Resolução cristalográfica da estutura da PAL18

Como passo inicial na resolução da estrutura, os dados anômalos foram utilizados como entrada no programa AutoSharp (Vonrhein et al., 2006). Os dados inicialmente são analisados

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pelo programa, que fornece estatísticas úteis sobre a qualidade dos dados e sinal anômalo presente. A próxima etapa consiste na busca pelas posições atômicas dos átomos pesados através da utilização de métodos diretos. A qualidade da solução encontrada é descrita através de uma variável denominada “Correlation Coefficient” (CC) (Fujinaga & Read, 1987). Valores de CC acima de 30 % (no caso de SAD) e um bom contraste entre a melhor solução e as restantes indicam que a solução encontrada pode estar correta. A escolha do número de sítios a serem procurados e do intervalo de resolução a ser utilizado podem ser críticas para o sucesso na determinação das posições dos espalhadores anômalos. Daí a importância da visualização através do indexamento pelo XDS do limite de resolução para o qual a razão sinal anômalo/ruído (I/Sigma) pode ser utilizável.

O programa autoSHARP refina as posições dos átomos pesados, ocupação dos sítios e, se necessário, os valores f’ e f” em 3 ciclos, onde então o cálculo das fases é realizado. A qualidade das fases pode ser medida através de parâmetros como “Figure of Merit (FOM)”. O programa determina automaticamente a estrutura baseada nas fases medidas através dos sítios dos espalhadores anômalos encontrados (Figura 25a). A sobreposição do modelo intermediário com o sítio ativo da proteína ExoU evidencia o correto encaixe de algumas fitas beta e hélices alfa, indicando que esse modelo intermediário poderia fornecer informações de fase suficientes para a resolução da estrutura (Figura 25b).

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Figura 25. Modelo gerado pelo programa Autosharp a partir das posições encontradas para os espalhadores anômalos. A) Modelo geral. B) Modelo geral (verde) em sobreposição ao domínio catalítico da proteína ExoU, demonstrando o correto posicionamento estrutural do modelo. As figuras foram geradas com o programa Pymol (De Lano Scientific)

Como os dados nativos apresentam maior resolução, a estratégia escolhida para resolução da estrutura da PAL18 foi a utilização das informações cristalográficas provenientes do cristal nativo à 2.14 Å e a utilização do modelo gerado através do AutoSharp como “doador” das fases, desse modo ao invés de utilizarmos as fases de uma proteína homóloga o que demanda grande consumo computacional, até que sejam encontradas as posiçoes ideais, as fases obtidas através do espalhamento anômalo dos átomos de selênio foram utilizadas para o processo de substituição molecular pelo programa PHASER. A tabela 3 mostra os dados cristalográficos para os cristais coletados no ESRF.

Tabela 3. Parâmetros de rede e estatística dos dados de difração do cristal nativo e derivado. Os valores entre parêntesis correspondem à camada de mais alta resolução.

O modelo gerado pela substituição molecular com resolução máxima de 2.14 Å e já com as fases incorporadas do cristal derivado foi utilizado pelo programa Autobuild para geração da estrutura da PAL18. Durante a construção do modelo os valores de R-factor e R-free foram monitorados. A figura 26 mostra a estrutura da PAL18 montada através do programa autobuild. A proteína cristalizou-se com duas moléculas na unidade assimétrica.

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Figura 26. Estrutura da unidade assímetrica da proteína PAL18. As duas moléculas são representadas por cores diferentes. As figuras foram geradas com o programa Pymol (De Lano Scientific)

As estatísticas após um ciclo de refinamento pelo programa REFMAC (CCP4) demonstram que o modelo condiz com os dados experimentais, R-factor= 0,2436, além disso o valor de R- free= 0.2823 mostra que não foram introduzidos nenhum tipo de viés à estrutura, o que poderia contribuir para uma falsa diminuição do valor do R-factor. A estrutura foi posteriormente refinada como descrito em metodologia. A tabela 4 apresenta os valores das estatísticas finais de refinamento.

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Tabela 4: Estatísticas do refinamento

A figura 27 mostra a semelhança estrutural no núcleo catalítico formado pela folha β central das proteínas PAL18 e ExoU. A presença de estruturas secundárias adicionais na estrutura completa da ExoU deve-se aos domínios e subdomínios extras presentes na proteína. Diferenças entre as estruturas da PAL18 e o domínio catalítico da ExoU ocorrem principalmente devido ao modo de ação de cada uma dessas proteínas. Enquanto a ExoU necessita de um cofator eucariótico para ser ativada, a PAL18 já encontra-se ativa no meio extracelular, além disso os diferentes sistemas de secreção utilizados por cada uma das proteínas pode contribuir para estruturas específicas em cada uma delas.

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Figura 27. Estruturas da PAL18 e ExoU. A estrutura do domínio catalítico da ExoU é apresentada em magenta no canto superior esquerdo. A estrutura da PAL18 é apresentada em verde no canto superior direito. Em baixo a sobreposição da estrutura da PAL18 (verde) e da ExoU: domínio fosfolipase em ciano, domínio de ponte em amarelo e domínio de ligação à membrana em vermelho. As figuras foram geradas com o programa Pymol (De Lano Scientific)

Além dos domínios extras da ExoU, a principal diferença notada entre as estruturas deve-se a presença de uma grande alfa hélice na PAL18 recobrindo a folha beta central. Tal hélice pode ser homóloga a grande alfa hélice que compõe o domínio de ligação à membrana da

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ExoU, desempenhando portanto um papel na interação com a membrana do hospedeiro, ou ainda pode conferir estabilidade ao núcleo catalítico o que explicaria a independência de cofatores eucarióticos para sua atividade fosfolipídica.

A figura 28a apresenta a estrutura da PAL18 indicando o N e C terminal. A figura 28b mostra o núcleo catalítico da PAL18, formado pela folha beta central circundada por alfa hélices que é conservado ao longo das fofolipases.

Figura 28: Estrutura da PAL18. A) Representação da PAL18 na ordem do arco-íris a partir do seu N-terminal (azul). B) Estrutura do núcleo catalítico conservado em serina hidrolases.

A serina mostrada na figura 29, juntamente com o resíduo conservado de ácido aspártico compõe a díade catalítica responsável pela ação fosfolipídica das proteínas tipo patatina.

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Figura 29. Sobreposição entre o núcleo catalítico das proteínas PAL18 e ExoU. PAL18 (verde) e ExoU (rosa), a Serina catalítica é mostrada em amarelo naPAL18 e vermelho na ExoU. As figuras foram geradas com o programa Pymol (De Lano Scientific)

Diferentemente do observado na estrutura da ExoU, onde o aspartato que compõe a díade catalítica Asp-Ser não foi observado devido a flexibilidade desta região, o resíduo é observável na estrutura da PAL18 como mostrado na figura 30.

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Figura 30. Díade catalítica formada pelos resíduos Ser60-Asp207 na PAL18. O aspartato conservado surge ao fim de uma fita beta e faz contato com o resíduo de serina conservado no loop de uma fita beta que conecta uma alfa hélice para formar a díade catalítica. As figuras foram geradas com o programa Pymol (De Lano Scientific)

A presença do aspartato na estrutura da PAL18 mostra que a região, diferentemente, da ExoU não é flexível por ter sua densidade eletrônica traçada. Isso explica o fato da PlpD apresentar atividade fosfolipídica já no meio extracelular (Salacha et al., 2010)

Tal como observado através da predição de estrutura terciária realizado por SALACHA et al., 2010 a díade catalítica aparece frente a frente envolta por um arcabouço formado pelos demais blocos conservados em patatinas (Figura 31).

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Figura 31. Disposição dos blocos conservados de patatinas na estrutura da PAL18. Os resíduos que compõe a díade catalítica são envoltos pelo arcabouço formado pelos blocos conservados em patatinas. Em preto os resíduos de Asp e Ser. O bloco 1 é mostrado em vermelho. O bloco 2 é mostrado em laranja. O bloco 3 é mostrado em amarelo. O bloco 4 é mostrado em violeta. As figuras foram geradas com o programa Pymol (De Lano Scientific)

Os resíduos conservados de glicina e a arginina que compõe o Bloco 1 em proteínas do tipo patatina são dispostos na estrutura da PAL18 como mostrado na figura 32. A cavidade oxiânion formada por esses resíduos constitui uma parte muito importante de algumas classes de enzimas, sobretudo das lipases e proteases, estabilizando o oxiânion formado durante o ataque nucleofílico da serina sobre o grupo carbonila do substrato. (Cyger & Schrag, 1999; Pleiss et al., 1998). Algumas lipases não pertencentes à família das patatinas, apresentam uma tampa hidrofóbica que recobre o sítio ativo e que quando deslocada, durante a interação com o substrato, gera uma região eletrofílica que funciona como a cavidade oxiânion, diferentemente do que ocorre nas estruturas das patatinas, essas enzimas apresentam um oxiânion transitório dependente da interação ao substrato (JAEGER et al., 1999)

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Figura 32. Díade catalítica e oxiânion das proteínas PAL18 e ExoU. A esquerda representado em verde a estrutura da PAL18 com a díade catalítica formada pela Serina nucleofílica em amarelo e o Aspartato em vermelho, o oxiânion é composto pelos resíduos conservados de glicina (azul claro) e arginina (azul escuro). A direita representado em magenta a estrutura da ExoU com a serina nucleofilíca em amarelo e o oxiânion composto pelos resíduos conservados de glicina (azul claro) e (lisina azul escuro). As figuras foram geradas com o programa Pymol (De Lano Scientific)

O resíduo básico arginina na PAL18 ou lisna na ExoU, que atua como oxiânion, apresentam posições diferentes entre as duas estruturas, enquanto o primeiro encontra-se no começo de uma alfa hélice, o segundo encontra-se em uma região de loop. Essa diferença pode fornecer informações sobre o posicionamento do substrato em cada proteína. Por apresentar o resíduo em uma região de loop a ExoU pode ser mais promíscua em relação ao posicionamento do substrato enquanto que a PAL18 provavelmente é ativa em uma determinada posição em relação ao substrato lipídico. A presença do aspartato catalítico em uma região flexível na ExoU também suporta essa hipótese.

A sequência compreendendo o resíduo Q88 até V131 está desordenada no modelo e assim sua construção não foi possível. A figura 33b mostra a posição dos resíduos terminais Q88 e V131. Essa sequência de 43 resíduos provavelmente forme uma região flexível. A possibilidade de desempenhar papel durante o reconhecimento do substrato pode ser testada através de ensaios de atividade com construções mutadas para essa sequência ou ainda através da determinação da estrutura da PAL18 em presença do substrato.

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Em lipases humanas e bacterianas é observado uma tampa flexivel (Figura 33a) que regula o acesso ao sítio catalítico dessas enzimas. A figura 33 mostra a posição dos residuos terminais que provavelmente formem essa tampa na PAL18 e na lipase de Bacillus sp.

Figura 33. Resíduos terminais da sequência não construida na estrutura da PAL18. A) Lipase de Bacillus sp, a tampa é mostrada em marrom escuro. B) Os resíduos terminais Q88 e V131 da sequência flexível da PAL18 são mostrados em vermelho, os resíduos que compõe a díade catalítica são mostrados em azul e a linha tracejada representa a provavel conformação da região flexível. Figura adaptada de Rengachari et al., 2012

A presença de grande quantidade de loops ao redor do sítio catalítico, assim como a região desordenada entre os resíduos Q88 e V131 podem ser importantes para o reconhecimento e interação do sítio ativo com a interface água-lipídeo, assim como ocorre com as lipases não pertencentes a família das patatinas, como a lipase pancreática humana, que apresenta uma tampa hidrofóbica recobrindo o sítio ativo, e que somente ao ser deslocada por outra molécula hidrofóbica ocorre a exposição desse sítio (ALOULOU et al., 2006). A figura 34 evidência o processo de regulação do acesso ao sítio ativo de lipases bacteriana e humana, além da PAL18.

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Figura 34: Regulação ao sítio catalítico. Os sítios catalíticos são apresentados em azul para todas as enzimas. A) Lipase de Bacillus sp. A tampa (rosa) apresenta-se na sua conformação aberta. B) Lipase de Bacillus sp. após 100ns de dinâmica molecular em solvente água, mostrando a conformação fechada da tampa (rosa). C) Lipase humana com a tampa (verde) assumindo sua conformação aberta. D) Lipase humana com a tampa (verde) assumindo sua conformação fechada. E) Visão superficial da PAL18. Figura adaptada de Rengachari et al., 2012.

A partir da observação das outras lipases e da exposição do sítio catalítico na superfície da PAL18 nós acreditamos que a tampa recubra a região indicada em azul na figura Xe de modo a regular o acesso do substrato ao sítio catalítico.

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