o final do acompanhamento. Um paciente necessitou intervenção cirúrgica uma semana após a infusão das CMMO (intercorrência clínica não ligada ao procedimento), apresentando novo evento isquêmico cerebral no pós-operatório. Em todos os pacientes houve captação na Tomografia Computadorizada de fóton único (sigla em inglês, SPECT) e nas imagens corporais totais realizados duas horas após infusão das CMMO marcadas. Devido à meia-vida curta do tecnécio (seis horas), nem todas as imagens realizadas 24 horas após a infusão apresentavam atividade do radiofarmaco. Todos os pacientes permaneceram em acompanhamento mesmo após o término do protocolo (120 dias) e dois pacientes apresentaram crise convulsiva tônico-clônica generalizada, aproximadamente 200 dias após a infusão. Apesar das crises convulsivas, não houve alteração nas escalas de avaliação,

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comparado ao 120° dia de acompanhamento. Neste pequeno estudo piloto, fase 1, a infusão intra-arterial de CMMO em pacientes com AVC isquêmico (fase subaguda) foi segura e exequível. Observou-se que a fração de CMMO marcada permaneceu na área isquêmica por, pelo menos, 24 horas em alguns pacientes. Estudos fase 2, com inclusão de maior número de pacientes, são necessários para avaliar eficácia e segurança.

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PALAVRAS-CHAVE: AVC ISQUÊMICO, TRONCO, MARCAÇÃO

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ABSTRACT:

Stroke remains the leading cause of disability in the world. There are few clinical trials that evaluated effective ways to enhance recovery in patients with residual disability (CRAMER, 2008). In recent years, several studies have investigated the potential restorative role of stem cells from different sources in animal models of brain ischemia (MENDEZ-OTERO; de FREITAS; MENDONÇA; ANDRÉ, 2007). This is a phase 1 clinical study to assess the safety and feasibility of bone-marrow mononuclear cell (BMMC) transplantation in patients with middle cerebral artery (MCA) territory ischemic stroke, within 90 days of stroke onset. In all patients a portion of the infusion cells (10%) was marked with tecnecium-99-m to evaluate the fate of BMMC after injection. Seven patients (aged 24 to 65 years) filled all the inclusion criteria according to a protocol registered in the Research Ethics Committee, number 169/03. Iliac-crest bone-marrow aspiration was performed under sedation and local anesthesia. BMMC were isolated using a Ficoll gradient, and 10% of the cells were separated and labeled with 99mTc and re-injected in the MCA responsible for the stroke (minimum: 1 x 108 and maximum: 5 x 108 injected cells) after navigation (Seldinger technique). Single photon emission computerized tomography (SPECT) and whole-body scan images were done two and 24 hours after the procedure. Electroencephalogram was done within 7 days after transplantation. Patients were evaluated with complete blood count, biochemical exams and by neurological scales (National Institute of Health Stroke Scale, modified Rankin Scale, and Barthel Index) before BMMC infusion and 1, 3, 7, 30, 60 and 120 days after. No patient exhibited any complication or adverse events during the procedure. In six patients there was no worsening in neurologic scales until the end of follow-up. One patient needed surgery (not related to the BMMC infusion) one week after the procedure. He had a new ischemic stroke. Whole-body scans and SPECT obtained two hours after infusion of labeled BMMCs showed uptake in the brains of all patients. Due to the six-hour half-life of 99mTc, the brain uptake at 24h after cell infusion couldn’t be visualized in all patients. All the patients remained monitored even after the end of follow-up (120 days) and two patients had generalized seizures, 200 days after cell infusion. In spite of that, the scales evaluated remained the same of the 120th day. In this small phase 1 pilot study, BMMC intra-arterial injection in patients with sub-acute ischemic strokes proved feasible and safe. The fraction of labeled BMMC stayed in the ischemic area for at least 24 hours in some patients. Phase II studies with more patients are required to further evaluate efficacy and safety of BMMC transplantation in patients with ischemic stroke.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Fisiopatologia simplificada da lesão induzida

pelo AVC, reparo endógeno e regeneração 17

Figura 2: Penumbra isquêmica 17

Figura 3: Paciente 1 - Imagens SPECT 2h após infusão CMMO 40

Figura 4: Paciente 1 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO 41

Figura 5: Paciente 1 - Imagens de corpo inteiro 24h após infusão CMMO 42

Figura 12: Paciente 3 - Imagem cerebral 24h após infusão CMMO 49

Figura 21: Paciente 7 - Imagens cerebrais 2h após infusão CMMO 58

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LISTA DE QUADROS, TABELAS E GRÁFICOS

Quadro 1: Protocolo de acompanhamento 34

Tabela 1: Características gerais dos pacientes 36

Quadro 2: Celularidade do material infundido 38

Tabela 2: Escala de AVC do Instituto Nacional Americano de Saúde

(sigla em inglês, NIHSS) da amostra 60

Tabela 3: Índice de Barthel dos pacientes 60

Tabela 4: Escala modificada de Rankin dos pacientes 61

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LISTA DE ABREVIATURAS

99m Metaestável

ACM Artéria Cerebral Média

AIT Ataque Isquêmico Transitório

AVC Acidente Vascular Cerebral

CEP Comissão de Ética em Pesquisa

CMMO Células Mononucleares da Medula Óssea

CONEP Comissão Nacional de Ética em Pesquisa

CTH Células-tronco Hematopoiéticas

CTM Células-tronco Mesenquimais

ECASS European Cooperative Acute Stroke Study

EEG Eletroencefalograma

EMS European Motor Scale

ESS European Stroke Scale

FC Fragment crystallizable

FDA Food and Drug Administration

FWHM Full Width at Half-max

GCSF Granulocyte Colony-stimulating Factor

GRID Gadolinium Rhodamine Dextran

HMG Hemograma

HUCFF Hospital Universitário Clementino Fraga Filho

IB Índice de Barthel

MIE Membro Inferior Esquerdo

MHC Major Histocompatibility Complex

MO Medula Óssea

NIHSS National Institute of Health Stroke Scale

NINDS National Institute of Neurological Disorders and Stroke

NK Natural Killer

PET Positron EmissionTomography

RM Ressonância Magnética

rt-PA recombinant tissue Plasminogen Activator

SPECT Single Photon Emission Computed Tomography

TC Tomografia Computadorizada

TCA Tempo de Coagulação Ativado

TCE Traumatismo Crânioencefálico

TRM Traumatismo Raquimedular

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 14

2 REVISÃO CRÍTICA DA LITERATURA 16

2.1 ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL (AVC) 16

2.2 CÉLULAS-TRONCO 19

2.2.1 Conceito 19

2.2.2 Aplicações 21

2.2.3 Estudos experimentais/ clínicos 23

2.2.3.1 Células-tronco na cardiologia 23

2.2.3.2 Células-tronco para reparo muscular e ósseo 23

2.2.3.3 Células-tronco para doenças da pele 24

2.2.3.4 Células-tronco na neurologia 24 3 OBJETIVOS 28 3.1 OBJETIVO GERAL 28 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 28 4 PACIENTES E MÉTODOS 29 4.1 PACIENTES 29 4.2 INTERVENÇÃO 30 4.2.1 Admissão hospitalar (D0) 30

4.2.2 Aspirado da medula óssea (D1) 30

4.2.3 Separação das células 31

4.2.4 Marcação das CMMO com radioisótopo 31

4.2.5 Infusão das células 32

4.2.6 Acompanhamento durante internação (D1 a D3) 32

4.2.7 Acompanhamento após a alta hospitalar 33

4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA 34

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5 RESULTADOS 35

5.1 CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA 35

5.2 SEGURANÇA DO PROCEDIMENTO 37

5.3 CELULARIDADE DO MATERIAL INFUNDIDO 38

5.4 IMAGENS 39 5.4.1 Paciente 1 40 5.4.2 Paciente 2 43 5.4.3 Paciente 3 46 5.4.4 Paciente 4 50 5.4.5 Paciente 5 53 5.4.6 Paciente 6 55 5.4.7 Paciente 7 58 5.5 ESCALAS DE AVALIAÇÃO 60 5.6 PARÂMETROS LABORATORIAIS 62 6 DISCUSSÃO 63 7 CONCLUSÃO 67 REFERÊNCIAS 68 ANEXOS 76

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1 INTRODUÇÃO

O AVC é a terceira causa de morte em países desenvolvidos (MURRAY; LOPEZ, 1997) e a principal causa de morte em alguns países em desenvolvimento (WU et al, 2001), incluindo o Brasil (ANDRÉ et al, 2006). O AVC permanece a principal causa de incapacidade no mundo: pelo menos 30% dos sobreviventes a um AVC têm recuperação incompleta e outros 20% necessitam de assistência com as atividades de vida diária (BONITA; SOLOMON; BROAD, 1997). Embora alguns fatores no tratamento do AVC agudo, como as Unidades de AVC e o uso dos trombolíticos, possam melhorar o prognóstico dos pacientes, há poucos estudos clínicos avaliando formas efetivas de melhorar a incapacidade residual (CRAMER, 2008). Nos últimos anos, muitos estudos investigaram o potencial papel restaurador de células-tronco, de diferentes fontes, em modelos animais de isquemia cerebral (MENDEZ-OTERO; de FREITAS; MENDONÇA; ANDRÉ, 2007). Estes estudos mostraram que a administração de células-tronco melhora a perda funcional observada após isquemia, tornando o transplante destas células uma abordagem atrativa para restaurar a função cerebral após AVC em humanos.

Duas instituições brasileiras diferentes (estudos clínicos fase 1) avaliaram a segurança do transplante autólogo de células-tronco nos primeiros dez dias após AVC isquêmico (MENDONÇA et al, 2006; de FREITAS et al, 2006). Vinte e seis pacientes (soma dos dois estudos) com infarto no território da ACM receberam transplante autólogo de CMMO, por via intra-arterial. Um paciente apresentou deterioração neurológica durante arteriografia cerebral, porém antes da injeção das células-tronco. Os pacientes tratados não exibiram piora clínica e nem lesões novas apareceram na avaliação sequencial por Ressonância Magnética (RM) de crânio, incluindo imagem pesada em difusão. Estes estudos sugeriram que o transplante autólogo de CMMO, via intra-arterial, é seguro nos primeiros dez dias após AVC isquêmico.

O transplante de células-tronco, após a fase aguda de uma isquemia cerebral, apresenta alguns obstáculos. A formação de tecido cicatricial e a restauração da barreira hematoencefálica podem afetar de forma adversa as células implantadas. Poucos modelos de estudos animais em AVC investigaram transplante de células-tronco, meses após o infarto (SAVITZ et al, 2002). Entretanto, há alguns estudos clínicos fase 1 e 2 que avaliaram pacientes com AVC isquêmico crônico e transplante de células-tronco nessa fase, incluindo pacientes até mesmo 10 anos após o evento isquêmico (KONDZIOLKA et al, 2000, 2005;

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SAVITZ et al, 2005; BANG et al, 2005) e dois desses estudos utilizaram células derivadas de teratocarcinoma humano (KONDZIOLKA et al, 2000, 2005; SAVITZ et al, 2005) e células porcinas (SAVITZ et al, 2005), que podem provocar respostas graves de rejeição. Bang e colaboradores examinaram a segurança e eficácia de células-tronco mesenquimais (CTM), autólogas, expandidas em cultura e administradas via intravenosa em dois momentos: a primeira infusão entre quatro e cinco semanas e a segunda entre sete e nove semanas após o início dos sintomas (BANG et al, 2005). Os cinco pacientes que receberam essas células não apresentaram efeitos adversos e tiveram melhora clínica em três e seis meses, comparados ao grupo controle. Nesse estudo, as células da medula óssea eram cultivadas por várias semanas antes do transplante, o que pode aumentar o risco de contaminação. Além disso, nenhum desses estudos avaliou a cinética das células in vivo.

Baseado no exposto acima, desenhamos um estudo clínico fase I para avaliação da segurança e exequibilidade da infusão de células mononucleares autólogas da medula óssea, em pacientes com AVC isquêmico ocorrido em até 90 dias antes da infusão. Em todos os pacientes do estudo uma parte das células a serem injetadas foram marcadas com tecnécio-99-m para avaliação da cinética das CMMO após a injeção.

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2 REVISÃO CRÍTICA DA LITERATURA

2.1 ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL (AVC):

AVC é a terceira causa de morte e é a maior causa de incapacidade em países em desenvolvimento (ANDRÉ et al, 2006). A incidência de AVC varia entre os países e aumenta exponencialmente com a idade. Nas sociedades ocidentais, aproximadamente 80% dos casos são causados por isquemia cerebral focal devido à oclusão arterial e os outros 20%, causados por hemorragias (FEIGIN et al, 2003).

A fisiopatologia tanto do AVC isquêmico quanto do hemorrágico tem sido muito estudada. Um grande número de eventos celulares e metabólicos se segue após a injúria cerebral (Fig. 1). Os mecanismos fisiopatológicos da isquemia cerebral e suas interações são muito complexos. Inicialmente, a porção central da lesão com perfusão muito baixa é cercada por uma área de disfunção causada por distúrbios iônicos e metabólicos, mas com integridade estrutural preservada, a penumbra isquêmica (Fig. 2). Entretanto, após essa fase dramática de injúria inicial, a lesão continua a crescer muitas horas e até dias após o início da isquemia. Dependendo do grau de fluxo sanguíneo residual e da duração da isquemia, a penumbra irá, eventualmente, ser incorporada ao infarto, se não ocorrer reperfusão(van der WORP; van GIJN, 2007). Portanto, quando um vaso arterial cerebral oclui, uma complexa cascata de eventos ocorre. Células despolarizam e edemaciam, aminoácidos excitatórios e íons potássio são liberados, enquanto os níveis de íons cálcio intracelular elevam-se rapidamente (excitotoxicidade). Alguns mecanismos de isquemia cerebral podem ter tanto ações benéficas quanto deletérias: (a) inflamação e interação imune-mediada, que contribuem para a expansão da lesão, mas também são instrumentos de contenção do crescimento da lesão e reparo; o desfecho do AVC é modulado pela interação do cérebro lesado com o sistema imune; (b) glutamato, que tem papel importante na excitotoxicidade, mas que também é essencial para a função cerebral normal e reorganiza a sinaptogênese após a injúria; (c) óxido nítrico, produzido pela óxido-nítrico sintetase em resposta à injúria e que pode aumentar o fluxo sanguíneo neuronal, mas também resulta no aumento de radicais livres. Portanto, o contexto celular, o tempo e a intensidade do estímulo são importantes para determinar se uma mesma molécula está em uma via de sinalização ou destruição e reparo(ENDRES et al, 2008).

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Figura 1: Fisiopatologia simplificada da lesão induzida pelo AVC, reparo endógeno e regeneração. Adaptada com permissão de Dr. Ulrich Dirnagl, do artigo “Improving outcome after stroke: overcoming the translational roadblock. Cerebrovas Dis 2008;25:269”.

Figura 2: Penumbra isquêmica. Adaptada com permissão de Dr. Ulrich Dirnagl, do artigo “Pathobiology of ischemic stroke: an integrated view. Trend neurosci 1999;22:394”.

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Baseado na duração dos sintomas, as isquemias podem ser transitórias ou permanentes (ataque isquêmico transitório [AIT] ou AVC, respectivamente). AIT é um déficit neurológico temporário, sem piora evolutiva, de início súbito, atribuído à isquemia focal do cérebro, retina ou cóclea, e que dura menos que 24 horas. Entretanto, a maioria dos AITs dura de cinco a 20 minutos. Sintomas com duração maior que 24 horas são considerados AVC isquêmicos (BILLER; LOVE; SCHNECK, 2008).

No atendimento emergencial ao paciente com sintomas sugestivos de isquemia cerebral, o déficit neurológico deve ser investigado por um exame neurológico cuidadoso. A escala de AVC do Instituto Nacional de Saúde Americano – NIHSS (do inglês, National Institute of Health Stroke Scale) (BROTT et al, 1989) é a escala mais utilizada para quantificar a gravidade do déficit. O infarto cerebral não pode ser distinguido, com certo grau de certeza, de hemorragia intracerebral com base nos sinais e sintomas somente. Em todos os pacientes com suspeita de AVC isquêmico, tomografia computadorizada (TC) ou RM de crânio deve ser realizada. A TC sem contraste é suficiente, pois tem alta sensibilidade para hemorragia intracraniana(van der WORP; van GIJN, 2007).

Tratamento trombolítico intravenoso com ativador do plasminogênio tecidual recombinante (sigla em inglês rt-PA), iniciado nas primeiras três horas após o início dos sintomas, é a única terapia clínica atualmente disponível para o AVC isquêmico agudo. Um estudo de AVC multicêntrico, randomizado (National Institute of Neurological Disorders and Stroke Recombinant Tissue Plasminogen Activator – NINDS rt-PA) utilizando 0,9 mg/Kg de peso de rt-PA, iniciado nas primeiras três horas após o início dos sintomas, demonstrou probabilidade 30% maior de ter incapacidade mínima ou nenhuma incapacidade em três meses, quando comparado com placebo(THE NINDS STUDY GROUP, 1995). Dois estudos europeus, European Cooperative Acute Stroke Study (ECASS) e ECASS II, investigaram um tempo maior para o uso do trombolítico após o início dos sintomas (seis horas), mas estes estudos falharam em mostrar eficácia (HACKE et al, 1995 e 1998). Em 2008 foram publicados os resultados do ECASS III, onde era utilizado rt-PA intravenoso entre três e quatro horas e meia após o início dos sintomas, ocorrendo modesta, mas significativa melhora no desfecho clínico, sem níveis maiores de hemorragia intracraniana do que o relatado previamente entre pacientes tratados nas primeiras três horas. Entretanto, o tratamento precoce permanece essencial. A significância do efeito da trombólise é tempo-dependente. O tempo “porta-agulha” (chegada ao hospital ao início da infusão intravenosa de rt-PA) permanece importante e deve ser o mais curto possível para aumentar a chance de um

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desfecho melhor (HACKE et al, 2008). Portanto, devido ao curto tempo para o tratamento, poucos pacientes recebem esta terapia.

Reduzir o risco de eventos aterotrombóticos futuros, em pacientes com história de AVC isquêmico, tem um papel importante na terapêutica. Devem-se utilizar agentes antiplaquetários, inibidores da 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima-A redutase (estatinas) e anti-hipertensivos, bem como adoção de alterações no estilo de vida (LUTSEP, 2009).

Conforme revisado por Mendez-Otero, numerosos estudos pré-clínicos e clínicos têm sido realizados nas últimas décadas, em busca de um agente neuroprotetor para tratar os pacientes com AVC isquêmico (MENDEZ-OTERO et al, 2007). Neuroproteção é qualquer estratégia ou combinação de estratégias que antagonizam, interrompem ou diminuem a sequência de eventos bioquímicos e moleculares da lesão que, caso não realizados, levariam à injúria isquêmica irreversível (GINSBERG, 2008). Entretanto, nenhuma das drogas testadas, até o momento, embora efetivas em estudos animais, foi eficaz em seres humanos e, portanto, novas estratégias devem ser desenvolvidas para evitar morte neuronal e/ou restauração da função cerebral lesada, após um AVC (MENDEZ-OTERO; de FREITAS; MENDONÇA; ANDRÉ, 2007 e SHUAIB et al, 2007).

2.2 CÉLULAS-TRONCO: 2.2.1 Conceito:

Células-tronco são células autorrenováveis, não-diferenciadas, capazes de produzir grande número de células diferenciadas. A característica que distingue as várias populações de células-tronco é seu potencial para gerar diversos tipos de células especializadas. Em outras palavras, as células-tronco podem ter características totipotenciais, pluripotenciais, bipotenciais ou unipotenciais. O zigoto é um exemplo de células totipotenciais, pois tem capacidade de gerar outro organismo. As células embrionárias (derivadas diretamente da massa celular interna do embrião pré-implantação no estágio de blastocisto) representam a população de células pluripotenciais, porque elas podem gerar todos os tecidos de um organismo, mas não outro organismo (pois não geram a placenta e nem folhetos extraembrionários). Usualmente, as células-tronco pluripotentes são definidas como células que dão origem às três camadas germinativas: ectoderma (pele, tecido neural), mesoderma (sangue, tecido adiposo, cartilagem, osso ou músculo) e endoderma (células do sistema respiratório e digestivo). Células multipotentes são capazes de diferenciar-se em tipos

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celulares múltiplos, mas dentro de certa linhagem (Ex: células-tronco hematopoiéticas, diferenciando-se em hemácias, leucócitos e plaquetas), ou seja, com potencial mais limitado (exemplo: sangue do cordão umbilical). O mioblasto representa um precursor de uma célula unipotente. Ele é capaz de gerar somente um tipo celular (FILIP et al, 2008).

Células-tronco que têm pluripotência similar ou igual às células-tronco embrionárias também podem ser derivadas de células germinativas, isto é, células germinativas embrionárias, células de carcinoma embrionário (de tumores testiculares adultos) e células de linhagem germinativa derivadas de células-tronco espermatogoniais ou de células de superfície de ovários adultos. As células-tronco persistem na vida adulta, mas o dogma tem sido se estas células-tronco adultas são mais restritas em sua capacidade de diferenciar e, também, se são somáticas ou órgão-específicas (BELLEHSEN; NAGLER; LEVI-SCHAFFER, 2008).

As células-tronco adultas multipotentes (células indiferenciadas) residem com células diferenciadas nos seus tecidos de origem, com nomenclatura correlacionada. As células progenitoras e as células-tronco adultas têm um papel reparativo, repondo as células e mantendo ciclo normal dos órgãos regenerativos, como o sangue, pele ou tecido intestinal (FARIN et al, 2009). As células do estroma mesenquimal adulto são células multipotentes e indiferenciadas, as quais residem, primariamente, na medula óssea e têm potencial de diferenciar-se em múltiplos fenótipos esqueléticos, como osteoblastos, condrócitos, adipócitos, células do estroma, fibroblastos e, possivelmente, tendões. No corpo humano, elas podem ser vistas como reservatórios disponíveis de células reparadoras, capazes de mobilizar-se, proliferar-se e diferenciar-se ao tipo celular apropriado em resposta a sinais específicos (CAPLAN, 2007).

Um nicho de células-tronco pode ser definido como um sítio específico ou reservatório definido, composto não somente de células de suporte, mas também de glicoproteínas da matriz organizadas em uma matriz funcional tridimensional. O contato entre esses elementos permite interações moleculares e sinalizadoras que são cruciais para a regulação da quiescência das células-tronco, autorrenovação, diferenciação e proliferação, bem como fatores que influenciam a mobilização e homing da progenitora. A regulação da autorrenovação e diferenciação das células-tronco adultas é crucial para a manutenção da homeostase tecidual. Portanto, a estrutura do nicho não somente providencia um ambiente propício à célula-tronco, mas também determina o estado apropriado regulado por mecanismos intrínsecos e moleculares (MORRISON; SPRADLING, 2008). Células-tronco adultas e seus nichos têm sido identificados em diferentes tipos de tecidos em mamíferos,

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incluindo o sistema hematopoiético, sistema epitelial, sistema intestinal e sistema nervoso (LI; XIE, 2005).

Em estado de repouso, a grande maioria das células-tronco hematopoiéticas (CTH) é quiescente, com somente uma fração dessas células entrando em um estado cíclico para proliferar e dar origem às “células-filhas”, que ir-se-ão proliferar e diferenciar como progenitoras de linhagens de células sanguíneas maduras. Tem sido estimado que bilhões de células sanguíneas sejam produzidas, a cada hora, em um organismo humano adulto saudável, durante a vida e, na maioria das circunstâncias, essa enorme produção é balanceada por perda celular programada, mantendo o número de células circulantes relativamente constante. Entretanto, quando ocorre estresse sistêmico como infecção, sangramento agudo ou quimioterapia, as CTH são recrutadas a responder com proliferação extensa, para manter progenitores suficientes, suprindo a necessidade das células sanguíneas (BRYDER; ROSSI; WEISSMAN, 2006).

2.2.2 Aplicações:

Transplante de CTH refere-se a qualquer procedimento onde células hematopoiéticas serão fornecidas para um receptor, com a intenção de repovoar ou substituir o sistema existente, em parte ou no total. Tradicionalmente, o transplante de CTH é realizado após um regime de alta dose de quimioterapia, com ou sem irradiação, para ablação da medula óssea e das células tumorais. Células-tronco colhidas são, então, transfundidas para repovoar a medula e restaurar a competência hematológica e imunológica. O transplante de CTH repõe o termo antigo utilizado “transplante de medula óssea” para indicar a gama de fontes de células doadoras disponíveis: medula óssea, células-tronco periféricas e sangue do cordão umbilical. As células-tronco podem ter origem no próprio paciente (autólogas), num gêmeo idêntico – singênica - ou em um doador – halogênica (JAGANNATHAN et al, 2008).

O uso de terapias imunes e celulares para tratar doenças hematológicas vem sendo estabelecido. Nos últimos 50 anos, o transplante de células hematopoiéticas desenvolveu-se em terapia curativa para uma variedade de estados de falência da medula óssea, malignidades hematológicas, imunodeficiências e erros inatos do metabolismo. Observação do efeito tumor contra enxerto vem providenciando fundamento para o tratamento de malignidades hematológicas com infusão de leucócitos do doador que exploram a resposta halogênica dos linfócitos T do doador, e experimentos com infusão de outras populações celulares efetoras halogênicas como as células natural killer (NK). Durante esta era, investigadores têm feito

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acentuado progresso para doadores alternativos para transplante e medidas para prevenir e tratar doença enxerto contra hospedeiro e infecções (McGLAVE, 2008).

As CTH possuem propriedades únicas que têm permitido, no contexto do transplante de medula óssea, ser o único tipo de célula-tronco no uso clínico rotineiro. Primeiro: embora a maioria das CTH normalmente residam no espaço extravascular na medula óssea, também possuem incrível habilidade de retornar a seus nichos após injeção na circulação venosa. Esta habilidade de recircular parece estar ligada às propriedades naturais das CTH, pois elas migram entre a medula óssea, o sangue, a linfa e órgãos extramedulares em condições fisiológicas. Portanto, as CTH podem ser injetadas endovenosamente ao invés de diretamente na medula do recipiente, tornando seu uso clínico relativamente fácil. Segundo: aumentando a propriedade circulatória das CTH usando agentes farmacológicos como fator estimulador das colônias de granulócitos (sigla em inglês, GCSF) pode-se obter, rotineiramente, CTH do sangue periférico de doadores saudáveis ao invés de obtê-las da medula óssea (procedimento mais invasivo). Finalmente, CTH expressam uma combinação única de marcadores de superfície celular que permitem sua purificação (BHATTACHARYA; EHRLICH; WEISSMAN, 2008).

Um grande número de barreiras clínicas, entretanto, permanece, dificultando o uso rotineiro do transplante de medula óssea para o tratamento das doenças hematológicas, como toxicidade do regime usual pré-transplante autólogo de CTH e complicações da doença enxerto contra hospedeiro (HAROUSSEAU, 2007).

Indicações estabelecidas (JAGANNATHAN et al, 2008): - Doenças malignas:

a) Mieloma Múltiplo; b) Linfoma não – Hodgkin; c) Linfoma de Hodgkin; d) Leucemia Mielóide Aguda; e) Síndrome Mielodisplásica; f) Leucemia Linfoblástica Aguda; g) Leucemia Mielóide Crônica; h) Leucemia Linfocítica Crônica;

i) Neuroblastoma, tumores de células germinativas e outras malignidades sólidas. - Doenças não-malignas:

(A) Talassemia; (B) Anemia falciforme

(25)

(C) Anemia aplástica

(D) Algumas desordens genéticas e imunológicas.

2.2.3 Estudos experimentais/ clínicos:

O uso de populações de células progenitoras e de células-tronco diferentes de CTH para reparar tecidos de origem, bem como outros tecidos, está em intensa fase de investigação.

2.2.3.1 Células-tronco na cardiologia: a ideia de reparar o tecido cardíaco usando diferentes

tipos de células-tronco tem levado a diferentes estudos experimentais. Esforços são feitos para restaurar a função do coração lesado com transplante de células-tronco não-residentes, como cardiomiócitos fetais, células-tronco embrionárias, células musculares esqueléticas, CTM derivadas da medula óssea ou células-tronco derivadas do tecido adiposo (LAFLAMME; MURRY, 2005). Diferentemente das células-tronco embrionárias, não há evidência convincente que células de tecidos pós-natal outros que não o coração, possam gerar cardiomiócitos funcionais in vivo. Estudos clínicos têm sugerido que somente 1,3 a 2,6% das células-tronco derivadas da medula óssea ficam retidas no coração. Benefícios funcionais também podem ser mediados através da secreção parácrina de fatores de crescimento ou citocinas, as quais podem, indiretamente, promover a sobrevida dos cardiomiócitos, mobilização de células progenitoras endógenas ou neovascularização (ROSENZWEIG, 2006).

2.2.3.2 Células-tronco para reparo muscular e ósseo: a capacidade regenerativa da

musculatura esquelética é atribuída às células-tronco musculares, também conhecidas como células satélite. Atualmente é bem aceito que as CTM constituem uma fonte de progenitores de tecidos derivados do mesoderma, como osso, cartilagem e gordura. Essas CTM multipotentes podem ser isoladas baseadas nas suas propriedades plásticas e de aderência e podem ser expandidas em culturas, de forma relativamente fácil. O reconhecimento de seu potencial terapêutico é um avanço importante na terapia celular: está bem estabelecido seu uso no reparo tecidual ósseo (reparo de defeitos ósseos segmentares de tamanho crítico em animais, restaurar cicatrização de fraturas de ossos longos nos seres humanos ou tratar ossos de crianças com osteogênese imperfeita), pouco se sabendo a respeito das vias de sinalização e determinantes moleculares envolvidos na diferenciação miogênica das CTM (GARCIA-CASTRO et al, 2008).

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2.2.3.3 Células-tronco para doenças da pele: terapias celulares com queratinócitos têm sido

praticadas com sucesso. Reconstituição da barreira epidérmica funcional com regeneração da derme papilar tem sido realizada com camadas epidérmicas autólogas em pacientes com queimaduras de pele, bem como em outras doenças de pele (PROSPER; VERFAILLIE, 2008).

O uso de células-tronco como material básico na engenharia tecidual tem o potencial de melhorar desfechos clínicos tanto em cicatrização de feridas e em terapia genética para doenças cutâneas e sistêmicas. Estudos de engenharia tecidual de pele têm mostrado que células-tronco epidérmicas podem fornecer uma fonte superior de células-tronco multipotentes para engenharia tecidual. Entretanto, avanços na engenharia tecidual de pele são necessários para a aplicação clínica (CHARRUYER; GHADIALLY, 2009).

2.2.3.4 Células-tronco na neurologia: o ponto-chave no tratamento das doenças

neurológicas é que o processo de lesão neuronal é frequentemente irreversível, porque os neurônios do cérebro e da medula espinhal são incapazes de regenerar espontaneamente (EINSTEIN; BEN-HUR, 2008).

Embora tenha sido sugerido que possa haver transdiferenciação das CTM em células de linhagem neural in vitro , nenhum grupo ainda observou que as CTM dão origem a neurônios completamente diferenciados e funcionais. A maioria dos dados atuais indica que fatores bioativos (neurotrofinas e fatores de crescimento), secretados pelas CTM, em resposta ao ambiente local, são os responsáveis pelos efeitos restauradores das CTM (LI; CHOPP, 2009).

a) No traumatismo crânio-encefálico (TCE): modelos experimentais demonstraram que as CTM derivadas de ratos doadores transplantadas no cérebro de roedores, intracerebral (MAHMOOD et al, 2002), intra-arterial (LU et al, 2001a) ou intravenoso (LU et al, 2001b) -com TCE induzido por contusão, melhorou significativamente o desfecho neurológico. Um estudo Fase I, que avaliará a infusão intravenosa de células autólogas, mononucleares, derivadas da medula óssea de crianças após TCE grave, está em andamento (NCT 00254722).

b) Na lesão de medula espinhal: uma das terapias celulares que vem sendo estudada para lesões na medula espinhal é o transplante de células gliais do bulbo olfatório na tentativa de restabelecer conexões através da cicatriz glial. Nesta terapia, o objetivo não é o de substituir neurônios perdidos, mas permitir o crescimento axonal através da cicatriz de glia. (MENDEZ-OTERO et al, 2007). Estudos publicados em traumatismo raqui-medular (TRM)

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têm encontrado efeitos positivos na administração local de células-tronco derivadas da medula óssea, comparado à administração endovenosa (SYKOVA et al, 2006).

c) Na Doença de Parkinson: modelos de parkinsonismo têm sido estudados mais extensivamente do que qualquer outra doença neurológica degenerativa (MEZEY, 2007). Transplante de células-tronco derivadas da medula óssea melhorou a função motora em modelo animal de Doença de Parkinson (LI et al, 2001).

d) Células-tronco em AVC isquêmico: estudos experimentais têm demonstrado que o transplante de CTM facilitam os mecanismos de neuro-restauração endógenos, incluindo redução da apoptose (CHEN et al, 2003a), e promoção do remodelamento glial, neuronal (LI et al, 2005 e SHEN et al, 2007), e vascular (CHEN et al, 2003b), não sendo esses eventos mutuamente exclusivos. Uma revisão recente mostrou que muitos estudos evidenciaram, em modelos animais variados de AVC isquêmico, melhora na recuperação funcional dos animais. Foram utilizadas CTM e/ou células da medula óssea (MEZEY, 2007).

Baseado nesses resultados, Bang e colaboradores examinaram a segurança, exequibilidade e eficácia da terapia celular usando CTM autólogas, expandidas em cultura, em pacientes com AVC isquêmico. Concluíram que, em pacientes com infarto cerebral grave, a infusão endovenosa de CTM autólogas parece ser segura e exequível e pode melhorar a recuperação funcional do paciente (BANG et al, 2005).

Outro estudo clínico, fase I, observou pacientes com AVC isquêmico agudo (entre três e dez dias após o início dos sintomas), realizando infusão intra-arterial (via artéria femoral) de células mononucleares autólogas da medula óssea, com resultados preliminares demonstrando segurança e exequibilidade (de FREITAS et al, 2006).

Dados limitados existem a respeito do uso de células exógenas em pacientes que tiveram AVC isquêmico. A segurança e viabilidade do transplante intracerebral de células neuronais culturadas foi estabelecido em dois estudos utilizando neurônios da Layton Bio Science – LBS (KONDZIOLKA et al, 2000 e 2005). Entretanto, apesar de haver melhora no déficit motor dos pacientes, traduzindo-se em melhora na capacidade de algumas atividades de vida diária, o estudo fase 2 não encontrou evidência de benefício significativo na função motora, que era o objetivo primário do estudo (KONDZIOLKA et al, 2005).

Investigadores de Boston avaliaram a segurança do transplante de células fetais suínas através de cirurgia estereotáxica em cinco pacientes na fase crônica (três meses a dez anos antes) do AVC isquêmico acometendo os gânglios da base (SAVITZ et al, 2005). As células

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foram retiradas da eminência gangliônica lateral, que são derivadas do striatum primitivo. Para evitar rejeição, as células foram tratadas antes do transplante com um fragmento F (ab’)2

contra o Complexo Maior de Histocompatibilidade (sigla em inglês, MHC) classe I sem a região Fragment crystallizable (Fc). Os três primeiros pacientes não apresentaram efeitos colaterais em um acompanhamento de quatro anos. O quarto paciente teve piora progressiva da hemiparesia esquerda. A RM de crânio mostrou captação de contraste no lobo frontal direito. Biópsia desse local mostrou necrose e inflamação sugestivas de infarto e o paciente foi tratado com corticóide com boa reposta. Um comitê de avaliação independente considerou o evento como sendo um infarto por uma oclusão venosa provavelmente secundária à cirurgia. O quinto paciente teve crises convulsivas parciais complexas e generalizadas atribuídas à hiperglicemia. A RM de crânio mostrou captação de contraste no lobo frontal direito e na área de isquemia. Devido a esses efeitos adversos o estudo foi interrompido pelo Food and Drug Administration - FDA (MENDEZ-OTERO et al, 2007).

Muitos ensaios utilizaram fatores tróficos para estudar a diminuição da incapacidade dos pacientes com AVC isquêmico. Dentre eles, predominam os que utilizaram granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). Um estudo randomizado e cego de Shyu e colaboradores (2006) avaliou a segurança e eficácia da administração subcutânea de G-CSF (15µ g/Kg/dia) por cinco dias, iniciando nos sete primeiros dias após o evento isquêmico, em 10 pacientes com AVC no território da artéria cerebral média e com a escala de AVC do Instituto Nacional de saúde americano (sigla em inglês NIHSS) entre 9 e 20. Os sete pacientes que receberam G-CSF tiveram maior percentual de melhora neurológica entre avaliação inicial e 12 meses do que os três pacientes do grupo controle (p. ex. 59% vs. 36% de melhora no NIHSS, p < 0,05). Foram utilizadas quatro escalas nesta avaliação: NIHSS, Escala de AVC Européia (sigla em inglês, ESS), Subescala Motora da ESS (sigla em inglês, EMS) e Índice de Barthel (sigla em inglês, BI). Além disso, exame de tomografia por emissão de pósitrons (sigla em inglês, PET) com fluordeoxiglicose mostrou melhora do metabolismo cerebral na área cortical peri-infarto dos pacientes tratados em comparação com os pacientes do grupo controle. De forma interessante, houve correlação entre o metabolismo cerebral avaliado pelo PET e a função motora medida através da escala motora da ESS. Outro dado relevante foi que os pacientes que receberam G-CSF no primeiro dia (D1) pós-AVC parecem ter tido maior recuperação do que os que receberam numa fase mais tardia.

Baseado nos estudos experimentais e clínicos acima, desenhamos um estudo clínico fase I para avaliação da segurança e exequibilidade da infusão de células mononucleares autólogas da medula óssea, em pacientes com AVC isquêmico em território da artéria cerebral

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média, com até 90 dias após o início dos sintomas. Estudamos, também, a cinética destas células através de marcação com radioisótopo, abordagem ainda não feita no campo da neurologia. A evolução, clínica e laboratorial, foi avaliada durante o seguimento do estudo, sendo todos os eventos registrados e descritos.

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3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a segurança e a exequibilidade do transplante autólogo de células mononucleares marcadas da medula óssea em pacientes com AVC isquêmico no território da artéria cerebral média, em até 90 dias após o AVC.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Descrever a cinética das células mononucleares autólogas derivadas da medula óssea marcadas com radiotraçador, duas e 24 horas após infusão na artéria cerebral média.

• Avaliar modificação dos parâmetros clínicos através de escalas de avaliação motora e funcional e medir a variação de parâmetros hematológicos e bioquímicos na corrente sanguínea ao longo do seguimento.

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4 PACIENTES E MÉTODOS

4.1 PACIENTES:

Este é um estudo clínico fase 1, unicêntrico, realizado no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF). O protocolo e o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) foram aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa do HUCFF (CEP 169/03) e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (Protocolo de Pesquisa nº 10385 – CONEP), sob o título “Terapia celular pelo transplante autólogo de células-tronco de medula óssea em pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico”. Também foi registrado no portal www.clinicaltrials.gov (NCT00473057). O TCLE foi obtido de todos os participantes.

Pacientes entre 18 e 75 anos de idade eram elegíveis para o estudo se tivessem as seguintes características:

(1) AVC isquêmico em território da ACM, evidenciado por TC ou por RM, dentro de 90 dias após os sintomas;

(2) recanalização da ACM envolvida, avaliada por estudo de Doppler transcraniano ou por angio-ressonância de crânio;

(3) uma pontuação entre 4 e 17 no NIHSS; (4) Assinatura do TCLE.

Foram excluídos pacientes que preenchessem qualquer dos seguintes critérios: (a) dificuldade em obter acesso vascular para procedimento percutâneo;

(b) estenose de carótida maior que 50% ao estudo de Doppler (ipsilateral ao AVC);

(c) piora neurológica (maior do que 4 pontos no NIHSS) antes da injeção, devido a edema ou hemorragia intracerebral;

(d) trombofilias ou doenças hematológicas primárias; (e) desordens neurodegenerativas;

(f) AVC prévio com Escala modificada de Rankin maior que 2; (g) trombo intracardíaco;

(h) desordens autoimunes;

(i) sepsis (de acordo com critérios definidos pela Sociedade de Terapia Intensiva e Colégio Americano de Médicos Torácicos, de 1992);

(j) história de neoplasia ou outra doença associada que tivesse impacto na sobrevida do paciente a curto prazo;

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(k) qualquer condição que, no julgamento dos investigadores, poderia colocar o paciente sob risco;

(l) desordens ósseas que pudessem aumentar o risco do procedimento de coleta de aspirado da medula óssea;

(m) insuficiência hepática;

(n) insuficiência renal (creatinina sérica maior que 2 mg/mL); (o) instabilidade hemodinâmica ou respiratória;

(p) AVC lacunar; (q) gravidez;

(r) participação em outro ensaio clínico.

4.2 INTERVENÇÃO:

4.2.1 Admissão hospitalar (D0):

Os pacientes foram admitidos na véspera do procedimento, sendo esse considerado o D0 de protocolo. Neste dia, o paciente foi submetido à avaliação clínica e visita pré-anestésica. Foi realizada hidratação venosa com solução salina (1000 mL em infusão contínua, 12 horas antes e 12 horas após o final da intervenção).

O uso prévio de medicações para hipertensão arterial sistêmica e diabetes era suspenso apenas no dia da intervenção, devido ao jejum prolongado (cerca de 10 horas), retornando após a infusão das CMMO.

4.2.2 Aspirado da medula óssea (D1):

Antes do encaminhamento ao centro cirúrgico, foram coletadas amostras de sangue para exames laboratoriais e obtenção de soro autólogo para suspensão das CMMO. No centro cirúrgico, os pacientes foram submetidos à sedação venosa, objetivando Escala de RASS -3 (ELY et al, 2003). As células foram obtidas com o paciente em decúbito ventral, após anestesia local, através de aspirado de medula da crista ilíaca póstero-superior (cerca de 20 aspirações, sendo 10 em cada crista ilíaca), obtendo-se um volume total de 100 mL. Procedimento este, realizado por um hematologista, conforme protocolo utilizado pelo Serviço de Hematologia do HUCFF, baseado em um protocolo Iugoslavo (BATINIC et al, 1990). Após observação na Unidade de Recuperação Pós-Anestésica, o paciente foi encaminhado ao quarto.

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4.2.3 Separação das células:

O material proveniente da aspiração era, então, encaminhado ao Laboratório de Marcação de Células e Moléculas do Serviço de Medicina Nuclear do HUCFF em 20 seringas heparinizadas contendo 5 mL de aspirado de medula óssea (MO) em cada. Após filtração de coágulos, gordura e espículas ósseas, foi iniciada a separação de células por centrifugação (400xg) em gradiente de Ficoll-Hypaque. O anel contendo as CMMO foi diluído em albumina a 5% e soro autólogo em um total de 20 mL, esperando-se uma contagem de 5 – 10 x 107 células (PERIN et al, 2003). Da solução contendo as CMMO, foram retiradas pequenas alíquotas para:

contagem celular;

imunofenotipagem por citometria de fluxo em aparelho BD FACSCanto™ classe 1, realizada no Laboratório de Terapia Celular do Instituto Nacional de Cardiologia de Laranjeiras;

culturas (germes comuns e fungos), encaminhadas ao Laboratório de Bacteriologia do HUCFF;

marcação celular com radioisótopo.

4.2.4 Marcação das CMMO com radioisótopo:

Uma alíquota (10%) da solução final contendo as CMMO foi incubada com 500 µl de cloreto estanoso (SnCl2) em solução fisiológica de cloreto de sódio (NaCl 0,9%) por 10

minutos em temperatura ambiente, conforme técnica desenvolvida no Laboratório de marcação de células e moléculas (LMCM) /UFRJ, para marcação com 99mtecnécio (GUTFILEN et al, 1999). A seguir, as células foram incubadas por mais 10 minutos com 45 mCi de 99mTecnécio. Após centrifugação (500 x g por cinco minutos), o sobrenadante foi removido e lavado novamente com solução salina. A viabilidade das células marcadas foi avaliada pelo teste de exclusão vital com azul de trypan (CARVALHO et al, 2008; CORREA et al, 2007). A eficiência da marcação (%) foi calculada pela atividade no precipitado (pellet) dividida pela soma da radioatividade no precipitado mais o sobrenadante, multiplicado por 100. A viabilidade das células foi superior a 93% em todos os casos. As células marcadas foram agregadas ao restante da suspensão de CMMO, sendo a solução (volume final: 10 mL) transferida para uma seringa e encaminhada à Unidade de Hemodinâmica. O procedimento de separação e marcação das células ocorreu em, aproximadamente, quatro horas. Todos os procedimentos foram realizados em condições estéreis, em capela de fluxo laminar.

(34)

4.2.5 Infusão das células:

Esta solução foi injetada lentamente na artéria cerebral média do próprio paciente (autóloga), ipsilateral ao AVC, através da técnica de Seldinger, via cateter introduzido na artéria femoral, por um único hemodinamicista, especializado em arteriografia cerebral. A técnica utilizada foi a coaxial de rotina, com punção de artéria femoral com cateter guia de diâmetro 6 french (Envoy-Cordis, Miami, Fla ou Guider-Soft tip- Boston Scientific-Target Therapeutics- Fremont, Califórnia), posicionado em nível cervical com infusão contínua de solução salina. Os pacientes foram anticoagulados com heparina endovenosa para obter um tempo de coagulação ativado (TCA) duas a três vezes o nível normal e todo o procedimento foi monitorizado por arteriografia cerebral. Um microcateter de diâmetro interno maior (SL 1018 Boston Scientific – Target Therapeutics, Fremont, California) foi introduzido até a porção M1 da ACM e a infusão foi realizada em, aproximadamente, 10 minutos. Pacientes receberam entre 1,25 x 108 e 5 x 108 CMMO, e o procedimento demorou, em média, uma hora. Anestesia local e sedação leve (Escala de RASS -1), esta procedida por anestesiologista do Serviço de Hemodinâmica, foi realizada durante o procedimento.

4.2.6 Acompanhamento durante internação (D1 a D3):

Os pacientes foram submetidos à cintilografia de corpo inteiro e à tomografia computadorizada com emissão de fóton único (sigla em inglês SPECT) no Serviço de Medicina Nuclear do HUCFF, utilizando câmera Xeleris (General Electric Medical Systems, Milwaukee, Wisconsin), duas e vinte e quatro horas após a infusão das CMMO, para avaliação da localização das mesmas. Imagens de corpo inteiro (anterior e posterior) foram adquiridas por 20 minutos, usando um explorador de duas cabeças de alta resolução e colimador de baixa energia. As imagens planares foram adquiridas por 10 minutos, matriz 256 x 256, incidência anterior, lateral direita e esquerda e posterior. O SPECT foi realizado com dois detectores de rotação opostos com colimadores de alta resolução e baixa energia. O equipamento utilizado para reconstrução da imagem (software e hardware) foi uma estação de trabalho processadora GE-Xeleris, para reconstrução das imagens do SPECT. Projeções foram coletadas em 24 minutos, com cada detector usando rotação de 180° para completar 360° numa órbita circular do crânio do paciente, em decúbito dorsal. Os volumes das imagens foram reconstruídos usando o algoritmo OSEM com alisamento axial e filtro Butterworth com ordem de 5 e ponto de corte 0,45. Volumes de imagens consistiram de 64 x 64 x 64 voxel cada um medindo 4,38 mm³. O detector de distância variou de 14 a 20 cm durante a rotação, resultando em resolução

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espacial completa com full width at half-max (FWHM), de aproximadamente 12 mm. Para cada paciente, a captação no cérebro, fígado, baço, pulmões, bexiga e corporal total foram avaliados após a injeção celular em imagens planares. A percentagem de captação nos hemisférios direito e esquerdo foi quantificada em imagens de SPECT para todos os pacientes.

Avaliação clínica e laboratorial foi realizada após os exames cintilográficos e 48h após a infusão das CMMO, onde os pacientes, estando em condições de alta, eram liberados do hospital. Estas avaliações tinham o objetivo de detectar possíveis complicações imediatas do procedimento. Também foram utilizadas escalas de avaliação motora e funcional: NIHSS, Índice de Barthel (IB) e Escala modificada de Rankin (EmR).O Quadro 1 detalha todo o protocolo de acompanhamento.

4.2.7 Acompanhamento após a alta hospitalar:

As avaliações de seguimento foram realizadas em 7, 30, 60, 90 e 120 dias após a infusão das CMMO, por meio das escalas clínicas supracitadas e de testes laboratoriais de rotina (hemograma completo e bioquímica), os quais eram realizados no laboratório de análises clínicas do HUCFF. Um eletroencefalograma (EEG) foi realizado nos primeiros sete dias após a infusão das CMMO, pelo Serviço de Neurologia do HUCFF.

(36)

Quadro 1. Protocolo de Acompanhamento: este quadro informa todos os exames

laboratoriais realizados, nas respectivas datas de avaliação.

D0 INFUSÃOD

1

ALTA D3 DIA 7 DIA 30 DIA 60 DIA 120

Glicose x x x x x x x Sódio x x x x x x x Uréia x x x x x x x Creatinina x x x x x x x HMG compl. x x x x x x x Plaquetas x x x x x x x EEG -- -- -- x -- -- --EmR x x x x x x x NIHSS x x x x x x x IB x x x x x x x

EEG, eletroencefalograma; EmR, Escala modificada de Rankin; HMG compl., hemograma completo; IB, Índice de Barthel; D0, Dia da internação hospitalar; D1, Dia da infusão celular; D3, 3° dia de infusão celular; D7, 7° dia de infusão celular; D30, 30° dia de infusão celular; D60, 60° dia de infusão celular; D120, 120° dia de infusão celular; NIHSS, National Institute of Health Stroke Scale.

4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram discutidos com Dr. Ronir Raggio Luiz (professor associado de Estatística da UFRJ) e, devido ao reduzido número de pacientes e ao tipo de estudo observacional, foi realizada apenas análise descritiva dos dados.

4.4 MONITORIZAÇÃO DE EFEITOS ADVERSOS

A avaliação quanto à possível relação entre efeitos adversos e a infusão de CMMO foram avaliadas por dois neurologistas não ligados diretamente à avaliação dos pacientes. Qualquer alteração clínica ou laboratorial, ligada ou não ao procedimento, também era comunicada ao Comitê de Ética e Pesquisa, através de relatório.

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5 RESULTADOS:

5.1 CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA:

As características clínicas e radiológicas dos pacientes incluídos estão na Tabela 1, sendo todos do sexo masculino. Dois pacientes estavam em uso de anticoagulante oral, que foi trocado por heparina de baixo peso molecular subcutânea (enoxaparina 1 mg/Kg duas vezes ao dia), uma semana antes do procedimento. Foram incluídos sete pacientes, no período de dezembro de 2006 a maio de 2008.

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Tabela 1: Características gerais dos pacientes: esta tabela informa as características

clínicas e radiológicas dos pacientes antes da infusão das CMMO, bem como a avaliação do NIHSS, IB e EmR no dia da infusão.

Pac 1 Pac 2 Pac 3 Pac 4 Pac 5 Pac 6 Pac 7

Sexo/ Idade M/24 M/ 65 M/ 47 M/ 65 M/ 57 M/47 M/ 60 Fator de risco FOP HAS/ DM/ DLP

HAS FA/ DM HAS HAS HAS/ DM

Sintomas Afasia, Hemipl. Disartria, Hemipl. Afasia, Hemip. Afasia, Hemipl. Disartria, Hemipl. Disartria, Hemipl. Disartria, Hemipl. Local do infarto

Esquerdo Direito Esquerdo Esquerdo Direito Direito Direito

Mecan. do AVC

Cardioem. Aterotr. Durante clip. aneurisma

Cardioem. Aterotr. Aterotr. Aterotr.

Tto agudo

Conserv. Conserv. Conserv. rt-PA IV rt-PA IV rt-PA IV +

IA + craniect.

Craniect.

Transf. Hemorr.

Não Sim Não Sim Não Sim Não

D1: NIHSS/ IB/ EmR (dias após o AVC) 7/ 100/ 2 (67) 9/ 35/ 4 (82) 4/ 95/ 1 (62) 13/ 25/ 5 (72) 9/ 30/ 4 (59) 13/ 10/ 5 (73) 13/ 20/ 5 (89)

Aterotr, Aterotrombótico; Cardioem, Cardioembólico; Clip, clipagem; Conserv, conservador; Craniect, Craniectomia; DLP, dislipidemia; DM, Diabetes Melitus; EmR, Escala modificada de Rankin; FA, Fibrilação atrial; FOP, Forâmen oval patente; HAS, Hipertensão arterial sistêmica; Hemip, hemiparesia; Hemipl, Hemiplegia; Hemorr, Hemorrágica; IA, Intra-arterial; IB, Índice de Barthel; IV, intravenoso; M, Masculino; Mecan, mecanismo; NIHSS, National Institute of Health Stroke Scale; Pac, Paciente; Transf, transformação; Tto, tratamento.

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5.2 SEGURANÇA DO PROCEDIMENTO

Não houve efeitos adversos relacionados ao procedimento, tampouco alteração clínica e laboratorial nos primeiros sete dias do acompanhamento. Os EEG de todos os pacientes demonstravam ritmo difusamente lento nas respectivas áreas isquêmicas. O EEG do paciente 3, além de lentificação, demonstrou surtos de pontas, ondas agudas e ondas irregulares, na projeção temporal esquerda (local da isquemia), mas sem expressão clínica. Apenas o paciente 1 fazia uso regular de fenitoína (100 mg, três vezes ao dia), devido à crise convulsiva no dia do AVC.

Na fase de avaliação pré-internação do paciente 7, observamos diminuição de pulso arterial periférico (dorsal do pé e tibial posterior) e história de claudicação intermitente no membro inferior esquerdo (MIE). A arteriografia cerebral para infusão das CMMO foi realizada, portanto, através da canulização da artéria femoral direita. Durante este procedimento, foi constatado que a ACM direita (envolvida no AVC), estava ocluída. Entretanto, como havia muitos ramos de colaterais, optamos pela infusão das células. O exame prévio realizado (Doppler transcraniano), para averiguação da patência da ACM, não demonstrava oclusão. Não houve alteração clínica nem laboratorial nos primeiros sete dias após o procedimento. Após avaliação por um cirurgião vascular (encaminhado por seu médico clínico), o paciente foi submetido à revascularização do MIE, sob anestesia geral. Apresentou hipotensão arterial durante o ato cirúrgico e piora do déficit motor no pós-operatório. À RM de crânio, foi evidenciado novo evento isquêmico no território da ACM direita.

Os pacientes permaneceram em acompanhamento no Ambulatório de Neurologia do HUCFF após o período de acompanhamento do protocolo. Dois destes (pacientes 5 e 6), apresentaram crise convulsiva tônico-clônica generalizada após, aproximadamente, 200 dias da infusão das CMMO. O paciente 5 foi tratado com fenitoína (100 mg, três vezes ao dia) e o paciente 6, com duas drogas: oxcarbazepina (300 mg, três vezes ao dia) e lamotrigina (100 mg/ dia), pois apresentou alergia à fenitoína e as crises não foram controladas com uma droga anti-epiléptica somente. Apesar das crises convulsivas, não houve alteração nas escalas de avaliação, comparado ao D120 de acompanhamento.

Todos os pacientes foram submetidos a um método de imagem (TC ou RM de crânio) por volta de 180 dias. À exceção do paciente 7, anteriormente descrito, nenhum apresentou novas lesões vasculares (isquêmicas ou hemorrágicas) ou lesões expansivas.

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5.3 CELULARIDADE DO MATERIAL INFUNDIDO

A média da infusão total de células na ACM foi de 3,2 x 108, variando entre 1 x 108 e 5 x 108. O Quadro 2 demonstra a celularidade de cada paciente. Os dados da celularidade do paciente 7 não estão disponíveis até o momento.

Quadro 2: Celularidade do material infundido: este quadro demonstra a celularidade do

material infundido, avaliada através de imunofenotipagem por citometria de fluxo em aparelho BD FACSCanto™ classe 1

Pacientes Infundidas (x108) CMMO (%) CTM (%) CTH (%)

1 _{5,0 x 10}8 66 0,15 1,10 2 1,25 x 108 65 0,27 3,39 3 3,9 x 108 69 0,09 4,68 4 4,0 x 108 73 1,73 2,51 5 _{3,2 x 10}8 73 0,07 0,67 6 _{1,0 x 10}8 58 0,04 2,02 7 4,0 x 108 x x x

CMMO, células mononucleares da medula óssea; CTH, células-tronco hematopoiéticas; CTM, células-tronco mesenquimais.

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5.4 IMAGENS

As imagens de corpo inteiro, obtidas duas horas após a infusão das CMMO marcadas, mostraram captação no cérebro de todos os pacientes. A localização das células pode ser melhor visualizada nas imagens de SPECT do que nas imagens corporais totais. O SPECT do paciente 2 permite pouca visualização das células marcadas porém, à quantificação realizada pelo aparelho de cintilografia, confirmou-se a presença das mesmas em menor quantidade, quando comparada aos outros pacientes. Houve captação distribuída no fígado, baço, pulmões e rins em todos os pacientes. Devido à meia-vida de seis horas do 99mTecnécio, a resolução da imagem diminuiu, de forma importante, 24h após a infusão das CMMO marcadas. Portanto, a captação cerebral só pode ser visualizada no cérebro dos pacientes 1 e 3, enquanto que, em todos, a captação era vista no fígado, pulmões, baço, rins e bexiga. O paciente 7 não possui gravadas as imagens de cintilografia realizadas 24h após a infusão das CMMO.

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5.4.1 Paciente 1

Figura 3: Imagens SPECT 2h após infusão CMMO

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Figura 4: Paciente 1 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO CMMO marcadas com 99m Tecnécio na área isquêmica CMMO marcadas com 99m Tecnécio nos pulmões CMMO marcadas com 99mTecnécio no fígado e baço CMMO marcadas com 99mTecnécio nas vias urinárias

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Figura 5: Paciente 1 - Imagens de corpo inteiro 24h após infusão CMMO

Anterior Posterior

CMMO marcadas com 99mTecnécio nas vias urinárias CMMO marcadas com 99mTecnécio no fígado e baço CMMO marcadas com 99m Tecnécio na área isquêmica

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Figura 7: Paciente 2 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO CMMO marcadas com 99m_{Tecnécio nas} vias urinárias CMMO marcadas com 99m_{Tecnécio no} fígado e baço CMMO marcadas com 99m_{Tecnécio nos} pulmões CMMO marcadas com 99m_{Tecnécio na} área isquêmica Anterior Posterior

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Figura 8: Paciente 2 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO CMMO marcadas com 99m Tecnécio nas vias urinárias CMMO marcadas com 99m_Tecnécio no fígado e baço Anterior Posterior

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Figura 10: Paciente 3 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO CMMO marcadas com 99m Tecnécio nas vias urinárias CMMO marcadas com 99m_{Tecnécio no} fígado e baço CMMO marcadas com 99m_{Tecnécio nos} pulmões CMMO marcadas com 99m_{Tecnécio na} área isquêmica Anterior Posterior

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Figura 11: Paciente 3 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO

CMMO marcadas com 99mTecnécio nas vias urinárias CMMO marcadas com 99mTecnécio no fígado e baço CMMO marcadas com 99mTecnécio na área isquêmica Anterior Posterior

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Figura 12: Paciente 3 - Imagem cerebral 24h após infusão CMMO

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Figura 14: Paciente 4 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO CMMO marcadas com 99m_Tecnécio nas vias urinárias CMMO marcadas com 99m_{Tecnécio no} fígado e baço CMMO marcadas com 99m_Tecnécio nos pulmões CMMO marcadas com 99m_{Tecnécio na} área isquêmica Anterior Posterior