MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOSSOMICIDA DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA E O POLISSACARÍDEO XILANA CONTRA FORMAS EPIMASTIGOTAS DE
Trypanosoma cruzi
TALITA KATIANE DE BRITO PINTO
NATAL/RN 2019
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TALITA KATIANE DE BRITO PINTO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOSSOMICIDA DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA E O POLISSACARÍDEO XILANA CONTRA FORMAS EPIMASTIGOTAS DE
Trypanosoma cruzi
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha
NATAL/RN 2019
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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Pinto, Talita Katiane de Brito. Avaliação da atividade tripanossomicida de nanopartículas de prata e o polissacarídeo xilana contra
formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi / Talita Katiane de Brito Pinto. - 2019.
74.: il.
Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal,
RN, 2019.
Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
1. Trypanosoma cruzi - Tese. 2. Nanopartículas de prata - Tese. 3. Benzonidazol - Tese. 4. Xilana - Tese. I. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616.937
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde: Prof. Dra Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira
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TALITA KATIANE DE BRITO PINTO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOSSOMICIDA DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA E O POLISSACARÍDEO XILANA CONTRA FORMAS EPIMASTIGOTAS DE
Trypanosoma cruzi
Aprovada em: 30/08/2019
Banca Examinadora:
Presidente da Banca:
Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha – Departamento de Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Membros da Banca:
Prof. Dra. Ariane Ferreira Lacerda (membro externo) -Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte (IFRN) - Campus Macau.
Prof. Dra. Nathalia Kelly de Araújo (membro externo)– Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte (IFRN) - Campus Pau dos Ferros. Prof. Dra. Ana Katarina Menezes da Cruz Soares (membro interno) – Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
Prof. Dr. Valter Ferreira Andrade Neto (membro interno) – Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
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Dedicatória
À Deus...
Autor e Senhor da minha vida!
Aos meus pais Francisca Brito e Reinaldo Brito (In Memoriam).
A eles todos os meus sonhos e projetos.
Aos meus filhos, Gabriel (Bi) e Miguel (Mi)
Todos os meus sorrisos e gestos de amor.
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Agradecimentos
Ao meu orientador, Prof. Dr. Hugo Rocha.
Minha sincera gratidão pelo amigo, professor e orientador que se deixou ser. Muito obrigada por ter acreditado em mim!
Aos meus irmãos, cunhadas e sobrinhos minha eterna gratidão por todo apoio, incentivo e torcida. Juntos seremos sempre mais fortes! Aos demais familiares e amigos que sempre me acompanharam nesta jornada.
À grande família Biopol. Meus sinceros agradecimentos por todos os momentos de aprendizado e alegria passados juntos.
Ao meu grande amigo Jefferson Barbosa (Jefildo). Minha eterna gratidão por todo apoio, ensinamentos, amizade e companheirismo. Você é o cara!
Jailma Almeida (Jaja). Palavras são insuficientes para demonstrar todo meu apreço, todo meu respeito e gratidão. A você minha amiga todas as bênçãos dos céus sejam em forma de retribuição. Amo você!
Maíra Menezes (minha linda enfermeira) meus sinceros agradecimentos por tudo que passamos juntos e pela linda amizade que fizemos. Você é especial!
Dayanne Gomes (Day). Muito obrigada pelo companheirismo nessa caminhada. Obrigada por sua alegria que enfeitava meus dias.
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Mônica Amorim (Monquinha) a você todo meu afeto e agradecimento por tantos momentos preciosos passados juntas. Você é fantástica!
Rony Lucas (Ronildo) eterna gratidão pela amizade e apoio durante todo o processo do doutorado. Que Jesus te abençoe sempre!
Ao grande amigo Diego Sabri (Popó) o chatolino da vida diária. O cara da Ressonância e tantas outras técnicas que domina. Obrigada por tudo amigo.
Adriana Oliveira (Adri) a você meus sinceros agradecimentos por ter andado ao meu lado nesse final de projeto. Você tem um futuro brilhante pela frente.
A Profa. e amiga Monique Gabriela (Moniquete) pela disponibilidade em ajudar e aconselhar. Seu incentivo fez toda diferença.
Ao meu amigo Wesley pelo seu bom humor sempre que alegrava os meus dias chuvosos, o meu eterno obrigada.
Ao laboratório de Imunoparasitologia do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, em especial ao professor Marcelo Silva meus eternos agradecimentos por todo apoio, amizade e ensinamentos. Você é um profissional muito fácil de admirar! A minha grande amiga Cláudia por ter se tornado muito mais que uma parceira de doutorado, e sim, uma amiga pra vida toda. Você é muito especial!! Ao amigo Jhonny por todo apoio nos experimentos e pela alegria da sua presença.
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Ao amigo Raniere, muito obrigada por todo carinho e ensinamentos transmitidos a mim no início dessa jornada.
Aos demais colegas do laboratório: Marília Negreiros, Luciana Fentanes (Lu), Verônica Aquino, Éder Galinari (MacGyver), Vinícius Campelo (Vini), Moacir (Momo) , Flávia (Flavoca), Joana de Ângelis (Jojo), Larisse (Lala) Leonardo Nobre (Leozito), Leonardo Aquino (Leo), Gabriel Fidelis, Jayane Mayara, Ivan, Karoline Rachel (Carolzinha), Cynthia Haynara, Raynara, Pablo Castro (Pablito), Mariana Santana (Mari) Lucas Alighieri (Luquetes), Carla (Carlota), Cinthia Beatrice, Thiago Laurentino os meus eternos agradecimentos pelo adorável convívio durante esses 4 anos.
Aos amigos do Departamento de Farmácia, em especial a Stella Barreto e Gabriel Azevedo pela forte amizade e companheirismo na “saga da coluna”. Vocês são fantásticos!
Aos professores Leandro Costa e Rafael Câmara pela amizade e ensinamentos.
Aos professores do Departamento de Bioquímica, em especial a Profa. Luciana Guimarães, Prof. Eliseu Santos, Profa. Suely Chavantes, o meu muito obrigada!
Aos membros da banca de qualificação, prof. Marcelo Silva e Profa. Mariana Santana. Muito obrigada por todo apoio e sugestões que enriqueceram meu trabalho.
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Aos técnicos do Departamento de Bioquímica Ana Katarina Menezes por todo apoio, a Francisco Freire pelas incontáveis análises no citômetro de fluxo e a Eliene por todo carisma e disposição em ajudar.
Ao Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros, em especial ao prof. Daniel Pontes, Mayara Jane e Francimar Júnior, por todo empenho nas análises e auxílio dos dados.
Aos colegas da secretaria, em especial ao Seu Rogério, Ricardo e Samara muito obrigada!
Ao colega Matheus por me fazer companhia nas primeiras horas do dia no laboratório, tornando sempre o nosso ambiente de trabalho um lugar agradável para se estar.
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Epígrafe
“
Eu queria ter mais que uma voz,Mais que um amor e uma vida para Te oferecer, Pois, Tu és muito mais do que eu possa ter em meu ser.
Tu és o autor, aquele que pintou com perfeição a vida.
Tu és o Senhor, aquele que me amou e és o meu Deus, meu Senhor, minha vida é para Teu louvor”.
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RESUMO
A doença de Chagas ou Tripanossomíase americana é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. O tratamento atual compreende o uso de pelo menos dois fármacos o benzonidazol (BNZ) e o nifurtimox, que apresentam elevada toxicidade e ineficácia na fase crônica da doença, o que induz a busca de alternativas terapêuticas mais eficazes. Estudos têm demonstrado que a síntese verde de nanopartículas de prata com polissacarídeos tem potencializado a atividade biológica tanto dos polissacarídeos como da prata. Portanto, o polissacarídeo xilana foi extraído do sabugo de milho, utilizando um método amigável ao meio ambiente, e foi usado para a síntese de nanopartículas de prata (nanoxilanas - NX). Estudos de microscopia de força atômica verificaram que a NX apresentou formato esférico e tamanho médio (~ 40 nm). Espectroscopias de infravermelho e Raman e de Espectrometria de emissão atômica por plasma acoplado comprovaram a presença de prata (~19%) e xilana na NX. Parasitas T. cruzi perderam 95% da sua capacidade de reduzir o MTT (3- brometo (4,5- dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazólio) quando incubados com nanoxilana (100 µg/mL). Análise de citometria de fluxo mostrou que 98% dos parasitas estavam positivos para iodeto de propídeo quando incubados por 24 h com NX (100 µg/mL). Os dados mostram que a nanoxilana induz necrose dos parasitas e que é um forte candidato para estudos pré-clínicos com animais infectados com Trypanosoma cruzi.
Palavras-chaves: Benzonidazol; Nanopartículas de prata; Trypanosoma cruzi; Xilana.
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ABSTRACT
Chagas disease or American trypanosomiasis is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. The current treatment comprises the use of at least two drugs, benzonidazole (BNZ) and nifurtimox, which present high toxicity and inefficiency in the chronic phase of the disease, which induces the search for more effective therapeutic alternatives. Studies have shown that the green synthesis of silver nanoparticles with polysaccharides has potentiated the biological activity of both polysaccharides and silver. Therefore, the xylan polysaccharide was extracted from corn cob using an environmentally friendly method and was used for the synthesis of silver nanoparticles (NX). NX-verified atomic force microscopy studies showing spherical shape and mean size (~ 40 nm). Infrared and Raman spectroscopy and coupled plasma atomic emission spectrometry confirmed the presence of silver (~ 19%) and xylan in the NX. T. cruzi parasites lost 95% of their ability to reduce MTT (3-bromide (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium) when incubated with nano xylan (100 µg/mL). Flow cytometric analysis showed that 98% of the parasites were positive for propidium iodide when incubated for 24 h with NX (100 µg/mL). The data show that nano xylan induces parasite necrosis and is a strong candidate for preclinical studies with animals infected with Trypanosoma cruzi.
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AFM Microscopia de força atômica
AgNO3 Nitrato de prata
ANOVA Análise de Variância
Ara Arabinose
BERENICE Benzonidazol e Triazol para Nanomedicina e Inovação na Doença de Chagas
BIOPOL Laboratório de biotecnologia de polímeros naturais
BNZ Benzonidazol
BOD Demanda bioquímica de oxigênio
BSA Albumina do soro bovino
CN Controle negativo
CP Controle positivo
º C Grau Celsius
DC Doença de Chagas
FBS Soro fetal bovino
FTIR Espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier
g Aceleração da gravidade
Gal Galactose
Glc Glicose
GlcA Ácido glucurônico
h Hora
HCl Ácido clorídrico
HMF Hidroximetilfurfural
HPLC Cromatografia em camada delgada de alta eficiência
H2SO4 Ácido sulfúrico
ICP-OES Espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado
KBr Brometo de potássio
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LABMEV Laboratório de Microscopia Eletrônica de Varredura
LIT Infusão hepática triptose
LQCPol Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros Man Manose MBHA3 (3-Hidroxi-2-metileno-3-(4-nitrofenilpropanonitrilo) min Minutos mg Miligrama mL Mililitro
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetil- tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
NH2 Amina
Na2HPO4 Fosfato dissódico
NX Nanoxilana
PI Iodeto de propídeo
PBS Tampão fosfato salino
RAW 264.7 Linhagem celular de macrófago murino
SDS Dodecil sulfato de sódio
Xyl Xilose
XYL Xilana
µg Micrograma
µL Microlitro
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Distribuição de casos da Doença de Chagas no mundo de acordo com
países endêmicos e não endêmicos ... 17
Figura 2: Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi ... 19 Figura 3: Síntese de nanopartícula de prata com o polissacarídeo xilana ... 22
xvii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 18
1.1 Doença de Chagas ... 18
1.2 Polissacarídeos com atividades biológicas ... 21
1.3 Nanopartículas de prata e método de síntese verde ... 22
2. JUSTIFICATIVA ... 24
3. OBJETIVOS ... 25
3.1 Geral: ... 25
3.2 Específicos: ... 25
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 26
4.1 Avaliação da composição química dos polissacarídeos ... 26
4.1.1. Dosagem de proteínas ... 26
4.1.2. Dosagem de compostos fenólicos ... 26
4.1.3. Dosagem de açúcares ... 26
4.2 Caracterização das nanopartículas ... 27
4.2.1. Espectroscopia de UV-visível ... 27
5. ARTIGO PRODUZIDO ... 28
6. CONCLUSÕES ... 67
7. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES ... 68
18
1. INTRODUÇÃO
1.1 Doença de Chagas
A doença de Chagas (DC) ou tripanossomíase americana, descoberta a mais de um século 1, é reconhecida como uma das doenças parasitárias tropicais mais
negligenciadas no mundo, atingindo cerca de 8 milhões de pessoas, principalmente na América Latina, além de estar entre as mais importantes infecções parasitárias, segundo a Organização Mundial de Saúde 2. Possui fatores de risco fortemente
relacionados com baixas condições socioeconômicas. Por muitos anos foi uma doença restrita às Américas, principalmente a América Latina, e predominantemente rural. No entanto, a partir da década de 40 devido a fatores socioeconômicos e migração da população do campo para os centros urbanos, esse perfil foi sendo alterado 3 levando a expansão da doença a outros locais, inclusive não endêmicos,
como Europa, EUA e Canadá (Figura 1), neste caso, devido a migração de pessoas infectadas 4,5. No Brasil o número de infectados entre 2012 e 2016 chegou a quase 2
mil pessoas, sendo 1.190 casos confirmados de acordo com o Ministério da Saúde (2019) 6.
Figura 1: Distribuição de casos da doença de Chagas no mundo de acordo com
países endêmicos e não endêmicos
19
Uma das principais vias de transmissão é a vetorial em que o inseto vetor é um triatomíneo, da subfamília Triatominae; várias espécies desta subfamília atuam como vetores na transmissão da doença de Chagas. No Brasil são conhecidas mais de 68 espécies, 13 delas de importância epidemiológica 6. O triatomíneo é conhecido
popularmente como “barbeiro ou bicudo”, e transporta em seu intestino o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. No momento da picada em áreas como pele ou mucosas, o barbeiro além de sugar o sangue também elimina através das fezes as formas tripomastigotas metacíclicas de Trypanosoma cruzi (transmissão clássica). No entanto, outras vias de transmissão têm emergido nos últimos anos e servido de alerta para as agências de saúde, são elas: a via transfusional, via vertical e a via oral, esta última em maior quantidade 7.
O ciclo evolutivo do T. cruzi é composto por formas evolutivas distintas – epimastigota, tripomastigota sanguínea, tripomastigota metacíclicas e amastigota. Diferem entre si principalmente por sua morfologia e posição do cinetoplasto em relação ao núcleo. Inicia-se o ciclo ainda dentro do intestino médio do inseto, quando o sangue contaminado com formas tripomastigotas é ingerido pelo triatomíneo. Tais formas diferenciam-se em epimastigotas que migram para a porção intestinal posterior e reto, e lá se diferenciam novamente em uma forma potencialmente infecciosa, tripomastigota metacíclico (metaciclogênese), que será eliminada nas fezes do vetor no momento da picada. Essas formas entram em contato com o hospedeiro através de ferimentos na pele ou mucosas e invadem diversas células nucleadas 8. Vias de
sinalização são ativadas após o reconhecimento celular, que culminam com a internalização deste parasita pela célula hospedeira, formando um “vacúolo parasitóforo” que abriga o parasita 9. As formas tripomastigotas, através de um
mecanismo enzimático, rompem a membrana deste vacúolo e alcançam o citoplasma da célula, local este em que se diferenciam na forma amastigota. Uma vez que o citoplasma celular está preenchido com inúmeras formas amastigotas, há o processo de nova diferenciação em forma tripomastigota. Essas formas flageladas livres no meio intercelular irão infectar células vizinhas ou migrar através da corrente sanguínea para infectar novas células em diversos tecidos (músculo cardíaco, intestino, esôfago) ou serem novamente ingeridas pelo inseto vetor 9,10. Na Figura 2 pode-se observar o
20
Figura 2: Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi
Fonte: Adaptado de https://www.chagasfound.org/chagas-disease/life-cycle/
A doença apresenta duas fases clínicas, a aguda ou inicial, caracterizada por sintomas geralmente leves (quando presentes), apesar do paciente apresentar altos níveis de parasitemia nesta etapa 11. Alguns estudos demonstraram que a doença é
curável se o paciente for submetido ao tratamento logo após a infecção 12,13. Caso não
haja cura nesse período o paciente passa para a fase seguinte, a crônica, a qual requer uma maior atenção, pois o mesmo pode apresentar quadros de miocardite e/ou distúrbios do sistema gastrointestinal e nervoso periférico 8. Nesta fase o paciente
pode manter-se assintomático por anos ou apresentar sintomas graves decorrentes da lesão da área afetada pelo parasita, podendo chegar a óbito 14–16.
O principal fármaco disponível atualmente no Brasil para o tratamento da doença de Chagas é o benzonidazol (BNZ), que objetiva eliminar o parasita sanguíneo na fase aguda da doença. No entanto, este composto apresenta acentuada toxicidade e baixa eficácia na fase crônica, além de fortes efeitos adversos 17. Alguns estudos
realizados em camundongos verificaram a eficácia deste fármaco durante a infecção crônica, no entanto, concluíram que o BNZ não erradica completamente o parasita 18–
21. Segura e colaboradores 20 não evidenciaram diminuição da miocardite em
camundongos tratados com o benzonidazol. Este fármaco, além disso, apresenta limitações dentre elas a proibição do uso por mulheres grávidas ou por pessoas com insuficiência renal ou hepática.
21
Diante de tantas desvantagens, surge a necessidade urgente de se identificar melhores fármacos para o tratamento de pacientes chagásicos 22,23. Dentro deste
contexto, pesquisas voltadas à prospecção de moléculas bioativas a partir de fontes naturais têm aumentado significativamente ao longo dos anos impulsionando os estudos para um avanço no quadro terapêutico atual desta morbidade.
1.2 Polissacarídeos com atividades biológicas
Estudos diversos têm demonstrado que compostos isolados de produtos naturais são ferramentas importantes utilizadas em muitas áreas que podem inclusive auxiliar no tratamento de doenças. Em particular os polissacarídeos que se apresentam como moléculas funcionais com vasta aplicabilidade nos campos da medicina, farmácia, indústria de alimentos e coméstica 24 e já são relatadas as suas
atividades anticoagulante e antioxidante 25–27; antitumoral 28 anti-inflamatória 29,
hipoglicemiante 30,31; antitrombótica 32.
Os polissacarídeos são polímeros naturais, unidos por ligações glicosídicas. Estes polímeros podem ser classificados de acordo com a sua função, podendo ser de reserva energética (amido) nas plantas e (glicogênio) em fungos e animais, ou estruturais como por exemplo a celulose. No universo desses compostos existem as xilanas que são heteropolissacarídeos estruturais que compõem a parede celular de plantas. A xilana é um composto linear com ligação β-(1-4)-D-xilopiranosil, que apresenta diversos substituintes ligados à sua cadeia principal, como por exemplo, resíduos de arabinose, ácido glucourônico, ácido metil-glucourônico e acetil. O arranjo estrutural da xilana pode diferir dependendo da fonte e devido a fatores abióticos e bióticos 33,34. As xilanas têm potencial de uso em vários processos biotecnológicos 35.
O sabugo de milho, um dos resíduos agrícolas, apesar de ter uma parcela significativa descartada pela indústria, desponta como fonte promissora de xilanas bioativas com elevado potencial farmacológico. Ebringerová e colaboradores 36
relataram em seus estudos propriedades imunomodulatórias das xilanas. Nagashima e seu grupo de pesquisa 37 também demonstraram a utilização das xilanas do sabugo
de milho na indústria farmacêutica como micro e nanopartículas para liberação controlada no tratamento de doenças de cólon. Atividades antioxidante, antitumoral, antimicrobiana e anticoagulante de xilanas de sabugo de milho foram evidenciadas por Melo-Silveira et al. 26. Além disso, devido as suas propriedades naturais, elas
22
também estão sendo empregadas em formulações para o tratamento de feridas 38.
Bourantane et al. 39 demonstraram a atividade antitumoral das xilanas através de
testes que evidenciaram morte de linhagens celulares de câncer colorretal.
Dada a sua importância, sua diversidade estrutural e suas propriedades biológicas, as xilanas são candidatas promissoras para o desenvolvimento de produtos com aplicações biotecnológicas e biomédicas. Estes dados geram interesse para busca de novos fármacos mais eficazes e com menores efeitos adversos envolvendo este composto e oportunidade para disponibilizar uma entrega mais efetiva do fármaco ao tecido lesado, através de nanoformulações com a xilana, principalmente a extraída do sabugo de milho 40,41.
1.3 Nanopartículas de prata e método de síntese verde
Uma série de vantagens aparecem no campo das nanopartículas feitas com metais como a baixa polidispersidade, inércia química, biocompatibilidade e fácil funcionalização, para que ofereçam grande potencial em processos biológicos, bioquímicos e biomédicos, tanto in vitro como in vivo 42. E devido ao crescente
interesse na área da nanotecnologia cada vez mais pesquisadores procuram utilizar métodos que agridam minimamente o meio ambiente, empregando métodos ecologicamente corretos. Estes métodos, utilizados na síntese de nanopartículas são conhecidos como método de síntese verde e objetivam utilizar reagentes não tóxicos ao meio ambiente, como por exemplo a água 43,44.
As nanopartículas de prata vêm demonstrando atividades biológicas importantes, sendo as mais significativas as antivirais 45,46, anti-inflamatória 47,
antifúngica 48 e antiangiogênica 49,50. No entanto, não há relatos na literatura dessas
nanopartículas sendo elas de prata conjugadas ao polissacarídeo xilana com atividade frente a formas evolutivas do Trypanosoma cruzi, o que gera uma oportunidade de análises desta como proposta a candidatas no tratamento da doença de Chagas.
O grupo de pesquisa no qual está enserida esta tese relatou através de alguns trabalhos o efeito sinérgico obtido pela união de um polissacarídeo a prata, na forma de nanopartículas: Amorim et al. 51 em seus estudos demonstraram a atividade
citotóxica de polissacarídeos sulfatados (PS) da alga marinha Spatoglossum
23
Fernandes-Negreiros et al. 52 também evidenciaram um aumento da intensidade nas
atividades antitumoral, imunomodulatória e antibacteriana dos polissacarídeos sulfatados da alga Dictyota mertensii.
Embora estudos já tenham evidenciado que xilana de sabugo de milho exibe várias atividades biológicas, particularmente, atividade antiproliferativa contra células de adenocarcinoma uterino 53 e atividade antioxidante 26, a atividade tripanossomicida
dessa molécula quando unida a nanopartícula de prata ainda é desconhecida.
Em nosso grupo de pesquisa a síntese da nanopartícula de prata ligada a xilana e a reação de redução da prata foram evidenciados através de uma mudança na coloração da solução de nitrato de prata e extrato bruto de xilana, dados estes monitorados através da Espectroscopia de UV-visível, conforme item 2.5.1. de resultados do artigo produzido, conforme observa-se na Figura 3.
Figura 3: Síntese de nanopartícula de prata com o polissacarídeo xilana. A:
Solução de nitrato de prata; B: Solução de extrato bruto de xilana e nanopartículas de prata e C: Solução de nanoxilana
24
2. JUSTIFICATIVA
A doença de Chagas está em ampla expansão, tanto com aumento do número de casos, bem como, aumento do número de países que estão sendo atingidos por ela. Seu tratamento, inclusive farmacológico, não é eficiente, o que tem impulsionado a busca por alternativas mais eficientes e menos danosas ao paciente. Dentro deste contexto, tem-se a busca por novas moléculas bioativas ou mesmo, a busca por nanomateriais que possam potencializar a ação das moléculas, tanto novas, como dos fármacos já existentes. Como é o caso da prata, um antiparasita já conhecido, mas que não pode ser administrado em pacientes, pois apresenta toxicidade nas concentrações em que é ativa. Polissacarídeos estão no cerne dessa linha de pensamento, pois muitos são bioativos e/ou podem ser utilizados como matéria prima para o desenvolvimento de nanomateriais. O Brasil é o terceiro maior produtor de milho e esta grande produção gera um volume acentuado de resíduos os quais, se não utilizados de forma correta, podem causar um problema ambiental significativo. Um desses resíduos é o sabugo de milho que aparece como uma rica fonte natural da xilana. A xilana é um polissacarídeo que não teve avaliação do seu potencial como componente de nanomateriais feitos com prata como agente tripanossomicida. Fato que não se justifica, pois a xilana é obtida facilmente por métodos não agressivos ao meio ambiente; é obtida em grandes quantidades do sabugo de milho; e já foi demonstrada como ser um composto com propriedades farmacológicas. Testes realizados pelo nosso grupo de pesquisa evidenciaram que nanopartículas de prata ligadas ao polissacarídeo xilana não possuem citotoxicidade frente a células da linhagem 3T3, este é outro fato que justifica o nosso interesse pela união de uma nanopartícula de prata ao polissacarídeo xilana extraído do sabugo de milho. Portanto, os dados aqui apresentados nesta Tese visam começar a preencher esta lacuna de conhecimento referente a xilana no tocante a temática da doença de Chagas.
25
3. OBJETIVOS
3.1 Geral:
Sintetizar nanopartículas de prata contendo xilana do sabugo de milho e avaliar sua a atividade contra formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi.
3.2 Específicos:
Extrair a xilana do sabugo de milho e caracterizá-la quimicamente; Avaliar a composição monossacarídica da xilana;
Sintetizar a nanopartícula de prata unida a xilana (nanoxilana) e avaliá-la morfologicamente e físico-quimicamente.
Avaliar a atividade antiparasitária contra Trypanosoma cruzi e identificar o mecanismo de morte causado pela NX.
26
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Todos os materiais e a maioria dos métodos encontrados nesta tese são descritos no Tópico 2 do artigo 1. Devido a alguns fatores, aqueles métodos que porventura, estejam muito resumidos no Tópico 2 são descritos com mais detalhe a seguir.
4.1 Avaliação da composição química dos polissacarídeos
4.1.1. Dosagem de proteínas
Para analisar a contaminação da amostra por proteínas foi utilizado o reagente de Bradford e a albumina bovina como padrão. As leituras foram feitas a 595 nm. Essa técnica envolve a ligação do corante Comassie brilliant blue à proteína e um aumento da absorção de luz (de 465 nm para 595 nm) pelo corante é evidenciado. O processo de ligação completa do corante à proteína é rápido, dura em torno de 2 minutos e a coloração é estável por 1 hora 54.
4.1.2. Dosagem de compostos fenólicos
A contaminação da xilana por compostos fenólicos foi avaliada utilizando o método colorimétrico de Folin-Ciocalteau. O reagente de Folin-Ciocalteau é composto pelos ácidos fosfomolibídico e fosfotunguístico, nos quais o molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de oxidação 6+. No entanto quando estes estão em presença de substâncias redutoras, formam-se compostos de molibdênio e tungstênio, ambos de cor azul. A coloração permite a determinação da concentração das substâncias redutoras. As leituras foram realizadas em 760 nm e o conteúdo desses compostos foi calculado a partir de uma curva padrão de ácido gálico 55,56.
4.1.3. Dosagem de açúcares
O teor de açúcares totais foi determinado por espectrofotometria a um comprimento de onda de 490 nm usando D-xilose como padrão. Como os polissacarídeos são ricos em grupos hidroxila (-OH), eles podem ser facilmente desidratados. Para isso utilizou-se um ácido forte como ácido sulfúrico que rompe facilmente as ligações glicosídicas presentes nessas moléculas, liberando os monossacarídeos presentes. Uma vez liberados esses monossacarídeos
27
desidratados geram um composto incolor conhecido furfural, quando o monossacarídeo desidratado for uma pentose, e o hidroximetilfurfural (HMF), quando for uma hexose. Após esse processo, adiciona-se fenol a 80%, que gera uma coloração amarelo-alaranjado. A mudança de coloração da solução foi medida na região do visível e é proporcional à quantidade de açúcares presentes na amostra. Esse método é conhecido como Fenol-H2SO4 ou Método de Dubois 57.
4.2 Caracterização das nanopartículas
4.2.1. Espectroscopia de UV-visível
A formação das nanoxilanas (NX) e redução da prata foram analisadas observando-se uma mudança na coloração da solução. A solução de coloração amarelo claro representou o tempo zero (0 h); a intermediária o tempo 12 h e a de coloração intensa (marrom escuro) o tempo total da síntese de 24 h. Esse aspecto foi monitorado por espectroscopia eletrônica na região UV-visível com leituras realizadas de 350 a 600 nm. Foi utilizado o Espectrofotômetro UV/Visível modelo DR 5000 Hach Lange GmbH (Düsseldorf, Alemanha).
28
5. ARTIGO PRODUZIDO
O artigo “Synthesis of trypanocidal active silver nanoparticle employing
corn cob xylan as a reducing agent” foi aceito no periódico International Journal of
Nanomedicine que possui fator de impacto 4.471 (ano 2018) e Qualis A1 da CAPES para área Medicina II.
29
Synthesis of trypanocidal active silver nanoparticle employing corn cob xylan as
a reducing agent.
Talita Katiane Brito1,2, Cláudia Jassica Gonçalves Moreno3,5, Rony Lucas Silva
Viana2,3, Jefferson da Silva Barbosa1,2,4, Francimar Lopes de Sousa Júnior6, Mayara
Jane Campos de Medeiros6, Raniere Fagundes Melo-Silveira2,3, Jailma
Almeida-Lima1,2,3, Daniel de Lima Pontes6, Marcelo Sousa Silva3,5,7, Hugo Alexandre Oliveira
Rocha 1,2,3 *
1Postgraduate Program in Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte
(UFRN), Natal-RN 59012-570, Brazil; talitakatiane@hotmail.com (T.K.B);
biolottus23@yahoo.com.br (J.A.L).
2Laboratory of Biotechnology of Natural Polymers (BIOPOL), Department of Biochemistry, Center of Biosciences, Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), Natal-RN, 59078-970, Brazil; rony_lucas@hotmail.com (R.L.S.V); ranieremelosilveira@gmail.com (R.F.M.S).
3Postgraduate Program in Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte UFRN), Natal-RN, 59.078-970, Brazil.
4Federal Institute of Education, Science and Technology of Rio Grande do Norte (IFRN), Rio Grande do Norte 59500-000, Brazil; jefferson.barbosa@ifrn.edu.br (J.S.B); 5Laboratory of Immunoparasitology, Department of Clinical and Toxicological Analysis, Health Sciences Center, Federal University of Rio Grande do Norte,
Natal-30
RN, 59012-570, Brazil;claudia.mrn1@gmail.com (C.J.G.M); mssilva.ufrn@gmail.com (M.S.S).
6Laboratory of Chemistry of Coordination and Polymers (LQCPol), Institute of Chemistry, Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), Natal - RN 59078-970, Brazil; francimar_junnior@hotmail.com (F.L.S.J); mayarajane20049@hotmail.com (M.J.C.M); pontesdl@yahoo.com (D.L.P).
7Global Health and Tropical Medicine, Institute of Hygiene and Tropical Medicine, New University of Lisbon, 1349-008, Lisboa, Portugal.
Correspondence: Hugo Alexandre Oliveira Rocha, Laboratory of Biotechnology of Natural Polymers (BIOPOL), Department of Biochemistry, Center of Biosciences, Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), Natal-RN, 59078-970, Brazil; hugo@cb.ufrn.br
Background: Chagas disease, also known as American Trypanosomiasis, is caused
by the protozoan Trypanosoma cruzi. It is occurring in Americas, including USA and Canada, and Europe and its current treatment involves the use of two drugs as follows: benznidazole (BNZ) and nifurtimox, which present high toxicity and low efficacy during the chronic phase of the disease, thus promoting the search for more effective therapeutic alternatives. Xylan, a bioactive polysaccharide, was extracted from corn cob using an environmentally friendly method.
31
Methods: Xylan from corn cob was characterized by FTIR (Fourier-transform
infrared spectroscopy) and monosaccharide composition. MTT (3-bromo(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium).
Result: Data from atomic force microscopy, FTIR, UV-Visive, Raman spectrocopy,
and coupled plasma atomic emission showed that NX was composed by xylan and silver (19%), with rounded shapes and average sizes (~ 40 nm). MTT and Flow cytometry analyses showed that NX (100 µg/mL) induces almost 100% death of the parasites (~95% necrosis), whereas xylan and silver were not effective.
Conclusion: This is the first time silver nanoparticles are presented as a trypanocidal
agent and the data point to the potential application of NX to new preclinical studies in vitro and in vivo.
Keywords: Xylan; Silver nanoparticles; Trypanosoma cruzi; Benznidazole.
1. Introduction
For several years, Chagas disease had assumed a predominantly rural profile, but has now become part of the urban zone due to movement of the population from country sides to cities, due to increased deforestation and socioeconomic changes. This migration has also affected non-endemic areas such as Europe, USA and Canada.1–3 Also known as American Trypanosomiasis, it is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and is transmitted among other forms by insects of the Triatominae subfamilys.4 It is estimated that around 8 million people worldwide, particularly those residing in
32
Latin America, are infected with Trypanosoma cruzi. More than 10 thousand people die of the disease every year and more than 25 million are at a risk of acquiring it.5
Chagas disease has two successive phases, acute and chronic.2 There are no vaccines to treat the patients affected by the disease and their treatment is pharmacological. On the other hand, these drugs are used to treat the disease mainly in its acute phase, reducing symptoms and parasitemia. The current treatment involves the use of two drugs: benznidazole (BNZ) and nifurtimox. Both are far from ideal due to their side effects, limited efficacy and little is known about their activity in the chronic phase. These disadvantages justify the urgent need to identify better drugs for the treatment of chagasic patients.6,7 Considering this scenario, researches aimed at prospecting bioactive molecules from natural sources has increased significantly over the years.8–11
In the secondary cell walls of Gramineae and dicotyledons, for example, the main hemicellulose is a polymer composed of D-xylose units linked by β glycosidic (1 → 4) bonds called xylans.12 Xylans from different sources have been used in the biosynthesis of grafts, bandages and sutures, synthesis of micro and nanoparticles13,14 as well as for the controlled release of drugs.15–17 It has been reported in the literature that corn cobs (Gramineae), underutilized in industry and often discarded, are the most promising material for the extraction of this biopolymers.18
Xylans obtained from corn cobs had a chemical composition consisting of 4-O-methyl-D-glucuronic acid, L-arabinose and D-xylose in a ratio of 2:7:19.19,20 It has been also reported that the xylans from corn cobs demonstrate immunomodulatory21,
33
antioxidant, anticoagulant and antibacterial properties as well as cytotoxicity to tumor cells.22
The synthesis of nanoparticles, including silver nanoparticles, often leads to the production of several undesirable wastes. Therefore, the search for more effective and environmentally friendly methods is ongoing. These methods are known as green synthetic methods and are considered efficient since they do not use toxic reagents, such as water, for the environment.23
Studies from our research group have shown that the green synthesis of silver nanoparticles with polysaccharides has potentiated the biological activity of both polysaccharides and silver. According to Amorim et al24, the cytotoxic activity of sulfated polysaccharides (sPS) of the seaweed Spatoglossum schröederi was potentiated against renal adenocarcinoma cells 786-0. Also, the antitumor, immunomodulatory and antibacterial activities of the sPS of the seaweed Dictyota mertensii had intensified.25 In both cases, they composed the structure of silver nanoparticles.
Our group also demonstrated that xylan from corn cobs exhibits several biological activities, particularly, antiproliferative activity against uterine adenocarcinoma cells26 and antioxidant activity.22 However, the activities of this
molecule were not evaluated when they are part of the silver nanoparticle structure
regarding its antiparasitic activity against T. cruzi. Therefore, in the present study, silver nanoparticles containing xylans of corn cobs were synthesized to evaluate their effects against T. cruzi.
34
2. Materials and Methods
2.1. Materials
MTT (3-bromo-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium), silver nitrate (AgNO3), D-xylose, bovine serum albumin (BSA), cell culture media - liver infusion tryptose (LIT), dextrose, hemina, tryptose and liver infusion broth were purchased from the Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). NaCl, KCl and Na2HPO4 from the INLAB (São Paulo, SP, Brazil). Sterile fetal bovine serum was purchased from the Cultilab (Campinas, SP, Brazil). Benznidazole (Rochagan) Hoffmann-La Roche (Basel, Switzerland) was provided by the consortium of the BERENICE (BEnznidazole and Triazole REsearch group for Nanomedicine and
Innovation on Chagas diseasE - Barcelona, Spain) project. We also procured the
Bradford reagent from the Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) and the Folin-Ciocalteau reagent from the Merck KGaA (Darmstadt, Hessen, Germany). Penicillin and streptomycin were obtained from Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA). Sodium hydroxide, sulfuric acid and methanol were purchased from the CRQ (Diadema, SP, Brazil). Phenol was obtained from the Reagen Quimibrás Indústrias Químicas S. A. (Rio de Janeiro, RJ, Brazil). Annexin V Apoptosis Detection Kit for flow cytometry (Annexin-FITC, Propionate Iodide - PercP) was purchased from BD Biosciences Inc. (San Diego, CA, USA).
35 2.2. Extraction of xylan from corn cobs
Fresh corn samples bought from a local market (Natal, RN - Brazil) were peeled, cleaned and washed. They were then cut into small pieces, dried in a kiln at 60 °C and ground until its flour was obtained. 160 mL of methanol was added to 10 g of flour produced from the cob and the material was stirred for 24 h in the dark to remove lipids and pigments. The precipitate was collected by centrifugation (10,000 × g, 20 min, 4 °C), dried and stored in hermetically sealed vials at 25 °C until use. For the extraction of the polysaccharides, 25 mL of the solution of NaOH (1.8 mol/L) in the ratio of 1:25 (w/v) was added to 1 g of corn cob flour. This solution was sonicated at an ultrasound power of 200 W for 30 min at intervals of 5 min and a temperature of 60 °C. The solution was centrifuged to separate the extracted material from the insoluble residue. Four volumes of chilled methanol was added to the supernatant under conditions of gentle agitation and was held protected from light at 4 °C for 24 h. The precipitate thus formed was collected by centrifugation (10,000 × g, 20 min, 4 °C), dried and stored in flasks at 25 °C for further analysis.
2.3. Chemical analysis of xylan
The contamination of xylan by phenolic compounds was evaluated using the Folin-Ciocalteau method and gallic acid was used as the standard, as described by Nascimento et al.27 Protein contamination was assessed using the Bradford reagent
36
and bovine albumin was used as the standard.28 Total sugars were analysed by the reaction of phenol-H2SO4 and D-xylose was used as the standard.29
2.3.1 Determination of the monosaccharide composition of xylan
An analysis of the monosaccharide composition was performed as described by Melo-Silveira et al.22 The material after being hydrolysed was subjected to sugar composition analysis using the LaChrom Elite® VWR-Hitachi high performance liquid chromatography (HPLC) system with a L-2490 refractive index detector. The column used was LichroCART® 250-4 Lichrospher® 100 NH2 (10 μM). The mobile phase used in the test was with acetonitrile: water (80:20) in a flow rate of 1 mL/ min, at 40 °C. The following sugars were analysed as references: arabinose, galactose, glucose, glucuronic acid, fructose, fucose, mannose, N-acetyl-glucosamine, galactosamine, rhamnose and xylose.
2.4. Synthesis of nano xylans silver
The nano xylans were obtained using the process of green synthesis described by Dipankar et al.30 The corn cob xylan was used as a bioreductor in this experiment. The synthesis of NX was performed by the addition of a solution of 1.0 mM silver nitrate to a 10 mg/mL (1:9 w/v) solution of xylan. The solution was subjected to continuous stirring for 24 h and was placed in conditions protected from the light. After this period, it was centrifuged at 10,000 × g for 15 min at 25 °C. The precipitate was collected and lyophilized.
37 2.5. Characterization of the nanoparticles
2.5.1. UV-Visible spectroscopy
The formation of NX and reduction of silver were analysed by observing a change in the color of the solution. Electron spectroscopy in the UV-visible region with readings in the 350 to 800 nm range was performed to monitor these reactions using the UV/Visible spectrophotometer model DR 5000 Hach Lange GmbH (Düsseldorf, Germany).
2.5.2. Atomic force microscopy (AFM) analysis
The samples were dried on coverslips in a desiccator. Images of the NX were obtained using the scanning probe microscope SPM – 9700 (Shimadzu, Kyoto, Japan), in the Scanning Electron Microscopy Laboratory (Laboratório de Microscopia Eletrônica de Varredura – LABMEV – Department of Materials Engineering) of the Federal University of Rio Grande do Norte (Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN).
2.5.3 Quantitative determination of silver in nano xylans by coupled plasma optical emission spectroscopy (ICP-OES)
2.5.3.1 Sample digestion
Analytical scales were used to weigh 100 mg of sample in Teflon cups (total 200 mg of sample; 100 mg of each cup), to which 7 mL of 65% nitric acid purified by
sub-38
boiling distillation (Berghof, Eningen, Germany) and 1mL of 30% hydrogen peroxide (Merck, Darmstadt, Germany) were added. The digestion cups were subsequently closed and digestion was performed in a microwave digester (Start D, Milestone, Italy) using 6 stages and a power of 1100W:(1) 5 min at 70 °C; (2) 2min at 70 °C;(3) 3min at 120 °C; (4) 2 min at 120 °C;(5) 10min at 170 °C;(6) 15 min at 170 °C and lastly 30 min of ventilation before there moval of the rotor from the microwave. The digested content was quantitatively made up to 15 mL using deionized water and filtered through a 0.45 µm membrane. The analyses were conducted in duplicate and analytical blanks were performed by conducting the procedure in the absence of sample.
2.5.3.2 Determination of silver content the digested sample
Silver content of digested sample (NX) was quantified using an inductively coupled plasma emission spectrometer (ICP-OES 5100 VDV, Agilent Technologies, Tokyo, Japan) in axial view, equipped with a radio frequency source (RF) of 27 MHz, using a simultaneous optical detector, a peristaltic pump, a double pass cyclonic spray chamber, a 1.8 mm quartz torch, and a spray glass nebulizer. The gas used in the system was plasma liquid argon with a purity of 99.996% White Martins, SP, Brazil). The ICP-OES equipment operated under the following conditions: power of the plasma, 1.5 kW; argon flow, 12.0 L/min; auxiliary argon flow, 1.0 L/min; nebulization flow, 0.70 L/min; number of replicates, 3; stabilization and reading time, 15 s, wavelength, 328.068 nm. The analytical curve for silver was prepared by diluting 1000 mg/L of reference standard solution (Merck, Darmstadt, Germany) into a 2.5–100 g/L range (r= 0.9999) in a solution of 5% (v/v) nitric acid prepared from 65% acid distilled
39
in a subboiling system (Distillacid, Berghof, Eningen, Germany). Serial dilutions were prepared for sample measurement: i) 0.1 mL/10 mL and ii) 0.2 mL/10 mL.
2.5.4 Analysis using Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR)
The samples (10 mg) were mixed with KBr, triturated, and pellets, made from this material, were subjected to FT-IR. Spectra of the samples were obtained using a spectrophotometer (IRAAffinity-1 Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) equipped with the IRsolution Shimadzu Corp. software (Kyoto, Japan) version 1.60 with scan number 32 and 4 cm-1 resolution. The frequency range for the analysis was 4000 to 400 cm-1. The analyses were carried out at the analytical center of UFRN's Chemistry Institute and the Coordination and Polymers Chemistry Laboratory (Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros - LQCPol - Department of Chemistry) of the Federal University of Rio Grande do Norte (Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN). Three independent analyses were performed.
2.5.5 Analysis using Raman spectroscopy
The Raman spectra were obtained from pre-crushed samples in the solid state. The samples were analysed using the Raman confocal microscope, model LabRAM HR Evolution, HORIBA Scientific with the CCD detector. For this purpose, the 633 nm laser with an acquisition time of 20 s and 2 s of accumulation in the region of 30 to 4000 cm-1 was used. The analyses were carried out at the Coordination and Polymers Chemistry Laboratory (Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros –
40
LQCPol – Department of Chemistry) of the Federal University of Rio Grande do Norte (Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN).
2.6 Evaluation of the antiparasitic activity of nano xylan by the colorimetric MTT (3-bromo(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) reduction assay
The epimastigote forms of the Y strain of T. cruzi were maintained in LIT supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA - USA) at 28 ± 2 °C in a biochemical oxygen demand (BOD) kiln. The strains were cultured until the exponential phase of growth (1 ×107 parasites/mL) was reached. Samples were tested at concentrations of 2.5, 10 and 100 μg/mL and incubated at 28 ± 2 °C for 24 h and 48 h. 90 μL of the culture (1 ×107 parasites) and 10 μL of nanoparticles were added to a 96-well plate and incubated for 24 h. After incubation, 10 μL of MTT (5 mg) was added, and after 75 minutes of incubation in a BOD kiln, 100 μL of the solubilisation solution (0.01N HCl and 10% SDS) was added. Absorbance was read at 570 nm using the Epoch Microplate Spectrophotometer obtained from BioTek (Winooski, VT, USA). The assays were performed in triplicate and the data obtained were processed with the GraphPad Prism software version 5.0, 2014 (La Jolla, California, USA).
2.7 Flow cytometry
The mechanisms of cell death of the T. cruzi parasite through apoptosis/necrosis were investigated by labeling with Annexin V/Propidium iodide by following the manufacturer’s instructions from the Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit -
41
Invitrogen. After treatment with nanoparticles for 24 hours, the parasites were centrifuged at a speed of 2000 rpm at 4 °C for 5 minutes. The pellet, thus obtained, was washed with phosphate buffered saline (PBS), resuspended in the binding buffer and the Annexin V/PI labeling was performed for 10 min at 25 °C protected from the light. The analysis was performed on the FACSCanto II flow cytometer (BD Biosciences, Eugene, OR, USA) with the FACSDiva software, version 6.1.2 (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, USA). For each experimental condition, 20,000 events were captured, and the percentage of labeled cells was calculated in the FlowJo Software Version vX.0.7 1997-2014 (FlowJo, Ashland, OR, USA).
2.8 Statistical analysis
The experiments were performed at least twice and in triplicates. Data were analysed using the ANOVA test, followed by the Tukey test. Statistical analyses were conducted using the Prism 5 software (GraphPad software, version 5.0, 2014 La Jolla, California, USA). Values of p < 0.05 were considered statistically significant. The results were expressed as mean ± standard deviation.
3. Results and discussion
3.1 Extraction and chemical analysis of the corn cob xylan
Xylan was extracted as described in the methods section, and the content of its total sugars, proteins and phenolic compounds was determined. It can be observed in Table 1 that the sample consists majorly of carbohydrates (97.42%), and the obtained
42
xylan is composed mainly of xylose (50%), glucose (20%), arabinose (15%) and galactose (10%) as well as some amounts of mannose (2.5%) and glucuronic acid (2.5%) residues. Similar compositions of monosaccharides were observed in other studies that evaluated xylans extracted from corn cob31 although their values differed from those observed in our work. On the other hand, in the corn cob xylan studied by Melo-Silveira et al22,26 the composition of monosaccharides as well as their proportions were similar to those presented in Table 1. It is worth mentioning that these authors used the same process described in this study.
Table 1. Chemical composition of xylan extracted from corn cob
axyl: xylose; bara: arabinose; cglc: glucose; dgal: galactose; eman: mannose; fGlcA: glucuronic acid.
3.2. Synthesis of silver nanoparticles with xylan (nano xylan)
The UV-Vis spectroscopy was used as an essential tool to confirm the synthesis of nanoparticles containing silver30 and assist in the analysis for the formation of nanocomposites with reduced silver. Therefore, an analysis was performed using this technique with a scanning range of 350-800 nm for the silver nanoparticle solution. In the region highlighted by the rectangle (between 400-450 nm) in Figure 1, a change in
Molar Ratio (%) Sample Polysaccharide (%) Protein (%) Phenolic Compounds (%)
aXyl bGlc cAra dGal eMan fGlcA
43
the light absorption profile, evidenced by a small increase in the absorbance values, is observed. From this region, a decrease in the absorbance is observed that almost reaches zero during the sweep. When the silver nitrate or xylan solutions were analysed separately in the 400-450 nm range, the same absorption profile was not observed in this wavelength range (data not shown). This signal is characteristic of reduced silver and indicates the formation of silver nanoparticles.32,33 Similar to the use of xylan employed in this work, in other studies, the use of polysaccharides with
reducing agents to synthesize silver nanoparticles has already been described.24,25,34
Figure 1. UV-visible light absorption spectrum of the silver nanoparticle suspension. Scan performed
between 350 and 800 nm.
3.3. Determination of the composition of NX
Constituents of NX were determined as described in the methods section and were found to consist of xylan (81%) and silver (19%). There are no reports in the literature about studies that have evaluated the amount of silver in nanoparticles
44
synthesized with the xylan polysaccharide. However, some authors have verified the amount of silver in the structure of nanoparticles containing other polysaccharides. In studies conducted by Amorim et al24 and Chen et al35, 7% and 6.7% of silver were found, respectively, in a fucan-coated nanoparticle composition and in nanoparticles synthesized with fungal exopolysaccharide. These values are lower than those obtained by us in our study using corn cob xylans. However, it is worth mentioning that the efficiency of synthesis of silver nanoparticles and their characteristics depend on certain factors such as temperature, concentration of plant extract used during the process and reaction time36, which would explain the previously described variation in values as well as the variation presented in this study.
3.3.1. Morphological analysis of NX by AFM
To evaluate the size of NX in the solution, their average size was determined using AFM, which was approximately 40 nm, and had a rounded/spherical shape (Figure 2).
45
Figure 2. Atomic Force Microscopy of silver nanoparticles containing corn cob xylan. In A, the
nanoparticle can be seen in two dimensions. The arrow indicates the size of the nanoparticle (40.17 nm).
B shows the representation of image A in three dimensions. It is also possible to observe the rounded
shape of the particles.
It is possible to obtain nanoparticles larger or smaller than those found in this research. However, silver nanoparticles with sizes ranging from 5 to 150 nm in diameter (45-48) have been commonly observed in literature. Another essential characteristic is the relation between the size of the nanoparticles and the response they cause in biological systems, since the cytotoxicity of silver nanoparticles is influenced by variations in their particle size.37
Studies report that smaller particles can induce higher cytotoxicity since they can be easily internalized by the cells. To support this hypothesis, Carlson et al38 using silver nanoparticles of sizes 15, 30 and 55 nm, found that the smaller nanoparticles (15 nm) generated more reactive oxygen species in murine macrophage lines. Liu et al39 in turn, working with four human cell lines (A549, HepG2, MCF-7 and SGC-7901), also found that silver nanoparticles with a diameter of 5 nm were more toxic than those with 20 and 50 nm.
Morphology is another factor that can influence the activity of different types of silver nanoparticles. The most commonly produced structures are as follows: spherical, triangular, square, cubic, rectangular, oval and acicular. Considering their toxicity, it is not yet known which form of the particle has the best effect on biological systems and it will depend on several factors (concentration, pH, temperature, electric
46
charge) instead of a single factor. However, what has already been observed is that spherical-shaped silver nanoparticles, such as the NX studied in this work, do not have damaging effects on the cells.40,41
3.3.2 Analysis using FT-IR
FT-IR is an important and widely used technique to study the physicochemical and conformational properties of compounds.42 Therefore, corn cob xylan and NX were analysed using infrared spectroscopy and its spectra are presented in Figure 3. There was no overlap in the spectra but there is a coincidence of bands found in both.
47
Bands in both spectra with absorption close to the 3430.70-3429.93 cm-1 regions were attributed to the O-H stretch of the xylan monosaccharides. Oliveira et al20 reported that this absorption bandwidth occurs because of the stretching of the monosaccharide hydroxyls associated with the water molecules by intra and intermolecular hydrogen bonds.
The presence of arabinose side chains is characterized by a low-intensity band in the 1161.41 cm-1 region. This band corresponds to the C–O–C vibrations in the anomeric region of the xylan.43 Another prominent band observed in the 1046.59 cm-1 region of both spectra, which is a characteristic of xylans, was attributed to the stretching of the C-C and C-O groups present in the sugar residues.44
The two bands that need to be highlighted are those observed at 896.90 cm-1 and 1039.63 cm-1. The first band was attributed to the anomeric carbon of the β-glycosidic bonds of the monosaccharides, while the second band is characteristic of xylans containing β (1→ 4) glycosidic bonds.45 Also, C, Li46 and Nacos et al47 have stated that these bands are characteristics of polysaccharides with xylose units in their main chain.
In both spectra, bands of moderate intensity in the 2936.63 cm-1 region were also observed which are characteristic of the C-H group stretches typical of monosaccharides.48,49
It has been reported in the literature that bands near the 1400 cm-1 region of the nanoparticle spectra correspond to those of reduced silver.50 With xylan, this band appears in the spectrum of the silver nanoparticles around 1392 cm-1.
48
We also observed the presence of a band in the 1923 cm-1 region of the NX spectrum and its absence in the xylan spectrum, which can be an indicator of the presence of clusters during the formation of the nanoparticle or the superposition of vibrational movements. However, we did not find data in literature reporting the presence of this band in the spectra of the silver nanoparticle with xylan.
Some xylan bands appeared to be displaced in the NX spectra compared to those of the free xylan spectrum, probably because of interaction between the silver and polysaccharide, resulting in modifications in the electron density around the xylan groups and displacing their vibrational modes.
Infrared analyzes suggest the interaction of polysaccharide (xylan) groups with silver, confirming the formation of silver nanoparticles with the corn cob xylan.
3.3.3. Analysis of xylan and NX using Raman spectroscopy
Raman spectroscopy is a technique widely used to complement the study of infrared spectroscopy.51 This analysis was carried out to confirm the structure of xylan
due to its complex nature52 and to analyse the formation of silver nanoparticles bound
to this compound.
There are few reports in literature on the analysis of the structure of xylan using the Raman technique. Therefore, the assignment of bands in the present work was based on interpretations of the spectra and performed using the data obtained from the Raman analyses of other polysaccharides.
49
In Figure 4, the presence of β-type glycosidic bonds (1→4) is identified by a band common to both spectra in the region around 840.18 cm-1.53 These authors also evidenced the same band in the Raman spectra of wheat arabinoxylans, which have xylans in its main chain.
Three bands around 1187 cm-1 (xylan) and 1201.80 cm-1 (NX) can be observed in Figure 4. These bands are closely related to the C-O-H and C-H groups. Zeng et al52 reported that xylans from the cell walls, that are solubilized by enzymes, also showed bands around the region between 1100 and 1220 cm-1.
Bands of glucopyranose rings were observed in the spectral range of 1100 to 900 cm-1, which are indicative of the C–C and C–O stretch modes.54
In the spectrum of NX, it can be noted that the main vibrational modes of xylan, as discussed already, are present and the majority of them have coincident bands except for an intense and wide band in the region of 2721.86 cm-1. However, after analysing many studies that have used the Raman technique to evaluate nanoparticles containing silver and polysaccharides, it was found that none presented an interpretation of this band making it difficult to understand its significance in the NX spectrum. Thus, it is necessary to conduct a study that goes beyond the scope of our work to explain its meaning.
Moreover, this spectrum is clearer and contains bands that are better defined than that of xylan. This corroborates with the report of Li et al,55 which asserts that the quality of Raman signals is affected by the size of their metal cores.
50
Data presented in this paper confirm the interaction of xylan with silver and the formation of silver nanoparticles. The synthesis of silver nanoparticles containing polysaccharides aims to improve biological activities not only of the polysaccharides themselves but also of the silver, since the presence of polysaccharides, such as xylan, allows a better acceptance of the nanoparticles by the cells. For example, in the study conducted by Akmaz et al,56 it was noted that the chitosan/silver nanoparticles had significantly higher bacterial activity than that of pure chitosan.
Figure 4. Raman and infrared spectra of xylan and nano xylan.
The analyses were performed using a 633 nm laser with an acquisition time of 20 s and 2 s of accumulation in the region of 500 to 4000 cm-1. All samples were obtained using this methodology. 3.4 Evaluation of the antiparasitic activity of nano xylan by the colorimetric MTT (3-bromo(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) reduction assay
51
Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is endemic in Latin America and manifests itself in two distinct phases, acute and chronic. BNZ is the drug of choice for treatment in the acute phase. However, despite its effectiveness, it is highly toxic. On the other hand, for the chronic phase of the disease, currently, no effective treatment is available. BNZ has low solubility/bioavailability and high toxicity and because of these factors may not affect an intracellular form the parasite.57 Therefore, it is crucial to search for new drugs that are effective. Some studies show silver as a treatment of choice due to its antimicrobial properties, however, due to its known cytotoxicity, its application is limited.58One way around this problem is to use silver in the form of nanoparticles, because in this formulation it is possible to use smaller doses of the element, thus making it less toxic. Moreover, the use of silver nanoparticles with polysaccharides becomes interesting because many of these molecules can easily cross the cell membrane without causing damage to normal cells.34,59
Figure 5 shows the antiparasitic activity of NX when incubated at concentrations of 2.5, 10 and 100 μg/mL for 24 and 48 h. BNZ was used as a positive control, as shown in Figure 5. In 24 h, only the highest concentration evaluated (100 μg/mL) was able to decrease the ability of the parasite to reduce MTT. However, at 48 h, its ability to reduce MTT was decreased when subjected to lower concentrations of BNZ (2.5 and 10 μg/mL). On the other hand, the effect of BNZ at its highest concentration on the ability of the parasite to reduce MTT was lower than that
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observed at 24 h (Figure 5B). This decrease in the effect of BNZ on the parasites in strain Y has also been reported by other authors.60
Under no conditions was the xylan able to inhibit the parasite-reducing action against MTT, even with the highest concentration tested (100 μg/mL). A similar result was observed when the effect of silver nitrate was evaluated, which showed that the two NX compounds, when isolated, do not affect the parasites. It is noteworthy that the amount of silver nitrate used contained 30 μg/mL of silver, which is 1.5 times greater than that present in the 100 μg/mL of NX.
Figure 5. Antiparasitic activity of xylan and nano xylan on the epimastigote forms of T. cruzi after
incubation for 24 h (A) and 48 h (B). The negative control is represented by CN. The positive control (BNZ) is represented by BNZ. Silver nitrate (AgNO3 - 30 μg/mL), nano xylan (NX and xylan (XYL). Different letters (a, b, c) indicate a significant difference (p < 0.05) between various concentrations of the same sample. Different numbers (1, 2, 3) indicate a significant difference (p < 0.05) between the same concentration of different samples. Statistical analysis was performed using ANOVA followed by the Student-Newman-Keuls post-test.
