Considerações finais

Este capítulo apresentou a etapa do trabalho referente ao “objetivo 2” proposto anteriormente o qual se refere aos ensaios em shaker com as três cepas selecionadas. Para cada cepa foi realizado um planejamento fatorial 23 _{do tipo estrela com análise estatística.}

Analisando a cepa L. rhamnosus ATCC 7469, o modelo estatístico não foi considerado preditivo, pois a validação experimental não confirmou os resultados obtidos no Statistica. Em relação às outras cepas, L. rhamnosus ATCC 10863 e L. delbrueckii ATCC 9649, os respectivos modelos foram validados pela confirmação experimental dos resultados. Observando os resultados experimentais gerados pelas três cepas, constatou-se que a L. rhamnosus ATCC 10863 foi a que mais produziu ácido láctico. Entretanto, se fossem considerados os valores das condições de operação testadas que foram obtidas pelo modelo estatístico, a quantidade de ácido láctico gerado seria menor que a quantidade gerada experimentalmente. Por esse motivo, optou-se por não utilizar o modelo gerado. Quando se faz uso de modelos estatísticos, principalmente utilizando micro-organismos, é importante realizar a validação experimental. Logo, as condições que geraram a maior quantidade de ácido láctico (16,3 g/L) foram temperatura de 43,4⁰ C e concentrações de sacarose e de extrato de levedura de 27,6 g/L e 3,0 g/L, respectivamente, de acordo com a Tabela 7 e 22. Esta temperatura determinada apresenta uma vantagem por ser relativamente alta, sendo favorável à inibição de outros micro-organismos contaminantes da fermentação.

Diante do comportamento dos açúcares observado nos resultados das três cepas, os quais foram similares, foi observado neste primeiro estudo que o substrato utilizado não foi devidamente consumido, apesar de registros da literatura afirmarem que estas cepas consomem o melaço sem hidrólise da sacarose.

Em experimentos seguintes, o próximo capítulo mostra os diferentes tipos de processos fermentativos realizados em biorreator/fermentador onde há controle de pH e melhor controle das condições de experimento, por ser um sistema fechado. A cepa a ser utilizada nesses processos será a L. rhamnosus ATCC 10863, selecionada anteriormente como a melhor das três testadas.

Os resíduos gerados durante os experimentos foram descartados de acordo com protocolos para descarte de resíduos microbiológicos da Faculdade de Engenharia Química da Unicamp. Após as análises e caracterizações, as soluções usadas neste projeto foram

autoclavadas a 121⁰ C. Os resíduos líquidos foram jogados na pia e os sólidos descartados no lixo comum. Não foram gerados resíduos químicos que necessitassem de tratamento anterior ao descarte e/ou encaminhamento para incineração.

CAPÍTULO 4

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Processos fermentativos em biorreator/fermentador

Este capítulo relata os processos fermentativos realizados em biorreator/fermentador, o micro-organismo e substrato utilizados, assim como o preparo do inóculo e do meio de fermentação. Também descreve a metodologia das análises realizadas, incluindo os dados cinéticos, e os resultados obtidos.

4.1 Micro-organismo

De acordo com o melhor resultado de produção de ácido láctico obtido no capítulo anterior, a cepa homofermentativa, anaeróbia facultativa e produtora de L (+) ácido láctico selecionada para ser utilizada nos processos fermentativos em biorreator foi a L. rhamnosus ATCC 10863.

4.2 Etapas dos processos fermentativos

4.2.1 Preparo do inóculo

Esta metodologia foi a mesma adotada e descrita no item “3.4.1” do capítulo 3, com exceção da última etapa, onde aqui os 50 mL de inóculo foram deslocados para 450 mL de meio de cultura MRS em outro “Erlenmeyer” estéril de 1000 mL, resultando em um volume final de 500 mL. Este foi mantido em shaker a 37⁰ C com rotação de 150 rpm por 30 horas para ativar a cepa antes de inserí-la no biorreator, ou seja, fazer com que ela se adapte àquele novo ambiente. Todos os tubos e “Erlenmeyers” com os meios de cultura e de fermentação foram esterilizados em autoclave a 121⁰ C por 15 min (LUNELLI, 2010; SENEDESE; MACIEL FILHO; WOLF MACIEL, 2015; TORRES DA SILVA, 2013).

4.2.2 Preparo do meio

O substrato utilizado foi o melaço de cana de açúcar, conforme descrição no item "3.2" do capítulo 3.

O volume do meio de fermentação composto por melaço dissolvido em água destilada foi 3,071 mL, resultando em 3,571 mL de volume total após a adição do inóculo,

mantendo os 14% (v/v) do mesmo. A concentração de sacarose e de extrato de levedura adotados foram os que geraram a maior produção de ácido lático nos ensaios em shaker mostrados no item "3.6" do capítulo 3, ou seja, 27,6 g/L e 3,0 g/L, respectivamente. Estas condições foram usadas anteriormente (LUNELLI, 2010; SENEDESE; MACIEL FILHO; WOLF MACIEL, 2015).

Como a sacarose não foi devidamente consumida nos processos fermentativos apresentados no capítulo 3, este capítulo mostra que foi realizado também um processo fermentativo em batelada com o melaço previamente hidrolisado, além de outros processos fermentativos em batelada e batelada alimentada com o melaço sem prévia hidrólise, como os realizados em shaker, a título de comparação. O processo de hidrólise consta descrito no item "4.2.4" neste capítulo.

4.2.3 Realização dos processos fermentativos

Os processos fermentativos foram realizados em biorreator/fermentador (New Brunswick, BioFlo 415), com capacidade de até 7 L. A Figura 17 ilustra o equipamento. Uma vez que o meio de melaço foi inserido no biorreator/fermentador, iniciou-se o processo de esterilização a 121⁰ C com duração de 15 min. Após o resfriamento automático, o inóculo foi adicionado, dando início à fermentação. A agitação foi de 200 rpm e o pH foi mantido em 5,0 durante todo o processo devido ao funcionamento automático da bomba de NaOH 4 N. A temperatura foi de 43,4⁰ C, de acordo com os resultados do planejamento experimental desta cepa mostrados no item "3.6" do capítulo anterior. As fermentações foram realizadas em condições anaeróbicas adicionando gás CO2 após inserir o inóculo até que o nível de gás O2

chegasse à zero. Esta metodologia foi também usada em trabalho anteriormente realizado (SENEDESE; MACIEL FILHO; WOLF MACIEL, 2015).

Figura 17 - Biorreator New Brunswick, BioFlo 415

Foram realizados cinco processos fermentativos no total, sendo eles dois processos de batelada alimentada e três de batelada, sendo o último processo de batelada com prévia hidrólise da sacarose do melaço. Para melhor visualização e entendimentos dos processos fermentativos realizados neste capítulo, o Quadro 5 os identifica.

Quadro 5: Identificação dos processos fermentativos realizados em biorreator/fermentador

Processo fermentativo Tipo Substrato

1 Batelada alimentada Melaço sem pré-tratamento