“MORFOLOGIA DO APARELHO REPRODUTOR
MASCULINO E DOS ESPERMATOZOIDES DE
Pachycondyla (HYMENOPTERA: FORMICIDAE:
PONERINAE)”
“MORPHOLOGY OF THE MALE REPRODUCTIVE
APPARATUS AND THE SPERMATOZOA OF
Pachycondyla (HYMENOPTERA: FORMICIDAE:
PONERINAE)”
Dedico este trabalho a meus grandes amigos Amanda, Isadora e Marllonn (in memoriam) e a meus pais, que sempre me apoiaram e guiaram minhas escolhas.
Procure, sempre procure o fim de uma história, seja ela qual for. Dê um sorriso para quem esqueceu como se faz isso.
Acelere seus pensamentos, mas não permita que eles te consumam. Olhe para o lado, alguém precisa de você.
Abasteça seu coração de fé, não a perca nunca. Mergulhe de cabeça nos seus desejos e satisfaça-os.
Procure os seus caminhos, mas não magoe ninguém nessa procura. Arrependa-se, volte atrás, peça perdão!
Não se acostume com o que não o faz feliz, revolte-se quando julgar necessário. Alague seu coração de esperanças, mas não deixe que ele se afogue nelas. Se achar que precisa voltar, volte!
Se perceber que precisa seguir, siga! Se estiver tudo errado, comece novamente. Se estiver tudo certo, continue.
Se sentir saudades, mate-a. Se perder um amor, não se perca! Se achá-lo, segure-o!”
Meus sinceros agradecimentos:
À Deus, primeiramente, por me permitir concluir esta vitória e ter paciência nos momentos difíceis, sempre guiando minha vida e norteando minhas decisões.
À meus pais, Edilmar Leite e Rosana Cuquetto Leite, exemplos de amor, força e sabedoria, que desde minha infância me incentivaram a estudar e dar o melhor de mim.
À minha querida orientadora Dr.ª Karina Mancini. Muito obrigada por me orientar nessa jornada com sua dedicação, compreensão, amizade e paciência nos momentos mais críticos. Karina, sou muito grata a todo conhecimento compartilhado.
À adorável Drª. Mary Anne Heidi Dolder, que, com sua paciência me coorientou e auxiliou nos momentos mais necessários, especialmente no manuseio do Microscópio Eletrônico de Transmissão.
Ao professor Dr. Paulo S. Oliveira e seus alunos, que me auxiliam em inúmeras coletas realizadas. Muito obrigada pelos artigos e conselhos de campo.
À meu querido amigo Michel, que mesmo estando distante compartilhou de minhas angústias e alegrias. Muito obrigada também pelas loucuras nossas e cumplicidade.
Às queridíssimas Bruna e Celina, que me acolheram de braços abertos na UNICAMP, me ajudando na rotina do laboratório e me mostrando a vida de Campinas.
Ao Laboratório de Ecologia e Sistemática de Borboletas e ao Mário, pelo auxílio técnico e de cladística.
Ao programa de pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural e à agência de fomento CNPq, por todo suporte técnico, científico e financeiro oferecido nesses dois anos.
Em suma, a todos que contribuíram direta e indiretamente para a conquista deste trabalho. Muito Obrigada!
espécies no Brasil, suas relações filogenéticas permanecem controversas. Uma notável fonte de caracteres para análises taxonômicas e filogenéticas é a caracterização espermática e do aparelho reprodutor. Tal caracterização tem se mostrado uma ferramenta na clarificação de questões da biologia reprodutiva e sistemática de diversos grupos de insetos. Desta forma, o presente estudo analisou, através de microscopia de luz e eletrônica de transmissão, a morfologia espermática de quatro espécies do gênero Pachycondyla (Formicidae: Ponerinae), bem como o aparelho reprodutor masculino: P. marginata, P. termitofane comutata, P. harpax e P. striata. A ultraestrutura dos espermatozoides de tais espécies é semelhante à descrita para outros Hymenoptera por apresentar: (1) acrossomo cônico do tipo bicamada; (2) adjunto do centríolo situado entre o núcleo e ambos os derivados mitocondriais e (3) flagelo constituído por dois derivados mitocondriais alongados, dois corpos acessórios triangulares e um axonema de padrão 9+9+2. Entretanto, as mesmas compartilham inúmeras características cujas evidências indicam evoluir como homoplasia via paralelismo, não conferindo, pois, suporte para uma resolução filogenética entre tais espécies e demais clados próximos. Dentre estes caracteres se destacam a organização espacial dos componentes acrossomais, o caráter cromatínico nuclear, a configuração da extremidade da transição núcleo-flagelo, além da condição simétrica do adjunto do centríolo. Além dessas, várias outras características corroboram a definição do estado parafilético do respectivo gênero, tais como o aspecto cromatínico, a condição simétrica do adjunto do centríolo e a organização terminal flagelar, por serem compartilhadas entre determinadas espécies de Pachycondyla e grupos filogeneticamente distantes, evidenciando, pois, as divergências dentro da mesma espécie. Por fim, a análise morfológica do aparelho reprodutor de P. marginata e P. striata evidenciou a existência de um padrão morfológico reprodutivo para Formicidae, uma vez que tais espécies exibiram íntima similaridade às descrições realizadas à respectiva família.
Although Formicidae be one of the most important animal groups in species richness in Brazil, their phylogenetic relationships remain controversial. One notable source of characters for taxonomic and phylogenetic analysis is the characterization of the spermatozoa and male reproductive tract. This characterization has shown to be a tool in clarifying issues of reproductive biology and systematics of many insect groups. Thus, this study analyzed by light and transmission electron microscopies, the sperm morphology of four species of the genus Pachycondyla (Formicidae: Ponerinae), and their male reproductive system: P. marginata, P. termitofane comutata, P. harpax and P. striata. The ultrastructure of spermatozoa of these four species is similar to that described to other Hymenoptera: (1) bilayer tapered acrosome; (2) centriolar adjunct located between nucleus and both mitochondrial derivatives and (3) flagellum comprises two elongate mitochondrial derivatives, two triangular bodies and an axoneme of 9 + 9 + 2 pattern. However, they share a number of features whose evidence indicates evolve as homoplasy via parallelism, not giving, support for a phylogenetic resolution among species and other nearby clades. Among these characters stand out, the spatial organization of acrosomal components, the nuclear chromatin character, setting the end of the transition nucleus-flagellum, in addition to symmetrical condition centriolar adjunct. Besides these, various other features confirm the setting of the paraphyletic status of its genus, such as chromatin aspect, symmetrical condition centriolar adjunct and flagellar terminal organization, by being shared among certain species phylogenetically distant and Pachycondyla groups, highlighting, therefore, the differences within the same species. Finally, the morphological analysis of the reproductor system of P. striata and P. marginata highlighted the existence of a reproductive morphology pattern to Formicidae, since such species showed close similarity to the descriptions made to its family.
1.1. Ordem Hymenoptera ... 12
1.1.1. Composição e Filogenia ... 12
1.1.2. Relevância Ecológica ... 14
1.2. Formicidae ... 15
1.3. Ponerinae... 19
1.4. Aparelho Reprodutor Masculino e Espermatozoides em Hymenoptera e sua Relevância Filogenética ... 23
1.4.1. Morfologia do Aparelho Reprodutor Masculino... 23
1.4.2. Espermatozoides de Hymenoptera ... 24
1.4.3. Relevância da Morfologia Espermática ... 26
2. Objetivos ... 28
2.1. Objetivo Geral ... 28
2.2. Objetivos Específicos ... 28
3. Referências Bibliográficas ... 29
Capítulo 1 - Características ultraestruturais dos espermatozoides de Pachycondyla harpax e Pachycondyla termitofane commutata (Hymenoptera: Formicidae) ... 35
Capítulo 2 - Structural and Ultrastructural Characterization of the Spermatozoa and the Male Reproductive System in Pachycondyla striata and P. marginata (Hymenoptera: Formicidae: Ponerinae) ... 55 4. Conclusões ... 78 Matriz de Caracteres ... 79 Cladograma ... 80 Anexo I ... 81 Anexo II ... 84
1. INTRODUÇÃO
1.1. Ordem Hymenoptera 1.1.1. Composição e Filogenia
Hymenoptera consiste em uma das quatro maiores ordens de insetos holometábolos, com mais de 130.000 espécies descritas, excedendo em número de espécies os Lepidoptera e os Diptera, e equivalendo aos Coleoptera (Gastón, 1991; LaSalle e Gauld, 1992; Hanson e Gauld, 1995; Quicke, 2003; Gillot, 2005; Grimaldi e Engel, 2005; Sharkey, 2007). Sua vasta diversidade está amplamente encoberta entre os pequenos grupos himenópteros relativamente pouco explorados (como Chalcidoidea, Platygastroidea), nos quais novas espécies são continuamente descobertas (Quicke, 2003).
A ordem é composta por cerca de 130 famílias divididas entre as subordens Symphyta e Apocrita (Goulet e Huber, 1993; Grimaldi e Engel, 2005; Davis et al., 2010; Aguiar et al., 2013). Symphyta é considerado um grado basal de taxa parafiléticos, no qual Apocrita está aninhado. Na respectiva subordem, a família Xyelidae é tida como grupo irmão dos demais Hymenoptera, sendo Orussidae considerado a linhagem irmã aos Apocrita (Sharkey, 2007; Davis et al., 2010). Apesar de Apocrita ser mais diverso que Symphyta, esta dispõe de maior riqueza de espécies em regiões temperadas em detrimento das tropicais e subtropicais, além de serem primitivamente fitófagos (Grimaldi e Engel, 2005).
Os Apocrita compreendem a subordem com maior abrangência em estudos, incluindo desde espécies parasitoides às eusociais. A mesma é subdividida em dois grupos, Parasitica e Aculeata. O primeiro é, atualmente, considerado parafilético, do qual deriva-se Aculeata (Figura 1). Dentre as 12 superfamílias constituintes de Parasitica, Ichneumonoidea, é frequentemente associada como grupo-irmão dos Aculeata (Davis et al., 2010).
Os Aculeata atualmente existentes restringem-se inteiramente ao período Cretáceo ou deposições recentes, sendo compostos pelas superfamílias Chrysidoidea (basal) e Apoidea+Vespoidea (os Euaculeata). Os mesmos representam o grupo Hymenoptera monofilético mais derivado, por incluírem taxa eusociais, com aproximadamente 45% das espécies descritas à respectiva ordem (Grimaldi e Engel, 2005; Davis et al., 2010). A superfamília Vespoidea é constituída por 10 famílias (Brothers, 1995; Sharkey, 2007; Davis et al., 2010). Formicidae compreende a maior e mais estudada família, com aproximadamente 14.000
espécies descritas, distribuídas em 324 gêneros (Hölldobler e Wilson, 1990; Agosti, 2004; Bolton, 2006; Davis et al., 2010; Bolton, 2015). Diferente da monofolia de Chrysidoidea e Apoidea, o caráter monofilético de Vespoidea é bastante controverso (Brothers, 1999; Carpenter e Wheeler, 1999; Sharkey, 2007; Davis et al., 2010). Seus representantes mais conhecidos são aqueles pertencentes às famílias Formicidae (formigas) e Vespidae (vespas não parasíticas). Análises moleculares recentes, realizadas por Davis e colaboradores (2010) ainda questionam a condição filogenética de Vespoidea (Figura 1).
Figura 1. Cladograma representando a relação entre os Hymenoptera. Subordens tradicionais são representadas em letras maiúsculas; os táxons terminais indicam as superfamílias ou famílias. As linhas tracejadas indicam a hipótese de relação de grupos-irmãos. As linhas mais espessas tracejadas representam a condição filogenética questionável. Modificado a partir de Davis et al. (2010).
1.1.2. Relevância Ecológica
Os Hymenoptera são componentes vitais dos ecossistemas terrestres, uma vez que são encontrados em abundância em praticamente todos estes ecossistemas. Representam um dos grupos com o maior número de interações tróficas, contribuindo ao equilíbrio e manutenção da diversidade de muitos grupos de animais e plantas (LaSalle e Gauld, 1992). São amplamente diversos em relação à sua história de vida, uma vez que os mesmos abrangem táxons fitófagos, parasitoides e predatórios, abrangendo os dois últimos a maioria das espécies. Adicionalmente, o mesmo compreende espécies solitárias, como algumas vespas, bem como aquelas dotadas de comportamento social, organizando-se em sociedades seja de formigas, abelhas ou vespas polinizadoras (Hawkins e Lawton, 1987; Hölldobler e Wilson, 1990; Quicke, 2003; Grimaldi e Engel, 2005).
Uma ampla quantidade de espécies Hymenoptera desenvolvem interações intra- e interespecíficas, cujas consequências favorecem as atividades humanas, especialmente as econômicas. O número de himenópteros benéficos supera a dimensão daqueles prejudiciais, embora algumas espécies sejam classificadas em ambas as categorias dependendo das circunstâncias. Como exemplo, determinados Hymenoptera parasitoides, embora causem ocasionalmente graves problemas médicos, são responsáveis por ingerir uma vasta variedade de outros insetos. Por conseguinte, estes atuam no controle biológico de insetos-praga em ambientes agrícolas, cuja razão custo-benefício faz-se amplamente favorável (Quicke, 2003; Sharkey, 2007). Além disso, as interações biológicas dentro das comunidades de parasitoides parecem ter maior estabilidade em detrimento das relacionadas à predação, de modo que o equilíbrio ecológico e manutenção da diversidade que essas comunidades promovem são mais estáveis do que as relações envolvendo predação (LaSalle e Gauld, 1992). Os Hymenoptera parasitoides consistem em bioindicadores especiais, por serem representativos da diversidade de seus hospedeiros, além de apresentarem grande sensibilidade a perturbações ecológicas, de modo a ocasionar flutuações iniciais em suas populações em detrimento de seus hospedeiros (LaSalle, 1993; Sharkey, 2007). Tal característica os torna ideais para estudos de conservação.
Apesar de sua ampla relevância na conservação ecossistêmica, diversos Hymenoptera atuam como insetos pragas, dentre os quais evidenciam-se os parasitoides, Symphyta,
Siricidae e Tenthredinoidea, além dos Apocrita Chalcidoidea e Torymidae, bem como alguns membros de Vespidae e Apoidea, em especial Apidae (Quicke, 2003; Grimaldi e Engel, 2005).
Complementarmente, os Aculeata, especialmente as abelhas (Apidae), exercem uma relevante atividade cujo produto representa considerável importância ao meio antrópico, a produção de mel, tanto para fins econômicos como alimentício. Adicionalmente, as abelhas também são responsáveis pela síntese de cera, sendo este recurso aplicado à uma ampla variedade de fins, desde velas para cosméticos à pomadas, no âmbito farmacêutico (Quicke, 2003; Grimaldi e Engel, 2005). Coletivamente, uma vasta variedade dos Aculeata, especialmente abelhas, formigas e vespas, exerce uma relevante função, ecológica bem como agrícola: a polinização de ampla variedade de culturas de plantas florísticas, atividade pela qual a maioria dos ecossistemas é mantida no tempo e espaço (Michener, 2000; Quicke, 2003; Sharkey, 2007). A evolução, diversificação e especialização de tais insetos têm acompanhado os respectivos processos das angiospermas por eles polinizadas, motivo pelo qual são de suma importância à manutenção da composição floral de diversos habitats.
1.2. Formicidae
Desde sua origem, a cerca de 120 milhões de anos, as formigas tornaram-se o grupo de insetos sociais com maior riqueza de espécies bem como diversidade ecológica (Hölldobler e Wilson, 1990; Ward, 2010), características que a evidenciam entre os Aculeata. Assim, considerando o número de indivíduos, um indicador de importância ecológica, Formicidae compreende claramente um dos grupos de maior significância no Brasil, uma vez que a biomassa de formigas nas florestas tropicais é aproximadamente quatro vezes maior que a fauna de vertebrados, podendo se igualar aos parâmetros da humanidade mundial (Wilson, 1971; LaSalle e Gauld, 1992; Franks, 2003; Grimaldi e Engel, 2005).
Formicidae domina, em sua escala de tamanho, inúmeros ecossistemas terrestres de latitude do hemisfério norte aos climas sulistas, exibindo, pois um exímio sucesso ecológico. Este deve-se, principalmente, à eficiente divisão de trabalho existente em suas colônias, além de modificarem o ambiente no qual habita para se adequar ao mesmo (Franks, 2003; Grimaldi e Engel, 2005).
Uma numerosa gama de espécies Formicidae exerce relevantes funções à manutenção dos ecossistemas, especialmente das angiospermas, atuando como dispersores e ceifadores de sementes, na renovação do solo, bem como na regulação quantitativa de afídeos e minimização da ressurgência de insetos herbívoros. Juntamente a estas, várias outras espécies invasoras de formigas são introduzidas, pela atividade humana, em habitats exóticos, nos quais atuam como pragas, por romperem o equilíbrio das relações ecológicas locais (Hölldobler e Wilson, 1990; Franks, 2003; Blüthgen e Feldhaar, 2010).
Em complemento, Formicidae mantém intima relação ecológica de simbiose com inúmeras espécies de plantas. Algumas dessas produzem atrativos específicos com os quais estimulam a dispersão de sementes, suprem, em grande proporção, a necessidade nutricional da colônia, além de promover sua nidificação em estruturas vegetais (e.g. troncos ocos e caules) bem como a manutenção do grupamento de formigas (Hölldobler e Wilson, 1990; Heil e McKey, 2003; Grimaldi e Engel, 2005).
Em detrimento dos demais Hymenoptera, Formicidae exibe uma ampla gama de itens alimentares, muitos dos quais faz-se singular à respectiva família (Hölldobler e Wilson, 1990), assim como a forma de obtenção dos mesmos. Logo, nesta estão inclusas espécies especializadas em ingerir sementes e/ou ovos de artrópodes, em predar cupins e em cultivar fungos, que atuam posteriormente como sua principal fonte de alimento, além das inúmeras espécies possuidoras de hábitos mais generalizados, as quais realizam como complemento de sua dieta, a coleta da secreção açucarada de afídeos ou mesmo de larvas de Lepidoptera (Brown, 1979; Wilson, 1980; Hölldobler e Wilson, 1990; Leal e Oliveira, 1995; Blüthgen e Feldhaar, 2010).
Em relação aos parâmetros filogenéticos e taxonômicos, Formicidae compreende, um grupo monofilético composto atualmente por 21 subfamílias, com aproximadamente 13.000 espécies existentes descritas (Bolton et al., 2006; Ward, 2010), para a maioria das quais há convincentes evidências de monofilia (Ward, 2007; Rabeling et al., 2008; Moreau e Bell, 2013). Análises filogenéticas moleculares sustentam a íntima relação entre a maioria das respectivas subfamílias em um grupo bem apoiado, denominado de clado Formicoide (Figura 2). Este faz-se composto por três grandes subfamílias, Dolichoderinae, Formicinae, e Myrmicinae, assim como pelas Myrmeciinae, Pseudomyrmecinae, Dorylomorph
(agrupamento compreendido pelas subfamílias Leptanilloidinae, Aenictogiton, Cerapachyinae e Ecitoninae e pelos gêneros Aenictus e Dorylus) além de outros pequenos grupos (Ward, 2010). Apesar de não compartilharem uma característica morfológica específica que os diferenciem dos demais Formicidae, os Formicoide emergem como um sólido grupo embasado por análises moleculares concretas (Ward e Brady, 2003; Ohnishi et al., 2004; Saux et al., 2004; Ward e Downie, 2005; Brady et al., 2006; Moreau et al., 2006; Ouellette et al., 2006; Moreau e Bell, 2013).
Dentre os Formicoide no geral, o clado Dorylomorph, situa-se na base filogenética dos mesmos, mantendo uma relação de grupo irmão para com os formicoides remanescentes. Entre estes, o relacionamento entre cinco principais clados é fortemente sustentado, sendo eles, os Myrmeciomorfos (Myrmeciinae e Pseudomyrmecinae); os Dolichoderomorfos (Dolichoderinae e Aneuretinae); os Ectaheteromorfos (Ectatomminae e Heteroponerinae); Myrmicinae e Formicinae. A relação entre os três últimos clados faz-se questionável, sendo, pois, tratada como uma tricotomia, haja vista a insuficiência de dados moleculares e morfológicos para a resolução do respectivo problema filogenético (Ward, 2010).
Além dos Formicoides, outros dois grandes grupos de Formicidae podem ser reconhecidos: a subfamília Leptanillinae, cujas espécies destacam-se como subterrâneas altamente modificadas; e o complexo Poneroide, composto pelas subfamílias Agroecomyrmecinae, Amblyoponinae, Paraponerinae, Proceratiinae e Ponerinae, compreendendo esta última o grupo em estudo. A relação entre tais clados e destes para com Formicoide permanece incerta. Várias análises filogenéticas com base molecular demonstraram Leptanillinae como grupo irmão de todos os demais Formicidae, estando, pois, na base filogenética da família, bem como os Poneroide, um clado irmão de Formicoide (Brady et al., 2006; Moreau et al., 2006; Ward, 2010; Moreau e Bell, 2013; Schmidt, 2013). Adicionalmente, tais análises, em sua maioria, corroboram o posicionamento de Ponerinae como grupo irmão de um clado específico composto por (Paraponerinae + Agroecomyrmecinae) (Figura 2) (Brady et al., 2006; Moreau et al., 2006; Moreau e Bell, 2013; Schmidt, 2013), contrariamente à análise de Rabeling et al. (2008), na qual Ponerinae é considerada grupo irmão das subfamílias Formicoide. Assim, o grupo irmão de Ponerinae permanece incerto bem como inteiramente o arranjo filogenético dos Formicidae, requerendo,
pois, dados moleculares e morfológicos adicionais a fim de elucidar o grau de relacionamento entre suas subfamílias.
Entretanto, há controvérsias em relação a tais resultados, uma vez que os mesmos podem ser decorrentes do fraco suporte na porção filogenética basal dos Formicidae, ou mesmo um artefato do fenômeno da “atração de ramificações longas” entre os Leptanillinae e seu grupo externo Vespidae (Holland et al., 2003; Rabeling et al., 2008; Ward, 2010; Moreau
Figura 2. Cladograma, obtido por inferência Bayesiana, exibindo as relações entre as subfamílias de Formicidae. Modificado a partir de Schmidt (2013).
e Bell, 2013). Um estudo realizado por Brady et al. (2006) estabeleceu uma nova configuração filogenética para os Formicidae. Utilizando dados moleculares, tais pesquisadores propuseram uma bipartição entre Formicoide e os Formicidae remanescentes, com Leptanillinae inserida no complexo Poneroide, de modo a este evidenciar-se como parafilético. Em suma, até a atualidade a condição filogenética do respectivo grupo, no qual Ponerinae encontra-se inserida, é considerada questionável e, portanto, de caráter duvidoso.
1.3. Ponerinae
Ponerinae evidencia-se como a maior e mais diversa subfamília de Poneroide, com mais de 1.100 espécies descritas (Bolton et al., 2006; Schmidt, 2013), amplamente distribuídas em habitats tropicais e temperados, ressaltando-se sua abundância na região tropical úmida.
A maioria dos Ponerinae mantém um agrupamento de caracteres sociais, que caracterizam a configuração primitiva da mesma dentre os demais Formicidae (Hölldobler e Wilson, 1990; Wilson e Hölldobler, 2005) tais como reduzidas colônias e complexidade na organização de trabalho e forrageamento solitário (Peeters e Ito, 2001; Fernandez, 2003; Medeiros e Oliveira, 2009). Com isso, as operárias de sua sociedade exibem maior totipotência funcional em detrimento das operárias dos demais Formicidae mais derivados (Anderson e Mcshea, 2001; Wilson e Hölldobler, 2005; Arantes et al., 2008). Adicionalmente, as colônias típicas dos Ponerinae, incluindo Pachycondyla, exibem pequeno porte, por conterem, em sua capacidade máxima, algumas centenas de operárias e uma única rainha – capaz de liberar suas asas após o voo nupcial – sendo ambas morfologicamente similares, exceto pela ocorrência de olhos maiores, ocelos e escleritos torácicos aéreos modificados nas rainhas (Heinze et al. 1994; Dietemann e Peeters, 2000; Schmidt e Shattuck, 2014).
Em contrapartida, os Ponerinae exibem elevada diversidade de características comportamentais, ecológicas e morfológicas consideradas derivadas para a família a qual pertence, de modo a dificultar a definição precisa de seu caráter filogenético (Schmidt e Shattuck, 2014).
Ponerinae desenvolveu uma notável diversidade de estratégias reprodutivas. Enquanto a maioria de suas espécies mantém o padrão reprodutivo básico, definido como “ancestral”, pelo qual a reprodução é efetivada por uma única rainha, inúmeros outros táxons exibem
modificações em tal estratégia. Duas das variações mais comumente relatadas compreendem a reprodução através de rainhas ergatoides, permanentemente sem asas, e operárias ‘gamergate’, isto é, membro reprodutivamente viável, apto à reprodução sexuada na ausência da rainha (Schmidt e Shattuck, 2014). Em relação ao aspecto filogenético e sistemático, acredita-se que ambas as condições tenham surgido inúmeras vezes entre os Ponerinae (Schmidt, 2013). Além disso, as mesmas estão correlacionadas a uma reduzida capacidade de dispersão ao considerar que tais indivíduos podem atuar como os únicos agentes reprodutores em uma colônia (Molet e Peeters, 2006; Schmidt e Shattuck, 2014).
Adicionalmente aos caracteres anteriores, a evolução dos Ponerinae tem sido marcada por uma ampla diversificação em comportamentos de forrageio, a qual compreende desde o método de captura de presas ao grau de cooperação entre as companheiras de forrageamento. Em referência a tanto, espécies de Ponerinae podem ser categorizadas, de acordo com seu hábito, em forrageadoras epigeicas ou criptobióticas, dependendo dos microhabitats onde forrageiam. A primeira categoria ocorre, predominantemente, na superfície do solo ou na vegetação baixa, sendo amplamente difundida entre as espécies de Pachycondyla (Fisher e Zimmerman, 1988; Hölldobler e Wilson, 1990; Orivel et al., 1998; Fernandez, 2003; Schmidt e Shattuck, 2014). Os forrageadores criptobióticos estabelecem-se no solo, serapilheira, madeira em decomposição, além de outros microhabitats ocultos, como já relatado para Pachycondyla striata (Passos e Oliveira, 2002).
Em consideração à presença de poderosas mandíbulas, os membros de Ponerinae, exibem vasta variedade de hábitos alimentares. Enquanto diversos táxons Ponerinae compreendem predadores e necrófagos generalistas (Fewell et al., 1996; Fourcassie e Oliveira, 2002; Wilson e Hölldobler, 2005; Rico-Gray e Oliveira, 2007) como determinadas espécies de Pachycondyla (Dejean et al., 1999), outros se especializaram na predação de tipos específicos de presa, em diferentes graus (Freitas, 1995; Leal e Oliveira, 1995; Dejean e Evraerts, 1997).
Em suma, inúmeros caracteres ‘primitivos’ exibidos pelos Ponerinae, dentre os quais destacam-se (1) a reduzida fertilidade da rainha resultando em colônias de pequeno porte; (2) a elevada similaridade morfológica entre castas; (3) fundação colonial semi-claustral, na qual a rainha forrageia em intervalos frequentes, sendo responsável pelo início de uma nova colônia e posteriormente da organização social; (4) forrageamento individual de suas operárias e (5) a
ausência de troca de comida regurgitada entre as operárias e larvas, comumente difundida entre os Myrmicinae, Dolichoderinae e Formicinae; caracterizam o paradoxo de Ponerinae, uma vez que as mesmas dispõem de elevado sucesso ecológico, embora sejam socialmente primitivas (Wilson e Hölldobler, 2005). A respectiva controvérsia, entretanto, possui uma possível resolução parcial caso os Ponerinae sejam considerados polifiléticos, contrariando dados sistemáticos, cujos fundamentos estabelecem a existência de diversos subgrupos modernos de caráter monofilético, tal como a tribo Ponerini, na qual Pachycondyla encontra-se inencontra-serida (Wilson e Hölldobler, 2005). Assim, o paradoxo não pode encontra-ser resolvido completamente somente por divisões taxonômicas.
No âmbito filogenético, as relações de alto nível entre os táxons de Ponerinae são escassamente compreendidas, ao considerarmos a ausência de análises filogenéticas completas na respectiva subfamília, o que dificulta estudos com ampla abordagem evolutiva aplicada aos caracteres sociais e ecológicos da mesma. Inicialmente, Fernandez (2003) baseado em caracteres morfológicos, estabeleceu a ocorrência de oito tribos Ponerinae. Em seguida, Ward e Brady (2003) e Astruc et al. (2004) embasados em dados moleculares sugeriu uma nova divisão, pela qual Ponerinae era constituída por dois grupos, os Ectatommini e outro específico, abrangendo as tribos Ponerini, Amblyoponini, e Platythyreini. Posteriormente, através de análises filogenéticas moleculares associadas às inferências evolutivas, Schmidt (2013) configurou Ponerinae em três tribos: a Platythyreini, com 39 espécies, Thaumatomyrmecini, com 12 espécies, e a diversa Ponerini, contendo 1.051 espécies, sendo todas consideradas monofiléticas, embora evidências morfológicas sejam ambíguas em relação à monofilia das duas últimas tribos propostas. A condição tribal de Platythyreini, exposta por Schmidt (2013), é também sustentada por outros estudos filogenéticos (Brady et al., 2006; Moreau et al., 2006), os quais consideraram o caráter não monofilético de Ponerini, incluindo Thaumatomyrmecini na mesma. Mais recentemente, Schmidt e Shattuck (2014), utilizando abordagens moleculares e taxonômicas morfológicas, propuseram a divisão de Ponerinae em duas tribos, Platythyreini e Ponerini, ao considerarem a sinonimização tribal de Thaumatomyrmecini, o qual torna-se inserido em Ponerini.
A subfamília Ponerinae possui uma problemática filogenética por apresentar considerável heterogeneidade morfológica e comportamental entre seus táxons, de modo a
inúmeros estudos proporem grande diversidade de arranjos internos, cujas propostas tornaram questionável a condição filogenética da mesma (Bolton, 1990, 2003; Baroni Urbani et al., 1992; Ward, 1994; Astruc et al., 2004; Saux et al., 2004; Brady et al., 2006; Moreau et al., 2006). Entretanto, com as atuais análises de Schmidt (2013) bem como Schmidt e Shattuck (2014), a taxonomia de Ponerinae faz-se relativamente estável, sendo seu caráter monofilético intensamente apoiado por evidências morfológicas e moleculares, o que corrobora inferências de estudos filogenéticos prévios (Brady et al., 2006; Moreau et al., 2006).
Dentre as tribos existentes de Ponerinae, Ponerini, na qual insere-se Pachycondyla – o gênero em estudo – exibe reduzido suporte para seu caráter monofilético. A não monofilia de Ponerini deriva da possível inclusão de Thaumatomyrmecini na mesma, como já relatado anteriormente (Brady et al., 2006; Moreau et al., 2006; Schmidt, 2013; Schmidt e Shattuck, 2014). Assim, dados morfológicos convergem, favoravelmente, à relação de grupo irmão entre Thaumatomyrmex e Ponerini, sendo também consistente o posicionamento do primeiro em Ponerini. As evidências moleculares, por sua vez, posicionam Thaumatomyrmex como um táxon altamente derivado de Ponerini, cujos caracteres morfológicos sofreram uma derivação secundária resultante da extrema especialização de caça (Brandão, 1991; Bolton, 2003; Schmidt, 2013).
Em um nível filogenético mais específico, entre os gêneros componentes de Ponerini, o caráter monofilético é fortemente sustentado para a maioria dos mesmos, com exceção de dois gêneros, dos quais destaca-se Pachycondyla (Smith, 2009; Keller, 2011; Mariano et al., 2011; Schmidt, 2013; Moreau e Bell, 2013; Schmidt e Shattuck, 2014). Os táxons do respectivo gênero estão amplamente distribuídos entre a filogenia de Ponerini, envolvendo uma notável diversidade ecológica, morfológica e comportamental além de numerosas simplesiomorfias, de modo a representarem inúmeras linhagens de caráter divergente, favorecendo, pois, a condição não monofilética de Pachycondyla (Schmidt, 2013; Schmidt e Shattuck, 2014).
1.4. Aparelho Reprodutor Masculino e Espermatozoides em Hymenoptera e sua Relevância Filogenética
1.4.1. Morfologia do Aparelho Reprodutor Masculino
De maneira geral, o aparelho reprodutor masculino em Hymenoptera é constituído por dois testículos, dois ductos deferentes, dois reservatórios/vesículas seminais, duas glândulas acessórias e um ducto ejaculatório (Figura 3) (Snodgrass, 1935; Jamieson, 1987; Jamieson et al., 1999; Alves, 2006). Os testículos ocorrem unidos - por um revestimento de tecido conjuntivo - ou não e podem variar de esféricos a fusiformes, sendo bastante evidentes nos adultos jovens, além de sofrerem degeneração gradativa até a completa regressão no estágio final da maturidade sexual. Estes representam o local de desenvolvimento do processo espermatogênico, sendo constituídos por folículos, os quais podem variar em número, forma e tamanho nos diferentes grupos taxonômicos. Em Vespidae bem como na maioria dos Apoidea são observados três folículos (Brito et al., 2005; Bushrow et al., 2006; Zama et al., 2007; Moreira et al., 2008, 2012; Araújo et al., 2010), embora Apidae esteja comumente relacionada a quatro folículos (Roig-Alsina e Michener, 1993; Ferreira et al., 2004; Lima et al., 2006; Fiorillo et al., 2009; Brito et al., 2010) e em Formicidae esta quantidade varie entre um a 25 folículos testiculares (Wheller e Krutzsch, 1992). Apesar da constância em relação à quantidade folicular nos respectivos grupos, algumas espécies apresentam certa variação como Apis mellifera (Apinae) a qual normalmente dispõe de 250 folículos testiculares (Ferreira et al., 2004) e Hypanthidium foveolatum (Megachilinae) com 28 folículos (Gracielle et al., 2009).Após deixarem os testículos, os espermatozoides formados permanecem armazenados na vesícula seminal, a qual abrange quase inteiramente o ducto deferente ou se restringe a apenas uma porção dilatada do mesmo (Jamieson et al., 1999). As glândulas acessórias, quando existentes, assim como os demais órgãos do aparelho reprodutor, dispõem de considerável diversidade morfológica, podendo ser esféricas, ovaladas ou tubulares. Por fim, os ductos ejaculatórios compreendem canais de comprimentos variados pelos quais ocorre a condução dos espermatozoides à genitália masculina durante a cópula.
Segundo Happ (1992), o conhecimento acerca da morfologia do sistema reprodutor masculino faz-se de grande relevância, uma vez que pode contribuir para a compreensão do crescimento populacional, da dinâmica das colônias, bem como à implantação de estratégias no seu controle.
1.4.2. Espermatozoides de Hymenoptera
A morfologia dos espermatozoides de Hymenoptera, embora seja bastante diversificada, apresenta um padrão para a classe. São constituídos de região anterior, que possui núcleo alongado e acrossomo na extremidade, e uma região flagelar, que possui axonema, longos derivados mitocondriais e corpos acessórios triangulares. Conectando ambas as regiões, há uma estrutura compacta, denominada adjunto do centríolo, a qual compreende a transição núcleo-flagelo.
De maneira geral, nos Hymenoptera, os espermatozoides são filiformes de comprimentos diversos, variando de 8 µm (Quicke et al., 1992) a 1500 µm (Zama et al., 2005a), além de apresentarem espiralações, enovelamentos ou simplesmente ocorrerem estendidos. O acrossomo compreende uma estrutura alongada formada por uma vesícula acrossomal e um perforatorium, sendo assim classificado de bicamada ou pode apresentar uma terceira camada extracelular, pela qual o mesmo recebe denominação de tripla camada (Newman e Quicke, 1999b; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto e Dolder, 2001a). O núcleo é alongado e seu comprimento exibe ampla variação entre as espécies, medindo de 4
Figura 3. Esquema morfológico do sistema reprodutivo masculino em Hymenoptera, sendo (1) os testículos, (2) os ductos deferentes, (3) as vesículas seminais, (4) as glândulas acessórias, (5) o ducto ejaculatório, (6) Gonóporo e (7) Folículo testicular. Modificado a partir de Snodgrass (1935).
µm (Quicke et al., 1992) a 105 µm (Lino-Neto et al., 1999). Em determinados grupos, o núcleo assume forma espiralada.
O adjunto do centríolo, por sua vez, consiste em uma estrutura alongada localizada paralelamente ao axonema, entre a base do núcleo e a extremidade anterior de um dos derivados mitocondriais ou ambos os derivados mitocondriais. A origem e função dessa estrutura ainda estão em discussão.
Situado no flagelo, o axonema apresenta o arranjo padrão para insetos, ou seja, 9+9+2: nove microtúbulos acessórios simples externos, nove duplas de microtúbulos periféricos e dois microtúbulos centrais. Assim como o núcleo, o axonema de algumas espécies apresenta um padrão espiralado (Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto e Dolder, 2001a,b). Em paralelo aos derivados mitocondriais e ao axonema, situam-se os corpos acessórios. Estes compreendem estruturas alongadas, de formato triangular, cuja origem e funcionalidade fazem-se desconhecidas. Os derivados mitocondriais, por sua vez, consistem basicamente em mitocôndrias modificadas que possuem cristas e apresentam algumas variações em Hymenoptera. Em alguns grupos, apresentam material paracristalino, podem variar em comprimento e em diâmetro.
Nesse âmbito, descrições da morfologia espermática à respectiva ordem abrangem espécies do grupo Symphyta (Quicke et al., 1992; Newman e Quicke, 1999a); os Aculeata, compreendendo as famílias Apidae (Cruz-Höfling et al., 1970; Peng et al., 1992, 1993; Lino-Neto et al., 2000b; Zama et al., 2001, 2004, 2005a; Báo et al., 2004; Araújo et al., 2005; Gracielle et al., 2009; Gomes et al., 2012), Halictidae (Fiorillo et al., 2005a), Anthophoridae (Fiorillo et al., 2005b), Vespidae (Mancini et al., 2006, 2009; Moreira et al., 2012) e Sphecidae (Zama et al., 2005b, 2007); Bethylidae (Oliveira et al., 2013), além do grupo Parasitica, os quais incluem Chalcidoidea (Fiorillo et al., 2008; Santos et al., 2013), Ichneumonidae (Moreira et al., 2010), Platygastridae (Paoli et al., 2013) Eucoilidae (Newman e Quicke, 1999b); Eurytomidae (Lino-Neto et al., 1999); Megalyridae (Newman e Quicke, 2000), Scelionidae (Lino-Neto e Dolder, 2001a), Trichogrammatidae (Lino-Neto et al., 2000a, Lino-Neto e Dolder, 2001b) e Braconidae (Quicke et al., 1992; Newman e Quicke, 1998).
Apesar das ressaltavas acima, as análises morfológicas espermáticas bem como do aparelho reprodutor masculino em Formicidae (Aculeata) são muito incipientes, e, portanto,
escassas, sendo restritas às descrições em poucas espécies de formigas, as quais incluem Acromyrmex versicolor, Conomyrma insana, C. wheeleri, Crematogaster sp., Tapinoma sessile (Wheeler et al., 1990), Atta capiguara, A. sexdens rubropilosa (Caetano, 1980), Solenopsis saevissima (Thompson e Blum, 1967), S. invicta (Lino-Neto e Dolder, 2002), e o gênero Pseudomyrmex (Moya et al., 2007), ausentando-se quaisquer espécies de Ponerinae em tais descrições. Em suma, as análises espermáticas em Formicidae, família em análise, além de escassas, são também relativamente antigas, datando a última descrição para 2007.
1.4.3. Relevância da Morfologia Espermática
Uma importante fonte de caracteres para insetos é a caracterização do sistema reprodutivo masculino. Essa caracterização, bem como dos espermatozoides, tem se mostrado uma excelente ferramenta no esclarecimento de questões da biologia reprodutiva, taxonomia e sistemáticas de diversos grupos de insetos.
A morfologia dos espermatozoides vem sendo descrita, há cerca de 30 anos, como um relevante e peculiar meio de informação taxonômica, o qual permite a caracterização de famílias, gêneros e, até mesmo, espécies (Baccetti, 1970, 1972; Phillips, 1970; Dallai, 1974; Jamieson, 1987; Dallai e Afzelius, 1993; Jamieson et al., 1999; Mancini et. al., 2006, 2009; Moya et. al., 2007; Lino-Neto et. al., 2008; Oliveira et. al., 2010). Baccetti (1970 e 1972) e Jamieson (1987), em seus trabalhos pioneiros demonstraram a importância da espermatologia em estudos filogenéticos, originando assim a espermiocladística. Seguindo a mesma linha de pesquisa, Jamieson e colaboradores (1999) elaboraram uma proposta de filogenia para os holometábolos a partir de caracteres morfológicos e moleculares, superpostos pelos caracteres apomórficos dos espermatozoides para as ordens de insetos.
Em Hymenoptera, os espermatozoides dos diversos taxa apresentam ampla diversidade morfológica a qual mantém-se conservada dentro de seus respectivos grupos taxonômicos, de modo que a mesma possa ser utilizada como ferramenta para estudos taxonômicos e evolutivos, considerando seu aspecto mais conservativo em detrimento do exibido pelos caracteres morfológicos tradicionais. As relações filogenéticas entre os clados de Hymenoptera, incluindo os Formicidae, são inferidas e elucidadas a partir de análises cladísticas baseadas em sequencias de nucleotídeos de DNA ribossomal além dos caracteres
morfológicos tradicionais (Bolton, 1990; Baroni Urbani et al., 1992; Brothers e Carpenter, 1993; Brothers, 1999; Astruck et al., 2004; Wilson e Hölldobler, 2005; Moreau et al., 2006; Ward, 2007; Lattke, 2011; Chen et al., 2013; Moreau e Bell, 2013; Schmidt, 2013; Schmidt e Shattuck, 2014). Juntamente a tais estudos, caracteres espermáticos estão, progressivamente, sendo utilizados como ferramentas filogenéticas ao respectivo fim.
Desse modo, os espermatozoides de Insecta, incluindo os Hymenoptera, são de suma importância para análises cladísticas, uma vez que os mesmos são considerados células conservativas, por (1) não sofrerem pressão direta de alterações ambientais; (2) por serem um caráter único à espécie produtora, cuja morfologia espermática bem como material genético faz-se espécie-específico, além de (3) suas modificações seguirem a evolução da espécie. Portanto, análises espermáticas detalhadas tendem a fornecer informações fundamentais a fim de clarificar complicações sistemáticas e filogenéticas entre os diversos grupos de insetos (Jamieson et al., 1999).
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Realizar uma análise comparativa da biologia reprodutiva estrutural, envolvendo caracteres morfológicos do sistema reprodutor masculino e dos espermatozoides de espécies representantes do gênero Pachycondyla (Hymenoptera: Formicidae: Ponerinae).
2.2. Objetivos Específicos
- Analisar a morfologia dos espermatozoides testiculares e vesiculares de indivíduos adultos; - Realizar a morfometria dos espermatozoides, através de medições de comprimento total e
nuclear;
- Comparar os dados obtidos no presente projeto com aqueles existentes na literatura de grupos e gêneros relacionados, visando à obtenção de um padrão morfológico consistente, auxiliando na taxonomia e filogenia do gênero estudado bem como de Formicidae e Hymenoptera como um todo;
- Analisar a potencialidade destes dados morfológicos como fonte de caracteres para estudos filogenéticos;
- Corroborar a ideia de que os dados extraídos da morfologia dos espermatozoides em insetos são fontes de apoio em análises evolutivas;
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Capítulo 1
Características ultraestruturais dos espermatozoides de Pachycondyla harpax e P. termitofane commutata (Hymenoptera: Formicidae)
Lívia Cuquetto Leitea, José Lino-Netoc, Heidi Doldera, Karina Carvalho Mancinia,b*
a Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural,
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brazil.
b Departamento de Ciências Agrárias e Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo (CEUNES/UFES),
São Mateus, Espírito Santo, Brazil.
c Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, Minas Gerais, Brazil
* Autor Correspondente: Departamento de Ciências Agrárias e Biológicas, Centro Universitário Norte do Espírito Santo, Universidade Federal do Espírito Santo, Rodovia BR101 Norte, Km 60, Bairro Litorâneo, 29932-540, São Mateus, Espírito Santo, Brazil.
Telefone: +55 27 3312-1542
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