i
Paulo Vinicius da Mata Madeira
Determinação da estrutura tridimensional do domínio catalítico do fator de
virulência PlpD de Pseudomonas aeruginosa
CAMPINAS
2014
vii
Resumo
Segundo a Organização Mundial da Saúde, doenças infecciosas são a segunda principal causa de morte no mundo. Essas doenças são causadas por organismos patogênicos que podem compartilhar certas similaridades em seu modo de infecção. Bactérias patogênicas são responsáveis por diversas doenças de acometimento humano, sua patogenicidade, na maioria das vezes, apresenta-se associada a secreção de fatores de virulência que são responsáveis pela adesão, invasão e por danos ás células e tecidos do hospedeiro. P. aeruginosa é um patógeno oportunista, multiresistente a antibióticos e é a bactéria Gram negativa principal causadora de infecções hospitalares, podendo levar à óbito por pneumonia e sepse pacientes imunocomprometidos, principalmente pacientes com fibrose cística, AIDS e vítimas de queimadura. A proteína ExoU de P. aeruginosa é um fator de virulência, altamente citotóxico, secretado pela bactéria que apresenta atividade fosfolipase A, degradando a membrana celular e levando a rápida morte celular. ExoU é pertencente a família das proteínas tipo patatina, essas proteínas apresentam regiões homólogas a fosfolipase A2 citosólica humana e regiões homólogas a proteínas patatinas. A proteína PlpD encontrada em linhagens que não codificam ExoU, a saber: PA01 e PA14 de P. aeruginosa apresentam todas as regiões conservadas, classificando-a como uma proteína bacteriana do tipo patatina, assim como a ExoU. Além disso foi mostrado que seu domínio catalítico é secretado pela bactéria e apresenta atividade de lipase, importante para o processo infectivo do patógeno. Como P. aeruginosa, assim como outros patógenos, se tornaram multiresistentes a antibióticos, a busca por novos alvos terapêuticos vem sendo incentivada. A compreensão estrutural dos componentes envolvidos no processo infectivo é essencial para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. Nesse trabalho a estrutura da porção secretada da proteína PlpD, com atividade catalítica, foi resolvida à uma resolção de 2.14 Angstroms. A análise da proteína mostrou diferenças interessantes entre sua estrutura e de seu homólogo ExoU, fornecendo pistas para a caracterização de seu mecanismo de ação à nível estrutural. Essa tese foi desenvolvida em colaboração com o grupo do Laboratório de Engenharia de Sistemas Macromoleculares de Marselha, França sob coordenação da Drª Sophie Bleves.
ix
Abstract
According to the World Health Organization, infectious diseases are the second leading cause of deaths worldwide . These diseases are caused by pathogenic organisms that may share certain similarities in their mode of infection. Pathogenic bacteria are responsible for many human diseases, their pathogenicity, most often appears associated with the secretion of virulence factors that are responsible for adhesion, invasion and damage to the cells and tissues of the host. P. aeruginosa is an opportunistic pathogen, multidrug-resistant and the main Gram negative cause of nosocomial infections, this pathogen may lead to death due to pneumonia and septcemia immunocompromised patients, especially patients with cystic fibrosis, AIDS and burn victims. The ExoU protein of P. aeruginosa is a highly cytotoxic virulence factor secreted by the bacterium which has phospholipase A activity by degrading the cell membrane and leading to rapid cell death. ExoU belongs to patatin-like protein family, these proteins have regions homologous to human cytosolic phospholipase A2 and regions homologous to patatins. The PlpD protein is found in strains that do not encode ExoU, namely P. aeruginosa PA01 and PA14. This protein shows all conserved regions of patatin-like proteins, classifying it as a bacterial patatin-like protein, as well as the ExoU. Furthermore it was shown that its catalytic domain is secreted by the bacterium and shows lipase activity, important for the infection process. As P. aeruginosa, as well as other pathogens have become multidrug resistant, the search for new therapeutic targets is being encouraged. The understanding of the structural components involved in the infective process is essential for the development of new therapeutic agents. In this work the structure of the secreted portion of PlpD protein which has catalytic activity was resolved at 2.14 angstroms resolution. The protein analysis showed interesting differences between its structure and its homologous ExoU, providing evidences to the characterization of its mechanism of action at a structural level. This thesis was developed in collaboration with the Macromolecular Engineering Systems Laboratory group in Marseille, France under the coordination of Dr Sophie Bleves.
xi Sumário Resumo... vii Abstract... ... vii Dedicatória... xi Agradecimentos... xii Lista de Figuras ... xv
Lista de Tabelas... xvii
1. Introdução 1 1.1 1.1 Pseudomonas aeruginosa... 1
1. 1.2 Bactérias Patogênicas e Sistema de Secreção... 2
1. 1.3 Sistema de Secreçao do Tipo V... 4
1. 1.4 Patatinas e Proteínas Tipo Patatina (PLPs)... 8
1. 1.5 Fosfolipases... 10
1. 1.6 Papel das Fosfolipases A na Patogênese... 12
1. 1.7 PlpD... 14
2.0 Justificativa 17 2. 3. Objetivo principal 18 3.1 3.1 Objetivos Específicos………. 19
44 4. Metodologia e forma de análise dos resultados 19 4.1 4.1 Produção e purificação da proteína recombinante PAL18... 19
4.2 Confirmação do produto da expressão e purificação através de espectrometria de massas e Western Blot...
20
xii
4.3 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)... 21
4.4 Ensaio de atividade de Lipase... 21
4.5 Ensaios de Cristalização... 21
4.5.1 Seeding... 22
4. 4.5.2 Cross-Seeding... 22
4. 4.6 Coleta e processamento dos dados de difração ... 22
3. 4.7 Determinação da estrutura... 23
4.7.1 Substituição Molecular... 23
4.7.2 Difração Anômala... 23
4.8 Refinamento da estrutura cristalográfica... 24
4. 4.9 Termal Shift... 25
5. Resultados e discussão 25 5.1 Expressão e purificação da Pal18... 25
5.2 Atividade de Lipase da PAL18... 30
5.3 Cristalização da PAL18... 31
5.4 Determinação da Fase... 34
Su 5.4.1 substituição Molecular... 34
5.4.2 Difração Anômala... 38
5.5 Resolução cristalográfica da estutura da PAL18... 43
6. Conclusões e perspectivas 56 7. Referências 57 8 .Anexos 65 8.1 Parecer da Comissão de Biossegurança... 65
xiii
xv
Agradecimentos
Em primeiro lugar agradeço minha orientadora Drª Andrea Dessen, responsável imediata para que esse trabalho fosse realizado, pela confiança depositada em mim, por todo apoio e
oportunidades geradas ao longo desse período e por todo enriquecimento científico e humano. Ao amigo e Co-orientador Drº David Neves por todas as contribuições diretas ao trabalho, pelas inúmeras discussões responsáveis por meu amadurecimento científico e por tornar o ambiente de trabalho cotidiano mais agradável.
A meus pais por não medirem esforços durante todo o tempo para que eu tivesse a
oportunidade de chegar a esse momento, apoiando-me sempre e sendo responsáveis por tudo o que sou.
Aos meus irmãos por toda a convivência e aprendizado que contribuíram para minha formação.
As minhas avós por todo carinho e simplicidade que tornaram as coisas mais fáceis. Ao meu amor Arina por toda sua inspiração, apoio incondicional, não apenas para esse
trabalho, mas por toda a vida, por sua dedicação e carinho ao longo de todas etapas de minha formação.
Ao Drº Carlos Contreras-Martel pela direta contribuição na coleta e processamento dos dados cristalográficos e pelas discussões de cristalografia que contribuíram para o interesse
despertado nessa ciência.
Ao Drº Marcio Dias pela coleta em Hamburgo e pelas discussões científicas.
A todos os amigos os quais tive o prazer de conviver durante a faculdade nas repúblicas Pata-de-camelo, Viralata e Só-kanela, além dos muitos outros que tornaram esse período
inesquecível.
As amigas do laboratório no LNBio Mayara e Samira por todo apoio na bancada e pelas risadas nos almoços e cafezinhos.
Aos amigos Xiba, Tábata, Priscila, Wesley, Fernanda, Aline e Angela pela amizade e pelos momentos de descontração na laboratório.
A todos meus professores das escolas Galileu Galilei e Escola da Vila, do cursinho Poliedro e da UNESP-Botucatu responsáveis por minha formação e interesse científico.
xvi
A todos os técnicos e pesquisadores responsáveis pelos laboratórios de Purificação de Proteínas, Espectrometria de Massas, Bioensaios e de Critslização pela ajuda durante as etapas desse trabalho.
Ao CNPEM e ao LNBio por todo apoio científico e financeiro.
Ao CNPq e FAPESP pelo apoio financeiro que permitiram a execução desse trabalho. E a todos que contribuiram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.
xvii
Lista de figuras
Figura 1: Sistemas de Secreção bacteriana. 4
Figura 2: Representação da estrutura tridimensional de EstA. 6 Figura 3: Representação das duas variantes do sistema de secreção tipo
V.
7
Figura 4: Esquema dos domínios de proteínas secretadas a partir do sistema de secreção tipo III.
7
Figura 5: Representação esquemática dos sítios de clivagem das diferentes fosfolipases sobre um fosfoglicerídeo.
10
Figura 6: Estruturas de Fosfolipases A2. 11
Figura.7: Estrutura tridimensional da proteína ExoU complexada à chaperona SpcU.
12
Figura 8: Alinhamento entre diferentes proteínas tipo patatina . 15 Figura 9: Esquema e modelo estrutural de PlpD. 16
Figura 10: Sequência da PlpD. 18
Figura 11: . Expressão e purificação da PAL18. 26
Figura 12: Espalhamento dinâmico de luz. 27
Figura 13: Estimativa da massa molecular da PAL18 a partir de gel filtração com coluna previamente calibrada.
28
Figura 14: Crosslink da PAL18. 29
Figura 15: Ensaio de atividade de lipase. 30
Figura 16: Cristais da PAL18 obtidos através de processo de difusão de vapor em gota suspensa.
32
Figura 17: Reflexão de um ângulo incidente do cristal e dados cristalográficos do cristal da PAL18.
33
Figura 18: Método FFAS de alinhamento de sequências proteicas. 35 Figura 19: Exemplo de sobreposição entre duas estruturas utilizando-se o 36
xviii programa Superpose.
Figura 20: Solução gerada através da técnica de substituição molecular. 37 Figura 21: Contrução da estrutura através do programa Autobuild
utilizando-se as fases obtidas pela substituição molecular.
38
Figura 22: Purificação da PAL18Semet. 39
Figura 23: Cristal da PAL18 expressa com selenometionina. 40 Figura 24: Cristais de PAL18 Semet obtidos após utilização do aditivo
N-dodecil β D maltosídeo.
41
Figura 25: Modelo gerado pelo programa Autosharp a partir das posições encontradas para os espalhadores anômalos.
44
Figura 26: Estrutura da unidade assímetrica da proteína PAL18. 46
Figura 27: Estruturas da PAL18 e ExoU. 48
Figura 28: Estrutura da PAL18. 49
Figura 29: Sobreposição entre o núcleo catalítico das proteínas PAL18 e ExoU.
50
Figura 30 Díade catalítica formada pelos resíduos Ser60-Asp207 na PAL18. 51 Figura 31: Disposição dos blocos conservados de patatinas na estrutura
da PAL18.
52
Figura 32: Díade catalítica e oxiânion das proteínas PAL18 e ExoU. 53 Figura 33: Resíduos terminais da sequência não construida na estrutura
da PAL18.
54
xix Lista de tabelas
Tabela 1: Índices obtidos após integração dos dados cristalográficos do cristal derivado através do programa XDS e XDSAPP.
42
Tabela 2: Índices obtidos após integração dos dados cristalográficos do cristal nativo através do programa XDS e XDSAPP.
43
Tabela 3: Parâmetros de rede e estatística dos dados de difração do cristal nativo e derivado
45
1
1. Introdução
1.1 Pseudomonas aeruginosa
Os componentes do genêro Pseudomonas apresentam-se como bastonetes Gram negativos ativamente móveis e aeróbios não fermentadores. O gênero representa um grupo diversificado de bactérias com importância médica, ambiental e biotecnológica (Schmidtke & Hanson 2008). A espécie mais importante, do ponto de vista médico, é a Pseudomonas aeruginosa. São bactérias monoflageladas com alta capacidade de versatilidade nutricional, possuindo exigências nutricionais mínimas, necessitando apenas de acetato e amônia como fontes de carbono e nitrogênio. Essas bactérias obtém energia da oxidação do açúcar, e muitas amostras podem crescer anaerobicamente utilizando nitrato como aceptor final de elétrons (Hass et al., 1992)
Pseudomonas são resistentes aos antibióticos mais comumente utilizados, inclusive as penicilinas e as cefalosporinas de primeira e segunda gerações, as tetraciclinas, o cloranfenicol, e a vancomicina. Os aminoglicosídeos e as fluoroquinolonas são normalmente eficazes (Breidenstein et al., 2011), porém são custosos além de apresentar relativa toxicidade.
Embora outras espécies também possam causar doenças, P. aeruginosa é um patógeno oportunista versátil que causa infecções em mamíferos, plantas, leveduras e insetos (Mahajan-Miklos et al., 2000). Essas bactérias são organismos de crescimento rápido que podem persistir em ambientes desfavoráveis, sendo difíceis, portanto, de serem erradicadas de áreas contaminadas. Podem ainda sobreviver em algumas soluções antisépticas utilizadas para desinfecção (Hancock, 1998). Desse modo, P. aeruginosa é a bacteria Gram-negativa mais comumente encontrada em infecções nosocomiais (Van Delden &Iglewski 1998).
P. aeruginosa são patógenos extracelulares típicos, ou seja, precisam resistir à ingestão por neutrófilos. Para tanto empregam inúmeras estratégias de modo a obter nutrientes escassos durante a infecção, podem por exemplo, aumentar a expressão de fosfolipase C de modo a obter fosfato (Ostroff et al 1989). Também produzem uma variedade de exotoxinas que causam inflamação local e destruição do tecido, possivelmente para obtenção de
2
nutrientes, permanência no hospedeiro e disseminação. A patogenicidade de P. aeruginosa ocorre, portanto, através da sua habilidade de produzir diversos fatores de virulência associadas a célula e/ou secretados (Van Delden and Iglewski 1998). Além disso apresentam a capacidade de causar distintas infecções o que pode ser atribuído ao seu grande genoma (Stover et al., 2000). O genoma é rico em genes codificando para proteínas transportadoras e reguladoras (Stover et al., 2000) o que condiz com a adaptação ambiental e, particularmente, com o potencial de virulência da linhagem..
Esses organismos têm a habilidade de infectar várias subpopulações de pacientes imunocomprometidos, particularmente vítimas de queimadura, pacientes com fibrose cística, AIDS e câncer (Cross et al., 1983; Kasper & Harrison, 2005). P. aeruginosa causa óbito com uma taxa de 30-60% em pneumonia e septicemia (Richard et al., 1994).
Como P. aeruginosa , assim como outros patógenos bacterianos, se tornaram multiresistentes (NNIS 2004) existe uma contínua necessidade de identificação de compostos que sejam direcionados à novos alvos com fins terapêuticos.
1.2 Bactérias Patogênicas e Sistema de Secreção
A estreita e dinâmica relação existente entre microorganismos patogênicos e seus respectivos hospedeiros resultou em uma evolução específica dos mecanismos responsáveis pela eficiente infecção e sobrevivência do patógeno. Esses mecanismos são, geralmente, compartilhados entre diferentes bactérias patogênicas, conferindo-lhes habilidades de adesão, invasão e de causar dano à células do hospedeiro (Wilson et al., 2002)
Bactérias patogênicas desenvolveram estratégias para aumentar a eficácia do processo infectivo. Entre outras estratégias, elas produzem fatores de virulência que, nas células do hospedeiro, atuam de modo a minimizar a eficiência da defesa imune, manipulando a sinalização celular para seu próprio benefício ou ainda utilizando o hospedeiro como um nicho para replicação (Cossart & Sansonetti, 2004; Merrell & Falkow, 2004). Além disso a maioria das bactérias liberam enzimas tais como proteases ou lipases de modo a transformar complexos macro-moleculares em nutrientes capazes de serem utilizados por elas (Son et al., 2007).
3
Investigações moleculares em bactérias mostraram que organismos patogênicos podem ser diferenciados dos não patogênicos pela presença de genes que codificam para determinantes de virulência específicos em forma de adesinas, toxinas, enzimas e mediadores de motilidade. Esses fatores são geralmente secretados para a superficie da célula bacteriana ou além desta, aumentando suas chances de sobrevivência e multiplicação (Finlay & Falkow, 1997). Esses determinantes podem ser patógeno-específicos ou conservados entre diferentes espécies ou gêneros.
Na mairoria dos casos os fatores de virulência produzidos pelo patógeno precisam ser transportados pelo envelope celular bacteriano e, em alguns casos, pela membrana plasmática do hospedeiro. De modo a viabilizar esse processo as bactérias desenvolveram uma grande quantidade de sitemas de secreção de proteínas (Desvaux et al., 2009; Bleves et al., 2010). A secreção proteica desenvolve um papel central na modulação das interações que ocorrem entre bactéria-hospedeiro via proteínas efetoras no ambiente do hospedeiro.
Em bacterias Gram-negativas como no caso de Pseudomonas aeruginosa, o envelope celular é composto, além da camada de peptidoglicano, por duas membranas hidrofóbicas. A membrana interna e a membrana externa são separadas pelo periplasma. Proteínas, enzimas ou toxinas secretadas tem que viajar através desse ambiente hidrofóbico das membranas. Essas proteínas são geralmente moléculas altamente hidrofílicas e portanto necessitam ser acomodadas em canais de água ou outros tipos de conduítes que consigam abranger o envelope celular. Os sistemas de secreção para o meio externo são gerados através da montagem de complexos macromoleculares os quais são chamados maquinarias de secreção. A composição e a natureza desses complexos podem variar, mas eles são amplamente conservados entre bactérias Gram-negativa (Van Wely et al., 2001). Seis diferentes classes de sistemas de secreção são identificados, os quais são reconhecíveis pelas características das proteínas/componentes que os formam. Mycobacterium tuberculosis apresenta um sétimo complexo, diferente dos demais (Bitter et al., 2009). São chamados sistemas de secreção tipo I ao tipo VI (Desvaux et al., 2009; Durand et al., 2009). Dentre os seis sistemas de secreção P. aeruginosa possui cinco deles (Figura 1) sendo que alguns em várias cópias. (Bleves et al. 2010).
4
Figura 1: Sistemas de Secreção bacteriana (Fronzes et al., 2009 adaptado).
1.3 Sistema de Secreçao do Tipo V
O sistema de secreção do tipo V foi originalmente descrito para a protease IgA em Neisseria gonorrhoeae (Pohlner et al., 1987). Assim como o sistema tipo II, porém diferentemente dos demais sistemas de secreção, esse sistema promove a secreção proteica em duas etapas, incluindo uma escala no periplasma. As proteínas secretadas através dessa via são sintetizadas em forma de precursores com um N-terminal carregando um sinal para exportação via maquinaria Sec ou Tat. (Michel & Voulhoux, 2009). Esse complexo macromolecular é responsável por transportar a proteína através da membrana interna. O sistema Sec promove a exportação de proteínas não enoveladas, enquanto a via Tat promove a exportação de proteínas enoveladas (Natale et al., 2007). A passagem pela membrana externa, que caracteriza a segunda etapa, é feita através do sistema de secreção V propriamente dito. Esse sistema permite a secreção através do envelope bacteriano de grandes proteínas associadas com adesão e virulência. Uma vez vencida a membrana interna
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via maquinaria Sec, o peptídeo efetor é secretado ou se ancora à membrana externa via uma estrutura barril beta que se insere nessa membrana (Bleves et al, 2010).
Proteínas que apresentam o domínio barril beta fusionado em um único peptídeo ao domínio efetor são chamadas auto-transportadoras. Como não são necessárias proteínas acessórias no processo de secreção, a via de secreção é chamada de autotransporte AT ou Va. (Dautin & Bernstein, 2007; Yen et al., 2008). Polipeptídeos dessa via consistem em um domínio efetor passageiro central de 40kDa a 400kDa e um domínio conservado no C-terminal, o qual forma a estrutura barril beta (Dautin & Bernstein, 2007). O barril beta pode-se inserir na membrana externa e é necessário para a translocação do domínio efetor ou passageiro para o espaço extracelular. Em alguns casos, como as adesinas, o domínio passageiro se mantém ligado ao barril beta e a proteína fica, portanto, ancorada à membrana externa. Em outros casos o domínio passageiro é clivado do barril beta através de atividade proteolíticas endógenas ou exógenas (Hendrixson et al., 1997; Shere et al., 1997; Coutte et al., 2003) deixando o passageiro solúvel no meio externo para desempenhar sua função.
Essas proteínas tem sido chamadas auto-transportadoras pois o dominio C-terminal forma a estrutura beta-barril com potencial de formar um poro, através do qual o domínio central com atividade catalítica possa passar. O genoma da linhagem PA01 de P. aeruginosa contém 3 genes que codificam para proteínas com domínios típicos de auto-transporte com um barril beta no C-terminal ligado ao domínio passageiro central. Enquanto que PA3535 e PA0328 ainda não foram caracterizados funcionalmente, a esterase A (EstA) tem sido largamente estudada, inclusive sua estrutura já foi resolvida (van den Berg, 2010) e é certo que apresenta atividade lipolitíca (Wilhelm et al.,1999).
6
Figura 2. Representação da estrutura tridimensional de EstA. A) N-terminal em azul e C-terminal em vermelho. B) Representação rotacionada em 90º em que hélices são representadas em vermelho, folhas beta em verde e loops em cinza. (figura adaptada de van den Berg, 2010)
Um outro mecanismo de secreção do tipo V é o sistema de secreção tipo dois parceiros ou TPS (two-partner). Esse sistema é um pouco mais sofisticado do que o AT e é conhecido como TPS ou Vb (Hodak & Jacob-Dubuisson, 2007., Mazar & Cotter, 2007). Nesse caso o domínio barril beta e o domínio passageiro apresentam-se como dois polipeptídeos distintos denominados TpsB e TpsA respectivamente. Esses polipeptídeos atuam em conjunto para exportar TpsA via TpsB. TpsA assim como o domínio passageiro no sistema AT são grandes proteínas que se mantém ligadas a superfície celular ou são liberadas no meio extracelular.
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Figura 3. Representação das duas variantes do sistema de secreção tipo V .(Fronzes et al., 2009 adaptado)
Apesar da via AT ser considerada uma variante do sistema de secreção tipo TPS, no qual a proteína transportada e o translocador estão conectados em um peptídeo único, não há semelhança de sequência ou estrutura entre o C-terminal dos AT e o TpsB. A estrutura do barril beta dos autotransportadores envolve 12 folhas beta (Oomen et al., 2004), enquanto que nas proteínas secretadas pela via TPS a estrutura é formado por 16 folhas betas (figura 4) (Clantin et al.,2007).
Figura 4: Esquema dos domínios de proteínas secretadas a partir do sistema de secreção tipo III.
A interação entre o domínio passageiro e o beta barril é específica e ocorre entre o motivo TPS e um domínio POTRA (polypeptide-transport-associated) que é encontrado no N-terminal do beta barril (Clantin et al., 2007). O domínio tipo POTRA é conectado ao beta barril mas
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projeta-se para fora em direção ao periplasma onde pode interagir com a proteína passageira. Esse domínio é responsável por ligações proteína-proteína e, no caso, pelo recrutamento da TpsA via TpsB, ele não é exclusivo dessas proteínas, porém nunca é encontrado nos AT.
Buscas no genoma da linhagem PA01 de P. aeruginosa identificaram 5 TPS putativos, sendo que entre eles apenas alguns foram caracterizados funcionalmente (Kida et al., 2008.; Borlee et al.,2010).
Recentemente uma proteína pertencente à uma quarta categoria de secreção do tipo V foi identificada em P. aeruginosa, ela foi denominada PlpD (Salacha et al., 2010). Através de predições de sequência verificou-se que o polipeptídeo da PlpD apresenta organização em dois domínios, incluindo um passageiro com atividade de lipase e um domínio previsto a formar uma estrutura barril beta. Desse modo classificou-se a proteína, portanto, como pertencente ao grupo dos AT ou Va, porém através de predições de estrutura foi previsto que o barril beta da PlpD possui 16 e não 12 folhas beta que é típico dos TpsB do grupo Vb. Além disso, análises de sequência revelaram que um domínio tipo POTRA pode ser identificado dentro da própria proteína PlpD, que também é característico da família Vb. Assim a PlpD representa um novo tipo de secreção com características dos tipos Va e Vb e foi nomeado como Vd (Salacha et al., 2010), uma vez que o tipo Vc já é usado para designar uma categoria particular de autotransporte em que o beta-barril é formado a partir da montagem de um homo-trímero e não de um monômero que é o que ocorre nos demais tipos. (Kajava & Steven, 2006; Meng et al., 2006).
1.4 Patatinas e Proteínas Tipo Patatina (PLPs):
BANERJI & FLIEGER, 2004 recentemente propuseram uma nova família de enzimas lipolíticas chamadas proteínas do tipo patatina (PLPs). Patatinas representam 40% de todas as proteínas solúveis em tubérculo de batata e apesar de serem consideradas proteínas de armazenamento, elas apresentam atividade lipido-acil-hidrosilase (Shewry, 2003). Essa atividade é considerada como um possível mecanismo de defesa contra patógenos de plantas e contra stress variados (Dhondt et al., 2000). Além disso, constatou-se que a patatina de
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batata B2 e a fosfolipase A2 citosólica de humanos compartilham domínios conservados (Hirschberg et al., 2001).
Em bactérias, genes codificando para homólogos de patatinas são encontrados em genomas de alguns patógenos de animais e patógenos/simbiontes de plantas, o que sugere uma importância durante o processo de interação com o hospedeiro (Banerji & Flieger, 2004). Uma análise de 369 genomas bacterianos feita por BANERJI ET Al., 2008 revelou que bactérias patogênicas e simbiontes, em contraste com bactérias não patogênicas, codificam um número muito maior de enzimas PLP. No mesmo estudo constatou-se que patógenos bacterianos intracelulares (L. pneumophila, R. prowazekii e M. tuberculosis) são espécies com com alta densidade de genes codificando para essas enzimas.
A primeira PLP bacteriana caracterizada foi a proteina ExoU do patógeno oportunista P. aeruginosa. ExoU é substrato para o sistema de secreção do tipo III e é diretamente entregue no citossol de células eucarióticas durante o processo infecioso. ExoU é a principal citotoxina secretada pela P. aeruginosa e produz rápida morte celular (Finck-Barbançon et al., 1997; Hauser et al., 1998; Sato et al.,2003) além de ser um importante determinante de virulência na maioria dos modelos animais de infecção (Shaver & Hauser, 2004).
ExoU é membro da família das fosfolipases A2 (FLA2) e sua atividade é necessária para a citotoxidade sobre células eucarióticas.(Sato & Frank, 2004; Sato et al., 2003). Sua expressão é associada à linhagens que causam infecções aguda. Diferentemente das fosfolipases eucarióticas, as quais remodelam membranas celulares e sintetizam mensageiros secundários pró-inflamatórios como ácido aracdônico e leucotrienos (Balsinde et al. 2002;Diaz & Arm 2003) a atividade de fosfolipase A2 da ExoU primariamente causa destruimento da membrana citoplasmática da célula do hospedeiro, resultando na lise celular.(Phillips et al. 2003 ; Sato et al. 2005). Além da sua atividade sobre fosfolipídeos, patatinas com atividade tipo FLA2 normalmente desempenham atividade esterase e/ou lipase (Salacha et al., 2010). Apesar da ExoU não ser codificada por todas linhagens de P. aeruginosa, como PA01, por exemplo, homólogos dessa proteína podem ser encontrados nessas linhagens (Wolfgang et al., 2003).
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1.5 Fosfolipases:
Fosfolipases (FLs) constituem um grupo heterogêneo de enzimas que compartilham a habilidade de hidrolizar uma ou mais ligações de éster em fosfoglicerídeos. Fosfolipases são enzimas ubíquas e diversas que mediam várias funções celulares, incluindo a manutenção da membrana, renovação celular e a geração de resposta inflamatória (Sitkiewicz et al 2007). Fosfoglicerídeos, por sua vez, apresentam quatro ligações de éster que podem ser clivadas de formas variadas através de diferentes FLs gerando amplas classes de moléculas que compreendem compostos com atividade biológica. As fosfolipases podem assim ser dividas em 4 grupos principais de acordo com os sítios de clivagem, sendo eles FLs A, B, C e D (Sitkiewicz et al 2007). Além disso, a FLA pode ser dividida em dois sub-grupos FLA1 FLA2 dependendo do carbono (1 ou 2) que cataliza a hidrólise, liberando ácido graxo e lisofosfolipídeo. A fosfolipase B apresenta clivagem combinando-se os sítios da FLA1 e FLA2.
Figura 5. Representação esquemática dos sítios de clivagem das diferentes fosfolipases sobre um fosfoglicerídeo.
Fosfolipases A estão envolvidas com a manutenção de processos celulares como o remodelamento da membrana (Zhang & Rock, 2008), metabolismo lipídico (Dessen, 2000) e utilização de nutrientes (Son et al., 2007).
Atividade de esterase ou lipase foram demonstradas para diversas FLA e B (Istivan & Coloe 2006). Esterases e lipases hidrolisam lipídeos neutros solúveis e insolúveis respectivamente (Arpigny & Jaeger, 1999; Jaeger et al., 1999). Assim algumas enzimas previamente descobertas como lipases e esterases foram posteriormente provadas sendo
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fosfolipases, porém são, geralmente, ainda classificadas como lipase/esterase ao invés de fosfolipases.
Um número limitado de estruturas de FLAs bacterianas são conhecidos. A fosfolipase A2 de S. violaceoruber (ScPLA2) é secretrada e foi a primeira fosfolipase A2 de procariotos caracterizada estruturalmente (Yasuyuki et al., 2002). Diversas estruturas de FLA2 de eucariotos já foram caracterizadas (Ghosh et al., 2006; Hurley & McCormick 2008) entretanto a considerável diferença entre ScPLA2 e PLA2 de eucariotos em relação a sequência primária, constante de ligação à cálcio, número de ligações dissulfeto e conformações da proteína (Sugiyama et al., 2002) levaram a propor SvPLA2 como um membro de um novo grupo de FLA2, chamado de FLA2 bacteriano (Sugiyama et al., 2002). Apesar das diferenças SvPLA2 e a FLA2 pancreática de bovinos (Van den Berg et al., 1995) revelam uma conservação parcial na estrutura (Yasuyuki & Masanori 2003) como pode ser observado na figura 6.
Figura 6. Estruturas de Fosfolipases A2. Esquerda: Estrutura da FLA2 de S. Violaceoruber, direita: FLA2 pancreática bovina. Estruturas secundárias α-hélices, regiões desordenadas e folhas beta estão coloridas em vermelho, laranja e azul respectivamente. (Figura adaptada de Matoba et al., 2003).
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Além disso, mais recentemente uma outra estrutura de FLA2 bacteriana resolvida foi da proteína pertencente a família das proteínas tipo-patatina ExoU (Gendrin et al., 2012).
Figura 7. Estrutura tridimensional da proteína ExoU complexada à chaperona SpcU. Os diferentes domínios são mostrados em cores diferentes. O domínio ponte (amarelo) contém elementos tanto no N-terminal quanto no C-terminal catalítico (azul). O domínio de ligação à membrane (vermelho) faz alguns contatos com os demais domínios. (Adaptada de Gendrin et al., 2012).
1.6 Papel das Fosfolipases A na Patogênese
A possibilidade de que as fosfolipases A estejam geralmente envolvidas com patogenicidade bacteriana foi apenas recém sugerida (Bofill et al., 2010). A hemólise é o mais comum e bem entendido mecanismo de ação das FLA bacteriana durante a infecção. Exemplos incluem Campylobacter coli, Vibrio parahaemolyticus, Legionella pneumophila e Rickettsia prowacekii (Schmiel & Miller 1999). Lisofosfolipídeos gerados pela ação de FLA ligados a membrana induzem expansão desta e assim contribuem para a desintegração física da membrana de eritrócitos (Chi & Wu 1990). Além disso lisofosfolipídeos em baixa concentração induzem uma lise osmótica dos eritrócitos por liberarem polipepitídeos de
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superficie celular das membranas dos eritrócitos o que aumenta a permeabilidade para íons de sódio (Bierbaum et al., 1979). Os lisofosfolipídeos podem causar lise de outras células como ocorre com o epitélio gástrico devido infecção por Helicobacter pylori (Schmiel et al., 1998; Slomiany & Slomiany, 1992) e também podem degradar soluções lipoprotéicas como o surfactante pulmonar. A degradação do surfactante pela ação do lisofosfolipídeo gerado pela FLA do patógeno respiratório L. pneumophila. (Banerji et al., 2008) ocasiona grande dificuldade de respiração devido a diminuição da complacência pulmonar.
Recentemente o efeito sinérgico de lisofosfolipídeos e do ramnolipídeo de P. aeruginosa na permeabilização da membrana foi relatado (Sanchez et al., 2010). Adcionalmente P. aeruginosa pode aumentar a produção de ramnolipídeos na presença de células polimorfonucleares (Alhede et al., 2009) o que causa rápida morte dessas células (Jensen et al., 2007).
Lipídeos são reconhecidamente importantes moléculas sinalizadoras em eucariotos. Na literatura é descrito que FLA2 de mamíferos libera ácido aracdônico e lisofosfolipídeos de membranas eucarióticas para fornecer os metabólitos para várias vias inflamatórias e não inflamatórias em eucariotos (Ghesquiere et al., 2005). Ainda pouco se sabe sobre o modo de ação direto das FLA2 bacterianas no hospedeiro. Entretanto existem algumas evidências que FLA2 de bactérias estão envolvidas na modulação da resposta inflamatória do hospedeiro e nas vias de sinalização celular.
A proteína tipo-patatina ExoU de P. aeruginosa é provavelmente a FLA bacteriana mais bem compreendida (Stirling et al., 2006). Ela apresenta atividades de fosfolipase A2, lisofofolipase, lipase e acil-hidrosilase (Tamura et al., 2004; Sato & Frank, 2004). A proteína é injetada diretamente no hospedeiro através do sistema de secreção do tipo III (Frank, 1997). A bactéria entrega a ExoU na sua forma inativa, a qual é ativada a partir de interações com o fator de ativação superóxido dismutase do hospedeiro (Sato et al., 2006). A proteína então se liga na membrana das células clivando os fosfolipídeos culminando em uma rápida e completa lise celular (Phillips et al., 2003).
Apesar da sua importância na lise de membranas celulares (Sato et al., 2003), em vivo ExoU é capaz de iniciar resposta inflamatória em eucariotos através de um mecanismo ainda
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não elucidado (Saliba et al., 2005). De qualquer modo, grandes mudanças na composição de fosfolipídeos de células de levedura ou células de mamíferos e evidências sobre a fragmentação de vacúolos de leveduras de acordo com a localização intracelular da ExoU enfatizam a hidrólise de fosfolipídeos de membrana como um fator mediando a citotoxicidade (Sato et al., 2003). Assim o papel da ExoU na pneumonia associada a ventilação (Diaz & Hauser, 2010; Plotkowski et al., 2008), pneumosepsia (Machado et al., 2010) e lesões epiteliais (Finck-Barbancon et al., 1997) causadas por P. aeruginosa são confirmadas (Schmalzer et al., 2010).
O conhecimento desse potente fator de virulência de P. aeruginosa resultou na identificação da pseudolipasina A, um inibidor especifico de ExoU mediado pela atividade FLA2 o qual pode ser um modelo para novas terapias baseadas na virulência (Lee et al., 2007).
Porém deve ser mencionado que certas linhagens de P. aeruginosa assim como PA01, não possuem genes codificando para ExoU no cromossomo. Por exemplo, aproximadamente 30% das linhagens de P. aeruginosa isoladas clinicamente codificam ExoU cromossomal (Feltman et al., 2001). Foi observado que linhagens de P. aeruginosa ExoU positivas isoladas de pacientes com pneumonia são mais virulentas do que as exoU negativa (Schunder et al., 2010). Juntos, experimentos in vivo e in vitro ressaltam a fosfolipase A2 de P. aeruginosa ExoU como um importante fator na patogênese bacteriana.
1.7 PlpD
A partir de buscas por proteínas do tipo patatina em linhagem PA01 de P. aeruginosa, SALACHA ET AL, 2010 identificaram que a proteína PlpD compartilha 40% de similaridade e 25% de identidade dentro do seu domínio N-terminal com a ExoU. De acordo com a base de dados Pfam, domínios do tipo patatina, que são responsáveis pela atividade enzimática de patatinas em bactérias, contém um sítio ativo que consiste em uma díade catalítica (Ser-Asp) ao invés de uma tríade catalítica típica da família das serina hidrolases. (Banerji & Flieger, 2004)
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A região N-terminal dessa proteína apresenta todos os domínios presentes em PLPs bacterianas: os três domínios conservados em patatina de batatas (blocos I, II e IV) (Banerji e Flieger, 2004) e o motivo adcional característico dessa familía de proteínas (bloco III) figura 8.
Figura 8. Alinhamento entre diferentes proteínas tipo patatina. PlpD e as PLPs bacterianas ExoU de P. aeruginosa, VipD de L. pneumophila e MXAN_3852 de M. xanthus evidênciando a conservação de resíduos em blocos funcionais.
O bloco I consiste em uma região rica em glicina contendo um residuo básico conservado de Arginina ou Lisina, o qual provavelmente desempenha papel de oxianion. O bloco II compreende um típico motivo de lipase Gli-X-Ser-X-Gli (Arpigny & Jaeger, 1999). O bloco III contém uma serina conservada que pode desempenhar função estrutural. O bloco IV contém um Aspartato conservado que juntamente com a Serina formam a díade catalítica. Através de predições de estrutura terciária (figura 9c) acredita-se que o sítio ativo da PlpD consista na Ser60 e Asp207 os quais devem formar a díade catalítica. (Salacha et al., 2010). Além disso o resíduo de Prolina altamente conservado nos blocos III e IV pode ser importante para a conformação correta da proteína.
A PlpD apresentaum N-terminal contendo o domínio tipo-patatina, e um C-terminal que abriga um domínio POTRA revelado pela base de dados Pfam, além de uma estrutura barril beta prevista através da estrutura secundária e fortalecida pela predição da estrutura terciária.
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Essa estrutura seria formada por 16 folhas beta (figura 9b) e permanece ligada à membrana externa enquanto o domínio efetor com atividade tipo-patatina no N-terminal é secretado. A figura 8a exemplifica a constituição da PlpD. SALACHA ET AL, 2010 também identificaram que o domínio patatina da PlpD é secretado em linhagens PA01 e PA14 e apresenta atividade de lipase, e de modo contrário a ExoU, PlpD não necessita de cofatores eucariótico para ser ativada, o que sugere que a proteína possa desempenhar papel já no ambiente extracelular e não apenas dentro da célula do hospedeiro.
Figura 9. Esquema e modelo estrutural de PlpD. A) representação esquemática dos domínios da PlpD. O peptídeo sinal (SP) de endereçamento via Sec, o domínio central passageiro com atividade patatina com os quatro blocos conservados em proteínas tipo-patatina bacterianas e o domínio POTRA também presente nas TpsB precedendo o barril beta. B) Predição da estrutura terciária do C-terminal a partir da estrutura da proteína FhaC evidenciando o barril beta em amarelo e o domínio POTRA em azul e verde. As linhas cinzas
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delimitam a membrana externa, EM indica meio externo e P o periplasma. C) O N-terminal da PlpD (residuos 25 à 235) foi previsto utilizando-se a estrutura da proteína Pat17, uma patatina de batata (Rydel et al., 2003). Nessa estrutura putativa os quatro blocos homólogos (em azul, roxo, verde e amarelo respectivamente) estão agrupados em um arcabouço onde as cadeia laterais dos resíduos Ser60 e Asp207 (em vermelho) responsáveis pelo sítio ativo putativo estão frente a frente. (Figura adaptada de Salacha et al., 2010).
Alinhamentos múltiplos revelaram homologia da PlpD exclusivamente com enzimas eucarióticas, o que está de acordo com observações que PLPs bacterianas notavelmente diferem de todos os grupos de hidrolases bacterianas conhecidos, sendo mais relacionadas a PLPs eucarióticas (Banerji et al. 2008). Todos os homólogos de sequência da PlpD possuem atividade esterase (Zaccheo et al., 2004; Murray & McMaster 2005; Moser et al., 2000, Xie et al., 2003, Rabin & Hauser, 2005), sendo que apenas alguns também possuem atividade de lisofosfolipase e fosfolipase A2 (van Tienhoven et al., 2002). Além disso foi descrito que ExoU é capaz de hidrolisar fosfolipídeos de um modo dependende de lisofosfolipase e fosfolipase A2 (Tamura et al., 2004). A partir da conservação do sítio ativo e dos resíduos importantes estruturalmente na PlpD e em seus homólogos, juntamente com a atividade hidrolítica experimentalmente demonstrada é provavel que PlpD possa ser uma esterase, fosfolipase A2 ou lisofosfolipase .
2. Justificativa:
Em nosso laboratório a sequência que compreende o domínio catalítico da PlpD contendo todos os motivos do tipo patatina, identificada como PAL18, foi clonado em vetor de expressão PET15b. A figura 10 mostra a sequência da proteína PlpD e do mutante PAL18. Também estão identificados os blocos conservados responsáveis pela atividade da proteína.
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Figura 10. Sequência da PlpD. Sequência de aminoácidos da PlpD e da PAL18. Em vermelho a sequência da PAL18, em amarelo a sequência identificada por Pfam do domínio tipo patatina (PAL18). Sublinhado estão em ordem os blocos I, II, III e IV conservados característicos de PLPs bacterianas.
A resolução da estrutura através de cristalografia da porção catalítica da PlpD traz informações essenciais quanto ao seu mecanismo de ação e possíveis papéis desempenhados durante o processo infecioso do patógeno P. aeruginosa. Além disso, experimentos de nocaute e análise de mutantes tem sido realizados em colaboração com o grupo da Dra Sophie Bleves, do Laboratório de Engenharia de Sistemas Macromoleculares de Marselha, França de modo a fornecer um entendimento global a cerca desta proteína.
3.0 Objetivo principal
O objetivo geral desse trabalho foi a elucidação da estrutura do domínio catalítico da PlpD, secretado pela bactéria P. aeruginosa, bem como sua caracterização estrutural e confirmação da presença de atividade nesse domínio.
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3.1 Objetivos Específicos
Para tanto utilizamos as seguintes estratégias:
Expressão de forma hetérologa, e purificação do domínio catalítico da PlpD recombinante em quantidade suficiente para testes de cristalização.
Confirmação da presença de atividade de lipase da proteína recombinante.
Utilização a plataforma Robolab do Laboratório Nacional de Biociências (CNPEM) para identificar condições iniciais de cristalização.
Refinamento das condições de cristalização iniciais. Obtenção de dados de difração de raios x.
Resolução da estrutura tridimensional.
4. Metodologia e forma de análise dos resultados
4.1 Produção e purificação da proteína recombinante PAL18
O fragmento correspondente ao domínio catalítico da PlpD (PAL18) foi clonado no vetor pET15b pelo grupo da Drª Bleves, o qual confere uma cauda de poli histidina ao N-terminal da proteína. A construção foi utilizada para transformar bactérias E. coli BL21(DE3), E. coli BL21(DE3) pLysS, C41(DE3) bem como DH5α para manutenção do clone. Foram realizados ensaios preliminares de expressão em pequena escala (50 ml de cultura) para observação da concentração ideal de IPTG, além do tempo de indução e temperatura ótimos para expressão da proteína (Mini-indução).
Para os ensaios em larga escala (1000 ml de cultura), uma colônia transformante foi selecionada e pré-inoculada em 40 ml de meio LB líquido suplementado com ampicilina. Após 16h, os pré-inóculos foram depositados em 1000 ml de meio LB líquido suplementado com antibiótico e incubados a 37°C por aproximadamente 2 horas até atingir OD600 entre 0,6 e 0,8, quando a expressão da proteína foi induzida com a concentração de IPTG observada na mini-indução, mantida sob agitação de 200rpm na temperatura e tempo ideais também observados na mini-indução.
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Após esse período as células foram submetidas a centrifugação a 6000 rpm por 10 minutos a 4ºC e os precipitados foram ressuspensos em tampão de lise composto por: 50mM Tris e 200mM NaCl, pH 7,5.
A ruptura das células, bem como do DNA das amostras foi realizada mecanicamente no gelo utilizando-se sonicação (5s com intervalos de 10 segundos por 2 minutos), e os extratos foram centrifugados a 13000 rpm durante 40min a 4°C para a obtenção do sobrenadante.
A purificação da proteína Pal18 deu-se em duas etapas, na primeira o sobrenadante contendo a proteína de interesse foi fracionado em coluna HiTrap Chelating (GE Healthcare) de 5ml previamente equilibrada com tampão A: 50mM Tris e 200mM NaCl em pH 7,5 e a proteína foi eluída em gradiente de tampão B: 50mM Tris, 200mM NaCl e 500m M imidazol em pH 7,5.) utilizando-se FPLC (AKTApurifier). A segunda etapa da purificação constituiu-se de cromatografia de exclusão molecular ou filtração em gel. Para esse processo foi acoplado à FPLC (AKTApurifier) uma coluna Superdex 75 16/60 (GE Healthcare) que foi utilizada na presença de tampão: 20mM Tris, 200mM NaCl e 1mM EDTA em ph 7,5.
4.2 Confirmação do produto da expressão e purificação através de espectrometria de massas e Western Blot:
A proteína purificada foi submetida a Espectrometria de Massa. Para isso, a fração resultante dos processos de purificação foi reduzida, alquilada e tripsinizada de acordo com VILLÉN & GYGI, 2008 modificado. Os produtos da tripsinização foram lidos em espectômetro de massa e as leituras foram utilizadas como entrada no servidor Mascot. Todos os procedimentos foram realizados no laboratório de espectrometria de massas (LNBio, CNPEM).
Além disso, foi realizado Western Blot da proteína Pal18 purificada de modo a confirmar o produto. Para tanto, o protocolo descrito por SAMBROOK et al., 1989 foi utilizado. Em resumo, a proteína foi fracionada em gel SDS-PAGE 15% , transferida para membrana de PVDF e incubada com soro anti-Histag fornecido pelo Kit Penta His HRP Conjugate (5Prime) que fornece o anticorpo primário já conjugado ao fluoróforo responsável pela imunodetecção.
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4.3 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)
Análise por DLS foi realizada no laboratório LEC (LNBio, CNPEM) para todas as amostras após purificação e analise por SDS-PAGE. As amostras foram previamente centrifugadas por 30 minutos a 20000g a 4°C. Foram realizadas 100 aquisições de 5 segundos no equipamento DynaPro (ProteinSolutions), com amostras de 80uL da proteína à 1mg/ml.
4.4 Ensaio de atividade de Lipase.
Os ensaios foram realizados de acordo com protocolo descrito em Salacha et al., 2010. A atividade lipolítica foi medida utilizando-se o p-nitrofenil palmitato como substrato. A solução substrato foi composta por 0,7mM de p-nitrofenil palmitato; 45mM Na2HPO4, 45mM KH2PO4, 4,5mM Deoxicholato sódico e 0,1%(M/V) de goma arábica. 200uL do substrato foram misturados à 10uL da PAL18 purificada à 1mg/ml em placas de ELISA. A leitura da absorbância do p-nitrofenol liberado pela reação foi lida em 410nm em intervalos de 20 segundos a uma temperatura de 30ºC.
4.5 Ensaios de Cristalização
Os ensaios de cristalização da proteína PAL18 foram realizados através da técnica de difusão de vapor em gota suspensa. Por se tratar de um método empírico, testes de grande amplitude foram conduzidos utilizando-se a plataforma Robolab (LNBio, CNPEM). Os “kits” utilizados para os testes iniciais de cristalização da proteína PAL18 e PAL18 SeMet estão listados abaixo:
Wizard Screens I e II (Emerald Biosystems) – 96 soluções PACT (Nextal/QUAIGEN) – 96 soluções
JCSG (Nextal/QUAIGEN) – 96 soluções SaltRx (Hampton Research) – 96 soluções
Precipitant Synergy (Emerald Biosystems) – 64 soluções
Crystal Screen e Crystal Screen 2 (Hampton Research) – 98 soluções
As gotas foram preparadas com o uso de um robô Honeybee 963 (Genomic Solutions) em placas de 96 poços. No reservatório foram aplicados 80 μL de solução, a gota foi formada por
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0,5 μL de proteína e 0,5 μL de solução do reservatório. Foram testadas as concentrações de 6, 10 e 15mg/ml da Pal18. As placas de cristalização foram mantidas sobre temperatura constante de 18ºC ou 4ºC.
As condições favoráveis foram refinadas manualmente utilizando-se novamente a técnica de difusão de vapor em gota suspensa variando-se a concentração do precipitante, do sal e do pH, além disso quando necessário fez-se uso do kit de aditivos Addtive Screen (Hampton Research), nesses casos foi adcionado à gota suspensa 0,6uL de aditivo.
4.5.1 Seeding
Para a técnica de seeding foi utilizado o kit Seed Bead (Hampton Research) foi utilizado no processo. Para a preparação do estoque, o poço da placa de cristalização contendo a gota com os cristais da PAL18 Semet de baixo poder de difração foi aberto, 50uL da condição foram transferidos para o tubo contendo as beads, os cristais foram então adcionados e quebrados através de vortexação por 10 segundos, seguida de encubação em gelo por mais 10 segundos durante um tempo total de 3 minutos, seguido de rápida centrifugação. Em seguida foi adcionado um volume de 450uL da condição do poço ao tubo. Diluições de 1:10; 1:100; 1:1000 e 1:10000 foram preparadas a partir do estoque.
As diluições do estoque de seeding foram utilizadas em igual volume à proteína recém purificada para compor a gota utilizada na montagem de novas placas de cristalização.
4.5.2 Cross-Seeding
Essa técnica foi utilizada como alternativa ao seeding convencional, para tanto, cristais nativos foram utilizados para montagem do estoque. A metodologia seguida foi igual à descrita para o seeding convencional.
4.6 Coleta e processamento dos dados de difração
Os dados de difração de raios X dos cristais da proteína PAL18 foram coletados nas linhas de cristalografia D03B-MX1 e W01B-MX2 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (CNPEM, Campinas, SP, Brasil) utilizando-se detector MAR 225 CCD (Mar Research). Dados de difração de raios x também foram adquiridos na linha ID29 do ESRF – Grenoble, França
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utilizando-se detector Pilatus. Os cristais foram mantidos a 100 K durante a coleta de dados utilizando-se nitrogênio gasoso. A crioproteção não se fez necessária, uma vez que não ocorreram cristais de gelo. O processamento dos dados foi realizado utilizando-se o pacote XDS. As estatísticas do processamento foram visualizadas graficamente através do programa XDSAPP o que permitiu uma seleção crítica das reflexões que contribuiam para as estatísticas sem grande incremento na mosaicidade.
4.7 Determinação da estrutura. 4.7.1 Substituição Molecular
De modo a recuperar as informações de fase para construção da estrutura, inicialmente foi utilizada a técnica de substituição molecular. Para tanto, utilizou-se o programa PHASER da plataforma PHENIX (Adams et al., 2010). Devido a baixa identidade entre a PAL18 e as proteínas homólogas com estrutura resolvida, foram utilizadas algumas metodologias de modo a favorecer a programática computacional. Foram gerados modelos poli-alanina utilizando-se o servidor PDB Goodies (Hussain et al., 2002), bem como estruturas quiméricas a partir da sobreposição das estruturas homólogas, através do programa Superpose (CCP4).
4.7.2 Expressão, Purificação e Cristalização da PAL18 SeMet
Células da linhagem E. coli C41 (DE3) transformadas com o vetor contendo o gene de interesse foram retiradas do estoque a -80°C e estricadas em meio de cultura LB sólido. Uma colônia isolada foi inoculadas em 50 mL de LB líquido suplementado com 100 μg.mL-1 de ampicilina. Os pré–inóculos foram deixados overnight a 37 ºC sob agitação. O pré-inoculo foi centrifugados à 3000 rpm por 10 minutos e as células ressuspendidas em 10mL de meio mínimo M9 contendo 12,8 g/L de Na2HPO4-7H2O; 3 g/L de KH2PO4; 0,5 g/L de NaCl; 1g/L de NH4Cl; 1 mM de MgSO4; 1M CaCl2; 0,4% glicose; FeCl2 suplementado com 200mg/L Tiamina e 100 μg.mL-1
de ampicilina. O processo foi repetido novamente. As células mantidas sob agitação a 37ºC no meio mínio M9+ Tiamina durante overnight, o volume de 10 ml foi vertido em 1L de M9+Tiamina com 100 μg.mL-1
de ampicilina, a cultura foi mantida sob agitação a 37ºC até alcançar OD600 0,4, quando 100mg/L dos amino-ácidos Lisina, fenilalanina e L-treonina e 50mg/L dos amino-ácidos L-Isoleucina, L-Leucina e L-Valina foram adcionados de
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modo a inibir a produção de Metionina, 60mg/l de Selenometionina também foi acrescentado de modo a ser incorporado durante a produção proteica. As células foram crescidas sob agitação a 37ºC até alcançar OD600 entre 0,6 e 0,8, quando então foram induzidas com 0,1mM de IPTG e expressas por 16h.
Os cristais foram obtidos através da técnica de difusão de vapor em gota suspensa utilizando-se a condição no poço: 20%(M/V) PEG 3350 e 200mM de Nitrato de sódio e a gota foi formada por 1uL da proteína PAL18Semet acrescida de 1uL da condição do poço e 0,6uL do aditivo N-dodecil β D maltosídeo à 5%, a placa foi mantida à 4ºC.
Os cristais da PAL18 com a incorporação de Seleniometionina foram utilizados na técnica de SAD. Um grupo de dados cristalográficos foi coletado na energia da borda de absorção do átomo de selênio determinada através do espectro de emissão de fluorescência do cristal calculado a partir dos valores dos componentes f’ e f” do fator de espalhamento atômico em função da energia. A quebra da lei de Friedel proporcionada pelo espalhamento anômalo permite a obtenção das fases, e portanto um posicionamento inicial da estrutura dentro da densidade eletrônica gerada experimentalmente. A detertminação da estrutura doi realizada pelo uso do programa autoSharp (de La Fortelle & Bricogne, 1997) que encontra e correlaciona os picos gerando as fases, posiciona tridimensionalmente os átomos pesados e gera um modelo parcial. Esse modelo foi utilizado como entrada no programa PHASER para substituição molecular utilizando-se os dados nativos com maior resolução. A construção do modelo definitivo foi realizada pelo programa Autobuild da plataforma PHENIX.
4.8 Refinamento da estrutura cristalográfica
O modelo construído pelo programa Autobuild foi refinado intercalando-se ajustes manuais da cadeia ao mapa de densidade eletrônica com a utilização dos algorítmos computacionais presentes no programa REFMAC (Murshudov et al., 1997) que foi utilizado na etapa de refinamento através da interface CCP4 (Potterton et al., 2003). Após cada ciclo de refinamento com o programa REFMAC o modelo foi analisado e ajustado manualmente utilizando-se o programa COOT (Emsley & Cowtan, 2004).
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4.9 Termal Shift
O ensaio basea-se na utilização de uma sonda hidrofóbica que emite fluorescência quando ligada. Proteínas enoveladas exibem as porções hidrofóbicas no interior do arcabouço hidrofílico em contato com o solvente, ao se desenovelar as regiões hidrofóbicas são expostas e ocorre a ligação à sonda, podendo ser lida através da fluorescência.
Para o ensaio, cada poço de uma placa de PCR com 96 poços recebeu um volume de 45uL da proteína à 5uM com diferentes tampões, variando-se o pH de 4 até 9. Também foi adicionado 5uL de Sypro orange em concentração 200X recém preparado a partir do estoque 5000X. A leitura foi realizada no aparelho Elowitz Lab qPCR variando-se a temperatura de 19ºC à 95ºC em incrementos de 1ºC. A cada incremento realizou-se uma medida e os dados foram plotados em gráfico Florescência X Temperatura.
5. Resultados e Discussão
5.1 Expressão e purificação da Pal18:
A PAL18 foi expressa na fração solúvel em bactérias C41(DE3) induzidas com 0,1mM de IPTG por 16h à 20ºC sob agitação de 200 rpm. Sua purificação foi obtida em um grau satisfatório através de fracionamento em colunas de afinidade e filtração em gel como descrito em materias e métodos. A figura 11a mostra o padrão de migração em gel de poliacrilamida da expressão e purificação da PAL18.
De modo a confirmar que a banda visualizada na figura 11a realmente se tratava da PAL18, foi realizado um Western Blot, revelando a proteína de aproximadamente 34 kDa com soro anti-Histag. Como a PAL18 foi produzida fusionada a uma cauda 6x Histidina conferida pelo vetor Pet15b, o soro reconhece a proteína recombinante via sua cauda evidenciando-a na membrana de PVDF (Figura 11b). Também foi realizado espectometria de massa com os produtos da digestão por tripsina da PAL18 purificada. Quando inserido no banco de dados MASCOT os padrões de clivagem remeteram exatamente a proteína PlpD de P. aeruginosa, novamente validando que o produto da expressão e purificação se tratava do alvo dessa pesquisa.
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Figura 11. Expressão e purificação da PAL18. A) Gel SDS 15% contendo: 1) Marcador Molecular 2) Extrato total da cultura não induzida com IPTG; 3) Fração insolúvel da expressão da PAL18; 4) Fração Solúvel da expressão da PAL18; 5) PAL18 após purificação por afinidade; 6) PAL18 após purificação por afinidade e filtração em gel. B) Western Blot da PAL18 purificada revelada com soro anti His.
Por se tratar de um processo desnaturante, a visualização através de gel SDS não nos fornece informação quanto a oligomerização da proteína. Sabendo-se que a monodispersidade é um dos fatores com influência sobre o processo de cristalização, foi realizado ensaio de espalhamento dinâmico de luz (DLS) com a proteína PAL18. O DLS fonece estimativas do raio hidrodinâmico das partículas em solução. A figura 12 mostra o alto grau de monodispersidade da amostra representado pela ausência de detecção de partículas que não a identificada pelo raio de 4.0nm, essa monodispersidade possibilitou a continuidade no processo de cristalização da proteína.
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Figura 12. Espalhamento dinâmico de luz. Monodispersidade da amostra evidenciada pelo DLS. É possível observar que o raio hidrodinâmico médio calculado é de 4 nm para o componente marjoritário da amostra.
A estimativa de massa da proteína também é dada pelo DLS, os 86 kDa estimados pela leitura pressupõem a formação de dímero ou trímero, uma vez que a massa estimada a partir da sequência de aminoácidos para o monômero pelo programa ProtParam (Gasteiger et al., 2005) é de 33,84 kDa. De modo a investigar a massa da PAL18 resultante dos processos de purificação, uma coluna Superdex 200 10/300 foi calibrada, utilizando-se, para tanto, os volumes em que proteínas com massa molecular conhecidas eram eluídas (Figura 13a). As proteínas Ferritina à 0,3mg/ml, Conalbumina à 3mg/ml, Ovalbumina à 4mg/ml, Anidrase Carbônica à 3mg/ml, Ribonuclease A à 3mg/ml e Aprotinina a 3mg/ml foram utilizadas para estabelecer a curva padrão. Após estabelecida a curva padrão, a proteína PAL18 foi submetida a interação com a coluna de gel filtração, sendo eluída com um volume de 13,69 ml (Figura 13b) indicando, portanto, quando plotada à curva padrão pré estabelecida uma massa
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de 90,23 kDa, o que indica qua a PAL18 se apresenta como um dímero ou um trímero em solução.
Figura 13. Estimativa da massa molecular da PAL18 a partir de gel filtração com coluna previamente calibrada. A) Calibração da coluna Superdex 200 10/300 com diferentes proteínas padrão. B) Gel filtração da PAL18 evidenciando o volume em que a proteína foi eluída.
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De modo a visualizar a transição entre o monômero e o oligômero foi realizado um ensaio de crosslink. Esse ensaio oferece um método direto de identificação de interações estáveis ou transientes e envolve a formação de ligações covalentes entre duas moléculas proteicas através do uso de reagentes bifuncionais contendo grupamentos terminais reativos, por exemplo, aminas. Foi utilizado o agente crosslinkante DSS, que reage com aminas primárias, conectando as lisinas distantes no máximo à 11,4 Angstroms, tamanho do braço do DSS. De modo a não interferir no experimento por conter grupamentos amina, o tampão Tris foi substituído através de diálise por tampão Hepes. Após encubação os produtos, juntamente com o controle sem DSS foram separados em gel SDS (Figura 14).
Figura 14. Crosslink da PAL18. Gel SDS 15% contendo: 1) Marcador Molecular; 2) Pal18 sem tratamento com DSS; 3) Pal18 tratado com 30uM de DSS; 4) Pal18 tratado com 160uM de DSS; 5) Pal18 tratado com 810 uM de DSS.
É possível observar a diminuição da banda referente ao monômero (~34kDa) e o aumento da banda referente ao oligômero (~100kDa) de acordo com o aumento da concentração de DSS utilizada.
Ensaio adicional de Termal Shift foi realizado como descrito em metodologia visando a caracterização bioquímica da PAL18, o que poderia facilitar sua cristalização através do conhecimento prévio de estabilidade em diferentes pHs. Porém, provavelmente devido ao caráter hidrofóbico do sítio ativo, que permite que a sonda ligue-se antes do desnovelamento
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proteíco, em todos os ensaios foram observados um alto sinal de fluorescência logo nas primeiras leituras, o que impossibilitou a caracterização.
5.2 Atividade de Lipase da PAL18
De modo a verificar se a proteína recombinante estava ativa, a atividade de lipase da proteína PAL18 foi medida através da degradação do substrato lipídico p-nitrofenil palmitato. O produto da reação (p-nitrofenol) foi quantificado através de espectofotometria em comprimento de onda de 410nm. As leituras sequenciais com intervalos de 20 segundos são representadas na figura 15.
Figura 15. Ensaio de atividade de lipase. À solução lipídica foi adcionado: Pal18 (verde), Lisozima (laranja) e tampão tris ph7,5 (rosa).
É possível observar um claro aumento na leitura da absorbância quando na presença da proteína Pal18, evidenciando a presença de atividade de lipase na proteína recombinante.
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5.3 Cristalização da PAL18:
Após a confirmação da integridade estrutural, atividade e monodispersidade da PAL18, a mesma, em diferentes concentrações, foi submetida a condições preciptantes presentes em kits comerciais de cristalização em proporções proteína/condição variadas. A condição: Sulfato de Magnésio 1,8 M e 100 mM Bis-tris propano pH 7,0 em proporção de volume 2:1 condição-proteína à 15mg/ml resultou na formação dos cristais como pode ser observado na figura 16a. Apesar da formação de monocristais com arestas bem definidas, muitas nucleações ocorriam. Através de um refinamento variando-se o pH, concentração da proteína e concentração do sal sulfato de magnésio obteve-se a partir de Sulfato de Magnésio 1,4M e 100mM Bis-tris propano pH 7,0 os cristais tal qual mostrado na figura 16b. Os cristais obtidos após o refinamento apresentaram-se maiores e, portanto, mais apropriados de serem utilizados na difração de raios X, porém ainda estavam ocorrendo muitas nucleações por gota, objetivando-se incrementar a qualidade dos cristais foram realizados refinamentos em que a condição 1,4 M de sulfato de magnésio foi utilizada com gradientes de NaCl ou películas dos óleos Silicone e parafina, sobre a condição contida no poço, em diferentes proporções. Em ambas estratégias objetivou-se diminuir a velocidade da taxa de difusão de vapor entre a gota contendo a proteína e a solução precipitante para que os cristais pudessem ocorrer em menor número, porém com maior tamanho. Os cristais resultantes dessa estratégia e utilizando-se 100 mM de NaCl ou proporção de 1:1 entre parafina e silicone compondo uma película sobre a condição preciptante, apresentaram um pequeno aumento quando comparado com as outras estratégias de cristalização.
