UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia Química
Departamento de Desenvolvimento de Processos e Produtos
ANA LÍVIA CHEMELI SENEDESE
DESENVOLVIMENTO DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE L-ÁCIDO LÁCTICO
OBTIDO A PARTIR DA FERMENTAÇÃO DE AÇÚCARES: OBTENÇÃO DE DADOS
CINÉTICOS E AVALIAÇÃO DE PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
CAMPINAS 2016
DESENVOLVIMENTO DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE L-ÁCIDO LÁCTICO
OBTIDO A PARTIR DA FERMENTAÇÃO DE AÇÚCARES: OBTENÇÃO DE DADOS
CINÉTICOS E AVALIAÇÃO DE PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção de título de Doutora em Engenharia Química
Orientadora: Profa. Dra. Maria Regina Wolf Maciel
Co-orientador: Prof. Dr. Rubens Maciel Filho
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ANA LÍVIA CHEMELI SENEDESE E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARIA REGINA WOLF MACIEL
CAMPINAS 2016
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura Elizangela Aparecida dos Santos Souza - CRB 8/8098
Senedese, Ana Lívia Chemeli,
Se56e SenDesenvolvimento do processo de produção de L-ácido láctico obtido a partir da fermentação de açúcares : obtenção de dados cinéticos e avaliação de processos de separação / Ana Lívia Chemeli Senedese. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
SenOrientador: Maria Regina Wolf Maciel.
SenCoorientador: Rubens Maciel Filho.
SenTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Engenharia Química.
Sen1. Fermentação. 2. Ácido láctico. 3. Lactobacillus. 4. Hidrólise. 5.
Cromatografia líquida de alta eficiência. I. Maciel, Maria Regina Wolf,1955-. II. Maciel Filho, Rubens,1958-. III. Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Engenharia Química. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: L-lactic acid production process development obtained from sugars fermentation : kinetic data obtaining and separation processes evaluation
Palavras-chave em inglês: Fermentation
Lactic acid Lactobacillus Hydrolysis
High-performance liquid chromatography
Área de concentração: Desenvolvimento de Processos Químicos Titulação: Doutora em Engenharia Química
Banca examinadora:
Maria Regina Wolf Maciel [Orientador] Jorge Vicente Lopes da Silva
Cecilia Amelia de Carvalho Zavaglia Melina Savioli Lópes
Viktor Oswaldo Cardenas Conha Data de defesa: 25-02-2016
Programa de Pós-Graduação: Engenharia Química
Ao meu filho Mateo Senedese Aguirre dedico este trabalho como expressão aos sentimentos de amor, garra e motivação.
Este trabalho não poderia ter se concretizado sem a colaboração de diversas pessoas e agências de fomento que, direta ou indiretamente, contribuíram para tal. Ao longo desta etapa da minha vida conheci várias pessoas e com elas cresci moral e profissionalmente. A estas pessoas e agências, ofereço meus sinceros agradecimentos. Especificamente, agradeço...
Especialmente à FAPESP (Processo 2011/11742-2) pelo apoio financeiro prestado durante a realização deste projeto.
Ao BIOFABRIS, BIOEN e CNPq também pelo suporte financeiro fornecido.
À minha orientadora Profa. Dra. Maria Regina Wolf Maciel pela oportunidade de
trabalhar e fazer parte do grupo de pesquisa pertencente aos Laboratórios de Otimização, Projeto e Controle Avançado (LOPCA) e de Desenvolvimento de Processos de Separação (LDPS) da Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas (FEQ/UNICAMP). Grata por compartilhar seu conhecimento intelectual e pela segurança e apoio.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Rubens Maciel Filho pelas constantes discussões, novas ideias e incentivo. Grata por compartilhar seu conhecimento intelectual, experiência e segurança.
Ao meu esposo Christian Aguirre pela compreensão e enorme apoio.
Aos meus pais Carlos e Ana Marta Senedese pelo apoio, reconhecimento e amor.
À minha irmã Ana Luisa Senedese Ribeiro pelos momentos de descontração.
Aos colegas do LOPCA John Hervin Bermudez, Laura Plazas Tovar e Gustavo Ponce e ex-colegas Jaiver Jaimes Figueroa e Bruna Torres da Silva por compartilhar seus conhecimentos e me apoiar na execução e discussão deste trabalho. A vocês meu enorme reconhecimento e sincero agradecimento.
À colega do LOPCA e grande amiga Lais Pellizzer Gabriel por estar sempre presente desde o início do mestrado, pela amizade, fidelidade e companheirismo.
À colega do LOPCA e amiga Ingrid Rocha pela ajuda em várias ocasiões no decorrer destes anos.
Ao amigo Arnaldo Lixandrão Filho pela paciência, companheirismo, momentos de descontração e apoio na discussão de resultados do trabalho.
Ao representante de vendas e técnico da Agilent Technologies Riberto Tonon e Sérgio Crelis, respectivamente, pelo grande suporte e atenção prestados para funcionamento adequado do equipamento de separação do ácido láctico.
Ao colega Gilson Barbosa Maia Junior pelo fornecimento de material de consumo.
Ao colega Cristiano pelo suporte computacional.
Aos funcionários e professores da FEQ que de diversas maneiras contribuíram para a realização deste trabalho.
Se você pode sonhar, você pode fazer.
A persistência é o caminho do êxito.
O uso de substratos alternativos em fermentações biotecnológicas é uma alternativa viável em substituição àqueles provenientes de fontes não-renováveis. O melaço é um exemplo e pode ser usado para produzir L-ácido láctico o qual tem se mostrado promissor na síntese de poli-L-ácido láctico (PLLA) para aplicação na área médica. Para este trabalho, três bactérias produtoras de L-ácido láctico e consumidoras de melaço foram selecionadas na literatura para ensaios em shaker: Lactobacillus (L.) rhamnosus ATCC 7469, L. rhamnosus ATCC 10863 e L. delbrueckii ATCC 9649. Por meio de um planejamento fatorial 23 do tipo estrela, foi
selecionada a bactéria que mais produziu L-ácido láctico, a L. rhamnosus ATCC 10863 com produção de 16,5 g/L. As condições de operação foram temperatura de 43⁰ C e concentração de sacarose (açúcar com maior porcentagem no melaço) e de extrato de levedura de 27,6 g/L e 3,0 g/L, respectivamente. O comportamento dos açúcares mostrou que a glicose e frutose foram praticamente totalmente consumidos, enquanto a sacarose foi pouco consumida. Em biorreator, aquela mesma cepa com as condições de operação mencionadas, além de pH 5,0, foi usada em dois processos fermentativos de batelada alimentada (processos 1 e 2) e dois de batelada (processos 3 e 4) com o melaço sem pré-tratamento. Dentre estes processos, a sacarose ainda foi pouco convertida, atingindo no máximo 22,5 % no processo de batelada alimentada 1. Neste mesmo processo, o máximo de frutose foi convertido, 98,4%, e o máximo de conversão da glicose foi no processo de batelada 4, 91,7 %. O pico máximo de L-ácido láctico produzido foi no processo de batelada alimentada 2, 22,0 g/L. Logo, posteriormente, foi realizado outro processo fermentativo de batelada (processo 5) com pré-tratamento do melaço, a hidrólise da sacarose em glicose e frutose utilizando a enzima invertase, resultando em praticamente 100 %. No processo fermentativo 5, a glicose foi convertida em 98,2 % e a frutose em 99,3 % e foram gerados 35,5 g/L de ácido láctico (pico máximo). A produtividade máxima foi de 2,0 g/Lh, o crescimento da biomassa foi de 5,0 g/L, o rendimento foi de 97,5 % e foram detectados 98,5 % do isômero L(+) do ácido láctico no caldo da fermentação ao final do processo. Portanto, este processo foi identificado como o “ótimo” deste trabalho. Em seguida, o processo de separação do L-ácido láctico foi feito no equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com coletor de frações. Foi usada a coluna semi-preparativa ZORBAX Eclipse XDB-C18 para separar o L-ácido láctico de todos os outros componentes
analítica Aminex HPX-87H que isolou e coletou o L-ácido láctico, obtendo 11 ml de solução de fase móvel e ácido diluído, com taxa de recuperação de 53,0 %. A título de demonstração de viabilidade de uso desta técnica para separar o L-ácido láctico proveniente de fermentação, esta metodologia foi válida.
The use of alternative substrates in biotechnological fermentations is a viable alternative to substitute those derived from non-renewable sources. The molasses is an example and can be used to produce L-lactic acid that has shown to be promising to produce poly-L-lactic acid (PLLA) for application in medical field. For this work, three L-lactic acid producing bacteria and also molasses consumers were selected from literature for shaker trials: Lactobacillus (L.) rhamnosus ATCC 7469, L. rhamnosus ATCC 10863 and L. delbrueckii ATCC 9649. Through a star configuration 23 experimental planning, the bacterium that produced more L-lactic acid
was selected, which was the L. rhamnosus ATCC 10863, producing 16.5 g/L. The operation conditions were 43⁰ C as temperature and concentrations of 27.6 g/L of sucrose (sugar with higher percentage at molasses) and 3.0 g/L of yeast extract, respectively. The sugars behavior showed that glucose and fructose were basically completely consumed while sucrose was barely consumed. At bioreactor, that bacterium with the operation conditions just mentioned, besides the pH 5.0, was used at two fed batch fermentation processes (processes 1 and 2) and two batch fermentation processes (processes 3 and 4) with the molasses without pre-treatment. Among these processes, the sucrose was still scarcely consumed, reaching the maximum of 22.5 % at fed batch process 1. At this same process, the maximum of fructose was converted, 98.4 %, and the maximum of glucose converted was at batch process 4, 91.7 %, The maximum peak of L-lactic acid produced was at fed batch process 2, 22.0 g/L. Thus, after, it was performed another batch fermentation process (process 5) with molasses pre-treatment, the sucrose hydrolysis into glucose and fructose using the enzyme invertase, resulting in 100 %. At fermentative process 5, the glucose was converted in 98.2 % and fructose in 99.3 %, generating 35.5 g/L of L-lactic acid (maximum peak). The maximum productivity was 2.0 g/Lh, the biomass growth was 5.0 g/L, the yield was 97.5 % and it was detected 98.5 % of the isomer L(+) of lactic acid at fermentation broth at the end of process. Therefore, this process was identified as the “optimum” of this work. Afterwards, the L-lactic acid separation process was done at the high performance liquid chromatography (HPLC) equipment with fraction collector. It was used the semi-preparative column ZORBAX Eclipse XDB-C18 to separate the L-lactic acid from all components remained at fermentation broth, but the acetic acid at the enzymatic solution previously used was collected at the same time.
rate of 53.0 %. Intending to demonstrate the viability of use of this technique to separate L-lactic acid from fermentation, this methodology was valid.
FIGURA 1 - FLUXOGRAMA DO PROCESSO DE OBTENÇÃO DO L-ÁCIDO LÁCTICO ... 28
FIGURA 2 - ESQUEMA GERAL DO TRABALHO REALIZADO E SUAS CONTRIBUIÇÕES. S = SACAROSE, EL = EXTRATO DE LEVEDURA ... 29
FIGURA 3 - ISÔMEROS DO ÁCIDO LÁCTICO ... 30
FIGURA 4 - CICLO DE VIDA DO LACTÍDEO ... 33
FIGURA 5 - APLICAÇÕES COMERCIAIS DO ÁCIDO LÁCTICO ... 36
FIGURA 6 - PRODUTOS DERIVADOS DO ÁCIDO LÁCTICO ... 37
FIGURA 7 - MELAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR ... 38
FIGURA 8 - FASES DE CRESCIMENTO CELULAR BACTERIANO, ONDE: (1) FASE LAG, (2) FASE LOG, (3) FASE ESTACIONÁRIA, (4) FASE DE DECLÍNIO ... 42
FIGURA 9 - EXEMPLO DE L. DELBRUECKII ... 44
FIGURA 10 - IMAGEM DE MO DE L. RHAMNOSUS ATCC7469 ... 44
FIGURA 11 - ESQUEMA SIMPLIFICADO DE SEPARAÇÃO DE DUAS MISTURAS EM CROMATOGRAFIA ... 53
FIGURA 12 - ILUSTRAÇÃO SIMPLIFICADA DE UM EQUIPAMENTO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ... 54
FIGURA 13 - CROMATOGRAMA TÍPICO PARA CÁLCULO DE PARÂMETROS ... 55
FIGURA 14 - CULTURA DE L. RHAMNOSUS ATCC 10863 EM MEIO MRS EM ESTUFA, COM INTERVALO DE 48 HORAS ENTRE CADA UMA EM ESTUFA. (A) REPIQUE DE ALÍQUOTA EM 5 ML DE MEIO MRS ÁGAR; (B) REPIQUE DE ALÍQUOTA EM 10 ML DE MEIO MRS; (C) TRANFERÊNCIA DE 5 ML DE INÓCULO PARA 45 ML DE MEIO MRS ... 65
FIGURA 15 - MEIO DE FERMENTAÇÃO COM INÓCULO DE L. RHAMNOSUS ATCC 10863 EM SHAKER ... 66
FIGURA 16 - ESQUEMA DA METODOLOGIA UTILIZADA NOS PROCESSOS FERMENTATIVOS EM SHAKER ... 67
FIGURA 17 - BIORREATOR NEW BRUNSWICK, BIOFLO 415 ... 90
FIGURA 18 - ESQUEMA DA METODOLOGIA UTILIZADA NOS PROCESSOS FERMENTATIVOS EM FERMENTADOR/BIORREATOR... 91
FIGURA 19 - (A) EQUIPAMENTO DE HPLC (INFINITY 1260,AGILENT TECHNOLOGIES) COM O (B) MÓDULO DE COLETOR DE FRAÇÕES ACOPLADO ... 113
FIGURA 20 - CROMATOGRAMAS DE TESTE DA FASE MÓVEL DE 90:10 (V/V) DE METANOL/ÁGUA NA COLUNA ZORBAX ECLIPSE PLUS C-18, SENDO (A) ÁCIDO LÁCTICO PADRÃO, (B) ÁCIDO ACÉTICO PADRÃO E (C) AMOSTRA DO CALDO FERMENTADO DO PROCESSO 5 DE BATELADA. ... 117
FIGURA 21 - CROMATOGRAMAS DE TESTE DA FASE MÓVEL DE 5/95 (V/V) DE METANOL/ÁGUA NA COLUNA ZORBAX ECLIPSE PLUS C-18, SENDO (A) ÁCIDO LÁCTICO PADRÃO, (B) ÁCIDO ACÉTICO PADRÃO E (C) AMOSTRA DO CALDO FERMENTADO DO PROCESSO 5 DE BATELADA. ... 118
FIGURA 22 - COMPARAÇÃO DO PICO EM COLETA VOLUMES DE 30 L (A) E 100 L (B) ... 119
FIGURA 23 - CROMATOGRAMAS DE TESTE INICIAL NA COLUNA ZORBAX ECLIPSE XDB C-18, SENDO (A) ÁCIDO LÁCTICO PADRÃO, (B) ÁCIDO ACÉTICO PADRÃO E (C) AMOSTRA DO CALDO FERMENTADO DO PROCESSO 5 DE BATELADA. ... 121
FIGURA 24 - CROMATOGRAMA DE COLETA DOS ÁCIDOS LÁCTICO E ACÉTICO COM A COLUNA ZORBAX ECLIPSE XDB C-18 ... 121
FIGURA 25 - SOLUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO, ÁCIDO ACÉTICO E FASE MÓVEL OBTIDA NO COLETOR DE FRAÇÕES APÓS A SEPARAÇÃO COM A COLUNA ZORBAX ECLIPSE XDB C-18. ... 122
TODOS OS COMPOSTOS APÓS A SEPARAÇÃO ... 123 FIGURA 27 - CROMATOGRAMA DE COLETA DO L-ÁCIDO LÁCTICO COM A COLUNA HPX-87H ... 125 FIGURA 28 - L-ÁCIDO LÁCTICO EM SOLUÇÃO DE FASE MÓVEL OBTIDO APÓS A SEGUNDA SEPARAÇÃO NO HPLC ... 126
TABELA 1: CONCENTRAÇÕES DE AÇÚCARES EM 100 G DE MELAÇO ANALISADO ... 60
TABELA 2: PARÂMETROS AVALIADOS NO PLANEJAMENTO FATORIAL 23DE CONFIGURAÇÃO TIPO ESTRELA PARA AS TRÊS CEPAS: MATRIZ DE PLANEJAMENTO CODIFICADA ... 61
TABELA 3: PARÂMETROS AVALIADOS NO PLANEJAMENTO FATORIAL 23DE CONFIGURAÇÃO TIPO ESTRELA PARA AS TRÊS CEPAS: VALORES DECODIFICADOS ... 62
TABELA 4: COMPOSIÇÃO DO MRS ÁGAR (NEOGEN CORPORATION) ... 64
TABELA 5: COMPOSIÇÃO DO MRS (NEOGEN CORPORATION) ... 64
TABELA 6: PARÂMETROS AVALIADOS NO PLANEJAMENTO FATORIAL 23 DE CONFIGURAÇÃO DO TIPO ESTRELA PARA L. RHAMNOSUS ATCC 7469 ... 68
TABELA 7: PARÂMETROS AVALIADOS NO PLANEJAMENTO FATORIAL 23 DE CONFIGURAÇÃO DO TIPO ESTRELA PARA L. RHAMNOSUS ATCC 10863 ... 69
TABELA 8: PARÂMETROS AVALIADOS NO PLANEJAMENTO FATORIAL 23 DE CONFIGURAÇÃO DO TIPO ESTRELA PARA L. DELBRUECKII ATCC 9649. ... 69
TABELA 9: CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO QUE GERARAM A MAIOR PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO PARA CADA CEPA ... 70
TABELA 10: VALORES DE ÁCIDO LÁCTICO OBTIDO EXPERIMENTALMENTE EM 24 H DE FERMENTAÇÃO E ÁCIDO LÁCTICO CALCULADO PELO SOFTWARE STATISTICA PARA L. RHAMNOSUS ATCC 7469 ... 72
TABELA 11: EFEITOS CALCULADOS, VALORES DE P E COEFICIENTES PARA L. RHAMNOSUS ATCC 7469 ... 73
TABELA 12: VALORES F DE REGRESSÃO E DE FALTA DE AJUSTE E R2 PARA L. RHAMNOSUS ATCC 7469 ... 74
TABELA 13: VALORES OBTIDOS NO SOLVER COMO ÓTIMOS PARA FERMENTAÇÃO DE L. RHAMNOSUS ATCC 7469 ... 76
TABELA 14: VALOR DE ÁCIDO LÁCTICO OBTIDO EXPERIMENTALMENTE EM 24 H DE FERMENTAÇÃO E ÁCIDO LÁCTICO CALCULADO PELO SOFTWARE STATISTICA PARA L. RHAMNOSUS ATCC 10863 ... 77
TABELA 15: EFEITOS CALCULADOS, VALORES DE P E COEFICIENTES PARA L. RHAMNOSUS ATCC 10863 ... 78
TABELA 16: VALORES F DE REGRESSÃO E DE FALTA DE AJUSTE E R2 PARA L. RHAMNOSUS ATCC 10863 ... 79
TABELA 17: VALORES OBTIDOS NO SOLVER COMO ÓTIMOS PARA FERMENTAÇÃO DE L. RHAMNOSUS ATCC 10863 ... 80
TABELA 18: VALOR DE ÁCIDO LÁCTICO OBTIDO EXPERIMENTALMENTE EM 24 H DE FERMENTAÇÃO E ÁCIDO LÁCTICO CALCULADO PELO SOFTWARE STATISTICA PARA L. DELBRUECKII ATCC 9649 ... 81
TABELA 19: EFEITOS CALCULADOS, VALORES DE P E COEFICIENTES PARA L. DELBRUECKII ATCC 9649 ... 82
TABELA 20: VALORES F DE REGRESSÃO E DE FALTA DE AJUSTE E R2 PARA L. DELBRUECKII ATCC 9649 ... 83
TABELA 21: VALORES OBTIDOS NO SOLVER COMO ÓTIMOS PARA FERMENTAÇÃO DE L.DELBRUECKII ATCC 9649 ... 84
TABELA 22: QUANTIDADE DE ÁCIDO LÁCTICO PRODUZIDA NAS FERMENTAÇÕES EM SHAKER: COMPARATIVOS ENTRE AS TRÊS CEPAS... 85
TABELA 23: AÇÚCARES E ÁCIDO LÁCTICO DETECTADOS POR HPLC NOS PROCESSOS FERMENTATIVOS DE BATELADA ALIMENTADA 1 E 2 ... 95
TABELA 24: CONVERSÃO DOS AÇÚCARES NOS PROCESSOS FERMENTATIVOS DE BATELADA ALIMENTADA 1 E 2 ... 96
TABELA 25: AÇÚCARES E ÁCIDO LÁCTICO DETECTADOS POR HPLC NOS PROCESSOS FERMENTATIVOS DE BATELADA 3 E 4 ... 97
TABELA 26: AÇÚCARES DO MELAÇO DURANTE PROCESSO DE HIDRÓLISE DA SACAROSE: A ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE 20.000 SU E 50.000 SU ... 99
TABELA 29: ÁCIDO LÁCTICO PRODUZIDO NOS CINCO PROCESSOS FERMENTATIVOS REALIZADOS EM FERMENTADOR/BIORREATOR .... 103
TABELA 30: CONVERSÃO DOS AÇÚCARES NOS PROCESSOS FERMENTATIVOS DE BATELADA ... 103
TABELA 31: DADOS DA LITERATURA SOBRE VALORES DE ÁCIDO LÁCTICO E PRODUTIVIDADE MÁXIMA OBTIDOS PELA L. RHAMNOSUS ATCC 10863 UTILIZANDO DIFERENTES SUBSTRATOS ... 104
TABELA 32: PRODUTIVIDADE MÁXIMA E FINAL DE TODOS OS PROCESSOS FERMENTATIVOS ... 106
TABELA 33: BIOMASSA OBTIDA EM CADA TEMPO EM TODOS OS PROCESSOS FERMENTATIVOS ... 107
TABELA 34: RESUMOS DOS RESULTADOS DE TODOS OS PROCESSOS FERMENTATIVOS ... 111
TABELA 35: ADAPTAÇÃO DO MÉTODO DA COLUNA ANALÍTICA PARA A COLUNA SEMI-PREPARATIVA ... 118
TABELA 36: METODOLOGIA FINAL ADOTADA PARA A COLUNA SEMI-PREPARATIVA ZORBAX ECLIPSE XDB C-18 ... 120
TABELA 37: DADOS PARA CÁLCULO DA TAXA DE RECUPERAÇÃO DO L-ÁCIDO LÁCTICO NAS DUAS SEPARAÇÕES ... 127
TABELA 38: VALORES DAS CONSTANTES OBTIDAS PARA O CÁLCULO DA TAXA DE RECUPERAÇÃO DO L-ÁCIDO LÁCTICO NAS DUAS SEPARAÇÕES E VALORES DAS TAXAS OBTIDAS ... 128
TABELA 39: DADOS PARA CÁLCULO DA TAXA DE RECUPERAÇÃO DO ÁCIDO ACÉTICO NAS DUAS SEPARAÇÕES ... 129
TABELA 40: VALORES DAS CONSTANTES OBTIDAS PARA O CÁLCULO DA TAXA DE RECUPERAÇÃO DO ÁCIDO ACÉTICO NAS DUAS SEPARAÇÕES E VALORES DAS TAXAS OBTIDAS ... 129
QUADRO 1: TRABALHOS REALIZADOS ENVOLVENDO O ÁCIDO LÁCTICO NO LOPCA/LDPS – UNICAMP ... 27
QUADRO 2: CARACTERÍSTICAS DO ÁCIDO LÁCTICO ... 31
QUADRO 3: PROPRIEDADES FÍSICAS E TERMODINÂMICAS DO ÁCIDO LÁCTICO ... 31
QUADRO 4: TÉCNICAS GERAIS DE SEPARAÇÃO USADAS COM BASE NAS CARACTERÍSTICAS DE PRODUTOS ESPECÍFICOS ... 50
GRÁFICO 1 - RELAÇÃO ENTRE OS VALORES DE ÁCIDO LÁCTICO OBTIDOS EXPERIMENTALMENTE E CALCULADOS PELO SOFTWARE
STATISTICA PARA L. RHAMNOSUS ATCC 7469 ... 73
GRÁFICO 2 - GRÁFICO DE PARETO SOBRE A SIGNIFICÂNCIA DAS VARIÁVEIS PARA L. RHAMNOSUS ATCC 7469 ... 74
GRÁFICO 3 - GRÁFICO DE ANÁLISE DE SUPERFÍCIE PARA L. RHAMNOSUS ATCC 7469: INFLUÊNCIA DA SACAROSE E TEMPERATURA NA PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO ... 75
GRÁFICO 4 - RELAÇÃO ENTRE OS VALORES DE ÁCIDO LÁCTICO OBTIDOS EXPERIMENTALMENTE E CALCULADOS PELO SOFTWARE STATISTICA PARA L. RHAMNOSUS ATCC 10863 ... 78
GRÁFICO 5 - GRÁFICO DE PARETO SOBRE A SIGNIFICÂNCIA DAS VARIÁVEIS PARA L. RHAMNOSUS ATCC 10863 ... 79
GRÁFICO 6 - RELAÇÃO ENTRE OS VALORES DE ÁCIDO LÁCTICO OBTIDOS EXPERIMENTALMENTE E CALCULADOS PELO SOFTWARE STATISTICA PARA L. DELBRUECKII ATCC 9649 ... 81
GRÁFICO 7 - GRÁFICO DE PARETO SOBRE A SIGNIFICÂNCIA DAS VARIÁVEIS PARA L. DELBRUECKII ATCC 9649 ... 83
GRÁFICO 8 - BATELADA ALIMENTADA 1 E 2: CONSUMO DE AÇÚCARES E PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO ... 96
GRÁFICO 9 - BATELADA 3 E 4: CONSUMO DE AÇÚCARES E PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO ... 97
GRÁFICO 10 - AÇÚCARES DO MELAÇO DURANTE O PROCESSO DE HIDRÓLISE DA SACAROSE: ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE 20.000 SU E 50.000 SU ... 100
GRÁFICO 11 - HIDRÓLISE DA SACAROSE DO MELAÇO ANTES DO PROCESSO FERMENTATIVO DE BATELADA 5 ... 101
GRÁFICO 12 - PROCESSOS FERMENTATIVOS DE BATELADA 3, 4 E 5: CONSUMO DE AÇÚCARES E PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO ... 102
GRÁFICO 13 - PRODUTIVIDADE DOS CINCO PROCESSOS FERMENTATIVOS REALIZADOS EM FERMENTADOR/BIORREATOR ... 106
GRÁFICO 14 - COMPORTAMENTO DA BIOMASSA NOS CINCO PROCESSOS FERMENTATIVOS REALIZADOS EM FERMENTADOR/BIORREATOR ... 107
AC... Affinity Chromatograpy Cromatografia de afinidade
ART... Açúcares redutores totais
BC... Bio- Chromatograpy Biocromatografia
CCD... Cromatografia de Camada Delgada
CLAE... HPLC...
Cromatografia líquida de alta eficiência High Peformance Liquid Chromatograpy
FDA... Food and Drug Administration
Administração para alimentos e drogas
HSCCC... High-speed Counter-Current Chromatograpy Cromatografia contracorrente de alta velocidade
LAB... Lactic acid bacteria
L. ou Lb. ... Lactobacillus
LDH... Lactato desidrogenase
LDPS... Laboratório de Desenvolvimento de Processos de Separação
LOPCA... Laboratório de Otimização, Projeto e Controle Avançado
MO... Microscopia óptica
MRS... Meio de crescimento bacteriano (nome designado pelos inventores de Man, Rogosa e Sharpe)
PE... Ponto de ebulição
PLA... Poli-ácido láctico
PLLA... Poli-L-ácido láctico
RRLC... Rapid resoution Liquid Chromatograpy Cromatografia líquida de rápida resolução
sp. ... Subespécie
SFC... Supercritical Fluid Chromatograpy,
Cromatografia líquida de fluído supercrítico
tM... Tempo morto em cromatografia líquida
TR... Tempo de retenção em cromatografia líquida
UPLC... Ultra Performance Liquid Chromatograpy
Cromatografia líquida de ultra eficiência
C... Molécula de carbono
CaCO3... Molécula de carbonato de cálcio
Ca(OH)2... Molécula de hidróxido de cálcio
CaSO4... Molécula de sulfato de cálcio
C3H12O6... Molécula de glicose/frutose
C3H6O3... Molécula de ácido láctico
C6H10CaO6... Molécula de lactato de cálcio
C12H22O11... Molécula de sacarose
H... Molécula de hidrogênio
H2O... Molécula de água
H2SO4... Molécula de ácido sulfúrico
H3PO4... Molécula de ácido fosfórico
O2... Molécula de oxigênio
CAPÍTULO 1 ... 24 1 Introdução ... 24
1.1 OBJETIVOS ... 24 1.2 ORGANIZAÇÃO DA TESE ... 25 1.3 CONTRIBUIÇÕES DESTE TRABALHO ... 26
CAPÍTULO 2 ... 30 2 Revisão bibliográfica ... 30
2.1 ÁCIDO LÁCTICO ... 30 2.2 APLICAÇÕES DO ÁCIDO LÁCTICO ... 34 2.3 SUBSTRATOS COM POTENCIAL PARA UTILIZAÇÃO EM FERMENTAÇÕES ... 37 2.3.1 Melaço de cana-de-açúcar ... 38 2.4 MICRO-ORGANISMOS PRODUTORES DE ÁCIDO LÁCTICO ... 39 2.5 PRODUÇÃO DO ÁCIDO LÁCTICO ... 44 2.6 SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO ÁCIDO LÁCTICO ... 48 2.6.1 Técnicas de cromatografia ... 53 2.7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 57
CAPÍTULO 3 ... 59 3 Processos fermentativos em shaker ... 59
3.1 MICRO-ORGANISMOS UTILIZADOS ... 59 3.2 SUBSTRATO DO PROCESSO FERMENTATIVO ... 59 3.3 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ... 60 3.4 ETAPAS DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS ... 63 3.4.1 Preparo do inóculo ... 63 3.4.2 Preparo do meio ... 65 3.4.3 Realização dos processos fermentativos ... 66 3.5 METODOLOGIA ANALÍTICA ... 67 3.6 RESULTADOS DOS PLANEJAMENTOS EXPERIMENTAIS E PROCESSOS FERMENTATIVOS ... 68 3.7 RESULTADOS DA VALIDAÇÃO ESTATÍSTICA ... 71 3.7.1 L. rhamnosus ATCC 7469 ... 71 3.7.2 L. rhamnosus ATCC 10863 ... 76 3.7.3 L. delbrueckii ATCC 9649 ... 80 3.7.4 Comparativo final entre as cepas analisadas ... 84
4 Processos fermentativos em biorreator/fermentador ... 88
4.1 MICRO-ORGANISMO ... 88 4.2 ETAPAS DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS ... 88 4.2.1 Preparo do inóculo ... 88 4.2.2 Preparo do meio ... 88 4.2.3 Realização dos processos fermentativos ... 89 4.2.4 Hidrólise da sacarose do melaço de cana-de-açúcar ... 92 4.3 METODOLOGIA ANALÍTICA ... 92
4.3.1 Análise da massa celular seca ... 92 4.3.2 Análise de açúcares e ácido láctico ... 93 4.3.3 Identificação dos isômeros do ácido láctico ... 93 4.4 RESULTADOS DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS ... 93
4.4.1 Consumo de açúcares e produção de ácido láctico ... 94 4.4.2 Produtividade ... 105 4.4.3 Massa celular seca ... 107 4.4.4 Rendimento ... 109 4.4.5 Identificação dos isômeros do ácido láctico ... 110 4.5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 110
CAPÍTULO 5 ... 112 5 Processo de separação do L-ácido láctico por cromatografia líquida de alta eficiência ... 112
5.1 EXPERIMENTAL ... 113 5.1.1 Preparo das amostras ... 114 5.1.2 Colunas utilizadas, desenvolvimento das respectivas metodologias e resultados . 114 5.1.3 Cálculo da taxa de recuperação do L-ácido láctico após a separação ... 126 5.2 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 130
CAPÍTULO 6 ... 132 6 Conclusões e sugestões para trabalhos futuros ... 132
6.1 CONCLUSÕES ... 132 6.2 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 134
Referências bibliográficas ... 135 Anexo 1... 148 Anexo 2... 149
CAPÍTULO 1
1
Introdução
Preocupações em relação aos impactos ambientais a longo prazo e ao fornecimento de produtos petroquímicos têm estimulado o interesse em usar a biotecnologia na produção sustentável de produtos químicos a partir de recursos renováveis. Fazer o uso de biocatalisadores microbianos e enzimáticos para produzir produtos industrialmente relevantes é denominado biotecnologia branca. Os avanços recentes em genômica e biologia de sistemas, engenharia metabólica e catálise têm contribuído para tornar a biotecnologia branca industrialmente viável (FRAZZETTO, 2003). A biotecnologia branca integra a ideia de química verde, a qual apresenta um efeito positivo sobre o meio ambiente e a sociedade, pois tanto a química verde quanto a biotecnologia branca compartilham o desafio de que produtos feitos através de processos sustentáveis devem continuar a ter uma vantagem econômica para substituir os processos petroquímicos utilizados atualmente e conquistar ampla aceitação industrial.
O potencial de um produto está relacionado à sua habilidade de derivar ou servir como suporte para outros. O ácido láctico encontra-se nesta categoria de produtos. É um ácido orgânico multifuncional e tem mostrado sua aplicação na manufatura de polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, como o poli-L-ácido láctico (PLLA). Este polímero está sendo amplamente utilizado na área biomédica (LASPRILLA et al., 2011a, 2011b; MARTINEZ et al., 2010, 2011, 2012; MENDES; JARDINI; BÁRTOLO, 2004; SAVIOLI LOPES; JARDINI; MACIEL FILHO, 2014; SAVIOLI LOPES; JARDINI; MACIEL-FILHO, 2012) para reparos de ossos (EFTEKHARI et al., 2014; LASPRILLA et al., 2010), suturas cirúrgicas, tecidos artificiais (MAJOLA et al., 1992; MONTICELLI et al., 2013; VAINIONPÄÄ; ROKKANEN; TORMALA, 1989; WAN et al., 2014) e scaffolds (arcabouços tridimensionais) (DUARTE; MANO; REIS, 2010; GUPTA; REVAGADE; HILBORN, 2007; LIU et al., 2014).
1.1 Objetivos
Os objetivos deste trabalho estão vinculados ao projeto “Instituto Nacional de Ciência & Tecnologia em Biofabricação (BIOFABRIS)”, projeto temático FAPESP (2008/57860-3), destinado ao desenvolvimento de uma metodologia para a biofabricação de estruturas
bioativas de modo a promover e melhorar o desempenho de órgãos ou tecidos. Um dos materiais a ser usado para esta finalidade é o poli-L-ácido láctico (PLLA), o qual é produzido a partir do ácido láctico.
Logo, o objetivo geral deste trabalho consiste na otimização da produção de L-ácido láctico obtido por fermentação de melaço de cana-de-açúcar (substrato alternativo de custo reduzido) visando alto rendimento de produto e seletividade (redução de bioprodutos secundários). Os objetivos específicos consistem em:
1. Selecionar, com base na literatura, três bactérias produtoras de L-ácido láctico, considerando suas características e vantagens.
2. Realizar um estudo fermentativo em “Erlenmeyer” com as bactérias selecionadas visando encontrar melhores condições de fermentação, incluindo a suplementação do meio com fonte de nitrogênio.
3. Realizar fermentações em biorreator com a melhor cepa selecionada, determinando as configurações de operação combinando consumo de açúcares e produção de L-ácido láctico durante a fermentação, de forma a evitar a inibição dos microrganismos; ainda, avaliar os parâmetros temperatura, pH e concentração de substrato, a fim de otimizá-los.
4. Avaliar os sistemas de fermentação de batelada e batelada alimentada com o objetivo de evitar inibição pelo substrato e pelo produto formado, além de diminuir a adição de base para ajuste de pH do caldo de fermentação (procedimento geralmente adotado em bateladas, que provoca a formação de sal de lactato e, portanto, diminuição de L-ácido láctico livre).
5. Selecionar um método de separação e purificação do L-ácido láctico obtido a partir da fermentação de melaço de cana-de-açúcar para posteriormente ser usado na síntese de PLLA, ressaltando que a mesma não será realizada neste projeto.
1.2 Organização da tese
Esta tese está organizada em seis (6) capítulos, referências bibliográficas e dois (2) anexos:
projeto de pesquisa, os objetivos propostos, assim como a organização da tese.
O Capítulo 2 aborda a revisão bibliográfica contendo conceitos do ácido láctico como aplicações, produção, micro-organismos produtores, substratos utilizados e processos de separação e purificação.
O Capítulo 3 descreve os processos fermentativos realizados em shaker incluindo a metodologia utilizada para o desenvolvimento desta etapa do trabalho e os resultados.
O Capítulo 4 mostra os processos fermentativos realizados em biorreator/fermentador, descrevendo a metodologia adotada seguida dos resultados.
O Capítulo 5 aborda a técnica de separação do ácido láctico adotada, assim como os resultados obtidos.
O Capítulo 6 expõe as conclusões obtidas e as perspectivas de trabalhos futuros. Em seguida, constam as referências bibliográficas utilizadas para a elaboração desta tese, as quais foram redigidas de acordo com as normas da ABNT (NBR 6023:2002).
Por fim, o Anexo 1 apresenta a autorização para realização do trabalho no que se refere ao Patrimônio Genético (PATGEN) concedidas pelo CNPq em 2015 e, o Anexo 2 mostra as curvas de calibração utilizadas nas análises de cromatografia líquida com a coluna Aminex HPX-87H.
1.3 Contribuições deste trabalho
Já foram realizados vários trabalhos de mestrado e doutorado envolvendo o ácido láctico nos laboratórios de pesquisa (LOPCA e LDPS - UNICAMP) nos quais esta tese aqui apresentada foi desenvolvida. Estes trabalhos podem ser verificados no Quadro 1.
Quadro 1: Trabalhos realizados envolvendo o ácido láctico no LOPCA/LDPS – UNICAMP
Assunto abordado Referência
Produção e controle da síntese do éster de ácido
acrílico através da fermentação do ácido láctico LUNELLI, 2010
Síntese do poli-ácido láctico a partir do ácido láctico
para aplicação biomédica LASPRILLA, 2011
Produção de ácido acrílico de fonte renovável a partir do ácido lático por fermentação do melaço de cana-de-açúcar
JAIMES, 2013
Produção de ácido propiônico usando ácido láctico
fermentado dos açúcares da cana-de-Açúcar TORRES DA SILVA, 2013
Desenvolvimento de microrreator para síntese de polímeros biorreabsorvíveis (PLLA) utilizados como implantes biomédicos
SAVIOLI LOPES, 2014
Estratégias de separação e purificação do ácido
láctico produzido por via fermentativa KOMESU, 2015
Diante destes assuntos já estudados anteriormente, este trabalho apresenta o fluxograma do processo estudado o qual consta na Figura 1.
Figura 1 - Fluxograma do processo de obtenção do L-ácido láctico
Ainda, este trabalho destaca como contribuições as seguintes etapas: seleção de uma bactéria produtora de L-ácido láctico para as fermentações em biorreator/fermentador; otimização do processo fermentativo em batelada para obtenção do produto de interesse em maior concentração por meio da realização de um processo prévio de hidrólise da sacarose do melaço com uso da enzima invertase; separação e coleta do L-ácido láctico com uso da técnica de cromatografia líquida de alta performance (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) com um sistema semi-preparativo o qual foi montado e configurado para este fim. Todas as etapas, mais detalhadamente, e principais contribuições deste trabalho podem ser conferidas na Figura 2.
CAPÍTULO 2
2
Revisão bibliográfica
Neste Capítulo serão abordados aspectos relacionados ao ácido láctico, envolvendo suas aplicações, produção, micro-organismos produtores, substratos que podem ser utilizados, com ênfase no melaço, além de alguns processos de separação e purificação.
2.1 Ácido láctico
O ácido láctico, também conhecido como ácido 2-hidroxipropiônico (C3H6O3), é o
ácido que mais se encontra na natureza. Em 1780 foi identificado no leite azedo pelo químico sueco Scheele. Alguns anos mais tarde, em 1789, Lavoisier nomeou este componente do leite de acide lactique. E apenas no século seguinte, Pasteur, em 1857, descobriu que o ácido láctico era na verdade um metabólito fermentativo produzido por alguns micro-organismos (BENNINGA, 1990).
O ácido láctico puro é um sólido branco cristalino com baixo ponto de fusão. É mais comum que seja encontrado como uma solução aquosa diluída ou concentrada. Este ácido possui um átomo de carbono assimétrico com quatro grupos diferentes ligados a ele: -COOH, -H, -OH e CH3, e, existe na forma racêmica e nas formas opticamente ativas L(+) e D(-),
como mostra a Figura 3. Dependendo da proporção do enantiômero presente no ácido láctico, materiais com propriedades diferentes podem ser obtidos.
Figura 3 - Isômeros do ácido láctico
Desde que as constantes físicas foram determinadas, melhoramentos nos procedimentos técnicos permitem uma caracterização mais determinada desse ácido. Os isômeros puros formam cristais monoclínicos sem cor e com ponto de fusão de 54oC. As
características do ácido láctico são apresentadas no Quadro 2 e algumas propriedades físicas e termodinâmicas no Quadro 3.
Quadro 2: Características do ácido láctico
Propriedades Características
Atividade óptica Isômeros L(+), D(-) e mistura racêmica DL
Auto-esterificação Em soluções com concentrações >20%
Cor Transparente ou amarelada
Cristalização Forma cristais de alta pureza
Miscibilidade Miscível em água, álcool, glicerol e furfural
Solubilidade Solúvel em água e insolúvel em clorofórmio
Volatilidade Baixa
Fonte: (MARTIN, 1996)
Quadro 3: Propriedades físicas e termodinâmicas do ácido láctico
Propriedades Valores Isômeros
Massa molar (g/mol) 90,08 D, L, DL
Ponto de fusão (⁰ C) 52,8 53,0 16,8 D L DL Ponto de ebulição (⁰ C) a 0,5 mmHg Ponto de ebulição (⁰ C) a 14 mmHg 82,0 122,0 DL DL
Constante de dissociação (pKa) a 25⁰ C 3,83
3,79
D L
Capacidade calorífica (J/mol·o C) a 20⁰ C 190 DL
Calor de solução (kJ/mol) a 25⁰ C 7,79 L
Calor de fusão (kJ/mol) 16,86
11,33
L DL Fonte: (HOLTEN, 1971)
Como o ácido láctico possui tanto os grupos funcionais hidroxila e carboxila, ele sofre autoesterificação ou esterificação intramolecular e forma poliésteres lineares, ácido
lactoiláctico e poli-ácido láctico (PLA) ou dímero cíclico 3,6-dimetil--dioxano-2,5-diona (dilactídeo). Considerando que os poliésteres lineares, ácido lactoiláctico e PLA são produzidos sob condições de condensação típicas, como pela remoção da água na presença de catalisadores ácidos, a formação de dilactídeos com elevado rendimento e seletividade requer a utilização de catalisadores especiais que são principalmente básicos e fracos (DE VRIES, 1989; GRUBER et al., 1992).
O dilactídeo, comumente chamado de lactídeo, é a principal matéria-prima para a polimerização de polímeros de massa molar do ácido láctico, ou seja, PLA, que são termoplásticos biodegradáveis. O isômero L(+) de ácido láctico é a matéria-prima preferida para a produção do dilactídeo, pois fornece um alto rendimento e um polímero de elevada massa molar com um elevado grau de cristalinidade e resistência à tração. Além disso, uma variedade de propriedades podem ser obtidas por copolimerização com outros monômeros funcionais oxigenados tais como glicolídeo, caprolactona, poli-éter polióis e o isômero D(-) do ácido láctico.
O ciclo de vida do PLA não envolve consumo significativo de energia em comparação com os derivados de combustíveis fósseis, e também mostra melhor equilíbrio de carbono do que poliolefinas (CAROTHERS; DOROUGH; VAN NATTA, 1932; MECKING, 2004). Em relação ao lactídeo, seu ciclo de vida do a partir de recursos vegetais através de degradação do polímero para o óxido de carbono e água é mostrado na Figura 4..
Embora o ácido láctico seja onipresente na natureza e tenha sido produzido como um subproduto na fermentação, sua produção não é em larga escala. Em 1990 sua produção mundial em volume aumentou para cerca de 40.000 t/ano com dois produtores importantes, CCA Biochem na Holanda, com subsidiárias no Brasil e na Espanha, e Sterling Chemicals nos EUA, como principais fabricantes. A CCA Biochem utilizou matéria-prima de carboidratos e tecnologia de fermentação, e a Sterling utilizou uma tecnologia química (DATTA; HENRY, 2006).
Figura 4 - Ciclo de vida do lactídeo
Fonte: adaptada de (RISTIĆ et al., 2011)
Diante deste fato, o ácido láctico tem sido considerado um produto químico relativamente fino em que apenas o seu uso em novas aplicações, por exemplo, como um monômero em plástico ou como um intermediário na síntese de grande volume de produtos químicos oxigenados, causaria um aumento significativo na sua demanda.
Por volta de 2003, mudanças importantes ocorreram no EUA. A Sterling saiu do mercado do ácido láctico e dois novos produtores, Archer Daniels Midland (ADM) e Cargill Dow (uma junção entre a Dow Chemical Company e a Cargill Corporation), entraram no mercado, ambos utilizando a tecnologia de fermentação de carboidratos. No início de 2005, a Cargill comprou a Dow e estabeleceu a NatureWorks LLC como a subsidiária integral (DATTA; HENRY, 2006). Atualmente, a NatureWorks LLC é uma grande produtora de PLA (DEFOSSE, 2009). Outras empresas produzem quantidades menores de PLA na Europa e no Japão, incluindo a Mitsui Chemical, Galactic, Treofan, e Shimadzu Corporation (MALVEDA; BLAGOEV; KISHI, 2006).
tecnologia de fermentação de carboidratos, com parceiros chineses. A produção mundial em 2006, considerando os usos do polímero, foi estimada em cerca de 120.000 toneladas (DATTA; HENRY, 2006).
Ao longo da década passada a produção mundial de ácido lático expandiu 10 vezes em decorrência do aumento da demanda por produtos verdes derivados do ácido láctico. A nível mundial, as empresas Galactic, PURAC Corporation, Cargill e Archer Daniels Midland Company (ADM) representaram cerca de 75% da capacidade mundial de ácido láctico (BANNER et al., 2011).
2.2 Aplicações do ácido láctico
A primeira produção comercial de ácido láctico foi feita por Charles E. Avery em Littleton, Massachusetts, USA em 1881 (NARAYANAN; ROYCHOUDHURY; SRIVASTAVA, 2004) e atualmente é um dos ácidos orgânicos mais importantes produzidos principalmente via fermentativa.
Tradicionalmente, o ácido láctico é usado na indústria de alimentos, de cosméticos, farmacêutica e química (BENNINGA, 1990; LITCHFIELD, 2009).
Como um acidulante alimentar, o ácido láctico tem um gosto ácido suave, em contraste com outros ácidos alimentares. É não volátil, inodoro e está classificado para uso geral como aditivos alimentares pela Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos da América (PURAC INC, 1989 apud DATTA; HENRY, 2006).
Outra aplicação para o ácido láctico e seus sais é em desinfecção em embalagem de carcaças, especialmente aquelas das aves domésticas e peixe, em que a adição de soluções aquosas de ácido láctico e seus sais durante processamento aumenta o período de vida útil e reduz o crescimento de organismos anaeróbios de deterioração, como Clostridium botulinum (ANDERS; CERVENY; MILKOWSKI, 1991) .
Industrialmente, o uso do ácido láctico como solvente verde derivado do lactato de etila é notável (LITCHFIELD, 2009). Os produtos do PLA estão no mercado em uma ampla gama de aplicações, incluindo embalagens, fibras e espumas. O PLA é considerado uma alternativa verde aos plásticos derivados do petróleo devido à sua biodegradabilidade (GUPTA; REVAGADE; HILBORN, 2007), é compostável e tem sido considerado como possível solução para os problemas de disposição de resíduos sólidos. Este biopolímero derivado do
ácido láctico vem despertando grande interesse e abrindo novas oportunidades para a confecção de dispositivos médicos biorreabsorvíveis, em especial na ortopedia, como pinos e parafusos. A aplicação em Engenharia de Tecidos como scaffolds, produzido a partir de PLA ou PLLA (DING et al., 2012; LASPRILLA et al., 2011a; LOAIZA et al., 2013; SAVIOLI LOPES; JARDINI; MACIEL FILHO, 2014; SAVIOLI LOPES; JARDINI; MACIEL-FILHO, 2012; ZAVAGLIA; PRADO DA SILVA, 2016; ZHENG et al., 1996), para substituição óssea tem aumentado, pois vem mostrando uma alternativa viável para a medicina (GUPTA; REVAGADE; HILBORN, 2007; LASPRILLA et al., 2010; MAJOLA et al., 1992; MARTINEZ et al., 2010; SAVIOLI LOPES; JARDINI; MACIEL-FILHO, 2012; VAINIONPÄÄ; ROKKANEN; TORMALA, 1989; YAN et al., 2011).
Os biopolímeros têm sido utilizados desde 1960, quando as primeiras suturas biodegradáveis, obtidas a partir de ácido glicólico e de ácido láctico, foram clinicamente aprovadas (KRICHELDORF; BERL; SCHARNAGL, 1988). Hoje, esses materiais são amplamente aplicados em produtos médicos em contato direto com sistemas biológicos (MIDDLETON; TIPTON, 2000; TSUJI et al., 2003) tais como marcapassos, próteses ortopédicas para fixação, suturas e materiais odontológicos (CHEN et al., 2003).
A Figura 5 adaptada de WEE; KIM; RYU (2006), representa de forma geral as aplicações do ácido láctico. A aplicação destes materiais é possível devido às suas características de biocompatibilidade e biofuncionalidade. Biocompatibilidade significa que o material e os seus possíveis produtos de degradação são tolerados pelos tecidos do corpo e não prejudica o organismo a curto ou longo prazo (WILLIAMS, 1999). Esta propriedade envolve tempo e local de uso, além do que se espera do implantem como a degradação ou não. Paralelo à biocompatibilidade, a biofuncionalidade é a capacidade do implante de fornecer imediato e bom desempenho estático e dinâmico à função específica do corpo que deve ser reposta. Neste contexto, são incluídos os problemas relacionados com a degradação química dos materiais, uma vez que o meio fisiológico pode ser agressivo, mesmo para materiais considerados quimicamente inertes, podendo reduzir a eficiência do implante.
Figura 5 - Aplicações comerciais do ácido láctico
Fonte: adaptada de (Wee, Kim & Ryu, 2006)
Atualmente o PLLA é um material promissor para estruturar scaffolds devido à sua biodegradabilidade e biocompatibilidade. Porém, existem alguns inconvenientes. A resistência mecânica e tenacidade do PLLA são mais baixas que a dos ossos naturais (HONG et al., 2005), além de possuir capacidade de osteocondução ou condução em condições in vivo (RHEE; CHOI; KIM, 2002).
Os polímeros biocompatíveis mais promissores pertencem ao grupo poli (hidroxiácidos), particularmente o PLA, poli caprolactona, poli ácido glicólico , poli -dioxanona (CHEN et al., 2003).
A presença de dois grupos funcionais reativos faz do ácido láctico o feedstock mais poderoso para ser usado como monômero para a conversão química de produtos como ácido propanóico, ácido acético, ácido acrílico, entre outros (DEMIRCI; POMETO III; JOHNSON, 1993). Assim, a partir do ácido láctico, diversos produtos de alto valor agregado podem ser produzidos (DATTA; HENRY, 2006), conforme mostrado na Figura 6.
Figura 6 - Produtos derivados do ácido láctico
Fonte: adaptada de (Datta & Henry, 2006)
2.3 Substratos com potencial para utilização em fermentações
A utilização de substratos alternativos em processos fermentativos, visando o aproveitamento de matérias-primas agrícolas de baixo custo ou subprodutos provenientes de diversas indústrias (melaços, farelos, xarope de milho, soro de leite, materiais celulósicos e amido), diminui o custo do meio de cultura utilizado e, consequentemente, do produto final (DUMBREPATIL et al., 2008; OHKOUCHI; INOUE, 2006; ROMANÍ et al., 2008) Porém, estes substratos possuem composição complexa, cuja totalidade exata é muitas vezes desconhecida. Além de fonte de carbono e demais nutrientes, podem apresentar elementos capazes de inibir o crescimento do microrganismo ou impedir a síntese do metabólito de interesse (HONORATO et al., 2007).
As características desejáveis de uma matéria-prima utilizada na produção de ácido láctico são as seguintes: que tenha baixo custo, que esteja disponível durante todo o ano, que possua baixo nível de contaminantes, que possibilite rápida taxa de produção, alto rendimento e pouca ou nenhuma formação de produtos secundários, e que tenha a habilidade
de ser fermentada com pouco ou nenhum pré-tratamento (VICKROY, 1985).
2.3.1 Melaço de cana-de-açúcar
No processo de fabricação de açúcar, o melaço, como exemplifica a Figura 7, é resultante da etapa de centrifugação. Cada tonelada de cana-de-açúcar produz cerca de 40 a 60 kg de melaço. Em relação às suas aplicações, encontra-se na alimentação desde o tempo do Brasil colonial. Desde o início do século XVII, foi utilizado para a produção de um destilado que nas colônias inglesas nas Américas recebeu o nome de "rum", nas francesas de "tafia", nas espanholas de "aguardente de cana" e na portuguesa de "aguardente de cana" e depois de "cachaça". É um bom suplemento alimentar, como fonte de carboidratos e ferro e no combate à depleção proteica e aos baixos teores de hemoglobina. Outras aplicações, principalmente no Brasil, são como suplemento para forragens volumosas para gado de corte, suplemento para alimentação de porcos e cavalos, adubação orgânica, adubo foliar, cicatrizar o pé de batata após chuva de granizo, pulverização do milho, confecção de molde na indústria de fundição, confecção de refratários, revestimento de forno e na massa de tijolo na indústria cerâmica, dar consistência à porcelana, fabricação de briquete em mineração, dar consistência ao papelão e à casquinha de sorvete, em pneus, em velas para filtro de água, produção de proteína, levedura para panificação e antibiótico. Ademais, é utilizado como umectante para fumos usados em cachimbos de água, como o narguile (CAVALCANTE, 2011).
Figura 7 - Melaço de cana-de-açúcar
Fonte: (ANDREW GARRISON, 2014)
No que se refere à sua composição, o melaço contém açúcares redutores, a parte de sacarose não cristalizada e os minerais: potássio, ferro, fósforo, cálcio e sódio. Em sua maioria é composto por sacarose. Este dado sugere o melaço como um potencial substrato para uso em fermentações. Segundo análise realizada por Lunelli (2010), o melaço possui aproximadamente 60% de Açúcares Redutores Totais (ART), sendo 54% sacarose, 3% glicose e 3% frutose.
A sacarose (massa molar de 342,24 g/mol) é um tipo de glicídio formado por uma molécula de glicose (massa molar de 180,16 g/mol) e uma de frutose (massa molar de 180,16 g/mol) produzida pela planta ao realizar o processo de fotossíntese. A sacarose é hidrolisada com grande facilidade por ácidos diluídos, resultando da reação o "açúcar invertido", isto é, a mistura equimolar de D-glicose e D-frutose, que é levógira, porque a frutose possui rotação específica negativa (-92,4°) mais alta do que a rotação específica positiva da glicose (+52,7°). A reação é chamada de inversão e é estritamente monomolecular, fazendo com que a velocidade da reação dependa exclusivamente da concentração de sacarose. A inversão da sacarose pode ser efetuada também enzimaticamente. A invertase, que separa os b-frutosídeos, e as a-glicosidases são as enzimas que catalisam a sua hidrólise. A reação estequiométrica da hidrólise da sacarose forma 2 moléculas de glicose/frutose na presença de água seguida da formação de 4 moléculas de ácido láctico (Equação 1).
À base disso, a sacarose é considerada um a-glicosídeo e um b-frutosídeo. A sacarose não é um açúcar redutor, o que significa que os dois grupos redutores dos monossacarídeos que a formam estão envolvidos na ligação glicosídica, ou seja, o átomo de carbono C1 da glicose e C2 da frutose devem participar da ligação. A hidrólise ácida da sacarose octometilada fornece 2,3,4,6-tetra-O-metil-D-glicose e 1,3,4,6-tetra-O-metil-D-frutose (“GESTIS Substance Database”, 2014).
2.4 Micro-organismos produtores de ácido láctico
Os micro-organismos produtores de ácido láctico são as conhecidas “bactérias do ácido láctico” (do inglês Lactic Acid Bacteria - LAB). O termo LAB foi usado para designar
“organismos do leite azedo”. A primeira cultura pura de uma bactéria foi de uma bactéria láctica, provavelmente Lactococus lactis, obtida por Lister em 1873 (AXELSSON, 2004). As bactérias lácticas são descritas como sendo bactérias gram-positivas, não esporogênicas, catalase negativa, citocromo ausente, não aeróbicas mas aerotolerantes, exigentes quanto aos fatores nutricionais, tolerantes a ácido e estritamente fermentativas com a formação de ácido láctico como principal produto da degradação de açúcar (OLIVA NETO, 1995).
As bactérias lácticas foram classificadas de acordo com: morfologia (cocos ou bastonetes), modo de fermentação de glicose (homofermentativa ou heterofermentativa), crescimento em determinadas temperaturas (por exemplo, 10⁰ C e 45o C) e faixa de consumo
de açúcar (AXELSSON, 2004).
A bactéria homofermentativa converte glicose quase que exclusivamente em ácido láctico. Desde que o processo de glicólise resulte em ácido láctico como o maior produto final do metabolismo, duas moléculas de ácido láctico são produzidas a partir de cada molécula de glicose, com um rendimento maior que 90% (THOMAS; ELLWOOD; LONGYEAR, 1979). Por sua vez, a bactéria heterofermentativa cataboliza glicose em etanol e CO2, além do
ácido láctico (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000).
O grupo das bactérias lácticas é composto por 12 gêneros de bactérias gram-positivas: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus (L.), Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella. Todos os membros desse grupo apresentam a mesma característica de produzir ácido láctico a partir de hexoses (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000).
A característica fundamental do metabolismo das LAB é a eficiente fermentação de carboidratos acoplada a níveis de fosforilação do substrato. A bactéria láctica tem dois principais caminhos de fermentação, a fermentação homoláctica, (processo de glicólise - caminho Embden-Meyerhof-Parnas) e a fermentação heteroláctica (caminho 6-phosphogluconate/phosphoketolase) (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000). Dependendo do caminho metabólico usado, a bactéria pode produzir produtos secundários, incluindo ácido acético, ácido fórmico, dióxido de carbono e etanol. Para uma produção industrial eficiente de ácido láctico, a produção destes produtos deve ser evitada ou minimizada. Diferentes fontes de carbono produzem diferentes quantidades de produtos secundários. Por exemplo, utilizando-se maltose na fermentação com L. lactis foi produzido 0,67 g de ácido láctico por
grama de produto total formado; alterando-se somente a fonte de carbono para glicose (mantendo-se todas as outras condições), a produtividade de ácido láctico foi de 0,93 g de ácido por grama de produto total formado (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000).
Muitas LAB produzem somente um isômero de ácido láctico, podendo ocorrer algumas vezes, dependendo das condições operacionais, a produção de pequenas quantidades do outro isômero. Organismos que produzem os isômeros L(+) ou D(-) do ácido láctico têm duas enzimas lactato desidrogenase (LDH) que diferem em sua estereo-especificidade. Algumas espécies de Lactabacillus produzem o isômero L(+), que, sob acúmulo, leva a uma mistura racêmica, convertendo em ácido láctico D(-) até que o equilíbrio seja alcançado (NARAYANAN; ROYCHOUDHURY; SRIVASTAVA, 2004). L. helveticus e L. plantarum produzem uma mistura racêmica (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000).
As bactérias em geral, não apenas as LAB, apresentam um ciclo de vida ou fases de crescimento, as quais são fase lag, fase log, fase estacionária e fase de declínio celular ou morte, mostradas na Figura 8. Na fase lag (1) ocorre um metabolismo altíssimo, mas sem divisão celular. Na fase log (2) verifica-se uma rápida divisão celular quando a bactéria vai crescer em progressão; é uma reta cuja inclinação vai depender da velocidade de divisão das bactérias. Na fase estacionária (3) há carência de nutrientes onde número de mortes se iguala ao número de células novas produzidas, resultando em uma situação de equilíbrio na população. Por fim, na fase de declínio (4), o número de células viáveis diminui e o número de catabólitos aumenta até provocar a morte de todas células.
Figura 8 - Fases de crescimento celular bacteriano, onde: (1) fase lag, (2) fase log, (3) fase estacionária, (4) fase de declínio
Fonte: adaptada de (TRABULSI et al., 1999)
A literatura relata a produção de ácido láctico por diversas LAB como L. amylophilus (ALTAF et al., 2006), L. casei (DING; TAN, 2006), L. delbrueckii 9649 (DEMIRCI; POMETO III, 1992; IDRIS; SUZANA, 2006; TORRES DA SILVA, 2013), Thermophilic Bacillus coagulans (SAKAI; EZAKI, 2006), Enterococcus faecium (SHIBATA et al., 2007), L. rhamnosus ATCC 10863 (AKSU; KUTSAL, 1986; CHEN; LEE, 1997; HUJANENM; LINKO, 1996; NARAYANAN; ROYCHOUDHURY; SRIVASTAVA, 2004) e L. rhamnosus 7469 (CHANG; LIEW, 2012; WANG et al., 2010). Ainda, deve-se considerar que as linhagens de micro-organismos diferem quanto ao metabolismo relativo a diferentes fontes de carbono, ou seja, substrato fornecido. Alguns exemplos de LAB são citados a seguir com alguns respectivos exemplos de substratos que podem fermentar: L. delbrueckii sp. delbrueckii ATCC 9649 é hábil para fermentar glicose (DEMIRCI; POMETO III; JOHNSON, 1993), melaço (TIWARI; PANDEY; MISHRA, 1979, apud HOFVENDAHL; HÄGERDAL, 2000), e farinha de trigo hidrolisada (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 1997); L. casei NCIMB 3254 é capaz de fermentar bagaço de mandioca (JOHN; NAMPOOTHIRI; PANDEY, 2007); L. rhamnosus ATCC 7469 pode fermentar glicose (SIEBOLD et al., 1994), melaço (TIWARI; PANDEY; MISHRA, 1979, apud HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000) e lactose (TANIGUCHI; KOTANI; KOBAYASHI, 1987); L. rhamnosus ATCC 10863 é capaz de fermentar sacarose (NARAYANAN; ROYCHOUDHURY; SRIVASTAVA, 2004), melaço (AKSU e KUTSAL, 1986), glicose (HUJANENM; LINKO, 1996) e madeira hidrolisada (PARAJÓ; ALONSO;
MOLDES, 1997).
De acordo com esses dados da literatura, e considerando o uso de melaço como substrato, foram identificadas e selecionadas três LAB a serem testadas neste trabalho: L. delbrueckii sp. delbrueckii ATCC 9649, L. rhamnosus ATCC 7469 e L. rhamnosus ATCC 10863, cumprindo o “objetivo 1” anteriormente proposto.
Em relação a L. delbrueckii, é uma espécie de bactéria gram-positiva em forma de bastonete hábil em fermentar açúcares em produtos lácticos sob condições anaeróbicas. Existem quatro subespécies que se diferenciam em relação aos seus metabólitos e genética, sendo elas bulgaricus, lactis, delbrueckii e indicus. Pode ser encontrada em produtos de laticínios como iogurte, leite e queijo, com exceção da subespécie delbrueckii que reside em fontes vegetais. Esta espécie é capaz de produzir D(-) e L(+) ácido láctico, conferindo as propriedades de bactérias lácticas (DELLAGLIO et al., 2005). A Figura 9 exemplifica esta espécie.
Sobre a L. rhamnosus, é uma bactéria que originalmente foi considerada como uma subespécie de L. casei, porém, a pesquisa genética mais tarde a considerou como uma espécie própria. É uma bactéria em forma bastonete de haste curta, muitas vezes aparece em cadeias, é anaeróbia facultativa e gram-positiva. A Figura 10, uma imagem obtida por microscopia óptica (MO) (Leica - Q500IW) da cepa L. rhamnosus ATCC 7469, mostra um exemplo desta espécie. Algumas cepas são utilizadas como probióticos, em iogurtes e produtos lácteos, como leite fermentado e não pasteurizado e queijo semiduro. São também particularmente úteis no tratamento de infecções do sexo feminino, mais particularmente os casos de difícil tratamento como vaginose bacteriana. As espécies de L. rhamnosus são mais comumente encontradas no trato genital e urinário feminino saudável e são também úteis na recuperação do controle em casos de supercrescimento bacteriano em infecções ativas (AVLAMI et al., 2001). As linhagens ATCC 7469 e 10863 selecionadas são cepas homofermentativas e produtoras do isômero L(+) do ácido láctico (DJUKIĆ-VUKOVIĆ et al., 2012).
Figura 9 - Exemplo de L. delbrueckii
Fonte: (BRZEZINSKI, 2013)
Figura 10 - Imagem de MO de L. rhamnosus ATCC 7469
2.5 Produção do ácido láctico
Uma das rotas de produção do ácido láctico é a síntese química. O processo comercial a partir da síntese química é baseado na lactonitrila. Cianeto de hidrogênio é
adicionado com acetaldeído, na presença de uma base, para produção de lactonitrila. Esta reação ocorre em fase líquida com elevada pressão. A lactonitrila é recuperada e purificada por destilação e, então, hidrolisada para produção de ácido láctico, através da adição de ácido clorídrico ou ácido sulfúrico (H2SO4), produzindo ácido láctico e sal de amônio. O ácido láctico
é esterificado com metanol para produzir metil lactato, que é removido e purificado por destilação e hidrolisado com água na presença de catalisador ácido para produzir ácido láctico e metanol (NARAYANAN; ROYCHOUDHURY; SRIVASTAVA, 2004).
O custo de produção do ácido láctico por síntese química é elevado, devido ao alto custo da matéria-prima e do processo de recuperação e purificação do produto (downstream process). Em comparação a isso, a produção biotecnológica do ácido láctico apresenta diversas vantagens, como por exemplo, o baixo custo da matéria-prima, condições operacionais brandas (temperatura e pressão), baixo consumo de energia, substituição de matéria-prima fóssil por matéria renovável, e baixa toxicidade dos catalisadores.
O ácido láctico para uso na produção de PLA deve satisfazer os requisitos adicionais de pureza enantiomérica (molécula com os mesmos átomos ligados, porém com diferenças na orientação espacial) elevada, ou seja, > 99% na forma de L(+) ou D(-); baixos açúcares residuais; baixos ácidos orgânicos, exceto os lácticos; e quantidades mínimas de aminoácidos e proteínas, compostos de nitrogênio complexos, solventes, e compostos coloridos. A presença destes compostos pode resultar na terminação da cadeia de PLA ou efeitos negativos sobre as propriedades do polímero (JOGLEKAR et al., 2006).
Além da rota de produção por síntese química, a rota biotecnológica por fermentação tem se tornado o processo mais popular, particularmente usando monossacarídeos proveniente de carboidratos renováveis usados como feedstock econômico (JOHN; NAMPOOTHIRI; PANDEY, 2007).
O tipo de processo fermentativo mais utilizado pela indústria alimentícia, como exemplo a produção de cerveja, vinho, iogurte, picles, entre outros, é fermentação descontínua ou fermentação em batelada (batch). Em termos de biotecnologia industrial, é um processo caracterizado pela inoculação e incubação de micro-organismos, de tal forma a permitir que a fermentação ocorra sob condições ótimas. Neste tipo de produção nada é adicionado, exceto oxigênio em processo aeróbio, antiespumante e ácido ou base para controle de pH. Com o fim da fermentação, a dorna é descarregada, lavada e esterilizada e
carregada novamente com mosto e inóculo. Já o meio anteriormente obtido é levado para tratamentos finais. Apresenta menores riscos de contaminação, se comparados com processos contínuos de fermentação (SCHIMDELL et al., 2001a).
Há também o tipo de processo fermentativo descontínuo alimentado ou fermentação em batelada alimentada (fed batch). Basicamente, o processo é definido como uma técnica em processos microbianos, onde um ou mais nutrientes são adicionados ao fermentador durante o cultivo e em que os produtos aí permanecem até o final da fermentação. Em alguns casos, todos os nutrientes são gradualmente alimentados à dorna. A vazão da alimentação pode ser constante ou variar com o tempo, e a adição de mosto pode ser de forma contínua ou intermitente. Mudança de volume pode ou não ocorrer, dependendo da concentração do substrato e da taxa de evaporação do sistema (SCHIMDELL et al., 2001b).
Ainda, há o processo contínuo. Este tipo de processo, em sua forma mais simples, é realizado alimentando-se uma dorna com fluxo contínuo de meio em uma determinada concentração, e retirando-se dela, de forma contínua, o caldo fermentado que pode ser encaminhado para outra dorna de espera ou para o processo de separação. Se não houver adição de soluções para controle do processo, nem perda de líquido por evaporação, o volume no decorrer da fermentação permanece constante, uma outra característica deste processo. Com o tempo foram ocorrendo modificações nas instalações fermentativas nas salas industriais. Instalaram-se ligações entre as dornas que trabalhavam de forma intermitente, por carga e descarga, de modo que o mosto passasse da primeira à última da série de recipientes. Na literatura internacional destacam-se os trabalhos de Alzola e Mariller. Posteriormente a tecnologia evolui para instalações especialmente projetadas para fermentação contínua. Inicialmente projetaram-se equipamentos para fermentação alcoólica de melaços de beterraba e cana-de-açúcar. No Brasil, dois pesquisadores se destacaram, Matos e Borzani. Ainda sobre este tipo de processo, há quatro tipos, os quais são sistemas de cortes, sistemas de reaproveitamento de inóculo, sistemas de cultura pura e sistemas de recuperação de leveduras (ALMEIDA LIMA et al., 2001).
A fermentação do ácido láctico é tradicionalmente realizada pelas LAB. O ácido lático é produzido diretamente a partir da glicose ou outras fontes de carboidrato. O piruvato produzido a partir da glicólise é convertido pela enzima LDH em ácido láctico, regenerando o
dinucleotídeo de nicotinamida e adenina ou NAD+ no processo. As condições ótimas de
produção variam com a procedência, mas tipicamente a temperatura é de 40 a 45o C, o
processo não é arejado, e o pH é mantido entre 5 e 7 devido ao forte efeito inibitório do ácido láctico livre na atividade metabólica das bactérias (por exemplo pH <5,0 tipicamente interrompe a fermentação bacteriana (BENNINGA, 1990). As taxas de produção, títulos, e os rendimentos tipicamente satisfazem os critérios discutidos acima. Limitações conhecidas ocorrem nos processos bacterianos, especialmente quando o ácido láctico é para ser usado na fabricação de PLA.
O uso de meios complexos e nutricionalmente ricos leva a custos de matéria-prima e purificação.Os meios nutricionalmente ricos e a variação de pH destas fermentações exigem que a esterilidade do processo deve ser mantida de modo a que o crescimento de organismos contaminantes não afete a qualidade do produto final (LITCHFIELD, 2009). LAB, como todas as bactérias, estão sujeitas a ataques de bacteriófagos. Isso se traduz em um risco significativo de paralisação da produção (BENNINGA, 1990).
A constante de acidez ou Ka do ácido láctico é 3,86 e, portanto, a um pH de 6,0,
menos de 5% de ácido láctico está sob a forma de ácido livre, ou seja, mais de 95% necessitam ser neutralizados (LITCHFIELD, 2009). Os agentes de neutralização típicos usados em escala industrial são de hidróxido de cálcio ou carbonato de cálcio (MALVEDA; BLAGOEV; KISHI, 2006), sendo que ambos resultam em lactato de cálcio como o produto final da fermentação. Nesta forma, o ácido láctico apresenta pouca utilidade ou valor como produto químico industrial. Assim, o ácido láctico deve ser libertado a partir do lactato de cálcio (JOGLEKAR et al., 2006). Isto é tipicamente feito através de acidulação do caldo com ácido sulfúrico. A estequiometria da neutralização onde o ácido láctico reage com hidrogênio e hidróxido de cálcio gerando lactato de cálcio e água é mostrado na Equação 2. E a Equação 3, de acidulação, mostra o lactado de cálcio reagindo com ácido sulfúrico gerando ácido láctico e sulfato de cálcio.
