UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
OCORRÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA O VÍRUS DA
CINOMOSE CANINA, PARVOVÍRUS E Ehrlichia spp. EM
CARNÍVOROS CATIVOS DO ZOOLÓGICO DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO, BRASIL
Isis Indaiara Gonçalves Granjeiro Taques
CUIABÁ – MT 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
OCORRÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA O VÍRUS DA
CINOMOSE CANINA, PARVOVÍRUS E Ehrlichia spp. EM
CARNÍVOROS CATIVOS DO ZOOLÓGICO DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO, BRASIL
Autora: Isis Indaiara Gonçalves Granjeiro Taques Orientador: Prof. Dr. Daniel Moura de Aguiar Co-Orientadora: Profa. Dra. Sandra Helena Ramiro Corrêa Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
CUIABÁ – MT 2016
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Amarílio e Guiomar, pelo apoio nas minhas escolhas e pela dedicação de sempre!
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela proteção divina em minha vida!
Aos meus pais, por todo ensinamento, pelas palavras de conforto nos momentos de dificuldades.
Ao meu noivo, Valdemir, pelo companheirismo e amor.
Ao meu sobrinho lindo, Antônio Pedro, pelo sorriso sincero.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Daniel Moura de Aguiar, por acreditar na realização deste trabalho, pela oportunidade, ensinamentos e por sempre instigar a busca pelo conhecimento científico.
A minha co-orientadora Profa. Dra. Sandra Helena Ramiro Corrêa e Profa. Dra. Regina Celia Rodrigues da Paz, pelo concessão das amostras.
A médica veterinária do Zoo-UFMT, Thaís Morgado, pelo auxílio nas coletas.
As colegas do LVR, Alice, Izabelle, Jackeliny, Ísis, pela parceria e por tornarem o ambiente de trabalho agradável.
Ao Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri e Profa. Dra. Alice Fernandes Alfieri por permitir a realização de parte do trabalho no Laboratório de Virologia Animal da UEL.
A médica veterinária do Laboratório de Virologia Animal da UEL, Juliana Torres Tomazi Fritzen pelo suporte técnico.
RESUMO
OCORRÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA O VÍRUS DA CINOMOSE CANINA, PARVOVÍRUS E Ehrlichia spp. EM CARNÍVOROS CATIVOS DO ZOOLÓGICO
DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO, BRASIL
A ocorrência de anticorpos contra o vírus da cinomose canina (CDV), parvorvírus e Ehrlichia spp. em carnívoros selvagens cativos foram avaliados em um jardim zoológico no Centro Oeste do Brasil. As amostras foram coletadas entre os anos de 2007 e 2014 de 45 carnívoros, incluindo espécies das famílias Canidae, Felidae, Procyonidae e Mustelidae. Os anticorpos foram avalidos pelo teste de vírus neutralização (VN) para CDV (ponto de corte: 8), inibição da hemaglutinação (HI) para parvovírus (ponto de corte: 80), reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para Ehrlichia spp. (ponto de corte ≥ 40) e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) para Ehrlichia canis. Anticorpos contra CDV e parvovírus foram detectados em 75% dos canídeos e felídeos (12/16). Procionídeos foram negativos para CDV, no entanto, um mustelídeos (Galictis cuja) foi positivo. Um Chrysocyon brachyurus e um Cerdocyon thous apresentaram anticorpos reativos para antígeno de E. canis. A alta frequência de anticorpos para o CDV e parvovirus sugere o contato dos carnívoros com ambos antígenos, no entanto, os animais responderam satisfatoriamente, visto que não a registros de doença clínica entre os carnívoros do Zoo-UFMT. A baixa frequência de anticorpos anti-Ehrlichia pode ser resultante da ausência de parasitismo por carrapatos. Outros estudos são necessários para compreender se a localização do Zoo-UFMT e a presença de animais domésticos em suas proximidades contribuíram para a propagação destes agentes infecciosos.
ABSTRACT
OCCURRENCE OF ANTIBODIES AGAINST CANINE DISTEMPER VIRUS, PARVOVIRUS AND Ehrlichia SPP. IN CAPTIVE CARNIVORES OF THE FEDERAL UNIVERSITY OF MATO GROSSO ZOO, BRAZIL
The occurrence of antibodies against canine distemper virus (CDV), parvovirus and Ehrlichia spp. in wild captive carnivores was evaluated in a zoological park in midwestern Brazil. Serum samples were collected between 2007 and 2014 from 45 carnivores, including the families Canidae, Felidae, Procyonidae and Mustelidae. Antibodies were evaluated by virus neutralization (VN) assay for CDV (cut-off: 8 VNU), hemagglutination inhibition (HI) test for parvovirus (cut-off: 80 HIU), indirect immunofluorescent assay (IFA) for Ehrlichia spp. (cut off: ≥ 40) and Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Ehrlichia canis. Antibodies against CDV and parvovirus were detected in 75% of Canidae and Felidae (12/16). Procyonidae were negative for CDV, although one Mustelidae (Galictis cuja) was positive. One Chrysocyon brachyurus and one Cerdocyon thous presented antibodies reactive to E. canis antigens. The high antibodies rates to CDV and parvovirus suggest the contact with both pathogens, however since no clinical history of disease are registered in the Zoo-UFMT, we can presume that carnivores have responded satisfactorily against the antigens. The low serological rates observed against Ehrlichia spp. may be resulted to the low occurrence of ticks among carnivores. Additional studies are necessary to understand if the localization of the Zoo-UFMT and the close presence of domestic animals to the zoo contributes for the propagation of CDV, parvovirus and Ehrlichia in the area.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Espécies e ano da coleta dos carnívoros cativos no Zoo-UFMT. Cuiabá-MT, 2016. __________________________________________________________________________ 24 Tabela 2 - Anticorpos anti-CDV nos cachorros-do-mato cativos no Zoo-UFMT. Cuiabá, MT. 2016 ___________________________________________________________________________ 30 Tabela 3 - Anticorpos anti-CDV nos carnívoros cativos no Zoo-UFMT. Cuiabá, MT. 2016 _ 31 Tabela 4 - Anticorpos anti-Parvovírus nos cachorros-do-mato cativos no Zoo-UFMT. Cuiabá, MT. 2016 _______________________________________________________________________ 31 Tabela 5 - Anticorpos anti-Parvovírus nos carnívoros cativos no Zoo-UFMT. Cuiabá, MT. 2016 ___________________________________________________________________________ 32
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Localização do Zoológico da Universidade Federal de Mato Grosso na área urbana de Cuiabá-MT. 2016. Fonte: Google Earth _________________________ 22 Figura 2: Contenção dos carnívoros para a captura no Zoo-UFMT, Cuiabá-MT, 2016. A: captura de uma irara com a utilização do puçá. B: dardo preenchido por cetamina e midazolam. C: Preparação da zarabatana. D: Onça-parda sedada. ___________ 25 Figura 3: Coleta de amostra sanguínea em um cachorro-do-mato, Cuiabá – MT, 2016. ____________________________________________________________ 25
SUMÁRIO RESUMO ... 8 ABSTRACT ... 9 LISTA DE TABELAS ... 10 LISTA DE FIGURAS ... 11 1 INTRODUÇÃO ... 13 2 REVISÃO DE LITERATURA ... 15
2.1 Vírus da Cinomose Canina (CDV) ... 15
2.2 Parvovírus ... 17 2.3 Ehrlichia spp. ... 19 3 OBJETIVO ... 21 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 21 4.1 Local de estudo ... 21 4.2 Amostragem ... 23 4.3 Análises laboratoriais ... 26 4.3.1 Vírus Neutralização (VN) ... 26
4.3.2 Inibição da Hemaglutinação (HI) ... 27
4.3.3 Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) ... 28
4.3.4 Ensaio Imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ... 28
5 RESULTADOS ... 30
5.1 Vírus Neutralização ... 30
5.2 Inibição da Hemaglutinação ... 31
5.3 Reação de Imunofluorescência Indireta ... 32
5.4 Ensaio Imunoabsorvente ligado a enzima ... 32
6 DISCUSSÃO ... 33
7 CONCLUSÃO ... 38
1 INTRODUÇÃO
A pesquisa de agentes infecciosos em animais selvagens tornou-se uma importante ferramenta para a conservação de espécies. Alterações ambientais naturais e antropogênicas possibilitam interações entre diferentes espécies potencialmente hospedeiras e agentes patogênicos culminando com diversos surtos de doenças infecciosas (CLEAVELAND et al., 2006; FUNK et al., 2001).
Neste contexto, os jardins zoológicos e as unidades de conservação desempenham importante papel na manutenção de espécies selvagens, de forma que, nessas condições possibilitam a aplicação de procedimentos diagnósticos avançados que contribuem expressivamente para o entendimento da relação patógeno-hospedeiro (MUNSON e COOK, 1993). Por outro lado, mudanças no hábito de cada espécie cativa, como a subnutrição, limitação espacial e o contato com espécies domésticas e o homem, desencadeiam alterações fisiológicas favorecendo assim, a instalação de infecções (CLEAVELAND et al., 2006).
O vírus da cinomose canina (CDV) pertence à família Paramyxoviridae e gênero Morbillivírus. É um vírus envelopado e apresenta genoma RNA fita simples (GREENE e VANDEVELDE, 2012) com relatos em todos os membros da ordem Carnivora (DEEM et al., 2000). A ocorrência da infecção por CDV têm sido frequente devastando populações de carnívoros selvagens em áreas de conservação (APPEL et al., 1994; ROELKE-PARKER et al. 1996). No Brasil, infecção pelo CDV tem sido relatado em animais de vida livre e cativos (MEGID et al., 2009; MEGID et al., 2010; MEGID et al., 2013; REGO et al., 1997) e inquéritos sorológicos realizados em unidades de conservação demonstraram a presença de anticorpos em espécies de procionídeos, felídeos e canídeos (FURTADO et al., 2013; HAYASHI, 2013; JORGE, 2010).
O parvovírus canino tipo 2 (CPV-2) e o vírus da panleucopenia felina (FPV) foram recentemente reclassificados no gênero protoparvovírus (COTMORE et al., 2014). São vírus pequenos que pertencem a família Parvoviridae e podem acometer uma grande variedade de carnívoros (GREENE E DECARO, 2012). Em cães, este parvovírus é o agente etiológico de uma grave gastroenterite viral (GREENE e DECARO, 2012). Nos felídeos domésticos, resulta em um quadro multissistêmico,
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altamente contagioso e letal na maioria dos filhotes (STUETZER e HARTMANN, 2014). Levantamentos sorológicos demonstraram anticorpos anti-parvovírus em canídeos e felídeos (BLANCO et al., 2011; FIORELLO et al., 2007; OROZCO et al., 2014). No Brasil, há relatos de mortalidade em canídeos cativos e carnívoros de vida livre (CURI et al., 2010; HAYASHI, 2013; HUBNER et al., 2010; JORGE, 2010; MAIA e GOUVEIA, 2002).
Ehrlichia spp. são bactérias intracelulares Gram-negativas, transmitidas por carrapatos que pertencem à ordem Rickettsiales e família Anaplasmataceae (DUMLER et al., 2001). Ehrlichia canis é o agente etiológico da Erliquiose Monocítica Canina (EMC), doença que afeta amplamente cães domésticos no Brasil (VIEIRA et al., 2011). A transmissão desta bactéria ocorre por meio do vetor, o carrapato marrom do cão, Rhipicephalus sanguineus (AGUIAR et al., 2007a). Diversas espécies da família Canidae são considerados hospedeiros vertebrados da EMC assim como os cães domésticos. No Brasil, detecção molecular e anticorpos anti-Ehrlichia spp. foram identificados em carnívoros selvagens cativos e de vida livre demonstrando a exposição destes animais para este agente (ALMEIDA et al., 2013; ANDRÉ et al., 2010; ANDRÉ et al., 2012; FILONI et al., 2006; WIDMER et al., 2011).
O Jardim Zoológico da Universidade Federal de Mato Grosso (Zoo-UFMT) é o único no Brasil situado dentro de um campus universitário. Localiza-se na área urbana de Cuiabá, sendo delimitado por residências. É um importante centro regional de visitação de espécies como onça parda (Puma concolor), jaguatirica (Leopardus pardalis), lobo-guará (Chrysocyon brachyurus), cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) e outras comuns nos biomas Amazônia, Cerrado e Pantanal. No entanto, atualmente é habitado por uma superpopulação de aves, répteis e mamíferos e diversos problemas estruturais são observados. Além disso, doenças infecciosas potencialmente transmitidas por animais domésticos já foram relatadas circulando em espécies de carnívoros selvagens cativas no Zoo-UFMT (ALMEIDA et al., 2011; SOUZA et al., 2010).
Com base nas características epidemiológicas dos agentes infecciosos supracitados, considerando a singular localização e as condições atuais do Zoo-UFMT, associado a importância das espécies cativas para a conservação da fauna o estudo desses patógenos torna-se necessário.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Vírus da Cinomose Canina (CDV)
O CDV é um RNA vírus, envelopado, pertencente ao gênero Morbillivírus, família Paramyxoviridae. É o agente etiológico da cinomose canina, uma doença altamente contagiosa, multissistêmica e endêmica mundialmente, que acomete principalmente cães domésticos (GREENE e VANDEVELDE, 2012).
A transmissão do CDV ocorre através de secreções e o contato próximo é necessário para a disseminação do vírus, pois devido sua característica envelopada, é rapidamente inativado no ambiente pelos raios ultravioletas, calor e ressecamento. O animal infectado pode eliminar partículas víricas por até três meses na urina. As cepas virais utilizadas atualmente para a produção de vacinas são antigas desta forma, é comum observar animais vacinados infectados pelo CDV. Os sinais clínicos ocasionados pelo CDV são principalmente, respiratórios, gastroentéricos e nervosos (GREENE e VANDEVELDE, 2012).
Os relatos de cinomose canina datam desde o século XVIII, no entanto, apenas no início do século XX foi proposta a etiologia viral deste agente infeccioso (CARRÉ, 1905) sendo confirmada em 1926, por um estudo experimental realizado em furões (LAIDLAW e DUNKIN, 1926).
A primeira ocorrência de cinomose em carnívoros selvagens foi em raposas-vermelhas (Vulpes vulpes) nos Estados Unidos (HELMBOLT e JUNGHERR, 1955), e desde então vêm sendo observada em todas as famílias da ordem Carnivora (DEEM et al., 2000).
Diversas epidemias de CDV foram relatadas em carnívoros selvagens sendo que, algumas delas causaram declínios populacionais significativos mostrando que este é um importante patógeno que pode afetar a conservação de muitas espécies selvagens. Williams et al. (1988) descreveram nos Estados Unidos um surto de CDV em furões-de-patas-negras (Mustela nigripes) que disseminou a última população destes animais. Os animais haviam sido capturados para a reprodução em cativeiro, no entanto, dois dias após a captura apresentaram sinais clínicos de cinomose e todos os animais morreram.
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Davidson et al. (1992) determinaram que o CDV é um importante patógeno ameaçador da conservação de raposas cinzentas (Urocyon cinereoargenteus) pois, o vírus foi responsável por 78% da mortalidade destes animais no sudeste norte-americano. Outro canídeo ameaçado por este agente patogênico é o cachorro-selvagem africano (Lycaon pictus). O CDV foi implicado como responsável por expressiva mortalidade em Botswana (ALEXANDER et al., 1996), Tanzânia (van de BILDT et al., 2002), e pelo desaparecimento da espécie em uma reserva no Quênia (ALEXANDER e APPEL, 1994). Nesta mesma reserva, 55% dos leões (Panthera leo) testados foram considerados positivos à sorologia (KOCK et al., 1998). Roelke-Parker et al. (1996) relataram surto de cinomose em leões do parque nacional do Serengeti na Tanzânia, que devastou 30% (aproximadamente 1000 indivíduos) da população leonina, e os cães foram implicados como fonte de infecção.
Populações de animais cativos também foram atingidas. Appel et al. (1994) relataram surto de CDV em um zoológico norte-americano que causou a morte de diversos felinos selvagens. Na América do Sul, Ferreyra et al. (2009) observaram o declínio na população de cachorros-do-mato em um parque na Argentina que mais tarde, o CDV foi caracterizado como responsável. Maia e Gouveia (2002) demonstraram que aproximadamente 19% dos lobos-guarás mortos em zoológicos no Brasil entre 1980-1998 foram vítimas da cinomose. Além destes relatos, inquéritos sorológicos e quadros clínicos isolados foram descritos.
Na Bolívia, Deem e Emmons (2005) detectaram dois lobos-guarás sororeagentes no Parque Nacional Noel Kempf Mercado e Fiorello et al. (2007) encontraram graxains-do-campo (Pseudalopex gymnocercus) soropositivos para o vírus da cinomose. Em um estudo anterior, cães amostrados no mesmo parque, foram também positivos (FIORELLO et al., 2004).
No Brasil, Rego et al. (1997) demonstraram mortalidade por CDV em furões (Galictis vittata), lobos-guarás e cachorros-do-mato cativos. Ainda, um cachorro-do-mato, uma raposinha-do-campo (Lycalopex vetulus) e um furão-pequeno (Galictis cuja) de vida livre morreram infectados por CDV (MEGID et al., 2009; MEGID et al., 2010; MEGID et al., 2013).
Inquéritos sorológicos realizados em unidades de conservação brasileiras localizadas nos estados de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Minas Gerais e São Paulo relataram soropositividade para CDV em cachorros-do-mato, lobos-guarás; onças-pardas, onças-pintadas, jaguatiricas e mãos-peladas (Procyon
cancrivorus) (CURI et al., 2012; FURTADO et al., 2013; HAYASHI, 2013; JORGE, 2008; NAVA et al., 2008).
De modo geral, o vírus da cinomose canina encontra-se disseminado em diferentes populações de carnívoros selvagens pelo mundo. Novos genótipos do vírus são relatados (BUDASZEWSKI et al., 2014; ESPINAL et al., 2014) originados a partir de mutações nas glicoproteínas de ligação a célula hospedeira. Portanto, o risco potencial de novos surtos de CDV em animais selvagens perdura.
2.2 Parvovírus
O Parvovírus felino (FPV), o parvovírus canino tipo 2 (CPV-2), o vírus da enterite dos visões (MEV) e o parvovírus dos guaxinins (RaPV) pertencem a família Parvoviridae, subfamília Parvovirinae. Atualmente encontram-se todos reclassificados como sendo a mesma espécie, protoparvovírus dos carnívoros 1 (proto: do Grego, primeiro) (CLEAVELAND et al., 2006; COTMORE et al., 2014).
O parvovírus felino foi inicialmente descrito como o agente etiológico da panleucopenia felina, uma doença infecto-contagiosa e endêmica, que acomete principalmente gatos domésticos. Gatos adultos podem ser assintomáticos ao adquirir a infecção, no entanto, em filhotes a doença geralmente é fatal, cursando com sintomatologia gastroentérica e nervosa (GREENE e DECARO, 2012). Há muito tempo o FPV foi implicado como patógeno responsável pela mortalidade de felídeos selvagens (GOSS, 1948; HINDLE e FINDLAY, 1932; HYSLOP, 1955; TORRES, 1941).
O CPV-2 foi conhecido mundialmente por ocasionar a parvovirose canina, gastroenterite viral mundialmente endêmica (GREENE e DECARO, 2012). A primeira descrição do agente ocorreu em 1978, e logo foi identificado como causador da gastroenterite viral que matou milhares de cães (APPEL et al.,1979). O vírus também atingiu os canídeos selvagens em um curto espaço de tempo. Já em 1979 foram detectados anticorpos em coiotes (Canis latrans) nos Estados Unidos e até 1981 a maioria dos animais desta espécie neste país eram soropositivos (THOMAS et al., 1984).
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Três hipóteses foram formuladas para explicar o surgimento do CPV-2, contudo, a mais aceita é que provavelmente derivou do FPV ou de um vírus intimamente relacionado e que animais selvagens participariam do processo de transmissão do FPV aos cães domésticos (TRUYEN et al., 1999). Apesar das sequências de DNA dos isolados de CPV-2 e FPV terem uma identidade superior a 98%, eles podem ser distinguidos através de anticorpos monoclonais (PARRISH e CARMICHAEL, 1983) e pela diferença de pH e temperatura para a ocorrência da hemaglutinação (SENDA et al., 1988).
Na década de 1980, duas variantes antigênicas emergiram e foram denominadas CPV-2a e CPV-2b sendo capazes de infectar felinos (MOCHIZUKI et al., 1993; MOCHIZUKI et al.,1996). Essas variantes antigênicas substituíram completamente o CPV-2, que ainda é utilizado na maioria das vacinas comerciais, e estão distribuídas na população canina mundial (Decaro et al., 2007). Em 2000, uma nova mutante do CPV-2, denominada CPV-2c foi descrita por Buonavoglia et al. (2001). Em Cuiabá - MT, por exemplo, Fontana et al. (2013) observaram que o CPV-2c é o genótipo predominante nos cães atendidos no hospital veterinário da UFMT.
A transmissão dos parvovírus ocorre por via oro-fecal. São bastante resistentes no ambiente podendo persistir por meses a anos se protegido do sol e de desinfetantes (GORDON e ANGRICK, 1986). Desta forma, quando introduzidos em uma região existe a possibilidade de permanecer por um longo período, acometendo de forma endêmica animais selvagens (CLEAVELAND et al., 2006).
Apesar da parvovirose canina ser relatada em cães de todas as idades a maior ocorrência é em filhotes, principalmente devido a replicação celular e condições imunológicas (GREENE e DECARO, 2012). Em animais selvagens, a mortalidade de filhotes é preocupante para a conservação das espécies em ameaça (CREEL et al., 1997; VEIJALLAINEN e SMEDS, 1988).
Relatos de mortalidade por parvovírus em lobos-guarás foram realizados por Mann et al. (1980) que diagnosticaram dois casos que vieram a óbitos por este vírus em um zoológico no estado de Virgínia, Estados Unidos. No Brasil, Maia e Gouveia (2002) detectaram o parvovírus como agente viral responsável por 21,5% das mortes nos zoológicos brasileiros.
Na América do Sul, há relatos de inquéritos sorológicos na Bolívia. Deem e Emmons (2005) relataram alta soro-ocorrência de lobos-guarás positivos no Parque
Nacional Noel Kempf Mercado e Fiorello et al. (2007) detectaram anticorpos anti-parvovírus em cachorros-do-mato e graxains-do-campo.
No Brasil, anticorpos foram detectados em grande variedade de espécies como cachorros-do-mato e vinagres (Speothos venaticus), lobos-guarás, raposinhas-do-campo, graxains-do-campo, onças-pardas e pintadas, jaguatiricas, e pequenos felídeos selvagens oriundos dos estados de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Acre, Rondônia, São Paulo e Rio de Janeiro (CURI et al., 2012; FILONI et al., 2006; HAYASHI, 2013; HUBNER et al., 2010; JORGE, 2008).
2.3 Ehrlichia spp.
Classificadas na ordem Rickettsiales e família Anaplasmataceae, as bactérias do gênero Ehrlichia são Gram-negativas, intracelulares obrigatórias e transmitidas por carrapatos. Infectam principalmente leucócitos (monócitos, macrófagos, granulócitos) de mamíferos (HARRUS et al., 2012) e células do intestino, da hemocele e da glândula salivar de carrapatos (GROVES et al., 1975). O gênero é composto pelas espécies: Ehrlichia canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris, E. ruminantium e E. minasensis (DUMLER et al., 2001; CABEZAS-CRUZ et al., 2016).
A primeira descrição do agente foi em 1935, na Argélia (DONATIEN e LESTOQUARD, 1935). Mais tarde, a doença foi reconhecida mundialmente ao levar a óbito vários cães militares dos Estados Unidos (HUXSOLL et al., 1970; KEEFE et al., 1982). Já o primeiro relato da bactéria no Brasil ocorreu em Minas Gerais, onde foram observadas inclusões citoplasmáticas compatíveis com mórulas de E. canis em linfócitos de cães (COSTA et al., 1973).
E. canis é o agente etiológico da Erliquiose Monocítica Canina (EMC), uma doença crônica, endêmica no Brasil e muitas vezes letal de cães. A doença é descrita em todos os continentes com exceção da Antártica e é relacionada à distribuição do carrapato vetor Rhipicephalus sanguineus (COHN, 2003, VIEIRA et al., 2011).
Em carnívoros selvagens, diferentes genótipos de Ehrlichia foram identificadas na Europa, Ásia, África, América do Norte e América do Sul. Na
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Europa, Groen et al. (2002) observaram raposas-vermelhas soropositivas e Dungan et al. (2005) detectaram na Geórgia guaxinins (Procyon lotor) positivos para E. canis e E. chaffeensis por meio de pesquisa de anticorpos.
Em Israel, Waner et al. (1999) sugeriram que chacais (Canis aureus syriacus) se comportaram como reservatório de Ehrlichia spp.. Shamir et al. (2001) também descreveram chacais positivos. Neste mesmo país, Fishman et al. (2004) encontraram raposas-vermelhas cativas soropositivas.
Nos Estados Unidos, Amyx e Huxsoll (1973) observaram que raposas-vermelhas infectadas experimentalmente por Ehrlichia canis transmitiram o agente para cães, através da picada de carrapatos e ainda foram identificadas como potenciais reservatórios para E. chaffeensis na Virgínia assim como Coiotes (KOCAN et al., 2000).
No Quênia, Price e Karstad (1980) isolaram E. canis em chacais (Canis mesomelas) parasitados por R. sanguineus e Rhipicephalus simus. Anticorpos anti-E. canis também foram encontrados em chacais de vida livre em diferentes localidades deste mesmo país (Alexander. et al, 1994).
No Brasil, detecção molecular de Ehrlichia spp. e inquéritos sorológicos foram realizados. Filoni et al. (2006) relataram a primeira evidência sorológica de Ehrlichia em uma onça-parda do Pantanal mato-grossense. Na mesma região, Widmer et al. (2011) detectaram quatro onças-pintadas soropositivas para Ehrlichia spp. das quais, duas foram positivas por método molecular. Análises filogenéticas demonstraram um genótipo filogeneticamente próximo a E. ruminantium, uma espécie que infecta bovinos, ovinos, caprinos e ungulados silvestres de distribuição restrita ao continente africano e caribenho (ALLSOPP, 2010). Adicionalmente, Almeida et al. (2013) descreveram um genótipo de Ehrlichia semelhante em cachorros-do-mato na região da Mata-Atlântica do estado de São Paulo.
Animais de cativeiro também foram descritos infectados por Ehrlichia no Brasil. André et al. (2010) descrevem pequenos felídeos selvagens cativos no estado de São Paulo infectados por um genótipo próximo a E. canis. Em 2012, foram avaliados canídeos e felídeos cativos em zoológicos nos estados de São Paulo e no Jardim Zoológico da UFMT, Mato Grosso. Cachorros-do-mato, cachorros-vinagres, jaguatiricas, onças-pardas entre outros felídeos e canídeos, incluindo espécies exóticas apresentaram DNA erliquial com similaridade acima de 98% para E. canis e E. chaffeensis (ANDRÉ et al., 2012).
3 OBJETIVO
Determinar a frequência de carnívoros selvagens soropositivos para CDV, parvovírus e Ehrlichia spp.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local de estudo
O estudo foi realizado no Zoo-UFMT localizado no campus universitário da UFMT, na área urbana da cidade de Cuiabá, localizado entre as coordenadas geográficas: 15º36’31” de latitude sul e 56º03’49” de longitude oeste e apresenta área total de 11 hectares (figura 1).
O Zoo-UFMT foi fundado em 23 de março de 1977 com o plano básico de manter algumas espécies de animais silvestres no entorno de uma represa artificial. Por muitos anos, foi a única instituição receptora no estado de animais provenientes de apreensão, por meio de órgãos oficiais. Atualmente mantém em seu plantel 14 espécies de aves, nove de reptéis e 20 espécies de mamíferos nativas dos biomas Amazônia, Pantanal e Cerrado. Dentre os mamíferos encontra-se animais de sete ordens diferentes, incluindo a ordem Carnivora.
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Figura 1: Localização do Zoológico da Universidade Federal de Mato Grosso na área urbana de Cuiabá-MT. 2016. Fonte: Google Earth
4.2 Amostragem
Durante o período de setembro de 2014 à março de 2015 foram coletados juntamente a equipe técnica do Zoo-UFMT e o Setor de Animais Silvestres do Hospital Veterinário da UFMT (HOVET-UFMT) amostras de sangue de três cachorros-do-mato, uma onça parda, uma jaguatirica oito quatis (Nasua nasua), quatro furões e uma irara (Eira barbara).
Ainda, foram incluídas no estudo, amostras sanguíneas do banco de dados do Zoo-UFMT provenientes de capturas para procedimentos de rotina e para outros projetos de pesquisa. Deste modo, foram testadas amostras de 45 carnívoros: 10 canídeos, seis felídeos, 23 procionídeos e seis mustelídeos. Os cinco cachorros-do-mato foram amostrados em dois momentos (Tabela 1). As coletas do presente estudo foram aprovadas pelo SISBIO (Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade) e CEUA (Comitê de Ética no Uso de Animais) sob os números 42303-1 e 23108.029695/14-8, respectivamente.
Para os procedimentos de coleta, os animais foram capturados com auxílio de contenção física e/ou química (Figura 2) com 10mg/kg de cetamina (Vetnil, Brasil) e 1mg/kg de midazolam (União Química, Brasil) sendo posteriormente mantidos em plano anestésico inalatório com isoflurano (Cristália, Brasil).
A colheita de sangue foi realizada por meio de venopunção da jugular externa com agulha 0,25 mm x 0,8 mm, sendo em seguida acondicionadas em tubos sem EDTA (ácido etilo-diaminotetracético) (figura 3). Os tubos foram identificados, acondicionados em caixas de térmicas sob refrigeração e transportados ao Laboratório de Virologia e Rickettsioses (LVR) do HOVET-UFMT. Para a obtenção de soro, as amostras foram centrifugadas a 1000g por 5 minutos. Os soros foram armazenados em microtubos e refrigerados a -20°C até a realização das análises sorológicas.
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Tabela 1 - Espécies e ano da coleta dos carnívoros cativos no Zoo-UFMT. Cuiabá-MT, 2016.
Família Espécie Nome Científico Nº de animais Ano da coleta Canidae
Cachorro-do-mato Cerdocyon thous 5
2007-2014; 2007-2014; 2008-2014; 2007-2012; 2008-2012 Lobo-guará Chrysocyon brachiurus 2 2013 Cachorro-vinagre Speothos venaticus 2 2008 Raposinha-do-campo Lycalopex vetulus 1 2013
Felidae Onça-parda Puma concolor 2 2013; 2014
Jaguatirica Leopardus pardalis 4 2011; 2014
Procionidae Quati Nasua nasua 20 2012; 2015
Mão-pelada Procyon cancrivorus 3 2013
Mustelidae Furão-pequeno Galictis cuja 4 2014
Figura 2: Contenção dos carnívoros para a captura no Zoo-UFMT, Cuiabá-MT, 2016. A: captura de uma irara com a utilização do puçá. B: dardo preenchido por cetamina e midazolam. C: Preparação da zarabatana. D: Onça-parda sedada.
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4.3 Análises laboratoriais
4.3.1 Vírus Neutralização (VN)
Para a detecção de anticorpos anti-CDV foi realizada a VN no Laboratório de Virologia Animal da Universidade Estadual de Londrina conforme a técnica descrita por Appel e Robson (1973). Foram testadas amostras de todos os canídeos, felídeos, procionídeos e mustelídeos. Um projeto piloto com amostras de cães domésticos foi realizado.
As amostras de soro conservadas a -20 ºC foram descongeladas e inativadas a 56ºC em banho-maria por 30 minutos. Inicialmente, distribuiu-se 50µL de meio de cultivo DMEM (Invitrogen, Estados Unidos) em microplacas Maxsorp (Nunc, Estados Unidos). Em seguida, pipetou-se 50 µL do soro de cada animal e seguiu diluição seriada na razão 2 (1:2 – 1:64). Logo após, foi adicionado 50 µL de suspensão viral, cepa Lederle, previamente titulada em 100 TCID50 (REED e MUENCH, 1938) e
incubou-se as placas por uma hora a 37°C em estufa incubadora com 5% de CO2.
Posteriormente, foram inseridos 50 µL de células VERO na proporção de 1x105/mL obtida em contador automático Countess (Invitrogen, Califórnia, Estados Unidos). Por fim, as placas permaneceram incubadas nas condições supracitadas por três dias e a leitura foi realizada em microscópio invertido na objetiva de 4x verificando a ocorrência de efeito citopático que, quando observado, indica a ausência de anticorpos anti-CDV no soro.
Com o intuito de evitar falsos resultados, utilizou-se em cada placa controles de célula, vírus e citotoxicidade do soro. O título para CDV foi determinado como a recíproca da maior diluição em que não foram observados efeitos citopatogênicos, sendo considerado positivos os animais que apresentaram título ≥ 8 (DEEM e EMMONS, 2005).
4.3.2 Inibição da Hemaglutinação (HI)
A detecção de anticorpos contra o parvovírus no soro dos canídeos e felídeos foi realizada através da técnica de HI (CARMICHAEL et al., 1980) no LVR – HOVET – UFMT.
As amostras de soro foram descongeladas e inativadas como anteriormente descrito. Foram aliquotados 10 μl do soro, acrescidos de 90 μl de PBS (solução salina fosfatada tamponada) pH 7,2, que resultou na diluição 1:10. Em seguida foram adicionados 10 μl de suspensão a 50% de hemácias de suíno para inativação de inibidores inespecíficos da hemaglutinação. Essa solução foi incubada por 2 horas a temperatura ambiente. Após este período, as amostras foram centrifugadas a 1.500 g por 10 minutos para separar as hemácias e soro tratado (sobrenadante) e realização do teste.
Em microplacas de 96 orifícios com fundo em “U”, foram pipetados 50 μl do soro tratado na linha A de cada coluna. Nas linhas B a H, foram colocados 25 μl de PBS. Posteriormente, foram realizadas diluições dos soros na razão 2 (1:10 -1:1280) e foram adicionados 25 μl de vírus atenuado da vacina Vencothree (Vencofarma, Brasil) contendo oito unidades hemaglutinantes (UHA) da cepa viral CPV-2b. Em seguida, as placas foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. Após este período, foram acrescentados 50 μl de suspensão a 1% de hemácias em PBS. As placas foram incubadas em geladeira por 24 horas e em seguida realizada a leitura das placas.
Foram considerados positivos para exposição ao parvovírus os animais para os quais foi observada a formação do “botão” de hemácias na diluição ≥ 1:80 (CARMICHAEL et al., 1980). O título de anticorpos foi considerado o inverso da maior diluição das amostras que foi capaz de inibir a aglutinação de hemácias.
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4.3.3 Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)
A RIFI foi realizada a partir de lâminas fixadas com o antígeno de E. canis, cepa Cuiabá #16 (AGUIAR et al., 2013), cultivadas em células DH82 no LVR-HOVET- UFMT. Neste ensaio foram testados os soros dos canídeos e felídeos. Os soros foram diluídos inicialmente em microplacas a 1:40 (AGUIAR et al., 2007b) com PBS (pH 7,2) e aplicado nas lâminas. Em cada lâmina foram incluídos soro controle negativo e soro controle positivo. Após aplicação das amostras, as lâminas foram incubadas por 30 minutos a 37ºC em câmara úmida, seguida por duas lavagem em PBS (pH 7,2) de 10 minutos. Depois da secagem em temperatura ambiente, foi adicionado conjugado de coelho anti-IgG de canino (Sigma Diagnostics, Estados Unidos) nas amostras de canídeos e de cabra anti-IgG de felino (Sigma Diagnostics, Estados Unidos) nas amostras de felídeos seguindo as diluições de 1:900 e 1:1000, respectivamente. As lâminas foram novamente incubadas a 37ºC por 30 minutos em câmara úmida, lavadas por duas vezes em PBS (pH 7,2) por 10 minutos e submetidas a secagem. Posteriormente, adicionou-se nas lâminas glicerina tamponada (pH 8,5) e foram examinadas em microscópio de epifluorescência na objetiva de 40x. As amostras consideradas positivas passaram por sucessivas diluições na razão dois com objetivo de obter o título final.
4.3.4 Ensaio Imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA)
Das amostras positivas na RIFI realizou-se o ELISA, no LVR-HOVET-UFMT, para o diagnóstico especifico de anticorpos anti-E. canis utilizando o peptídeo sintético correspondente à região do epítopo da proteína TRP19 (24-mer, HFTGPTFSEVNLSEEEKMELQEVS) (Bio-Synthesis Inc, Estados Unidos) (MCBRIDE et al., 2007). Como controle negativo utilizou-se o peptídeo correspondente a região C-terminal da proteína TRP36 do isolado Israel de E. canis (IS36-C-V, 15-mer,
NPTGLKFLDLYTQLTL) (Bio-Synthesis Inc, Estados Unidos) devido sua baixa imunorreatividade (ZHANG et al., 2008).
Foram utilizadas microplacas MaxiSorp (Nunc, Estados Unidos) e inicialmente os peptídeos foram diluídos em PBS (pH 7,4) na concentração de 1,0 µg/ 50 µl sendo adsorvidos nas placas em temperatura ambiente por 1 hora sob agitação. Posteriormente as placas foram lavadas por três vezes com 200µL de solução TRIS salina tamponada (Sigma Diagnostics, Estados Unidos) com 0,2% de Tween 20 (Kirkegaard & Perry Laboratories, Estados Unidos) (TBST0,2%). Em seguida,
bloqueou-se a placa com 100 µL de TBST0,2% adicionado de 10% de soro equino
(Sigma Diagnostics, Estados Unidos) por 1 hora, em temperatura ambiente com agitação e logo após, lavou-se as placas como descrito acima.
Os soros dos canídeos e felídeos positivos foram diluídos na proporção de 1:200 em TBST0,2% com 5% de soro equino (Sigma Diagnostics, Estados Unidos)
sendo adicionado 50 µL da solução por cavidade, e incubadas em temperatura ambiente por 1 hora sob agitação. Após este período, as placas foram lavadas quatro vezes com TBST0,2% e em seguida as lavagens, foram adicionados em cada
orifício 50 µL de conjugado caprino anti-IgG canino e conjugado caprino anti-IgG felino, marcados com fosfatase alcalina (Kirkegaard & Perry Laboratories e Sigma Diagnostics, Estados Unidos), para as amostras de canídeos e felídeos, respectivamente, na diluição de 1:5000 em TBST com 5% de soro equino.
As placas foram incubadas novamente por 1 hora em temperatura ambiente sob agitação e após esta etapa, as placas foram lavadas por quatro vezes em TBST0,2% e depois incubadas por 20 minutos com 100 µl de substrato BluePhos
(Kirkegaard & Perry Laboratories, Estados Unidos). O desenvolvimento colorimétrico foi determinado em leitor óptico de microplacas (absorbância de 650nm) (Biotek Instruments, Winoosli, Estados Unidos) e os dados analisados no software GEN5 Data Analysis (Biotek Instruments, Estados Unidos). O valor da Densidade Óptica (DO) foi obtido através da leitura em triplicata de cada amostra, subtraído do valor de DO resultante do peptídeo controle. As amostras que apresentaram DO ≥ 0,300 foram consideradas positivas (AGUIAR et al., 2016).
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5 RESULTADOS
5.1 Vírus Neutralização
Todos os canídeos foram positivos para CDV (100% - 10/10). Observou-se que o cachorro-do-mato #3 foi positivo apenas na primeira coleta, com título igual a 32. Os outros cachorros-do-mato mostraram-se positivos nas duas coletas com variação de títulos de 16 a 64 (Tabela 2).
Tabela 2 - Anticorpos anti-CDV nos cachorros-do-mato cativos no Zoo-UFMT. Cuiabá, MT. 2016
Cachorro-do-mato (C. thous) Título CDV 2007 2008 2012 2014 #1 64 - - 64 #2 32 - - 8 #3 - 32 - 4 #4 64 - 32 - #5 - 32 16 - - não coletado
Quanto aos outros canídeos testados, os dois lobos-guarás foram positivos com título igual à 64, o cachorro-vinagre apresentou título de 16 e a raposinha-do-campo obteve título de 64.
Dos felídeos, uma onça-parda apresentou título de 8 e uma jaguatirica 32. Todos os procionídeos, quatis e mãos-peladas, foram soronegativos para a sorologia de CDV. Entre os mustelídeos, apenas um furão-pequeno foi sororeagente com título de 8 (Tabela 3).
Tabela 3 - Anticorpos anti-CDV nos carnívoros cativos no Zoo-UFMT. Cuiabá, MT. 2016
Espécie Nome científico Nº positivos
Nº Testados
Título CDV
Lobo-guará Chrysocyon brachyurus 2 2 64
Cachorro-vinagre Speothos venaticus 2 2 16; 64
Raposinha-do-campo Lycalopex vetulus 1 1 64
Onça-parda Puma concolor 1 2 8
Jaguatirica Leopardus pardalis 1 4 32
Quati Nasua nasua 0 20 NR
Mão-pelada Procyon cancrivorus 0 3 NR
Furão-pequeno Galictis cuja 1 4 8
Irara Eira barbara 0 2 NR NR= não reagente
5.2 Inibição da Hemaglutinação
Anticorpos anti-parvovírus foram encontrados em 75% dos canídeos e felídeos (12/16). Nas duas coletas realizadas nos cachorros-do-mato, apenas dois animais foram positivos com título de 80 na segunda coleta (Tabela 4).
Tabela 4 - Anticorpos anti-Parvovírus nos cachorros-do-mato cativos no Zoo-UFMT. Cuiabá, MT. 2016 Cachorro-do-mato (C. thous) Título parvovírus 2007 2008 2012 2014 #1 10 - - 80 #2 20 - - 40 #3 - NR - NR #4 10 - 80 - #5 - 40 20 -
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Todos os outros canídeos foram positivos: um lobo-guará com título de 160 e o outro 320, os dois cachorros-vinagre tiveram título de 1280 e a raposinha-do-campo apresentou título de 160.
Dos felídeos, três jaguatiricas tiveram títulos de 1280, as duas onças-pardas apresentaram título de 160 e 1280, respectivamente (Tabela 5).
Tabela 5 - Anticorpos anti-Parvovírus nos carnívoros cativos no Zoo-UFMT. Cuiabá, MT. 2016
Espécie Nome científico Nº positivos
Nº testados
Título parvovírus
Lobo-guará Chrysocyon brachyurus 2 2 160; 320 Cachorro-vinagre Speothos venaticus 2 2 1280
Raposinha-do-campo Lycalopex vetulus 1 1 160
Onça-parda Puma concolor 2 2 160; 1280
Jaguatirica Leopardus pardalis 3 4 1280
5.3 Reação de Imunofluorescência Indireta
Foram testados todos os canídeos e felídeos, no entanto, apenas dois canídeos foram sororeagentes para Ehrlichia spp. um cachorro-do-mato (#3), unicamente na primeira coleta, com título de 10240 e um lobo-guará com título igual a 320.
5.4 Ensaio Imunoabsorvente ligado a enzima
O cachorro-do-mato e o lobo-guará positivo na RIFI foram testados através do ELISA frente ao peptídeo sintétido da proteína TRP19 de E. canis contudo, somente o cachorro-do-mato sororreagiu com DO= 2,536. O lobo-guará apresentou DO= 0,094.
6 DISCUSSÃO
De modo geral, observou-se que anticorpos anti-CDV e parvovírus foram encontrados em grande parte dos canídeos e felídeos cativos no Zoo-UFMT. Contudo, não se pode afirmar o momento em que estes animais entraram em contato com esses agentes infecciosos, pois não se sabe a origem precisa e o tempo exato que estão cativos. Atualmente o Zoo-UFMT encontra-se embargado para a recepção de animais, no entanto, quando os animais foram recolhidos os mesmos não foram identificados de maneira correta, portanto não há informações precisas de quaisquer evento sanitário dos mesmos. Sabe-se somente que grande parcela destes carnívoros vieram do ambiente periurbano no estado de Mato Grosso e ainda, a partir de um pequeno plantel de animais que havia em um batalhão do exército, localizado próximo ao Zoo-UFMT, atualmente extinto (dados não apresentados). Outra hipótese que justificaria a ocorrência desses anticorpos seria a realização de vacinação (para cinomose), já que não pode ser descartada pela ausência dos registros e ainda, os testes sorológicos utilizados não são capazes de diferir anticorpos produzidos a partir de antígeno vacinal e não vacinal (APPEL e ROBSON, 1973; CARMICHAEL et al., 1980).
Ao avaliar os resultados dos cachorros-do-mato, que foram amostrados em duas coletas entre os anos de 2007 a 2014, observa-se que o contato destes carnívoros com CDV pode ter ocorrido antes da primeira coleta, pois na segunda coleta, nota-se que os títulos diminuíram para CDV, com exceção de um animal. Furtado et al. (2013) relataram essa mesma dinâmica nos anticorpos para CDV em onças-pintadas de vida-livre no Pantanal. Wagner e Bhardwaj (2012) descrevem o mesmo padrão em furões domésticos (Mustela putorios furo) vacinados para CDV. Para parvovírus, os anticorpos foram observados em dois cachorros-do-mato apenas na segunda coleta, demonstrando que estes carnívoros entraram em contato com este patógeno dentro do cativeiro, uma vez que o período de incubação dos parvovírus é de 14 dias (GREENE e DECARO, 2012). Deste modo, acredita-se que estes animais tenham respondido adequadamente frente ao antígeno, pois no histórico atual de óbitos do Zoo-UFMT, não são observados sintomatologia
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característica desses patógenos virais. Ademais, vale salientar o grande potencial de disseminação de CDV e parvovírus em animais de Zoológico, conforme previamente discutido por Thalwitzer et al. (2010). Além disso, diversos estudos demonstram animais de vida livre e cativos sororeagentes ou apresentando infecção pelos agentes supracitados (ANDRÉ et al., 2012; FURTADO et al., 2013; HAYASHI, 2013; JORGE, 2008; MAIA e GOUVEIA, 2002; MEGID et al., 2009; WIDMER et al., 2011).
Outro ponto relevante para a ocorrência destes patógenos no Zoo-UFMT pode ser atribuído a sua localização. Como já descrito anteriormente, o Zoo situa-se na área urbana da cidade, delimitado por bairros residenciais com presença de animais domésticos. Além do mais, apesar da entrada de animais domésticos não ser permitida, é comum observar cães errantes ou mesmo junto aos seus proprietários na pista de caminhada localizada no entorno do zoológico, dentro do campus universitário. Excepcionalmente, observam-se ainda gatos domésticos errantes pela universidade. Gaskin (1974) e Ikeda et al. (2001) sugerem maior investigação dos gatos na epidemiologia do CDV principalmente por que esta espécie apresentou soroconversão após infecção.
Para o parvovírus, Wasieri et al. (2009) confirmaram na Alemanha, através de método molecular, o primeiro caso de transmissão de parvovírus felino de animais errantes para grandes felídeos cativos. Desta forma, é possível sugerir, que os gatos errantes que habitam a universidade, possam atuar na transmissão do parvovírus aos C. thous que soroconverteram no Zoo-UFMT.
Quanto aos cães, esta interação tem sido sugerida historicamente, como determinante para a transmissão de CDV a carnívoros selvagens (van de BILDT et al., 2002; MEGID et al., 2009; MEGID et al., 2010; ROELKE-PARKER et al., 1996) indicando ser um forte indício de fonte de infecção aos animais do Zoo-UFMT.
Todos os canídeos foram positivos para CDV. Os cachorros-do-mato apresentaram títulos entre 8 a 64. Em animais de vida livre a ocorrência mostrou-se inferior. Jorge (2008) encontrou na região do Pantanal Mato-grossense 27,9% dos cachorros-do-mato positivos, com a mesma variação dos títulos. Já Hayashi (2013) detectou apenas 11,6% em Goiás e os títulos variaram entre 8-16. Além disso, Megid et al. (2009) confirmaram o quadro clínico ocasionado por CDV em uma fêmea dessa espécie no estado de São Paulo, através de método molecular.
No presente estudo, dois lobos-guarás foram positivos com títulos de 64. O contato dos lobos-guarás com o CDV é preocupante para a conservação da espécie
já que, Maia e Gouveia (2002) identificaram que 19,4% dos óbitos em lobos-guarás nos zoológicos são ocasionados pelo CDV. Em contrapartida, animais de vida livre também estão susceptíveis a infecção, pois lobos-guarás de vida livre procedentes do estado de Minas Gerais foram soropositivos para CDV (CURI et al., 2012).
Os dois cachorros-vinagres e a raposinha-do-campo foram sororeagentes com variação dos títulos entre 16-64. Não há relatos de detecção de anticorpos anti-CDV nestas espécies, sendo este o primeiro relato. Contudo, mortalidade nestas espécies por CDV já foram descritas, inclusive no Brasil (MCINNES et al., 1992; MEGID et al., 2010).
Dentre os felídeos, neste estudo uma onça-parda e uma jaguatirica foram positivas para CDV. Vários pesquisadores demonstraram onças-pardas, jaguatiricas e até mesmo onças-pintadas de vida livre soropositivas para CDV em diversos locais do Brasil (FURTADO et al., 2013; HAYASHI, 2013; JORGE, 2008; NAVA et al., 2008). Nenhum procionídeo apresentou positividade para CDV. No entanto, Cubas (1996) verificou suscetibilidade de quatis ao vírus e Jorge (2008) encontrou mãos-peladas soropositivos. Apenas um furão-pequeno foi positivo para CDV neste trabalho. Sabe-se que os furões-domésticos são altamente susceptíveis a infecção por este Morbillivírus com elevado índice de mortalidade (PERPIÑÁN et al., 2008). No Brasil, Rego et al. (1997) encontraram corpúsculo de inclusão em um furão-grande (Galictis vittata) cativo no estado de São Paulo e Megid et al. (2013) detectaram recentemente por método molecular, mortalidade por CDV em um furão-pequeno.
Felídeos e canídeos selvagens podem ser infectados por parvovírus canino (CPV-2) e parvovírus felino (FPV) (IKEDA et al., 2002). Recentemente, o CPV-2, FPV entre outros parvovírus que acometem carnívoros, foram reclassificados como mesma espécie (COTMORE et al., 2014). Apesar de diversos estudos abordarem em felídeos a ocorrência de FPV e em canídeos CPV-2, utilizando HI como diagnóstico, não é possível concluir quais espécies foram responsáveis pelas soroconversões uma vez que eles podem apresentar reações cruzadas (PARRISH e CARMICHAEL, 1983).
Dois cachorros-do-mato (40%) foram positivos para parvovírus neste estudo. Curi et al. (2010) e Hayashi (2013) também observaram soropositividade em animais de vida livre e ainda, Mann et al. (1980) descreveram mortalidade em cachorros-do-mato cativos nos Estados Unidos. Todos os lobos-guarás no presente estudo foram
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sororeagentes. Curi et al. (2010) encontrou resultado idêntico em Minas Gerais. Assim como descrito para CDV, o contato com parvovírus para lobo-guará é preocupante para a conservação da espécie. Maia e Gouveia (2002) descreveram frequência relevante (21,5%) de mortalidade por esse vírus em lobos-guarás de zoológicos brasileiros.
Diferente deste estudo, não há na literatura consultada inquéritos sorológicos com presença de cachorros-vinagres positivos para parvovírus no Brasil. Janssen et al. (1982) descreveram mortalidade em nove cachorros-vinagres cativos nos Estados Unidos. Assim como neste estudo, raposinhas-do-campo de vida livre vêm sendo detectadas com anticorpos anti-parvovírus (CURI et al., 2010; HAYASHI, 2013).
Todos os felídeos amostrados neste trabalho foram positivos para parvovírus. Jorge (2008) encontrou no pantanal mato-grossense alto índice de felídeos positivos (75% jaguatiricas, 100% onças-pardas). Já Hayashi (2013) encontrou no estado de São Paulo apenas, 9% de jaguatiricas e 25% de onças-pardas positivas. Apesar das variações nas frequências de animais sororeagentes para parvovírus, observa-se que ocorre de forma endêmica em diferentes localidades no país. A relativa resistência ambiental do parvovirus pode ser fator influente nas altas taxas de ocorrência (CLEAVELAND et al., 2006).
Anticorpos anti-Ehrlichia spp. foram encontrados em apenas dois canídeos, um cachorro-do-mato (título 10240) e um lobo-guará (320). A menor frequência de infecção por Ehrlichia nos animais estudados quando comparado ao CDV e parvovirus pode ser justificado pela forma de transmissão que requer o parasitismo por carrapatos, enquanto os outros patógenos podem ser transmitidos pela contato direto ou até mesmo indireto com os agentes virais. Ressalta-se que durante as coletas, não foram observados nenhum carnívoro parasitado por carrapatos.
O cachorro-do-mato foi positivo para Ehrlichia spp. apenas na primeira coleta. Curiosamente mostrou-se negativo na segunda coleta em um intervalo de sete anos. Sabe-se que a maioria dos cães tornam-se soronegativos de seis a nove meses após tratamento (HARRUS et al. 2012), no entanto, neste caso não houve tratamento sendo assim, pode-se presumir que apesar da soroconversão a infecção não se instalou adequadamente e o animal conseguiu subsequentemente eliminar o microorganismo.
Através do ELISA realizado a partir do peptídeo do gene TRP19 (MCBRIDE et al. 2007), específico para E. canis, este cachorro-do-mato mostrou-se positivo, sugerindo que a E. canis ou mesmo espécies filogeneticamente próximas foi responsável pela estimulação. A RIFI pode resultar em reações cruzadas com outras espécies do gênero Ehrlichia ou até mesmo outras agentes da família Anaplasmataceae (WEN et al. 1997). Widmer et al. (2011) encontraram quatro onças-pintadas sororeagentes ao antígeno de E. canis na RIFI, contudo, através da análise filogenética resultante da amplificação do gene dsb verificaram similaridade genética com E. ruminantium. Almeida et al. (2013) também detectaram no estado de São Paulo, cachorros-do-mato positivos para um novo genótipo da bactéria (Ehrlichia sp. fox-ES-1) que demonstrou proximidade genética a E. ruminantium.
Com base nesses achados, sugere-se que outros genótipos de Ehrlichia podem estar participando da epidemiologia das erliquioses entre os animais silvestres no ambiente natural bem como no Zoo-UFMT. A existência de pelo menos 2 espécies fora confirmado no estado ou propriamente no ambiente pantaneiro infectando animais domésticos como E. canis (AGUIAR et al., 2013) em cães e E. minasensis (AGUIAR et al., 2014) em bovinos.
Neste estudo, nenhum cachorro-vinagre mostrou positividade para Ehrlichia. Em contrapartida, André et al. (2012) detectaram, através de método molecular, dois cachorros-vinagres cativos no Zoo-UFMT positivos para Ehrlichia canis (98% similaridade, gene 16S rRNA). Não se sabe o ano de coleta desses animais, por isso, não foi possível identificar se os animais positivos anteriormente são os mesmo deste estudo.
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7 CONCLUSÃO
De acordo com os resultados do presente estudo, podemos concluir que: A alta frequência de anticorpos anti-CDV e anti-parvovírus é observada no
Zoo-UFMT;
A localização do Zoo-UFMT e a presença de animais domésticos em seu entorno podem ter contribuído para a ocorrência de anticorpos nestes animais, contudo, são necessários mais estudos para a comprovação desta hipótese;
A baixa frequência de anticorpos anti-Ehrlichia pode ser resultante da ausência de parasitismo por carrapatos nos carnívoros;Um cachorro-do-mato foi exposto à Ehrlichia canis ou há uma espécie filogeneticamente próxima.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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