Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Avaliação da função mitocondrial em idosos
institucionalizados com e sem Doença de Alzheimer
-VERSÃO FINAL-
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM GERONTOLOGIA: ATIVIDADE FÍSICA E SAÚDE NO IDOSO
Cecília Gabriel
Orientadoras: Prof. Dra. Maria Paula Gonçalves da Mota Mestre Vanessa Arada de Almeida
II
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Avaliação da função mitocondrial em idosos
institucionalizados com e sem Doença de Alzheimer
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM GERONTOLOGIA: ATIVIDADE FÍSICA E SAÚDE NO IDOSO
Cecília Gabriel
Orientadoras: Prof. Dra. Maria Paula Gonçalves da Mota Mestre Vanessa arda de Almeida
AGRADECIMENTOS
No culminar de mais uma etapa da minha formação profissional e académica é fundamental destacar e agradecer a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a sua realização.
À Professora Doutora Maria Paula Gonçalves da Mota, pela disponibilidade em ser orientadora com seu contínuo entusiasmo, optimismo e encorajamento, mesmo em momentos de desespero. Quero agradecer por toda a partilha e ajuda tanto científica e moral na realização do estudo, sem si nada disto seria possível.
À Mestre Vanessa Arada de Almeida por toda a orientação, ajuda e amizade demonstrada ao longo da realização deste estudo.
Ao Ricardo Micael de Oliveira Cardoso por toda a amizade, paciência e ajuda no decorrer de todo o processo.
À minha família, que sempre me apoiou, devo-lhes tudo e nenhum agradecimento será suficientemente grande para demonstrar a minha gratidão para com eles.
Aos meus amigos Diogo Cardoso e Marta Silva que me ajudaram a manter a sanidade mental durante todo o desespero das várias etapas “dificultadas” no decorrer do processo.
Por último, mas não menos importante, quero agradecer ao Gonçalo Mendes e ao nosso “Kenzo” por serem os meus pilares e a minha força que me impulsiona todos os dias em todas as aventuras.
VI
Resumo
A longevidade dos países desenvolvidos aumentou e com isso a frequência de doenças degenerativas. A doença de Alzheimer (DA) tem uma incidência elevada (60 a 70%) e é caracterizada por uma deterioração progressiva do cérebro associada à acumulação de placas amilóides e emaranhados neurofibrilares (Oddo, 2012). A DA causa deterioração progressiva e irreversível de diversas funções cognitivas, incluindo a memória, atenção, concentração, linguagem, pensamento e comportamento (Queimaduras & Iliffe, 2009). A perda de autonomia do idoso é agravada nos casos de DA, que muitas vezes culmina em institucionalização. Embora o principal fator de risco para a DA seja a idade, o processo distingue-se do envelhecimento normal. Apesar de existirem alterações e manifestações comuns, provavelmente apoiadas por alterações moleculares e celulares semelhantes, no processo de envelhecimento do cérebro do estas são agravadas. A literatura tem atribuído um papel importante ao stress oxidativo e às alterações mitocondriais seja no processo de envelhecimento ou na DA. Assim, este estudo tem como objetivo compreender as mudanças na função mitocondrial associadas ao processo de envelhecimento normal e na DA. A amostra foi composta por 14 indivíduos sem demência (80,5±7,7 anos de idade) e 11 DA (83,2±7,7 anos de idade). Todos os sujeitos eram institucionalizados e o diagnóstico da DA foi confirmado por um médico Neurologista. Após 9 horas de jejum, 10 ml de sangue foram recolhidos por punção venosa em tubos com K3EDTA
e sistema de vácuo e em seguida centrifugou-se para separar o soro, e para obter linfócitos e plasma. A função mitocondrial [respiração em estado 3 e em estado 4, e taxa de controle respiratório (RCR = estado 3 / estado 4)] foram medidos em linfócitos no OROBOROS, de acordo com os procedimentos do equipamento. A peroxidação lipídica foi determinada no plasma pela concentração de produtos de reação ao ácido tiobarbiturico (TBARs) por método espetrofotométrico. O teor de proteína foi determinado pelo método de biureto. Para comparar os valores médios de ambos os grupos, foi utilizado o t-teste para amostras independentes. O nível de significância foi fixado em 0,05. Os resultados obtidos não permitiram encontrar diferenças significativas entre os grupos na respiração mitocôndrias nos estados 3 (1.77±0.67 e 1.80 ±1.07 nmolO2/min/10 6 para normal e DA, respetivamente) e 4 (0.56±0.33 e 1,55 ±0.77
nmolO2/min/10 6 para indivíduos normais e DA, respetivamente). Foram encontradas alterações
significativas entre os grupos na RCR (3.76±1.54 e 2.33±1.36 para o normal e DA, respetivamente) (t = 2,553; p = 0,017) e na concentração de TBARs no plasma (15.796±4.098 e 11.169±4.459 nmol/mg de proteína para os idosos sem demência e DA, respetivamente ) (t =
2,230; p = 0,041). Estes resultados revelaram que, comparativamente com DA, os indivíduos sem demência evidenciam mitocôndrias mais "saudáveis", uma vez que apresentam alta taxa de controle respiratório (RCR). No entanto, a quantidade de danos por stress oxidativo (TBARS) foi maior nos idosos sem demência, possivelmente devido à influência de outras variáveis que não foram consideradas (medicação, dieta e atividade física diária).
VIII
Abstract
The longevity of the developed countries has increased and with it the frequency of degenerative diseases. Alzheimer's disease (AD) has a high incidence (60 to 70%) and is characterized by a progressive deterioration of the brain associated with the accumulation of amyloid plaques and neurofibrillary tangles (Oddo, 2012). AD causes progressive and irreversible deterioration of various cognitive functions, including memory, attention, concentration, language, thinking and behaviour (Burns & Iliffe, 2009). The loss of autonomy of the elderly is aggravated in the cases of AD, which often culminates in institutionalization. While the major risk factor for AD is age, the process is distinguished from normal aging. Although there are common changes and manifestations, probably supported by similar molecular and cellular changes, in AD brain aging process is aggravated. Literature have attributed an important role to oxidative stress and mitochondrial alterations either in the aging process or the AD. Thus, this study aims to understand the changes associated with normal aging process in mitochondria function and to identify some of the key differences in individuals with AD. MethodsThe sample was composed by 14 normal old subjects (80.5 7.7 years) and 11 AD (83.2 7.7 years) participated in this study. All the subjects were institutionalized and the diagnose of AD was in charge of a clinical Neurologist. After 9 hours of fasting condition, 10ml of of blood were collected by venous puncture into the vacuum K3EDTA tubes and then centrifuged to separate serum, and to obtain lymphocytes. Mitochondria function [respiration in state 3 and state 4, and respiratory control ratio (RCR=state 3/state 4)] were measured in lymphocytes cells in OROBOROS, according to the equipment procedures. Malondialdehyde Lipid peroxidation (Thiobarbituric reaction products, TBARs) was assayed in plasma samples by spectrophotometic method. Protein content was determined by Biureto method. To compare average values of both groups, a t-test for independent samples was used. Significance level was set a 0.05. The obtained results failed to found significant differences between groups in mitochondria respiration in states 3
(1.77 0.67 and 1.80 1.07 nmolO2/min/10 6 for normal and AD, respectively) and 4 (0.56 0.33 and 1.55 0.77 nmolO2/min/10 6 for normal and AD subjects,
respectively). Significant changes between groups were found in RCR (3.76 1.54 and 2.33 1.36 for normal and AD, respectively) (t=2.553; p=0.017) and in plasma TBARS (15.796 4.098 and 11.169 4.459 nmol/mg of protein for normal and AD, respectively) (t=2.230; p=0.041). These results revealed that comparatively with AD, normal aged subjects evidence “healthy” mitochondria once they show high respiratory control (RCR). Nevertheless, the amount of oxidative stress damage (MDA) was higher in normal old subjects, possibly due to the influence of other unconsidered variables (medication, diet and daily physical activity).
X
Ìndice Geral
Resumo ... VI Abstract ... VIII Índice de Figuras e Tabelas ... XI Lista de Abreviaturas ... XII
Introdução ... 13
1. Revisão de Literatura ... 15
1.1. O envelhecimento e a Doença de Alzheimer ... 15
1.2 Diagnóstico da Doença de Alzheimer ... 19
1.3 Histopatologia da DA ... 21 1.4 As Mitocôndrias no envelhecimento e na DA ... 23 1.5. Fatores de risco DA ... 31 2. Metedologia ... 35 2.1. Amostra ... 35 2.2 Instrumentos e procedimentos ... 35 2.2.1 Parâmetros Sociais ... 35 2.2.2. Parâmetros Bioquímicos ... 35 2.3. Análise estatística ... 37 3. Resultados ... 39 4. Discussão ... 41 5. Conclusão ... 45 Referências Bibliográficas ... I Anexos ... VI Abstract aceite para apresentação em congresso ... VI
Índice de Figuras e Tabelas
Figura 1 - Fatores patogénicos da mitocôndria
Tabela 1- Funções mitocondriais afetadas através de modelos biológicos
Tabela 2- Valores médios (𝑥̅) e respetivos desvios padrão (DP) da idade (anos), respiração mitocondrial em estádio 3 e em estádio 4 (....), taxa de controlo respiratório (respiratory control
ratio, RCR) em linfócitos e concentração plasmática de TBARs (nmol/mg proteína) de
XII
Lista de Abreviaturas
INE- Instituto Nacional de Estatística OMS- Organização Mundial de Saúde DA- Doença de Alzheimer
NIA- National Institute of Aging
ERO´s- Espécies Reativas ao Oxigénio
DCNT’s- Doenças Crónicas Não Transmissíveis DGS- Direção Geral de Saúde
Aβ- Beta amiloide
ATP- Adenosina trifosfato
ADP- Adenosina difosfato
SNC- Sistema Nervoso Central DP- Doença de Parkinson
MPTP- 1-metil-4fenil-1,2,3,6- tetraidropiridina ADN- ácido desoxirribonucleico
ETC- Cadeia de transporte de electrões
NADH- Dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzido
FADH2- dinucleótido de flavina e adenina
MtDNA- DNA mitocondrial NMDA- n-metil-d-aspartato
IMC- Índice de Massa Corporal
EURODERM- European Community Concerted Action on Epidemiology and Prevention of Dementia
MMSE- Mini Mental State Examination
AVD- Atividade de vida diária PBS- Tampão fosfato-salino
BSA- albumina de soro bovino
Introdução
O índice de envelhecimento (relação entre a população idosa e a população jovem) tem vindo a registar um aumento acelerado em Portugal. As alterações ocorridas nos últimos vinte anos, originadas pelo aumento da esperança média de vida e pela diminuição da taxa de natalidade, produziram mudanças significativas no contexto social. Os dados divulgados pelo INE (2002) indicam que a população idosa ultrapassa já em número a população jovem. Deste modo, o estudo do processo de envelhecimento é importante e é, atualmente, indiscutível a sua relevância na investigação científica (INE, 2014).
A Organização Mundial de Saúde (OMS), classifica os idosos como um grupo específico de indivíduos com idade igual ou superior a 65 anos. Este grupo, tem vindo a assumir cada vez maior relevância estatística social, na nossa sociedade, despertando um maior interesse pelos cientistas que procuram formas de minimizar os efeitos adversos da perda de funcionalidade com a idade e aumentar a longevidade (Centro de estudos dos povos e culturas de expressão portuguesa, 2012).
A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença degenerativa do cérebro é a causa mais comum de demência (Boyle et al., 2012). A demência é caracterizada por um declínio na memória, linguagem, capacidade de resolução de problemas e outras habilidades cognitivas que afetam a capacidade de realizar atividades quotidianas (Wilson et al., 2009). Este declínio ocorre porque as células nervosas, neurónios de certas zonas do cérebro envolvidas na função cognitiva foram danificadas e já não funcionam normalmente. Na DA, a lesão neuronal, afeta regiões do cérebro que permitem levar a cabo as funções corporais básicas, como caminhar ou a deglutição. Em estágios finais, a pessoa com esta doença é totalmente dependente, acamada e requerem cuidados constantes até á morte (Wilson et al., 2009).
A DA foi identificada pela primeira vez há mais de 100 anos (Alzheimer, Forstl, & Levy, 1991), mas 70 anos passaram antes que tenha sido reconhecida como a causa mais comum de demência (Katzman, 1976). Embora a investigação já conhecida tenha revelado muito sobre a DA, muito ainda está para ser descoberto sobre as mudanças biológicas precisas que causam a DA, o porquê da progressão ser mais rápida em alguns
14 casos e ser mais lenta noutros, como é que a doença pode ser prevenida, reduzida ou interrompida.
Os investigadores acreditam que a deteção precoce será a chave para prevenir, retardar e parar a DA (Morris et al., 2012). Nos últimos 10 anos houve um aumento do número de trabalhos científicos sobre a sua deteção precoce (Caramelli, 2011). Em 2011, o Instituto Americano do Envelhecimento (NIA) e a Associação Alzheimer propuseram critérios e diretrizes para o diagnóstico da DA (Sperling, Karlawish, & Johnson, 2013). De acordo com os critérios propostos, a doença começa antes que os sintomas se manifestem, como o aparecimento da perda de memória, enquanto que os critérios anteriormente apresentados exigiam perda de memória e um declínio nas habilidades do pensamento para o diagnóstico poder ser realizado (Guy M. McKhann, 2011).
Apesar de serem já conhecidos diversos fatores de risco associados ao desenvolvimento da DA (Azad, Al Bugami, & Loy-English, 2007; J. H. Chen, Lin, & Chen, 2009), ainda não existe relação causa efeito entre as mesmas. De um modo geral, os fatores relacionados com o estilo de vida que estão associados à disfunção mitocondrial são os mesmo que estão associados à DA, desta forma, a disfunção mitocondrial parece ter impacto sobre a génese de diversas doenças neurodegenerativas, como a DA. Miró (1999) afirma que a disfunção mitocondrial é provocada sobretudo por fatores de risco externos envolvendo o estilo de vida da pessoa. O estilo de vida predispõe ao desenvolvimento de vários fatores de risco para a saúde, alguns diretamente relacionados na literatura com a DA (de Oliveira, 2012; Matsudo, 2009; Menezes Figueiredo, 2007).
Assim, é importante verificar se a perda de função das mitocôndrias com o processo de envelhecimento se distingue daquela que deverá ocorrer nos DA. Neste sentido, o objetivo deste estudo é verificar se existem diferenças na função mitocondrial de idosos institucionalizados com e sem DA, através da análise de parâmetros da respiração da mitocondrial.
1. Revisão de Literatura
1.1. O envelhecimento e a Doença de Alzheimer
A distribuição etária da população mundial está a passar por uma profunda transformação, uma vez que a taxa de mortalidade e a taxa de fertilidade caíram abruptamente nos últimos anos, levando a que a distribuição etária mude gradualmente para idades mais avançadas em que todas as regiões do mundo estão a experienciar estas mudanças (Fried, 2000).
O aumento da esperança média de vida e a redução da duração da fertilidade são os principais fatores desta transição demográfica. A nível global, a esperança média de vida passou de 47 anos em 1950-1955 para 65 anos em 2000-2005 e é esperado atingir os 75 anos em 2045-2050. No período de 1950-1955 a taxa de fertilidade total caiu de 5,0 para 2,6 filhos por mulher e é esperado que esta tendência de queda se mantenha, diminuindo até atingir 2,0 filhos por mulher em 2045-2050 (Nations, 2007).
Paralelamente á transição demográfica, observam-se mudanças nos padrões de morbilidade e mortalidade, as doenças cardiovasculares e neuropsiquiátricas passam a ocupar lugar de grande destaque tornando-se rapidamente um problema de saúde pública, particularmente as demências (Teixeira, Souza Junior, Higa, & Theme Filha, 2015) Neste sentido, a identificação de indivíduos com potencias fatores de risco de desenvolver esta doença, torna-se muito importante, tanto para medidas de prevenção como de tratamento precoce (Charchat, 2007).
Com efeito, as mudanças que constituem e influenciam o envelhecimento são complexas, a nível biológico o envelhecimento é associado á acumulação de uma grande variedade de danos celulares e moleculares. Com o tempo, esse dano leva a uma perda gradual das reservas fisiológicas, ao aumento do risco de contrair diversas doenças em declínio geral na capacidade intrínseca do individuo. Em última instância, resulta a morte. Porém, essas mudanças não são lineares ou consistentes e estão apenas vagamente associadas á idade de uma pessoa em anos (Organização Mundial De Saúde 2015).
Ao envelhecer, as alterações fisiológicas ocorrem naturalmente em todos os órgãos e sistemas (Boss & Seegmiller, 1981). Existem dois tipos de envelhecimento: o biológico e o estocástico, o primeiro envolve mudanças biológicas inevitáveis e
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1.1. O envelhecimento e a Doença de Alzheimer
universais, o segundo para além de compreender as alterações biológicas refere o aumento da incidência das doenças crónicas não transmissíveis (DCNT's), estas, propiciam a acumulação de danos ao longo da vida como por exemplo uma dieta desequilibrada, o tabagismo, obesidade e o sedentarismo. A eficiência metabólica fica comprometida na adoção de um estilo de vida inapropriado, o que contribui para a quebra da homeostasia corporal (produção de energia, biossíntese de esteroides, apoptose, etc) (Melov, 2004; Troen, 2003) Esta homeostasia é afetada pela perda progressiva da função mitocondrial (Atamna, 2007).
As DCNT's constituem uma das principais causas de morte a nível mundial, em que 35% dos óbitos registados em 2005 provêm de DCNT's. A OMS prevê que em 2020 esta percentagem possa atingir os 73% de óbitos devido as DCNT's.
A Assembleia Geral da Nações Unidas, na sua 66ª sessão de 19 e 20 de Setembro de 2011, debruçou-se sobre questões de saúde relacionadas com as DCNT's, e, adotou uma declaração política para a prevenção e controlo, em que, no item 18, se reconhece especificamente que as doenças neurodegenerativas, incluindo a DA, constituem uma importante causa de morbilidade, ou seja, cerca de 10% da população com idade superior a 65 anos tem DA (Moreira et al, 2006). Swerdlow et al (2010), afirma que a incidência de DA aumenta com o avançar da idade.
A Alzheimer Portugal em 2015 definiu que DA é uma das doenças neurodegenerativas mais comuns que afetam com mais agressividade o ser humano de um ponto de vista bio-psico-social em todo o mundo (Marroquín, 2002). A direção Geral de Saúde estima que em Portugal existam cerca de 182.000 pessoas com demência, das quais 130.000 representam a DA. A DA passa assim, a estar incluída em programas de promoção de saúde a nível mundial, um dos maiores desafios do século XXI, dado que inclusivamente as DCNT's constituem uma ameaça ás economias de muitos estados membros, podendo levar a crescentes desigualdades entre países e populações.
Alois Alzheimer publicou em 1898 o seu primeiro artigo relativo a pacientes com sinais de demência e senilidade. No entanto, apenas em 1901 se descobriu um caso particular de demência severa, este foi um marco na história da DA salientando sintomas como perda de memória, mesmo em eventos recentes, desorientação, diminuição da capacidade comunicativa e incapacidade de julgar diferentes situações (R. Santos, Correia, S., Wang, X., Perry, J., Smith, M., Moreira, P., Zhu, X., 2010). A Era moderna
1.1. O envelhecimento e a Doença de Alzheimer
da descoberta molecular da DA teve inicio em meados 1980 com o isolamento e caracterização da proteína Beta Amiloide (Aβ) criada apenas em condições anormais, mas no início da década de 90 foi descoberto que todas as células segregam esta proteína (Moreira, Santos, & Oliveira, 2007).
Apesar da etiologia da DA ser bastante desconhecida, este facto tem vindo a ser alterado pela constante procura de respostas pela comunidade científica. A manifestação da DA pode advir de dois tipos distintos desta doença: associada á idade ou seja a esporádica/início tardio e um tipo familiar de início precoce com origem genética envolvendo mutações na proteína percursora Aβ (Maslow & Mezey, 2008) . A proteína Aβ e a proteína Tau são biomarcadores mais estudados desta doença, particularmente se esta for de origem genética (R. Santos, Correia, S., Wang, X., Perry, J., Smith, M., Moreira, P., Zhu, X., 2010). As mesmas causas não podem ser associadas quando falamos de DA esporádica ou de início tardio, com as mitocôndrias a assumirem um papel central, uma vez que estes organelos são conhecidos por perderem eficiência e tornarem-se progressivamente disfuncionais com o avançar da idade, que também está correlacionado com a produção de ERO's (Maslow & Mezey, 2008).
A DA é caracterizada por um declínio progressivo das funções cognitiva (Albert et al., 2011). Consequentemente leva muitas vezes a alterações do comportamento, da personalidade e da capacidade funcional (Kapczinski, 2004) .São conhecidas três fases durante a progressão da DA leve, moderada e severa(R. Swerdlow, Burns, J., Khan, S., 2010). Aquando leve, evidencia-se perdas de memória episódicas e dificuldades no armazenamento e processamento de novas informações, evoluindo gradualmente na degradação do juízo próprio, no cálculo, no raciocínio e nas habilidades visuo-espaciais. Quando o indivíduo se encontra num estado moderado da doença pode ocorrer apraxia ou disfasia, tendo dificuldades em escolher palavras adequadas ao discurso. Ao apresentar uma fase mais severa da doença, o indivíduo vivencia alterações no ciclo de vigília/sono, alterações comportamentais (agressividade, confusão, irritabilidade, delírios e alucinações) e ainda a incapacidade de realizar atividades básicas como a higiene pessoal ou a deglutição (Barnes & Flier, 2015; Freitas, 2006).
1.2 Diagnóstico da Doença de Alzheimer
A DA caracteriza-se por ter um diagnóstico clínico patológico combinado, que apenas é definido quando o paciente satisfaz os critérios clínicos e apresenta, numa biópsia cerebral ou necrópsia alterações histopatológicas próprias da DA (placas senis e emaranhados neurofibrilares) (Kapczinski, 2004).
Quando se comprova que duas ou mais funções cognitivas estão afetadas, a verificação de outros sintomas permitem avaliar o nível de progressão da DA e, dependendo do estado de progressão, pode verificar-se a perda neuronal no hipocampo e no neocortex (Young, 2010).
Para um diagnóstico da DA é necessária a avaliação por especialistas de várias condições como o estado da memória do paciente, bem como, a linguagem, a atenção, a capacidade cognitiva e social (Nitrini, 2005).
O diagnóstico da DA surge lentamente e sequencialmente como se se desenvolve- se de acordo com um plano programado que se divide em seis fases: a fase 1 é caracterizada pela redução β-amilóide no fluido cérebro-espinhal; a fase 2 é caracterizada pelo aumento da proteína tau no fluido cefalorraquidiano e deposição de proteina Aβ no cérebro, detetado através da análise de uma TAC (Tomografia Axial Computorizada);a fase 3 é caracterizada pela diminuição do metabolismo cerebral; a fase 4 é caracterizada pelo comprometimento cognitivo e pela redução da massa cerebral, detetado por uma ressonância magnética; a fase 5 é caracterizada pela redução massiva de massa cerebral e comprometimento cognitivo agravado e; a fase 6 (estádio terminal) requer acompanhamento especializado constante do paciente (Isaiev, 2015).
1.3 Histopatologia da DA
A Era moderna da descoberta molecular da DA teve início em meados 1980 com o isolamento e caracterização da proteína Aβ criada apenas em condições anormais, mas no inicio da década de 90 foi descoberto que todas as células segregam esta proteína (Moreira et al., 2007). Apesar da etiologia da DA ser bastante desconhecida, este facto tem vindo a ser alterado pela constante procura de respostas pela comunidade científica. A manifestação da DA pode advir de dois tipos distintos desta doença: associada à idade, ou seja, do tipo esporádico (inicio tardio) e do tipo familiar, de inicio precoce, com origem genética envolvendo mutações na proteína percursora Aβ (Maslow & Mezey, 2008).A proteína Aβ e a proteína Tau são os biomarcadores mais estudados desta doença, particularmente se esta for de origem genética (R. Santos, Correia, S., Wang, X., Perry, J., Smith, M., Moreira, P., Zhu, X., 2010). As mesmas causas não podem ser associadas quando falamos de DA esporádica ou de início tardio. Neste tipo de DA, as mitocôndrias têm vindo a assumirem um papel importante, uma vez que estes organelos são conhecidos por perderem eficiência e tornarem-se progressivamente disfuncionais com o avançar da idade, que também está associado à diminuição da capacidade bioenergética e aumento da produção de ERO (Maslow & Mezey, 2008).
Os principais aspetos histopatológicos da DA são a perda neuronal maciça, a deposição de placas senis e emaranhamentos neurofibrilares compostos por proteína tau hiperfosforilada intracelular (Maslow & Mezey, 2008). Indivíduos com Da apresentam alterações nos níveis de insulina, massa muscular, densidade óssea e consumo máximo de oxigénio, estas alterações metabólicas correlacionam-se com a atrofia cerebral e com a performance cognitiva (R. Swerdlow, Burns, J., Khan, S., 2010), isto correlaciona-se por sua vez aos fatores de risco associados á doença uma vez que quanto menor os níveis de atividade física (acamados/incapacitados) maior será o nível de sedentarismo da pessoa e menor atividade metabólica da mesma (Boveris & Navarro, 2008; Matsudo, 2009; Riviere, 2001).
Apesar do cérebro apenas representar cerca de 2% do peso corporal, este recebe cerca de 15% do débito cardíaco e consome 20% do oxigénio consumido pelo organismo humano (Moreira et al., 2007). Toda esta necessidade energética provém das ligações neuronais para manter o gradiente de iões ao longo da membrana plasmática que é essencial para a formação de potencial de ação (Melov, 2004). Esta necessidade é
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1.3. A Histopatologia da DA
constante, mesmo por um período de tempo pequeno sem oxigénio ou glicose pode levar a morte cerebral (Moreira et al., 2006).
Em 2009, Reddy conclui um estudo evidenciando que os danos mitocondriais e patologias sinápticas fazem parte da progressão da DA (Reddy, 2009). Sewrdlow e Khan (2004) propuseram a teoria da cascata mitocondrial sugerindo que a forma esporádica da DA não tenha como causa a acumulação Aβ, mas sim, pelas consequências do declínio na função mitocondrial que aparecem no decorrer do envelhecimento (R. H. Swerdlow & Khan, 2004). De acordo com esta hipótese, a disfunção mitocondrial seria o primeiro sintoma na DA esporádica, que, consequentemente, impulsiona a manifestação da patologia com outros sintomas (R. H. Swerdlow & Khan, 2004).
A dinâmica da mitocondrial pode ser afetada por alterações do estado bioenergético em resposta a questões fisiológicas ou a alterações ambientais. Cérebros com DA mostram alterações estruturais na morfologia da mitocôndria como por exemplo a redução do seu número, o aumento do seu tamanho e cristas da membrana interna partidas (Moreira et al., 2007).
1.4 As Mitocôndrias no envelhecimento e na DA
As mitocôndrias são organelos celulares bem distintos, delimitados por duas membranas. Estes organelos citoplasmáticos contêm genoma próprio, que codifica algumas das proteínas e componentes do seu sistema de síntese proteica (Azevedo et al., 2005). A mitocôndria possui uma variedade de funções incluindo a produção de ATP e controlo de eficiência energética, homeostase do cálcio, formação de radicais livres (ERO's) e sinalização apoptótica (Moreira et al., 2007; Ozawa, 1998b) . As mitocôndrias produzem mais de 90% da energia das células. Esta produção bioenergética assume a sua máxima importância no cérebro, uma vez que os neurónios têm a capacidade glicolítica limitada, fazendo deles altamente dependentes da fosforilação oxidativa aeróbia, para além de que a função neuronal é extremamente exigente ao nível do consumo de energia(R. X. Santos et al., 2010).
As mitocôndrias são crescentemente reconhecidas como organelos subcelulares essenciais para a formação de energia que abastece as células, mas, ao mesmo tempo, elas monitorizam a saúde da célula de modo a tomar uma decisão rápida, se necessário e proceder a uma morte programada (Moreira et al., 2006).
Em células eucarióticas, o processo de obtenção de energia que ocorre na mitocôndria, é muito importante uma vez que proporciona a síntese de muito mais ATP do que o formado pela glicólise (Azevedo et al., 2005).
A função primordial da mitocôndria é a respiração, que, promove a produção de energia. A mitocôndria separa os componentes orgânicos em água e dióxido de carbono para libertar energia na forma de adenosina trifosfato (ATP) (Sergiev et al, 2015). Cada mitocôndria é contida numa dupla membrana, a mais exterior é relativamente permeável para pequenas moléculas pela via de transporte de proteínas conhecidas como purinas. A membrana mais interior forma pequenas dobras, o que aumenta a área da membrana. A respiração mitocondrial gera um gradiente de protões pela membrana interior gerando um potencial transmembranar através dos complexos I-IV da cadeia respiratória permitindo que o fluxo de eletrões a partir da redução de NADH e FADH2 para oxigénio.
Simultaneamente, a energia libertada na oxidação do NADH e FADH2 é usada para
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1.4. As Mitocôndrias no envelhecimento e na DA
exterior e a membrana interior. Assim, o espaço intermembranar está carregado positivamente e matriz negativamente.
Durante a respiração, o oxigénio é reduzido em várias etapas, produzindo, por vezes, um superóxido e um peroxido de hidrogénio, essas moléculas, conhecidas como ERO permanecem ligadas ao citocromo c oxidase até a redução do oxigénio para água seja completa, isto acontece ao nível dos complexos I e III da cadeia respiratória. Os EROS de curta duração são indutores potentes de dano oxidativo em qualquer biomolécula como proteínas e lípidos, particularmente ao nível das mitocôndrias provocam mutações prejudiciais no mtDNA{Giorgio, 2005}
Cinco dos complexos enzimáticos, juntamente com ubiquinona e o citocromo c, constituem a cadeia de transporte de electrões (ETC) (R. Santos, Correia, S., Wang, X., Perry, J., Smith, M., Moreira, P., Zhu, X., 2010). Durante o fluxo de eletrões, através da cadeia respiratória mitocondrial, os complexos respiratórios I, III e IV bombeiam protões em toda a membrana mitocondrial interna para o espaço inter-membranar, gerando energia potencial que conduz a fosforilação de ADP em ATP. A cadeia respiratória permite que grande quantidade de energia libertada pela redução de oxigénio a água ocorra em várias pequenas reações de oxidação/redução, de maneira a que possa ser armazenada em vez de se dissipar em forma de calor (Azevedo et al., 2005).
O transporte de eletrões através dos complexos respiratórios da mitocôndria, é um processo altamente eficiente, no entanto, algum do oxigénio consumido é ainda convertido em iões superóxido, principalmente nos complexos I e III.O fluxo de eletrões ao longo da cadeia de transporte de eletrões na mitocôndria foi evidenciado como a maior fonte de radicais de oxigénio mutagénico (ERO) (Moreira et al., 2007). A produção exacerbada deste superóxido é prejudicial á célula, o ERO contribui para uma grande variedade de processos patológicos. O sistema nervoso central (SNC) é especialmente propenso a danos induzidos por ERO, devido à sua maior disponibilidade de oxigénio e ao consumo de níveis elevados de ácidos gordos polinsaturados, a sua deficiência nas defesas antioxidantes, e elevado teor de metais (R. Santos, Correia, S., Wang, X., Perry, J., Smith, M., Moreira, P., Zhu, X., 2010; R. X. Santos et al., 2010).
Inevitavelmente a quantidade de radicais livres produzidos induz uma sobrecarga á capacidade de neutralização pelo sistema neuronal, assim, ocorre o stress oxidativo, seguindo-se de disfunção mitocondrial e dano neuronal. As espécies recativas geradas
1.4. As Mitocôndrias no envelhecimento e na DA
pela mitocôndria têm alguns alvos específicos na célula incluindo até mesmo os próprios componentes da mitocôndria (Moreira et al., 2007).
A mitocôndria é o organelo responsável por muitos processos essenciais no desenvolvimento e no desempenho normal das funções do organismo, incluindo a regulação intracelular de cálcio, da produção de ATP e na libertação de proteínas (Ozawa, 1998a) .
Este organelo, tem um papel central no envelhecimento, verificando-se disfunções durante este processo (Lin, 2006; Nasseh, 2001). Inúmeros estudos foram conduzidos para perceber o papel da mitocôndria no envelhecimento e no aparecimento de doenças neuro-degenerativas, evidenciando danos ao nível dos Complexos da cadeia respiratória com a perda neuronal (Navarro, 2007).
Na estrutura mitocondrial, mudanças relacionadas com idade têm sido descritas, como por exemplo, a vacuolização, inclusões intramitocondriais, acumulação de glucagénio e perda da matriz. Uma das descobertas mais importantes é a diminuição dos níveis de cardiolipina, que serve como proteína de ancoragem envolvida na permeabilidade da membrana mitocondrial interna e controlando os gradientes. Na figura 1 evidenciam-se as causas e fatores patogénicos da mitocôndria que provocam disfunção mitocondrial tais como a excitotoxicidade do glutamato/aspartato de hiperestimulação através de recetores NMDA
Figura 1- Fatores patogénicos da mitocôndria
Inflamação • IL-1β • IL-6 • TNFα Stress Oxidativo • Oxido e Peroxido nitrico • Peroxido de Hidrogénio • Superoxido • Hidroxilo
Mitocondria
Excitotoxicidade • Glutamato • Aspartato Sistema Ubiquinona defeituoso • Beta - Amiloide • Tau Fosforilação Deficiente • Defeitos enzimáticos • Mutações no DNAmt • Defeitos nos Complexos I-IV26
1.4. As Mitocôndrias no envelhecimento e na DA
(N-metil-D-aspartato) e recetor amino-3-hydroxy-5-methyl-4-ácido isoxazolepropionico ) em desequilíbrio na homeostasia do cálcio (Pfeiffer, 2003). Defeitos na cadeia respiratória alteram a fosforilação oxidativa impactando a síntese de ATP (Mancuso, 2010). A má função do sistema ubiquitina leva ao acúmulo de proteínas anormais, tais como a proteína tau e beta-amilóide. Este desequilíbrio gerado produz espécies reativas de oxigênio e produtos de óxido nítrico. Os mediadores inflamatórios também levam à produção de ERO’s (Violante, 2010). Mutações no DNA mitocondrial advindas deste stress oxidativo afetam a longevidade do ser humano (Violante, 2010).
Análises bioquímicas post-mortem em cérebros com DA evidenciam dano ao nível das enzimas do ciclo de ácido cítrico, piruvato desidrogenase, desidrogenase α- cetoglutarato e isocitrato desidrogenase. Essas mudanças correlacionaram o estado clínico e a função das enzimas podendo estar relacionados com um metabolismo cerebral diminuto (Hroudova et al., 2014). A atividade do citocromo c oxidase foi encontrada reduzida em plaquetas de pacientes com DA (Parker, 1994). Do mesmo modo, esta atividade significativamente diminuída da citocromo c oxidase foi observada no córtex de pacientes com DA (Mutisya, 1994 ). Outro estudo confirmou a diminuição da atividade no hipocampo de pacientes com DA, que sugere a especificidade anatómica (Maurer, 2000).
A perda progressiva da função mitocondrial é conhecida como uma característica comum do envelhecimento dos tecidos vivos, estas funções incluem a produção de energia, biossíntese de esteroides, a montagem grupos heme, biossíntese de pirimidina e na apoptose entre outras (Atamna, 2007; Melov, 2004).
A mitocôndria, com a sua estrutura e função, está associada a um importante número de doenças envolvidas no processo acelerado de envelhecimento cerebral e mais especificamente a várias doenças neurodegenerativas (Violante, 2010) .
As mutações mitocondriais são particularmente suscetíveis de se acumularem em células que permanecem por longos períodos de tempo, tais como as células do tecido nervoso e tecido muscular. As alterações degenerativas na função mitocondrial são pensadas para contribuir para um número de doenças neurológicas comuns no decorrer do envelhecimento como por exemplo a doença de Parkinson (DP) ou DA (R. Santos, Correia, S., Wang, X., Perry, J., Smith, M., Moreira, P., Zhu, X., 2010).
1.4. As Mitocôndrias no envelhecimento e na DA
Esta acumulação de danos foi considerada no início de 1980, quando o número de jovens viciados em drogas, relatado para hospitais com aparecimento súbito de tremores musculares graves que são características da DP em adultos e idosos. Foi descoberto que estes indivíduos teriam injetado por via intravenosa uma heroína sintética que foi contaminada com um composto chamado MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6- tetraidropiridina). Estudos posteriores revelaram que a MPTP causou danos no complexo I da cadeia respiratória mitocondrial, levando á morte de células nervosas na mesma região do cérebro que é afetado em pacientes com DP. Quando estas células de DP foram estudadas, denotou-se uma diminuição acentuada na atividade do complexo I. Esta deficiência do complexo I deve-se provavelmente devido a um aumento documentado na taxa de mutação do ADN das células em comparação com outras células. Estudos implicam a exposição de certos pesticidas, particularmente a rotenona, um conhecido inibidor do complexo I, como um fator de risco ambiental para o desenvolvimento de DP.
Na cadeia de transporte de eletrões de mitocôndrias de linfócitos de doentes com DA verificou-se um aumento na atividade dos complexos II e IV, podendo este ser um mecanismo compensatório para fornecer energia (Feldhaus et al., 2011). Algumas das evidências de disfunções da cadeia de transporte de eletrões em DA estão resumidos na Tabela 1.
Tabela 1- Funções mitocondriais afetadas através de modelos biológicos
MODELO BIOLÓGICO FUNÇÃO MITOCONDRIAL AFETADA REFERÊNCIAS Mitocôndrias em linfócitos de pacientes com DA Maior oxidação de piruvato-malato, o glicerol-3-fosfato, as atividades enzimáticas (I, II, e
III) foram
encontrados em pacientes com AD
28 1.4. As Mitocôndrias no envelhecimento e na DA Plaquetas, córtex motor postmortem e hipocampo de paciente com DA A atividade do citocromo c oxidase reduzida pode tornar o tecido vulnerável a excitotoxicidade ou disponibilidade de oxigênio reduzida (Keil, 2006) Plaquetas de sangue humano Os níveis de ATP foram reduzidos, enquanto ROS foram aumentados em pacientes com DA. (Keil, 2006 ) Sete regiões do cérebro humano (cerebelo, frontal, temporal, occipital, córtex parietal, tálamo e núcleo caudado) Proteína do Complexo III de significativamente reduzida no córtex temporal de pacientes com AD.
(Hroudova, 2014 )
Disfunções mitocondriais envolvidas na fisiopatologia das doenças neuropsiquiátricas incluem distúrbios na fosforilação oxidativa, aumento de deleções no mtDNA, mutações ou polimorfismos, sinalização de cálcio prejudicada e metabolismo energético prejudicado, assim como interações com proteínas específicas da doença. A patologia mitocondrial poderia ser um fator importante na manifestação de sintomas clínicos de doenças neurodegenerativas (Hroudova et al., 2014).
1.4. As Mitocôndrias no envelhecimento e na DA
Estudos têm demonstrado alterações no ciclo de Krebs e na CTE (Bubber, Haroutunian, Fisch, Blass, & Gibson, 2005; Cardoso, 2004), sugerindo uma alteração no metabolismo energético dos pacientes (Keil et al, 2006). Manczak (2006) evidencia que existem danos ao nível da atividade do complexo IV em doentes de Alzheimer. Estudos,
post-mortem, indicaram uma diminuição na atividade da enzima citocromo c oxidase em
cérebros de pacientes com DA quando comparados com indivíduos saudáveis (Parker, 1994). Strazielle et al (2003) num estudo em modelos animais com DA, demonstrou o aumento do metabolismo energético em diferentes regiões cerebrais, através do aumento da atividade do citocromo c oxidase (Strazielle, 2003). A redução na atividade de uma ou mais enzimas da cadeia de transporte de eletrões ou na ATP sintase compromete a síntese de ATP e provoca um aumento na produção de ROS, levando á morte neuronal (Young, 2010). Estas evidências levam ao entendimento que a disfunção da mitocôndria e o stress oxidativo têm um papel fundamental na DA(R. Swerdlow, Burns, J., Khan, S., 2010).
A habilidade de locomoção da mitocôndria entre células é de máxima importância em células polarizadas, tais como os neurónios, que têm um requerimento energético muito elevado e vários compartimentos subcelulares especializados. Deficiências tanto a nível da fissão como da fusão mitocondrial têm vindo a ser descriminadas na alteração do movimento mitocondrial. É possível que o tamanho das mitocôndrias também tenha um papel relevante porque neurónios com falta de fusão mitocondrial demonstram um aumento de diâmetro da mitocôndria que bloqueia as ligações neuronais (Moreira et al., 2006).
1.5. Fatores de risco DA
A DGS (2015), refere que ainda não existe nenhuma fórmula que se possa utilizar para prevenir a DA. No entanto, já se identificaram vários fatores de risco associados á demência. Embora existam fatores de risco impossíveis de modificar (como os fatores genéticos ou a idade), muitos dos fatores de risco podem ser alterados através de mudanças no estilo de vida e/ou tratamentos médicos adequados. Os marcadores biológicos e os estudos sistemáticos do cérebro deixam claro que, por um período de 15 a 20 anos, existem mudanças no cérebro antes do diagnóstico da demência da Doença de Alzheimer, ainda que seja em sua fase inicial (ABRAZ, 2016).
O fator mais preditivo para a demência é a idade (Tom et al., 2015). A prevalência da demência aumenta substancialmente em indivíduos com idade >80 anos e é superior entre mulheres mais velhas do que os seus homólogos masculinos, em ambos com idades compreendidas entre os 65 e os 80 anos, a incidência de DA duplica a cada 4 anos, alcançando uma prevalência de 30% aos 80 anos (Azad et al., 2007).O segundo maior fator de risco descrito na literatura é a hereditariedade, pacientes que tiveram parentes de primeiro grau com demência têm um aumento de 10% a 30% de desenvolverem a DA (Gatz et al., 2003).
A nível genético, a presença da apolipoproteína E ɛ4 (APOE- ɛ4) está associada ao aumento da probabilidade do desenvolvimento esporádico da DA, este alelo está também associado aos níveis elevados de colesterol total e apresenta mais incidência em mulheres do que em homens (Chen et al., 2009; Corder et al., 1993; Isbir et al., 2001) (Maslow, 2008).
Atualmente cerca de 25% das mulheres com idade superior a 65 anos tem historial clínico de hipertensão arterial. A hipertensão arterial parece ser um importante parâmetro preditivo na deterioração cognitiva com um aumento significativo no risco de desenvolver a DA (Kivipelto et al., 2001).
Ainda não existe consenso entre a comunidade científica sobre a questão da influência do sexo na incidência da DA, vários fatores complicam esta associação por exemplo hormonas esteroides, que, uma vez que são antioxidantes previnem o aparecimento da DA; estilo de vida, etnia e polimorfismo genético de genes relacionados com o sexo do individuo. Assim é necessário considerar outros fatores de risco no estudo
32
1.5.Fatores de risco da DA
da associação do sexo na DA (Chen et al., 2009).Um estudo Holandês demonstrou que a incidência de DA é superior em mulheres do que em homens depois dos 85 anos (Andersen et al., 1999). Por outro lado, um estudo de Ruitenberg et al. (2001) sobre a diferença de género na incidência de demência afirma não existir diferenças entre ser homem ou mulher na DA (Ruitenberg & Bretelera, 2001).
É possível que indivíduos com nível educacional mais baixo tendam a ter uma função cognitiva mais baixa comparando com indivíduos da mesma idade com nível educacional mais alto (Wilson et al., 2009).
Com o avançar da idade adulta, a composição corporal altera-se e os níveis de adiposidade aumentam, sobretudo na zona visceral. Nos idosos, o peso corporal tende a diminuir, resultado da combinação da perda de massa muscular e óssea levando á sarcopenia. Estudos evidenciam que a obesidade está relacionada com o desenvolvimento de DA (Emmerzaal, Kiliaan, & Gustafson, 2015; Gaddey & Holder, 2014; Hassing et al., 2009). A obesidade acarreta outros fatores de alto risco para o desenvolvimento da DA como o IMC alto, a pressão arterial alta, os níveis de colesterol altos e o desenvolvimento de outras patologias como a Diabetes mellitus (tipo II). A Diabetes tipo II está fortemente associada à resistência à insulina, que, por sua vez, está relacionada com a formação de Aβ e agentes inflamatórios no cérebro, o que consequentemente aumenta o risco de DA (Craft, 2007; Forette & Boller, 1991; Posner et al., 2002; Sun & Alkon, 2006).
A EURODERM (European Community Concerted Action on Epidemiology and Prevention of Dementia) associou o tabagismo a uma maior probabilidade de risco de DA. Por outro lado, segundo a DGS 2015, o álcool, apesar de quando consumido moderadamente, parece estar associado a uma menor incidência de DA (em particular o caso do vinho), já quando consumido em excesso deve ser considerado um fator de risco.
A perda de peso em DA pode ser correlacionada com a presença taxas mais altas de infeção e inflamação, a queima de energia devido aos movimentos repetitivos e défice cognitivo que compromete independência do paciente (Du, 1993; Kikuchi, 2006). Este processo aumenta o risco de infeções, úlceras da pele e estimula a perda de temperatura do corpo, o que consequentemente compromete a qualidade de vida de pacientes com AD (Riviere, 2001). Há uma teoria por trás da perda de peso visto em AD pacientes que se baseia na morfologia e no que tem a ver com as lesões cerebrais causadas pela doença, e uma significativa associação foi encontrada entre o baixo peso corporal e atrofia do córtex
1.5.Fatores de risco da DA
temporal na região medial do sistema nervoso central responsável pelo comportamento alimentar (Grundman, 2006).
Um moderador potencial da trajetória da função executiva na DA é a atividade física. Uma revisão sistemática de ensaios clínicos controlados sobre este tema, concluiu que as intervenções de atividade física têm efeitos positivos na função cognitiva do paciente com DA (Chen, Y., 2009; Pivi, 2012).
Vários medicamentos estão relacionados com o risco de demência. Um estudo Francês relacionou positivamente o uso de benzodiazepinas com a incidência de DA. As
descobertas de fármacos anti-depressivos são inconclusivas, o que pode ser o resultado da etiologia diferente de subtipos de demência, bem como diferentes farmacocinéticas e farmacodinâmicas relacionadas com um aumento do risco de demência (Chen, Y., 2009).
O papel dos fatores ambientais sobre o progresso da demência é complicado. O alumínio está relacionado com o risco de demência, pois pode atuar como um cofator na progressão da demência (Solfrizzi et al., 2006; Rondeau, 2000). Tem sido especulado que outros metais, tais como ferro, cobre e zinco, estão relacionados com vários nutrientes (Shore, 1984; Solfrizzi et al., 2006). Por exemplo, os níveis séricos de vitamina D é menor entre mulheres com demência leve do que entre aquelas sem patologia (Kipen, Helme, Wark, & Flicker, 1995). Além disso, um ensaio clínico demonstrou que a vitamina E não é benéfico para pacientes com comprometimento cognitivo leve num estágio entre o envelhecimento normal e estágios iniciais de demência (Petersen, 2001). Alguns macronutrientes, como a glicose, proteína (triptofano e tirosina) e ácidos gordos insaturados, têm sido associados a mudanças biológicas relacionadas à idade na função cognitiva entre as pessoas com DA (Otsuka, 2002).
Muitos fatores contribuem para a patogénese do mundo complexo das demências. Como resultado da melhor assistência a nível da saúde e alterações ao nível do estilo de vida, o aumento da longevidade parece levar a um crescente número de pessoas com demência. Nesta era de desenvolvimento tecnológico e as ferramentas que possuímos permitem avaliar exaustivamente a relação entre fatores de risco genéticos bem como os fatores ambientais de modo a que consigamos compreender estas patologias para preveni-las (Chen, 2009).
34
2. Metedologia
2.1. Amostra
Foi utilizada uma amostra constituída por 27 idosos institucionalizados no distrito de Vila Real, 14 idosos grupo controlo ou seja, sem qualquer patologia psiquiátrica e 13 idosos com Doença de Alzheimer, desde grau leve ao grau severo, diagnosticado por Neurologista.
Todos os inquiridos neste estudo (ou cuidadores) assinaram um consentimento informado, na qual se referenciava todos os paços desta investigação.
2.2 Instrumentos e procedimentos
2.2.1 Parâmetros Sociais
Questionário Sociodemográfico. Para avaliação das variáveis sociodemográficas (idade,
género, estado civil, escolaridade, histórico clínico) foi aplicado um questionário, preenchido pelo investigador responsável.
2.2.2. Parâmetros Bioquímicos
Colheita de sangue. A colheita de 10ml de sangue foi efetuada por um enfermeiro/a da
instituição, entre as 9h e 10h da manhã, em que os idosos estavam em jejum. Procedeu- se á identificação dos tubos de colheita com a terminologia de Oxx para grupo controlo e Axx para grupo experimental (com DA).
Isolamento de Linfócitos e separação de plasma. Após a colheita, divide-se cada amostra
em dois tubos com 4ml de PBS cada. De seguida a amostra em PBS é cuidadosamente dividida para dois tubos com 4ml de Histopack. Centrifugou-se os tubos com a amostra+PBS+Histopack a 400G’s durante 20minutos.
36 Após a centrifugação procedeu-se á remoção da camada de linfócitos para um tubo de plástico e completou-se com PBS até perfazer 14ml. De seguida centrifugou-se novamente durante 10 minutos a 400G’s. No final, removeu-se o plasma para outro tubo, para ser suspendido para posterior colocação em 2 tubos de Eppendorf 1,5ml. Reservaram-se os mesmos numa arca frigorifica de -80ªC. Aos linfócitos retirou-se o PBS, e acrescentou-se nova dose do mesmo para proceder á suspensão dos mesmos, em seguida colocou-se o preparado num Eppendorfe por cada amostra.
Determinação da proteína. A concentração total da proteína no plasma foi medida por
espefotometria de acordo com o método biureto, utilizando sérum de albumina (Gornall, 1949).
Contagem de Linfócitos. Procedeu-se á contagem de linfócitos com o auxilio de um
microscópio óptico com lente aumentada 10x. em que a contagem foi feita nos cantos inversos da câmara de bauher. A contagem foi repetida duas vezes de modo a poder fazer a média, multiplicou-se cada contagem por 50 uma vez que queremos que a concentração final seja igual 50µl em todas as amostras.
Meio de ensaio. Para a preparação do meio de ensaio para a avaliação da respiração
mitocondrial de linfócitos foi necessário: 300 nM de Manitol, 10 nM ded KCL, 10 nM de HEPES, 5nM de MgCl2 com pH=7,4. No final adicionou-se 1mg/ml de BSA.
Avaliação da Respiração mitocondrial.
Estadio 3 e Estadio 4 - O protocolo de titulação clássica começa com a adição das
mitocôndrias em meio isotónico saturado de ar com fosfato inorgânico no estado 1. A adição de ADP induz uma ativação transiente por ADP para esgotar eficazmente substratos endógenos, após a qual o Estado 2 é um estado de esgotamento de substrato de residual de consumo de oxigénio. A ativação pelo ADP do substrato é alcançada no Estado 3 (capacidade máxima de ADP) através da adição de substrato. Neste estado, a respiração é alta e o ADP está esgotado por fosforilação de ATP. A respiração cai na transição para Estado 4, que é um estado de repouso limitado por ADP, na presença de ATP. A segunda titulação ADP é seguido por outra transição do Estado 3 → 4 Estado (DP → TL) a uma concentração de ATP final mais elevado. Finalmente, torna-se o oxigênio da respiração limitado, após a transição aeróbia-anóxico
RCR- estado 3 / estado 4
TBARs- O nível de peroxidação dos lípidos no plasma foi medido por determinação dos
níveis de peróxidos lipídicos como a quantidade de substâncias reactivas ao ácido tiobarturico formado, de acordo com o processo descrito por Wills (1987).
2.3. Análise estatística
Durante todo o processo de recrutamento e obtenção de dados, estes foram introduzidos numa base de dados.
Para o tratamento estatístico foi ser utilizado o programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) em que foi utilizado o T-Test para amostras independentes se cumprirem os pressupostos de normalidade e o teste de Mann-Whitney se não cumprirem os pressupostos de normalidade com um grau de significância com p<0,5.
3. Resultados
Na tabela 2 podem ser observados os valores médios (𝑥̅) e respetivos desvios padrão (DP) da idade, respiração mitocondrial e concentração plasmática de TBARs da amostra estudada.
Tabela 2. Valores médios (𝑥̅) e respetivos desvios padrão (DP) da idade (anos), respiração mitocondrial em estádio 3 e em estádio 4 (....), taxa de controlo respiratório (respiratory control ratio, RCR) em linfócitos e concentração plasmática de TBARs (nmol/mg proteína) de indivíduos idosos sem demência e com doença de Alzheimer (DA). Sem demência (𝒙̅±DP) DA (𝒙̅±DP) p Idade (anos) 80,5±7,7 83,2±8,3 0,383 Estádio 3 (nmolO2/min/106) 1,77±0,67 1,80±1,07 0,928 Estádio 4 (nmolO2/min/106) 0,56±0,33 1,55±0,77 0,061 RCR 3,76±1,54 2,33±1,36 0,017 TBARs (nmol/mg de proteína) 15,796±4,098 11,169±4,459 0,041
A amostra total apresentou uma variação de idades compreendida entre os 72 e os 91 anos, não se verificando diferenças significativas na idade média dos dois grupos considerados.
Relativamente à respiração mitocondrial de linfócitos, os dados obtidos revelaram que não há diferenças significativas na respiração em estádio 3 e em estádio 4, apresentando os idosos com DA valores estatisticamente quase significativamente superiores (p=0,061) na respiração mitocondrial em estádio 4, comparativamente aos idosos sem demência. A avaliação da RCR revelou valores significativamente mais elevados nos idosos sem demência do que os idosos com DA (t=2,553; p=0,017).
Ao nível da análise dos TBARs (nmol/mg de proteína) constataram-se diferenças significativas na sua concentração plasmática (t=2,230; p=0,041), sendo os valores superiores nos idosos sem demência.
4. Discussão
As mitocôndrias possuem um papel importante no metabolismo celular e são essenciais para o funcionamento neuronal (Keil, 2006). Alterações no funcionamento da mitocôndria são descritas em diversas doenças neurodegenerativas, como na doença de Parkinson (Van Laar, 2009), esclerose múltipla (Kristofiková et al., 2009) e doença de Alzheimer (Bonilla, 1999; Maurer, 2000; Vargas, 2010).
O estado 3 do ADP é controlado em partes aproximadamente iguais pela a atividade de ATP e da oxidação do substrato (incluindo absorção do substrato, enzimas de processamento, complexos da cadeia de transporte de eletrões e citocromo c). A inibição de qualquer um destes processos tem como resultado a diminuição da taxa do estado 3. O Estado 3 é controlado exclusivamente pela oxidação do substrato e deteta disfunções nas componentes da cadeia respiratória (Brand, 2011). Os resultados obtidos não evidenciam diferenças significativas na respiração mitocondrial em estado 3, o que sugere que na DA os componentes da cadeia respiratória não são afetados de forma distinta comparativamente ao envelhecimento “normal”. Sugere-se, no entanto, uma análise da atividade dos complexos da cadeia respiratória, para aprofundar e esclarecer se os mecanismos envolvidos no processo de respiração mitocondrial diferem em idosos com DA comparativamente aos idosos sem demência.
O estado 4 é controlado predominantemente pela fuga de protões que contaminam as ATPases que reciclam o ATP e ADP sintetizados. O baixo índice do estado 4 indica que a mitocôndria mantém uma performance suficientemente alta mesmo tendo um baixo índice de transporte de eletrões. Um alto índice do estado 4 indica que existe uma fuga alta de protões alterados (Brand, 2011). Embora os resultados obtidos não evidenciem diferenças significativas na respiração mitocondrial em estado 4, as mitocôndrias dos linfócitos dos idosos sem demência, apresentam valores consideravelmente mais baixos o que sugere uma boa performance. Já o elevado estádio 4 observado nas mitocôndrias de linfócitos dos DA sugere uma elevada fuga de protões que poderá levar ao aumento da formação de ERO. Neste estudo não foi analisada a formação de ERO em ambos os
42 grupos, mas parece-nos que seria um parâmetro muito pertinente a ser considerado em estudos futuros.
Os valores do RCR, estado 3 / estado 4, são fortemente influenciados por quase todos os aspetos funcionais de fosforilação oxidativa, o que os torna bons indicadores de disfunção mitocondrial (Brand, 2011). Com efeito, a disfunção mitocondrial pode levar a um aumento da produção de radicais livres e, consequente ao "stress oxidativo". Esta disfunção pode afetar quase todas as funções celulares, assim, qualquer observação de disfunção celular pode sugerir uma disfunção ao nível mitocondrial que deve então ser testado pelo rácio respiratório da célula (Brand, 2011). Os nossos resultados evidenciam que os indivíduos com DA apresentam um menor RCR em relação aos indivíduos normais, o que nos leva a induzir que indivíduos com DA têm de produzir mais energia no estado 4, e possivelmente obtêm essa energia através de mecanismos de compensação. De facto, os resultados sugerem que indivíduos com DA apresentam o estado 4 mais elevado que indivíduos normais. O estímulo do consumo de O2 (estado 3) obtido pela
adição de pequena quantidade de ADP, seguido por diminuição na taxa respiratória devido ao consumo do ADP (estado 4). A relação entre a taxa de respiração ativa (estado 3) e de repouso (estado 4) é referida como RCR e é medida da certeza do acoplamento entre a transferência de eletrões pela cadeia respiratória e a fosforilação oxidativa, indicando a qualidade da preparação mitocondrial e a sua capacidade em acelerar a respiração sob condições de necessidade de energia, conservada a energia livre das reações de óxido-redução na forma de ATP. Valores baixos de RCR, comparados aos respetivos controles, indicam alterações em um ou mais componentes da cadeia respiratória e, portanto, do estado energético celular (Brand, 2011).
Os resultados obtidos nos parâmetros de função mitocondrial, sugerem que nos idosos com DA ela está prejudicada o que nos levaria a esperar encontrar um aumento dos danos induzidos por stress oxidativo. No entanto, ao contrário do que seria esperado, a concentração plasmática de TBAR’s dos idosos sem demência foi superior à dos idosos com DA. A medição de Substâncias Reativas ao Ácido Thiobarbiturico (TBAR’s) é um método bem conhecido e aprovado pela literatura para identificar e monitorizar a peroxidação lipídica (Correia, 2005). O fato de não termos avaliado a capacidade antioxidante não nos permite tecer considerações sobre os fatores que afetam o stress oxidativo e contribuem para a acumulação de danos causados por ERO. Possivelmente, alterações não consideradas como por exemplo a medicação de doentes de DA poderão
justificar a menor acumulação de TBARs nos DA, uma vez que esta medicação para além dos agentes anti-inflamatórios possui agentes anti-oxidantes e suplementos bioenergéticos que podem ter compensado as alterações metabólicas e reduzido a peroxidação lipídica (Parilhar, 2004).Outra possível justificação para a obtenção destes resultados poderá ser a influencia da diminuição da atividade física dos indivíduos com DA comparativamente aos indivíduos sem demência que continuam as suas atividades de vida diária (AVD’s), apesar de com algumas limitações, levando estes a terem um maior desequilíbrio na regulação dos agentes oxidantes da célula. A alimentação também pode ser considerada como justificação para estes resultados uma vez que pacientes diagnosticados com DA sãos frequentemente aconselhados a manter uma dieta rica em anti-oxidantes (Engelhart, 2002).
Uma variedade de anormalidades bioquímicas pode levar ao funcionamento irregular do metabolismo energético na mitocôndria, uma vez que a disfunção mitocondrial na DA pode ser influenciada por fatores ambientais, metabólicos, alimentares e/ou genéticos (Atamna, 2007).
Sabendo que o bom funcionamento do metabolismo energético é responsável pela produção da maior parte da energia que as células necessitam para manter as suas funções nos diversos sistemas do organismo, inclusive o cérebro (Navarro, 2007), pode-se presumir que qualquer alteração nos eventos que fazem parte deste processo pode interferir na produção de ATP e, em última análise, provocar alterações significativas na função celular. É possível que a alteração mitocondrial seja um evento precoce na fisiopatologia da DA sozinha, ou como um cofator, interagindo com outros processos que façam parte da doença (Crouch, 2005; Caspersen, 2005). O corrente conhecimento sobre o envolvimento da mitocôndria no envelhecimento e em doenças neurodegenerativas é bastante limitado (Reddy, 2009) sendo necessários mais estudos para uma melhor compreensão dos mecanismos que envolvem a disfunção mitocondrial relacionada com a DA.
5. Conclusão
O metabolismo mitocondrial associado à disfunção da cadeia respiratória e ao stress oxidativo consequente está a ser considerado como um possível mecanismo patogénico numa série de doenças neurodegenerativas, incluindo a DA. Em contraste com as placas senis e emaranhados neurofibrilados de tau, observados apenas nas fases tardias da doença de Alzheimer, a disfunção mitocondrial e stress oxidativo são dois eventos precoces na patologia da DA, que em comorbilidade com as mudanças associadas ao envelhecimento na função mitocondrial levam ao stresse oxidativo.
Neste estudo evidenciamos que as mitocôndrias dos idosos sem demência têm melhor RCR do que nos idosos com DA. No entanto verificou-se uma disparidade de resultados esperados quanto á medição dos TBAR’s evidenciando um valor superior em indivíduos sem demência comparativamente a indivíduos com DA.
São necessários mais estudos neste âmbito para uma melhor compreensão da patologia.
I
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