Ensaios de Cristalização

Os ensaios de cristalização da proteína PAL18 foram realizados através da técnica de difusão de vapor em gota suspensa. Por se tratar de um método empírico, testes de grande amplitude foram conduzidos utilizando-se a plataforma Robolab (LNBio, CNPEM). Os “kits” utilizados para os testes iniciais de cristalização da proteína PAL18 e PAL18 SeMet estão listados abaixo:

 Wizard Screens I e II (Emerald Biosystems) – 96 soluções  PACT (Nextal/QUAIGEN) – 96 soluções

 JCSG (Nextal/QUAIGEN) – 96 soluções  SaltRx (Hampton Research) – 96 soluções

 Precipitant Synergy (Emerald Biosystems) – 64 soluções

 Crystal Screen e Crystal Screen 2 (Hampton Research) – 98 soluções

As gotas foram preparadas com o uso de um robô Honeybee 963 (Genomic Solutions) em placas de 96 poços. No reservatório foram aplicados 80 μL de solução, a gota foi formada por

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0,5 μL de proteína e 0,5 μL de solução do reservatório. Foram testadas as concentrações de 6, 10 e 15mg/ml da Pal18. As placas de cristalização foram mantidas sobre temperatura constante de 18ºC ou 4ºC.

As condições favoráveis foram refinadas manualmente utilizando-se novamente a técnica de difusão de vapor em gota suspensa variando-se a concentração do precipitante, do sal e do pH, além disso quando necessário fez-se uso do kit de aditivos Addtive Screen (Hampton Research), nesses casos foi adcionado à gota suspensa 0,6uL de aditivo.

4.5.1 Seeding

Para a técnica de seeding foi utilizado o kit Seed Bead (Hampton Research) foi utilizado no processo. Para a preparação do estoque, o poço da placa de cristalização contendo a gota com os cristais da PAL18 Semet de baixo poder de difração foi aberto, 50uL da condição foram transferidos para o tubo contendo as beads, os cristais foram então adcionados e quebrados através de vortexação por 10 segundos, seguida de encubação em gelo por mais 10 segundos durante um tempo total de 3 minutos, seguido de rápida centrifugação. Em seguida foi adcionado um volume de 450uL da condição do poço ao tubo. Diluições de 1:10; 1:100; 1:1000 e 1:10000 foram preparadas a partir do estoque.

As diluições do estoque de seeding foram utilizadas em igual volume à proteína recém purificada para compor a gota utilizada na montagem de novas placas de cristalização.

4.5.2 Cross-Seeding

Essa técnica foi utilizada como alternativa ao seeding convencional, para tanto, cristais nativos foram utilizados para montagem do estoque. A metodologia seguida foi igual à descrita para o seeding convencional.

4.6 Coleta e processamento dos dados de difração

Os dados de difração de raios X dos cristais da proteína PAL18 foram coletados nas linhas de cristalografia D03B-MX1 e W01B-MX2 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (CNPEM, Campinas, SP, Brasil) utilizando-se detector MAR 225 CCD (Mar Research). Dados de difração de raios x também foram adquiridos na linha ID29 do ESRF – Grenoble, França

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utilizando-se detector Pilatus. Os cristais foram mantidos a 100 K durante a coleta de dados utilizando-se nitrogênio gasoso. A crioproteção não se fez necessária, uma vez que não ocorreram cristais de gelo. O processamento dos dados foi realizado utilizando-se o pacote XDS. As estatísticas do processamento foram visualizadas graficamente através do programa XDSAPP o que permitiu uma seleção crítica das reflexões que contribuiam para as estatísticas sem grande incremento na mosaicidade.

4.7 Determinação da estrutura. 4.7.1 Substituição Molecular

De modo a recuperar as informações de fase para construção da estrutura, inicialmente foi utilizada a técnica de substituição molecular. Para tanto, utilizou-se o programa PHASER da plataforma PHENIX (Adams et al., 2010). Devido a baixa identidade entre a PAL18 e as proteínas homólogas com estrutura resolvida, foram utilizadas algumas metodologias de modo a favorecer a programática computacional. Foram gerados modelos poli-alanina utilizando-se o servidor PDB Goodies (Hussain et al., 2002), bem como estruturas quiméricas a partir da sobreposição das estruturas homólogas, através do programa Superpose (CCP4).

4.7.2 Expressão, Purificação e Cristalização da PAL18 SeMet

Células da linhagem E. coli C41 (DE3) transformadas com o vetor contendo o gene de interesse foram retiradas do estoque a -80°C e estricadas em meio de cultura LB sólido. Uma colônia isolada foi inoculadas em 50 mL de LB líquido suplementado com 100 μg.mL-1 de ampicilina. Os pré–inóculos foram deixados overnight a 37 ºC sob agitação. O pré-inoculo foi centrifugados à 3000 rpm por 10 minutos e as células ressuspendidas em 10mL de meio mínimo M9 contendo 12,8 g/L de Na2HPO4-7H2O; 3 g/L de KH2PO4; 0,5 g/L de NaCl; 1g/L de NH4Cl; 1 mM de MgSO4; 1M CaCl2; 0,4% glicose; FeCl2 suplementado com 200mg/L Tiamina e 100 μg.mL-1

de ampicilina. O processo foi repetido novamente. As células mantidas sob agitação a 37ºC no meio mínio M9+ Tiamina durante overnight, o volume de 10 ml foi vertido em 1L de M9+Tiamina com 100 μg.mL-1

de ampicilina, a cultura foi mantida sob agitação a 37ºC até alcançar OD600 0,4, quando 100mg/L dos amino-ácidos L-Lisina, L-fenilalanina e L- treonina e 50mg/L dos amino-ácidos L-Isoleucina, L-Leucina e L-Valina foram adcionados de

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modo a inibir a produção de Metionina, 60mg/l de Selenometionina também foi acrescentado de modo a ser incorporado durante a produção proteica. As células foram crescidas sob agitação a 37ºC até alcançar OD600 entre 0,6 e 0,8, quando então foram induzidas com 0,1mM de IPTG e expressas por 16h.

Os cristais foram obtidos através da técnica de difusão de vapor em gota suspensa utilizando-se a condição no poço: 20%(M/V) PEG 3350 e 200mM de Nitrato de sódio e a gota foi formada por 1uL da proteína PAL18Semet acrescida de 1uL da condição do poço e 0,6uL do aditivo N-dodecil β D maltosídeo à 5%, a placa foi mantida à 4ºC.

Os cristais da PAL18 com a incorporação de Seleniometionina foram utilizados na técnica de SAD. Um grupo de dados cristalográficos foi coletado na energia da borda de absorção do átomo de selênio determinada através do espectro de emissão de fluorescência do cristal calculado a partir dos valores dos componentes f’ e f” do fator de espalhamento atômico em função da energia. A quebra da lei de Friedel proporcionada pelo espalhamento anômalo permite a obtenção das fases, e portanto um posicionamento inicial da estrutura dentro da densidade eletrônica gerada experimentalmente. A detertminação da estrutura doi realizada pelo uso do programa autoSharp (de La Fortelle & Bricogne, 1997) que encontra e correlaciona os picos gerando as fases, posiciona tridimensionalmente os átomos pesados e gera um modelo parcial. Esse modelo foi utilizado como entrada no programa PHASER para substituição molecular utilizando-se os dados nativos com maior resolução. A construção do modelo definitivo foi realizada pelo programa Autobuild da plataforma PHENIX.