SAVIOLI LOPES,
3.7 Resultados da validação estatística
Com o objetivo de obter um modelo estatístico com as melhores condições de produção de cada cepa, uma avaliação no programa Statistica foi realizada com base nos valoresde ácido láctico obtidos no final da fermentação, ou seja, em 24 horas, e os valores de ácido láctico identificados no HPLC.
Para que o modelo de predição seja estatisticamente significativo, os três testes devem ser satisfatórios, a saber:
O teste F da regressão, no qual o valor calculado deve ser maior que o valor tabelado,
O teste F da falta de ajuste, para o qual o valor F calculado deve ser menor que valor F tabelado,
O coeficiente de correlação R2 deve apresentar um valor aceitável, realizado
considerando 90% de nível de confiança.
Considerando estas informações, seguem os resultados obtidos para cada cepa analisada.
3.7.1 L. rhamnosus ATCC 7469
láctico e o desvio relativo calculados através do programa Statistica, são apresentados na Tabela 10. Foi gerado um gráfico (Gráfico 1) que representa essa relação, o qual mostra uma grande dispersão dos pontos, o que deu um indício da não significância do modelo que será gerado a partir dos mesmos.
Tabela 10: Valores de ácido láctico obtido experimentalmente em 24 h de fermentação e ácido láctico calculado pelo software Statistica para L. rhamnosus ATCC 7469
Ensaios Ácido láctico experimental (g/L)* Ácido láctico calculado (g/L) Desvio relativo (%) 1 7,4 8,0 6,9 2 9,0 9,4 5,1 3 9,0 9,1 2,2 4 10,4 10,5 1,6 5 7,3 8,0 8,9 6 9,0 9,4 5,5 7 8,4 9,1 8,6 8 9,0 10,5 17,1 9 8,1 8,0 0,5 10 10,8 10,4 3,6 11 8,7 8,3 4,8 12 11,0 10,2 6,6 13 10,4 9,2 10,7 14 9,7 9,2 4,93 15 10,7 9,2 12,5 16 9,0 9,2 2,93 17 9,8 9,2 5,14
Gráfico 1 - Relação entre os valores de ácido láctico obtidos experimentalmente e calculados pelo software Statistica para L. rhamnosus ATCC 7469
O resultado da análise estatística mostrou que apenas a variável Temperatura linear foi significativa. A variável Sacarose linear foi próxima de ser significativa, segundo o Gráfico de Pareto (Gráfico 2), portanto esta foi inclusa como significativa. O extrato de levedura foi considerado não significativo. A Tabela 11 mostra os efeitos calculados e os valores p, assim como os valores dos coeficientes, e o Gráfico de Pareto complementa esta afirmação.
Tabela 11: Efeitos calculados, valores de p e coeficientes para L. rhamnosus ATCC 7469
Variáveis Efeitos Valores de p Coeficientes
Nome Valor
Média 9,28756 0,00043 C1 9,28756
Temperatura (°C) (linear) 1,43532 0,08027 C2 0,71766
Gráfico 2 - Gráfico de Pareto sobre a significância das variáveis para L. rhamnosus ATCC 7469
A Tabela 12 exibe os valores dos testes F de regressão e de falta de ajuste, além do valor de R2. Apesar valor de R2 ser baixo, o modelo passou em ambos os testes F, gerando
a Equação 4 considerando “AL” = ácido láctico, “C” = coeficiente, “T” = temperatura e “S” = sacarose. Os valores das variáveis no modelo são valores codificados.
Tabela 12: Valores F de regressão e de falta de ajuste e R2 para L. rhamnosus ATCC 7469
F de regressão F calculado F tabelado F de falta de ajuste F calculado F tabelado R 2 9,38 2;14;0,1 = 2,73 0,95 12;2;0,1 = 9,41 0,57
O Gráfico 3 mostra a análise de superfície gerada, mostrando a influência da sacarose e temperatura, as variáveis consideradas significativas, sobre a produção de ácido láctico. Observa-se que a maior produção de ácido láctico foi obtida quando foram usados os valores máximos das variáveis estudadas.
Gráfico 3 - Gráfico de análise de superfície para L. rhamnosus ATCC 7469: influência da sacarose e temperatura na produção de ácido láctico
Para que os valores ótimos das condições de fermentação fossem obtidos, uma otimização através do Solver no Excel foi realizada usando o modelo obtido pelo software Statistica. Tendo conhecimento destes valores, uma validação experimental foi realizada para confirmar o valor de ácido láctico obtido através do procedimento de otimização numérica no Solver. A Tabela 13 traz estes valores. Os valores codificados obtidos para sacarose e temperatura foram máximos, o que confere com o gráfico de análise de superfície. Como foi constatado anteriormente, o extrato de levedura não foi significativo. Porém, sabe-se que é necessária a suplementação do meio de fermentação com fonte de nitrogênio para melhor desempenho da cepa. Dessa forma, analisando o efeito do extrato de levedura sobre a produção de ácido láctico, tem-se que valores mínimos deste favorecem valores máximos de ácido láctico. Por este motivo fixou-se o extrato de levedura no menor valor que corresponde a -1,68 (valor codificado).
Tabela 13: Valores obtidos no Solver como ótimos para fermentação de L. rhamnosus ATCC 7469
Variáveis Valores codificados Valores decodificados
Temperatura (°C) 1,68 43,0
Sacarose (g/L) 1,68 46,0
Extrato de levedura (g/L) -1,68 1,3
Ácido láctico (g/L) --- 11,4*
*Valor a ser obtido experimentalmente usando as condições fornecidas pelo Solver
Portanto, uma fermentação em triplicata foi realizada para confirmar a quantidade final de ácido láctico de 11,4 g/L seguindo as condições de operação mostradas na Tabela 13. A média e o desvio padrão obtidos foram 8,84 e 0,23, respectivamente. O resultado obtido na fermentação com as condições fornecidas pela otimização através do procedimento de otimização numérica no Solver apresenta uma diferença de 2,37 g/L a menos do que o esperado. Logo, o modelo estatístico não foi validado. Observando-se a Tabela 10 constata-se que a quantidade máxima de ácido láctico obtida foi no ensaio 12, de 11,0 g/L.
Com isto conclui-se que, embora o modelo tivesse sido catalogado como modelo preditivo, a validação do mesmo deixou em evidência que este modelo não pode ser considerado preditivo, o que se deixa um precedente de que quando se usa a técnica de planejamento de experimentos deve-se chegar até a validação experimental do modelo, já que ele por si só pode não se sustentar (RIGUEIRA; RODRIGUES; GLORIA, 2011).
3.7.2 L. rhamnosus ATCC 10863
Seguindo a mesma linha de resultados da cepa anterior, os valores de ácido láctico obtidos no HPCL e os valores de ácido láctico e o desvio relativo calculados pelo software Statistica constam na Tabela 14. Foi gerado um gráfico que representa essa relação (Gráfico 4). Observando o mesmo, os pontos também estão dispersos, o qual prevê a não significância do modelo gerado nesta análise. Porém, pode ser apreciado que nos valores máximos existe uma melhor concordância entre os valores experimentais e os preditos, o que leva a supor que o modelo pode ser significativo quando usado para encontrar valores máximos de concentração de ácido láctico.
Tabela 14: Valor de ácido láctico obtido experimentalmente em 24 h de fermentação e ácido láctico calculado pelo software Statistica para L. rhamnosus ATCC 10863
Ensaios Ácido láctico experimental (g/L)* Ácido láctico calculado (g/L) Desvio relativo (%) 1 13,5 9,6 28,1 2 7,8 12,4 59,7 3 7,1 9,7 36,5 4 12,0 11,6 3,01 5 7,5 9,6 28,8 6 14,2 13,3 5,83 7 12,9 9,9 22,3 8 7,2 12,8 76,9 9 5,0 7,0 39,5 10 16,3 11,7 27,7 11 13,3 12,8 3,33 12 14,6 12,4 14,3 13 12,0 11,0 7,8 14 13,4 11,9 11,0 15 11,3 11,5 1,3 16 11,4 11,5 0,6 17 11,4 11,5 0,9 *Mesmos valores apresentados na Tabela 7
Gráfico 4 - Relação entre os valores de ácido láctico obtidos experimentalmente e calculados pelo software Statistica para L. rhamnosus ATCC 10863
O resultado da análise estatística mostrou que todas as variáveis são significativas, exceto Extrato de levedura2. A Tabela 15 mostra os efeitos calculados e os valores de p, assim
como os valores dos coeficientes, e o Gráfico de Pareto (Gráfico 5) complementa esta afirmação.
Tabela 15: Efeitos calculados, valores de p e coeficientes para L. rhamnosus ATCC 10863
Variáveis Efeito Valor de p Coeficiente
Nome Valor Média 11,50321 0,000003 C1 11,50321 Temperatura (linear) 2,81493 0,000067 C2 1,40746 Temperatura2 -1,48097 0,000269 C3 -0,74049 Sacarose (linear) -0,21571 0,011270 C4 -0,10786 Sacarose2 0,83137 0,000852 C5 0,41568 Extrato de levedura (linear) 0,55310 0,001739 C6 0,27655 Temperatura x sacarose -0,44514 0,004564 C8 -0,22257 Temperatura x extrato de levedura 0,47136 0,004074 C9 0,23568 Sacarose x extrato de levedura 0,14254 0,042018 C10 0,07127
Gráfico 5 - Gráfico de Pareto sobre a significância das variáveis para L. rhamnosus ATCC 10863
A Tabela 16 expõe os valores dos testes F de regressão e de falta de ajuste, além do valor de R2. O valor de R2 foi muito baixo e o modelo não passou em ambos os testes F.
Tabela 16: Valores F de regressão e de falta de ajuste e R2 para L. rhamnosus ATCC 10863
F de regressão F calculado F tabelado F de falta de ajuste F calculado F tabelado R 2 0,33 8;8;0,1 = 2,59 10990,07 6;2;0,1 = 9,33 0,25
A Equação 5 gerada pelo modelo segue abaixo, sendo “AL” = ácido láctico, “C” = coeficiente, “T” = temperatura, “S” = sacarose e “EL” = extrato de levedura.
As variáveis independentes encontram-se codificadas no modelo. Como já foi dito anteriormente, o modelo como um todo não foi significativo, porém devido ao baixo desvio obtido nos valores máximos de ácido láctico experimental e calculado, decidiu-se realizar uma otimização para obter os valores ótimos de fermentação desta cepa. A condições obtidas com
a otimização apresentadas na Tabela 17 foram utilizadas para realizar um novo experimento de fermentação.
Tabela 17: Valores obtidos no Solver como ótimos para fermentação de L. rhamnosus ATCC 10863
Variáveis Valores codificados Valores decodificados
Temperatura (°C) 0,97 42,0
Sacarose (g/L) 1,68 46,0
Extrato de levedura (g/L) 1,68 1,3
Ácido láctico (g/L) --- 13,8*
*Valor a ser obtido experimentalmente usando as condições fornecidas pelo Solver
A fermentação foi realizada em triplicata para confirmar a quantidade final de ácido láctico de 13,8 g/L, segundo as condições fornecidas na Tabela 17 e a média obtida foi 10,23 g/L ± 3,68. O resultado foi confirmado, validando a equação gerada pelo modelo. Porém, observando a Tabela 14, constata-se que a quantidade máxima de ácido láctico obtida foi de 16,3 g/L no ensaio 10. Logo, como este valor de ácido láctico foi maior que o valor obtido nas condições do modelo estatístico. Mesmo este sendo validado, as condições consideradas como as ótimas foram aquelas obtidas nas condições do ensaio 10.
3.7.3 L. delbrueckii ATCC 9649
A Tabela 18 traz os valores de ácido láctico obtidos no HPCL, além dos valores de ácido láctico e o desvio relativo calculados no software Statistica. Foi gerado um gráfico que representa essa relação (Gráfico 6), onde observa-se que nos valores máximos, os valores de ácido láctico coincidem com a reta.
Tabela 18: Valor de ácido láctico obtido experimentalmente em 24 h de fermentação e ácido láctico calculado pelo software Statistica para L. delbrueckii ATCC 9649
Ensaios Ácido láctico experimental (g/L) Ácido láctico calculado (g/L) Desvio relativo (%) 1 4,5 4,8 5,2 2 4,2 7,1 13,9 3 7,9 7,5 10,7 4 9,1 8,7 4,5 5 8,4 4,8 7,4 6 4,4 4,6 21,2 7 8,5 5,1 26,5 8 4,7 3,8 7,6 9 7,7 5,8 7,6 10 4,7 6,7 9,6 11 7,4 5,6 3,1 12 6,1 7,2 4,2 13 6,2 7,1 22,0 14 6,6 3,0 27,7 15 6,7 7,4 1,06 16 6,5 7,4 1,47 17 6,7 7,4 0,19
*Mesmos valores apresentados na Tabela 8
Gráfico 6 - Relação entre os valores de ácido láctico obtidos experimentalmente e calculados pelo software Statistica para L. delbrueckii ATCC 9649
O resultado da análise estatística mostrou que todas as variáveis são significativas, sem exceção. A Tabela 19 mostra os efeitos calculados e os valores p, assim como os valores dos coeficientes, o que também pode ser verificado através do Gráfico de Pareto (Gráfico 7).
Tabela 19: Efeitos calculados, valores de p e coeficientes para L. delbrueckii ATCC 9649
Variáveis Efeito Valor de p Coeficiente
Nome Valor Média 7,45557 0,000056 C1 7,45557 Temperatura (linear) 0,53161 0,009575 C2 0,26580 Temperatura2 -0,80140 0,005138 C3 -0,40070 Sacarose (linear) 0,96564 0,002931 C4 0,48282 Sacarose2 -0,73643 0,006076 C5 -0,36822 Extrato de levedura (linear) -2,43864 0,000461 C6 -1,21932 Extrato de levedura2 -1,64029 0,001234 C7 -0,82014 Temperatura x sacarose -0,55618 0,014814 C8 -0,27809 Temperatura x extrato de levedura -1,27005 0,002893 C9 -0,63503 Sacarose x extrato de levedura -1,18274 0,003333 C10 -0,59137
Gráfico 7 - Gráfico de Pareto sobre a significância das variáveis para L. delbrueckii ATCC 9649
Na Tabela 20 são mostrados os valores dos testes F de regressão e de falta de ajuste, além do valor de R2. O modelo apresentou um valor de R2 aceitável e passou no teste
F de regressão.
Tabela 20: Valores F de regressão e de falta de ajuste e R2 para L. delbrueckii ATCC 9649
F de regressão F calculado F tabelado F de falta de ajuste F calculado F tabelado R 2 3,64 9;7;0,1 = 2,729 177,43 5;2;0,1 = 9,29 0,82
Foi gerada a Equação 6, onde “AL”= ácido láctico, “C” = coeficiente, “T” = temperatura, “S” = sacarose e “E”L = extrato de levedura.
Seguindo o que já foi realizado anteriormente com as outras duas cepas, foi realizada o procedimento de otimização no Solver para obter os valores ótimos das condições
de fermentação, os quais são conferidos na Tabela 21.
Tabela 21: Valores obtidos no Solver como ótimos para fermentação de L.delbrueckii ATCC 9649
Variáveis Valores codificados Valores decodificados
Temperatura (°C) 1,11 43,0
[Sacarose] (g/L) 1,59 45,0
[Extrato de levedura] (g/L) -1,68 1,3
Ácido láctico (g/L) --- 9,1*
*Valor a ser obtido experimentalmente usando as condições fornecidas pelo Solver
A fermentação de confirmação em triplicata deste valor máximo de ácido láctico de 9,1 g/L foi realizada seguindo as condições de operação fornecidas na Tabela 21, sendo 8,68 g/L ± 0,48 foi a média obtida. Os resultados obtidos na fermentação com as condições fornecidas pelo procedimento de otimização numérica estão de acordo com o esperado. Logo, o modelo estatístico foi validado, determinando as melhores condições de operação desta cepa. Ainda, observando-se a Tabela 18, constata-se que a quantidade máxima de ácido láctico obtida foi também de 9,1 g/L, no ensaio 4.
3.7.4 Comparativo final entre as cepas analisadas
Fazendo uma avaliação dos resultados anteriormente apresentados das três cepas testadas, a Tabela 22 mostra um comparativo dos valores de ácido láctico obtidos por cada uma delas, sendo eles os obtidos pelo procedimento de otimização numérica no Solver e os obtidos na validação experimental dos modelos, assim como o valor máximo obtido no resultado experimental do planejamento fatorial 23 de configuração tipo estrela.
Tabela 22: Quantidade de ácido láctico produzida nas fermentações em shaker: comparativos entre as três cepas
Variáveis L. rhamnosusATCC 7469 L. rhamnosusATCC 10863 L. delbrueckiiATCC 9649
Condições de
fermentação Solver Ensaio 12 Solver Ensaio 10 Solver Ensaio 4
Temperatura (°C) 43,0 40,0 42,0 43,4 43,0 43,0
Sacarose (g/L) 46,0 46,5 46,0 27,6 45,0 38,8
Extrato de levedura (g/L) 1,3 3,0 1,3 3,0 1,3 2,0
Ácido láctico (g/L) 11,4* 10,9*** 13,8* 16,3*** 9,1* 9,1***
9,07** --- 13,91** --- 9,16** ---
*Resultado esperado segundo as condições do Solver
**Média + desvio padrão da triplicata de fermentações obtida na validação experimental segundo as condições do Solver
***Valor máximo obtido nos 17 ensaios experimentais do planejamento fatorial 23 de configuração tipo estrela Como constatado anteriormente, o modelo estatístico não foi validado para a cepa L. rhamnosus ATCC 7469, já que o valor de ácido láctico produzido experimentalmente usando as condições fornecidas pelo Solver não conferiu com o esperado. Logo, as condições selecionadas como melhores para esta cepa são as do ensaio 12 do planejamento fatorial 23
do tipo estrela, conforme a Tabela 6 e 22.
Já em relação às cepas L. delbrueckii ATCC 9649 e L. rhamnosus ATCC 10863, seus respectivos modelos foram validados, uma vez que o valor de ácido láctico produzido experimentalmente usando as condições fornecidas pelo Solver foram bem próximos aos respectivos valores esperados. Ainda, para a cepa L. delbrueckii ATCC 9649, os valores obtidos no Solver e nos experimentos do planejamento fatorial (ensaio 4) foram coincidentes, sendo viável adotar como as melhores condições de fermentação as fornecidas pelo Solver. No caso da L. rhamnosus ATCC 10863, o valor obtido (e conferido experimentalmente) pelo Solver não coincide com o valor máximo obtido no planejamento fatorial, apresentando 2,39 g/L a menos que o valor obtido no ensaio 10. Logo, mesmo tendo a validação estatística, é viável utilizar as condições que produziram maior quantidade de ácido láctico. Esta quantidade de ácido láctico obtida de 16,3 g/L foi a maior entre as cepas. Portanto, a L. rhamnosus ATCC 10863 foi a cepa identificada como a maior produtora de ácido láctico, e as condições de fermentação que levaram a este resultado são as que devem ser adotadas para a etapa seguinte de fermentação em biorreator/fermentador.