SAVIOLI LOPES,
2.6 Separação e purificação do ácido láctico
Após a produção do ácido láctico, há a necessidade de sua separação, ou seja, obter o ácido isolado da solução na qual se encontra, sem as impurezas presentes neste meio, incluindo outros produtos gerados. Alguns processos que podem ser utilizados são
precipitação de cálcio, eletrodiálise (MADZINGAIDZO; DANNER; BRAUN, 2002) e diálise, absorção ou troca de íons, extração por membrana e solvente (WASEWAR, 2005), extração reativa (JÄRVINEN et al., 2000), destilação por reação química (CHOL; HONG, 1999), osmose reversa (TIMMER; VAN DER HORST; ROBBERTSEN, 1993) e nanofiltração (LEE et al., 2006).
Os variados processos de separação e purificação utilizados na biotecnologia podem ser classificados com base na força de condução para a separação. Baseado neste critério, alguns dos processos anteriormente citados e ainda outros constam no Quadro 4.
A formação de resíduos de sulfato de cálciopode ser evitada através da separação extrativa do ácido láctico. Devido à elevada polaridade e da característica hidrofílica do ácido láctico, ele é pouco extraído com extratores convencionais orgânicos. O alto consumo de solvente é inevitável. LUX e SIEBENHOFER (2012) usaram éter iso-propil como solvente. Para um volume de solução aquosa de ácido láctico, 50 volumes de éter iso-propil foram aplicados devido à distribuição desfavorável.
Embora o método de extração por solvente não seja o convencional, ele tem sido desenvolvido para a separação de ácido láctico. Muitos pesquisadores têm investigado a extração reativa do ácido láctico em solventes imiscíveis. Em tais processos, o ácido láctico é primeiramente extraído do caldo da fermentação e em seguida recuperado do solvente a partir de extração retroativa com outro solvente. Extratores amina têm sido um método de separação prospectivo para ácidos carboxílicos a partir de soluções aquosas. O ácido láctico pode ser prontamente extraído em um número elevado de solventes orgânicos com aminas alifáticas com alta massa molar e solventes doadores de oxigênio com ligações de fósforo, mostrando, particularmente, boa seletividade. Três importantes critérios foram estabelecidos para a seleção de solvente: alta distribuição do coeficiente de ácido láctico, fácil regeneração e extração retroativa e baixa tendência para a formação de emulsão (WASEWAR, 2005).
Quadro 4: Técnicas gerais de separação usadas com base nas características de produtos específicos Base de separação Técnica de separação Aplicação em separação e purificação
Tamanho
Filtração Separação de biomassa celular, debris, biocatalizadores imobilizados, precipitados e cristais
Microfiltração Separação de biomassa celular
Ultrafiltraçao Separação de proteínas, dessalinização Nanofiltração
Osmose reversa Remoção de solutos pequenos, dessalinização
Diferença de
densidade Centrifugação
Separação de biomassa celular, debris, biocatalizadores imobilizados, precipitados e cristais
Volatilidade Destilação a vácuo
Extração a gás
Recuperação de produtos voláteis de baixa massa molar
Solubilidade
Extração líquido-líquido Extração de fluido supercrítico
Recuperação de produtos não polares e com carga de baixa massa molar
Extração aquosa de duas fases Recuperação de proteínas
Precipitação Concentração e purificação de produtos e proteínas de baixa massa molar
Cristalização Purificação e formulação de produtos e proteínas de baixa massa molecular
Carga Troca iônica
Concentração e purificação de moléculas e produtos com carga baixa e alta
Eletrodiálise Purificação de ácidos orgânicos
Hidrofobicidade
Fase reversa Purificação de solutos não polares Cromatografia de interação
hidrofóbica Purificação de proteínas
Recognição molecular
Cromatografia de afinidade Purificação seletiva de proteínas
Imprinting molecular Separação de compostos similares estruturalmente, enantiômeros, etc Fonte: (HATTI, 2010)
A técnica de troca iônica tem sido amplamente usada na separação biológica de aminoácidos ou proteínas (HOUWING; BILLIET; VAN DER WIELEN, 2002; TONG; YAO; ZHU, 2001). Várias resinas para troca iônica foram estudadas para recuperação e purificação do ácido láctico obtido do caldo fermentado, sendo elas Amberlite XAD 1600 (THANG; NOVALIN,
2008), PVP (ZHENG et al., 1996), IRA-420 (GONZÁLEZ-VARA Y R. et al., 2000), IRA-400 (CAO; SHIK YUN; KOO, 2002) e DOWEX-50W (CHOL; HONG, 1999).
Em estudo de TONG et al. (2004), a purificação de ácido láctico obtido a partir do caldo fermentado foi realizada com cromatografia de troca iônica usando resina IRA-92. Os resultados experimentais demonstraram que quando o pH do caldo fermentado era 6,0, o rendimento da recuperação, pureza e produtividade na purificação do ácido láctico foram mais elevados. Em escala experimental, o scale-up de processo de purificação mostrou pouca influência sobre o rendimento de recuperação e a pureza. Sob as condições preliminares ótimas, o rendimento, a pureza e a produtividade específica foram de 82,6%, 96,2% e 1,16 g ácido láctico/(g-resinaxdia), respectivamente.
Na fermentação extrativa de glicose por L. deLrueckii NRRL B-445 (L. rhamnosus ATCC 10863), aminas tais como Adogen 464, Aliquat 336, tri--octilamina e TOPO, foram tóxicas para as células (SEEVARATNAM et al., 1991). A resina hidrofóbica Bonopore em óleo de parafina mostrou nenhuma toxicidade em batelada. No entanto, o rendimento de ácido láctico foi menor do que o de uma fermentação convencional em batelada que podem ter resultado de absorção de nutrientes essenciais pela resina Bonopore (WASEWAR, 2005).
A eletrodiálise tem atraído muita atenção para a produção de ácido lático, que não produz sal em desperdício. O caldo da fermentação após microfiltração é alimentado para a unidade de eletrodiálise. Um processo de configuração chamado de processo "duplo ED" foi desenvolvido, o qual utiliza uma unidade de dessalinização por eletrodiálise para remover cátions multivalentes e concentrar sal de lactato. Após, segue uma unidade de eletrodiálise water-splitting com membranas bipolares em que as espécies iônicas são convertidas nas formas de seu ácido e base equivalentes e separadas. O lactato de sódio é convertido em ácido láctico que é enriquecido com o avanço do processo. Os íons de sódio são transportados através da membrana catiônica e associados com os íons hidroxila para formar hidróxido de sódio o qual é reciclado para a fermentação. Isto permite que o processo opere econômica e eficientemente (HATTI, 2010).
Yabannavar & Wang (1991) desenvolveram um sistema de extração para a remoção contínua de ácido láctico a partir da fermentação da glicose por L. deLrueckii. O sistema de extração mostrando a menor toxicidade para as células foi de 15% em Alamine 336 em álcool oleílico. As células foram protegidas do solvente por imobilização. A produtividade
de ácido láctico foi 12,0 g dm-3 gel h-1 em comparação à 7,0 g dm-3 gel h-1 para uma
fermentação de controle na ausência de solvente. A concentração em massa do produto final de 90,0 g dm-3 foi obtida por extração retroativa com hidróxido de sódio.
A técnica de destilação molecular híbrida foi avaliada por KOMESU et al. (2014) para purificar o ácido láctico proveniente de fermentação, apresentando resultados satisfatórios. O sistema proposto consiste em um sistema de evaporação composto por um evaporador cilíndrico com dois condensadores, um localizado internamente e outro externamente a aquele. Por meio de um planejamento experimental fatorial, as condições de operação (fluxo de alimentação, temperatura do condensador e evaporador no destilado e resíduo, agitação, pureza e recuperação do ácido láctico) foram avaliadas. Os resultados mostraram que operando à alta pressão (1000 Pa), comparando-se à pressão geralmente usada na destilação molecular (0,1 pa), e usando apenas uma etapa de separação (geralmente são necessárias pelo menos mais duas etapas), a purificação do ácido láctico foi de 89,7 %, cerca de 18 vezes a concentração inicial presente na solução da fermentação.
Em outro trabalho realizado por alguns integrantes do mesmo grupo citado acima (KOMESU et al., 2015), foi testada a técnica de destilação reativa para a purificação do ácido láctico. Esta técnica consiste em uma reação química e um processo de destilação que acontecem simultaneamente em um aparato de destilação fracionado. Neste caso, a destilação reativa para a recuperação do ácido láctico evolveu a esterificação do ácido láctico (ácido láctico + etanol) e hidrólise (etil lactato + água) catalisada por um catalisador ácido. Novamente foi realizado um planejamento experimental com o objetivo de avaliar os parâmetros utilizados no processo, sendo eles taxa molar do etanol/ácido láctico, temperatura do reboiler e concentração catalítica no rendimento do lactato. Como resultado, o uso desta técnica possibilitou obter o ácido láctico três vezes mais concentrado do que na solução inicial, apresentando bons resultados.
Algumas técnicas têm sido desenvolvidas e refinadas para satisfazer as necessidades das indústrias de biotecnologia. A evolução da tecnologia de membrana tem permitido a separação de uma grande variedade de produtos com base em princípios de separação diferentes (HATTI, 2010). Estas técnicas incluem resinas com macroporos, membranas, destilação molecular e ultrafiltração (NAWAZ et al., 2006), já citadas anteriormente, e extração de fluídos supercrítica (İÇEN; GÜRÜ, 2009), microondas
(VONGSANGNAK et al., 2004) e cromatografia.
2.6.1 Técnicas de cromatografia
O princípio básico da cromatografia é a separação de misturas, no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma fase estacionária e uma fase móvel, como mostra a Figura 11.
Figura 11 - Esquema simplificado de separação de duas misturas em cromatografia
Os principais componentes da cromatografia líquida são: a bomba, que movimenta a fase móvel e a amostra através da coluna; uma coluna, que contêm a fase estacionária, geralmente formada por partículas de sílica, porosas, esféricas e diâmetro em torno de 35 μm, e um detector que mostra os tempos de retenção (tR) das moléculas, sendo
que este varia de acordo com as interações da amostra com as fases estacionária e móvel (MALVIYA et al., 2009). A Figura 12 mostra um esquema simplificado de cromatografia líquida.
Figura 12 - Ilustração simplificada de um equipamento de cromatografia líquida
A Figura 13 ilustra um cromatograma típico. O tempo de retenção (tR) é o tempo
gasto por um componente desde a sua injeção até a sua detecção na saída do sistema. Ele engloba todo o tempo que um componente fica no sistema cromatográfico, seja diluído na fase móvel, seja retido na fase estacionária. O tempo morto (tM), indicado no primeiro sinal
do cromatograma, indica o tempo gasto pelas moléculas da fase móvel para atravessar a coluna e atingir o detector. Normalmente ele é determinado por algum composto ou impureza presente na mistura em análise que não é retido pela fase estacionária. Para a determinação dos tempos de retenção corrigidos é necessário conhecer o tempo morto, uma vez que a correção é feita simplesmente descontando o seu valor do valor do tempo de retenção (MEYER, 2010).
Figura 13 - Cromatograma típico para cálculo de parâmetros
Fonte: adaptada de BAUDELET et al., 2014
Ainda, para que se possa realizar a separação e purificação de determinado composto de interesse após sua identificação e quantificação, é possível acoplar outro módulo ao equipamento de HPLC, o coletor de frações. Na década de 90, as técnicas associadas ao HPLC passaram a ser utilizadas em trabalhos sobre aumento de escala, ou seja, saindo da escala analítica para escala semi-preparativa e preparativa, mudando-se a coluna e configurações de operação. Baseado no tempo de retenção do composto de interesse, é possível programar a coleta apenas desse composto. Essa nova fase veio acompanhada da aplicação da técnica na separação de enantiômeros presentes em misturas racêmicas (MILLER et al., 1999).
A identificação, quantificação, purificação e separação de compostos ativos por cromatografia tem aumentado significativamente nas áreas de petróleo, química, engenharia química, biomedicina e alimentos (BERTHOD; RUIZ-ANGEL; CARDA-BROCH, 2009; HAYES et al., 2014). Na área farmacêutica algumas técnicas específicas de cromatografia consideradas ainda mais apuradas que o HPLC para obtenção de compostos estão sendo utilizados, sendo elas Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência, (Ultra-Performance Liquid Chromatography - UPLC), Cromatografia Contra Corrente de Alta Velocidade, (High-Speed Counter-Current Chromatography - HSCCC), Cromatografia Líquida de Rápida Resolução (Rapid Resolution Liquid Chromatography - RRLC), Cromatografia Líquida de Fluído Supercrítico (Supercritical Fluid Chromatography - SFC), Cromatografia de Afinidade (Affinity Chromatography - AC) e
Biocromatografia (Bio-Chromatography - BC) (ZHAO; JIANG, 2010).
A cromatografia líquida foi definida no início de 1900 pelo botânico russo Mikhail S. Tswett. Considerado o pai da cromatografia, Tswett publicou o primeiro artigo de cromatografia líquida, no qual ele descreveu a separação de compostos (pigmentos de folhas) extraídos de plantas, utilizando solvente em uma coluna empacotada com partículas de carbonato de cálcio. No período entre 1906 e 1952 houve alguns avanços importantes, como por exemplo o surgimento da técnica de cromatografia planar, onde um papel é usado como suporte. No entanto, em 1950 foi introduzido como alternativa a camada fina de sílica, que posteriormente ficou conhecida como Cromatografia de Camada Delgada (CCD). O avanço da cromatografia em coluna foi por volta de 1940, onde Martin e Synge, ganhadores do prêmio Nobel, descreveram a descoberta da cromatografia líquida-líquida (ou partição) (JANDERA; HENZE, 2000; MILLER, 2005).
Somente a partir dos anos 70 se conseguiu um avanço considerável da cromatografia líquida moderna que até então era pouco desenvolvida, apesar de que um dos primeiros experimentos sobre cromatografia, no início do século, foi o tipo que é hoje chamado cromatografia líquida clássica. O avanço foi gradual e atingiu o atual nível de sofisticação que a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE, em inglês: High Performance Liquid Chromatography, HPLC) apresenta, devido ao revolucionário desenvolvimento tecnológico da prática deste tipo de cromatografia. Desde 1968 tornou-se possível rechear colunas com partículas de pequeno tamanho, necessárias para alta resolução e, também, adquirir equipamentos que funcionam nas altas pressões necessárias para obter uma boa velocidade de eluição. Nos últimos dez anos ocorreu o desenvolvimento de vários detectores espectrofotométricos que operam em comprimentos de onda variável até 190 nm, e houve um aumento na utilização dos detectores por fluorescência, eletroquímicos, e por fluorescência induzida por laser, bem como acoplamento com o espectrômetro de massas. Com estes, tornou-se possível a detecção da maioria dos compostos e a análise de traços em amostras complexas, como sangue, urina, solo, alimentos, petróleo, etc. Hoje em dia são comuns estudos com partículas pequenas, a execução do HPLC com fase reversa e, particularmente, o uso de equipamentos para uma perfeita eluição com gradiente, bem como de métodos especiais, tais como a formação de pares iônicos. Como resultado, dificuldades anteriores ou separações difíceis de compostos como corantes polares, isômeros, drogas
básicas e seus metabólitos são agora rotina (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
Não foram encontrados relatos na literatura do uso desta técnica para separar o ácido láctico produzido por fermentação. Dessa forma, este foi o processo de separação selecionado para este trabalho, considerando também que este equipamento já seria utilizado no decorrer do trabalho para identificação e quantificação de compostos da fermentação.
2.7 Considerações finais
Diante dos relatos apresentados neste capítulo, pode-se entender que o ácido láctico é um ácido orgânico importante, é produzido principalmente por via fermentativa e pode ser empregado em diversas áreas como indústria de alimentos, comércio, química, farmacêutica, feedstock químico e biomédica, com aplicações específicas em cada uma delas. Com destaque para a área biomédica, estão os polímeros do ácido láctico como o PLA e PLLA, os quais podem ser empregados na Engenharia de Tecidos na confecção de dispositivos médicos como scaffolds para substituição óssea, pinos e parafusos, mostrando-se uma alternativa viável para a medicina.
As LAB produzem o ácido láctico por fermentação diretamente a partir da fonte de carboidrato e podem produzir o isômero D(-), L(+), ou ambos, sendo que neste caso a LAB possui duas enzimas LDH. As condições ótimas de produção variam com o micro-organismo, mas geralmente a temperatura é de 40 a 45o C, o processo não é arejado, e o pH é mantido
entre 5,0 e 7,0. Um gênero das LAB que se destaca por sua variedade de espécies e de trabalhos na literatura é o Lactobacillus. Foram selecionadas para uso neste trabalho três espécies deste gênero as quais são produtoras do isômero L(+) do ácido láctico, o isômero de interesse para a futura síntese de PLLA. São elas L. deLrueckii ATCC 9649, L. rhamnosus ATCC 7469 e L. rhamnosus ATCC 10863. Além de serem produtoras de L-ácido láctico, as três cepas selecionadas por meio da literatura são capazes de fermentar o melaço, o substrato a ser utilizado neste trabalho. O melaço é um substrato renovável e de baixo custo que contém açúcares redutores, a parte de sacarose não cristalizada e os minerais potássio, ferro, fósforo, cálcio e sódio. É rico em sacarose, sendo este açúcar a maioria da sua composição.
Por fim, em relação ao processo de separação do ácido láctico, vários foram apresentados e um deles foi selecionado para a prática neste trabalho, sendo ele a técnica de
HPLC associada à um coletor de frações automático. Este processo consiste na separação e coleta do composto de interesse em cada amostragem coletado em determinado tempo durante a coleta. Geralmente cada composto apresenta um tempo de retenção, mas é possível ocorrer o mesmo tempo de retenção para compostos diferentes.
A técnica de HPLC é usada para análise de drogas (MONTALBANO et al., 2014), isolamento de proteínas (TÓTH et al., 2014), separação de fármacos quirais (GUILLAUME; ANDRÉ, 2008; NORTON et al., 2007) e produtos de fermentação, sendo este último um tipo clássico de amostra complexa (DHARUMAN; VASUDHEVAN; AJITHLAL, 2011). Esta técnica vem sendo cada vez mais empregada em associação à cromatografia em fluido supercrítico, nas separações semi-preparativas e preparativas de fármacos (BAUDELET et al., 2014; MILLER, 2012). Entretanto, não foram encontrados trabalhos na literatura que relatassem especificamente esta técnica para separar L-ácido láctico proveniente de fermentação por via biotecnológica.
CAPÍTULO 3
3
Processos fermentativos em shaker
Este capítulo relata os processos fermentativos realizados em shaker, abordando o planejamento experimental, os micro-organismos e substrato utilizados, assim como o preparo do inóculo e do meio de fermentação. Além disso, aborda também a metodologia de análise e os resultados obtidos.