OCORRÊNCIA E SENSIBILIDADE MICROBIANA DE LINHAGENS DE
Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICAS ISOLADAS DE PROPRIEDADES
LEITEIRAS NA REGIÃO DE RIBEIRÃO PRETO-SP, BRASIL
Ariel Eurides Stella1
Everlon Cid Rigobelo1
Ana Claudia de Oliveira1
Renato Pariz Maluta1
José Moacir Marin3
Fernando Antônio de Ávila2
RESUMO
Foram colhidas 19 amostras de água, sete amostras de leite dos tanques de expansão e 466 amostras de fezes de bovinos leiteiros de sete propriedades, da região de Ribeirão Preto-SP, com o objetivo de caracterizar os principais sorogrupos de Escherichia coli enteropatogênicas (EPEC), bem como o perfil de sensibilidade das linhagens a 13 antimicrobianos. Oitenta e oito estirpes foram caracterizadas como sorogrupos EPEC distribuídas em nove sorogrupos distintos, dos quais os mais comuns foram: O158 e O55. Entre as linhagens também foi determinada a freqüência do sorogrupo O157. Uma maior variedade de sorogrupos foi encontrada nos animais adultos (vacas), ao passo que nos animais jovens (bezerros), a variação de sorogrupos foi menor. O sorogrupo O157 apenas foi encontrado entre os bezerros. Duas destas cepas (0,43%) foram confirmadas como sorotipo O157:H7. As cepas de E. coli apresentaram resistência frente à penicilina G (100%) e novobiocina (100%), e foram sensíveis aos antibióticos: cloranfenicol (96,6%) e gentamicina (89,8%). Todas as cepas analisadas apresentaram resistência a mais de um dos antimicrobianos testados.
Palavras-chave: resistência a antimicrobianos, bovinos leiteiros, Escherichia coli, EPEC, O157:H7.
OCCURRENCE AND MICROBIAL SENSIBILITY OF STRAINS ENTEROPATHOGENIC Escherichia coli ISOLATED FROM DAIRY FARMS OF
THE REGION OF RIBEIRÃO PRETO-SP, BRAZIL ABSTRACT
In this study 19 water samples, 7 bulk-milk samples and 466 stools of dairy cattle from seven dairy farms from the region of Ribeirão Preto-SP were collected, in order to characterize the serogroups of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) as well as the susceptibility to 13 antimicrobials. Eigthy-eight strains (20%) were characterizated in EPEC serogroups, showing nine distinct serogroups of which the most frequents were: O158 and O55. The frequency of
E. coli O157 among the samples was also determined. The higher diversity of serogroups was
detected in adult animals (cows), while in the young animals (calves) the variation was more
1 Programa de P.ós-graduação em Microbiologia Agropecuária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias-UNESP, Via de Acesso Prof. Paulo Donatto Castellane, s/n, CEP 14884-900, Laboratório de Microbiologia Veterinária, Jaboticabal-SP. E-mail: ariel.vet@gmail.com (Autor para correspondência).
2 Professor titular do Departamento de Patologia Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias-UNESP.
3 Professor Assistente Doutor do Departamento de Morfologia, Estomatologia e Fisiologia – Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP.
restricted. The O157 serogroup was found only among calves. Two isolates (0,43%) were confirmed as serotype O157:H7. The E. coli strains showed resistance to penicillin (100%) and novobiocin (100%); while sensitivity was observed to chloramphenicol (96,6%) and gentamycin (89,8%). All the isolates showed resistance to more than one of antimicrobial drug tested.
Key words: antimicrobial resistance, dairy cattle, E. coli, EPEC, O157:H7.
OCURRENCIA Y SENSIBILIDAD MICROBIANA DE LINAJES Escherichia
coli ENTEROPATOGENICAS AISLADAS DE PROPRIEDADES LECHERAS EN LA
REGIÓN DE RIBEIRÃO PRETO – SP, BRASIL RESUMEN
Fueron recogidas 19 muestras de agua, siete muestras de leche de conjunto y 466 muestras de heces de bovino de siete propiedades, de la región de Ribeirão Preto, con el objetivo de caracterizar los principales suerogrupos de Escherichia coli enteropatogenicas (EPEC), así como la sensibilidad microbiana de linaje para 13 antimicrobianos. Ochenta y ocho linajes fueron caracterizadas como suerogrupos O158 y O55. Entre los linajes también fueron determinadas la frecuencia del suerogrupo O157. Una gran variedad de suerogrupos fueron encontrados en los animales adultos (vacas), a diferencia de los más jóvenes (becerros), donde la variación de suerogrupos fuera más pequeña. El suerogrupo O157 fuera encontrado solamente entre los becerros. Dos de estas cepas (0,43%) fueron corroboradas como suerotipo O157:H7. Las cepas de E. coli presentaron resistencia frente la penicilina G (100%) y novobiocina (100%), y fueron sensibles a los antibióticos cloranfenicol (96,6%) y gentamicina (89,8%). Todas las cepas analizadas presentaron resistencia a más de uno de los antimicrobianos comprobados.
Palabras-clave: resistencia a los antimicrobianos, bovinos lecheros, Escherichia coli, EPEC, O157:H7.
INTRODUÇÃO
Escherichia coli (E. coli) shiga toxigênica produz uma ou mais toxinas (Stx1 e Stx2),
sendo o seu representante mais conhecido o sorotipo O157:H7. Este sorotipo é reconhecido como principal causa da Síndrome Urêmica Hemolítica (SUH) na América do Norte e Austrália, também associado à colite hemorrágica e trombocitopenia (BOOP et al., 1999; HORNITZKY, 2000). O primeiro isolamento confirmado de E. coli O157:H7 foi realizado em 1975, nos EUA, de uma mulher com diarréia sanguinolenta (DOYLE et al., 1997).
Embora grande variedade de alimentos tenham sido associados às doenças causadas pela E.coli O157:H7, a maioria dos surtos ocorreram pelo consumo de alimentos crus ou mal cozidos de origem bovina (DOYLE et al., 1997). PRUIMBOOM-BREES et al. (2000) sugerem que a falta de receptores vasculares para a toxina Shiga, poderia justificar o fato de os bovinos serem reservatórios tolerantes de E. coli O157:H7.
Leite cru também foi confirmado como fonte de E. coli O157 nos EUA (MARTIN et al., 1986; WELLS et al., 1991 e KEENE et al., 1997), no Reino Unido (CHAPMAN et al. , 1993 & KIRK et al., 1997) e Finlândia (LAHTI et al., 2002) resultando em casos de colite hemorrágica (CH) e SUH. E. coli O157:H7 se mostrou hábil em penetrar nas células epiteliais da glândula mamária de bovinos, podendo assim contaminar o leite, transformando a glândula em um reservatório para este microrganismo e facilitando a sua posterior
disseminação para o ambiente (MATTHEWS et al. , 1997). Vários surtos e casos esporádicos
de doença causada em humanos por E. coli O157:H7, O157: -H (não móvel) e outros isolados
não identificados para o antígeno H oriundos de fazendas leiteiras, alertam para o papel do leite cru como um importante veículo de transmissão (REITSMA & HENNING, 1996).
Doyle et al. (1997) relatam que entre 1982 e 1994, 68 surtos foram causados por E.
coli O157:H7, tendo como vias de transmissão mais freqüentes a carne bovina (32,4%), a
água (4,4%) e o leite cru (2,9%). O controle de qualidade na indústria láctea é de fundamental importância, pois segundo Katic e Randenkov (1998), E. coli O157:H7 pode manter-se viável
em leite pasteurizado, contaminado artificialmente, a uma temperatura de 70C ou 200C, por
mais de 21 dias (MASSA et al., 1999).
Nos EUA, a taxa de prevalência da E. coli O157:H7 varia de 0,2% a 8,4% em vacas, 1,6% a 3,0% em novilhas e 0,4 a 40% em bezerros (2 a 24 meses) (HUSSEIN & SAKUMA, 2005). A fonte de E. coli O157:H7 para os bovinos ainda não foi definitivamente identificada. Assim, possíveis fontes incluem alimentos ou água contaminados, bovinos já colonizados por esta bactéria no rebanho, animais silvestres, humanos contaminados ou instalações e equipamentos contaminados pelas fezes dos animais (DOYLE et al., 1997).
E. coli enteropatogênicas causam uma síndrome caracterizada por diarréia líquida, vômito e febre em crianças e neonatos. O aspecto clínico da doença varia de diarréia limitada a uma forte síndrome de enterite crônica (NATARO e LEVINE, 1994). No Brasil, as linhagens EPEC representam um dos principais microrganismos responsáveis por quadros de diarréia em crianças de até um ano de idade (GOMES et al., 1991), tendo sido isoladas de alimentos e produtos lácteos (SILVA et al., 2001).
A maioria dos genes de resistência aos antimicrobianos estão localizados em estruturas denominadas plasmídeos, descritas no final da década de 50. NAKANO et al. (1988) detectaram a sua presença nas enterobactérias patogênicas como Salmonella sp, e E. coli presentes na microbiota intestinal de vacas. Os plasmídios que contêm gene para resistência aos antimicrobianos (fator R) são responsáveis pela resistência adquirida a diversos antibióticos e quimioterápicos, e pela ocorrência de estirpes multi-resistentes. O uso indevido de antimicrobianos aumenta a pressão seletiva para estirpes multi-resistentes, limitando a efetividade dos protocolos terapêuticos (FRANKLIN, 1999).
O presente estudo objetivou determinar a ocorrência dos principais sorogrupos de EPEC, determinar o perfil de sensibilidade das linhagens frente a 13 antimicrobianos, bem como verificar a presença de estirpes do sorotipo O157:H7 em amostras de fezes de bovinos adultos e jovens, leite e água.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram selecionadas aleatoriamente sete propriedades leiteiras da região de Ribeirão Preto-SP. Nestas propriedades foram colhidas durante o período de janeiro a junho de 2005, 466 amostras de fezes (311 amostras de vacas e 155 de bezerros), 19 amostras de água e sete amostras de leite, num total de 492 amostras.
Para o isolamento de E. coli, as amostras de água, leite e fezes foram semeadas diretamente em ágar MacConkey (incubação por 24 - 48 horas, em aerobiose, a temperatura
de 370C). As colônias suspeitas (três colônias de cada placa) foram identificadas
bioquimicamente como pertencentes à espécie E. coli com base nos testes de fermentação da
lactose, produção de gás sulfídrico (H2S), produção de indol, reações de vermelho de metila e
de Voges-Proskauer, utilização de citrato e produção de uréase (KONEMAN, et al. 2001). Em seguida, todas as linhagens de E. coli identificadas foram semeadas em placas de ágar
MacConkey Sorbitol, e incubadas por 24 h, em anaerobiose, a 370C (KONEMAN, et al.
anti-soro1 para sorogrupos EPEC segundo as instruções do fabricante. As estirpes sorbitol-negativas no agar MacConkey sorbitol foram submetidas ao teste de aglutinação em lâmina,
com anti-soro específico O1572. As amostras positivas foram enviadas ao Instituto Adolfo
Lutz em São Paulo-SP para confirmação do sorogrupo e determinação do antígeno flagelar H7.
Para a realização dos testes de sensibilidade aos antimicrobianos as linhagens de E.
coli foram semeadas em placas contendo agar Müeller Hinton, incubadas a 370C por 18 a 20 horas, segundo recomendação do NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (2000). Os antimicrobianos utilizados foram: ampicilina (10µg), cefalotina (30µg), cloranfenicol (30µg), enrofloxacina (5µg), eritromicina (15µg), estreptomicina (10µg), gentamicina (10µg), neomicina (30µg), novobiocina (30µg), penicilina (10U), sulfametrim (25µg), tetraciclina (30µg) e trimetoprim (5µg).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
E. coli foi isolada de 430 amostras de fezes (287 amostras de vacas e 143 amostras de
bezerros), cinco amostras de leite e sete amostras de água. Todos os isolados de E. coli (442), foram cultivados em ágar MacConkey sorbitol. Destes, 40 (17,7%) se mostraram sorbitol-negativos, dos quais quatro (10%) reagiram ao teste de aglutinação em lâmina com anti-soro O157. Destas duas foram confirmadas como O157:H7, isoladas de bezerros.
Do total de amostras com isolamento de E. coli, 88 (20%) foram caracterizadas em nove diferentes sorogrupos específicos EPEC (Tabela 1). O sorogrupo O157 foi identificado em quatro (0,9%) amostras de fezes, de uma mesma propriedade, resultado similar ao obtido por Vold et al. (1998) e Hancock (1997), utilizando separação imunomagnética e PCR, que revelou uma prevalência de 1%. Diferentes sorogrupos foram encontrados nas vacas (O158, O55, O142, O26, O125, O126 e O111). Contrariamente nos bezerros, a variação de sorogrupos foi menor (O157, O55, O125, O158 e O142). O sorogrupo O157 foi identificado somente em bezerros (Tabela 1). Estes dados estão de acordo com Wells et al. (1991) que descreveram E. coli O157 mais freqüentemente em animais jovens.
No Estado do Rio de Janeiro, Cerqueira et al. (1999) obtiveram três linhagens (1,5%) do sorotipo O157:H7, isoladas das fezes de bovinos leiteiros e de corte em abatedouro. No Estado de São Paulo, Irino et al. (2005) encontraram 0,6% de E. coli O157:H7 nas fezes de bovinos leiteiros jovens. No presente estudo, também no Estado de São Paulo, duas estirpes de E. coli O157:H7 foram isoladas de bezerros, de uma mesma propriedade, obtendo-se freqüência de 1,3% nesta categoria animal .
Na Argentina, Chinen et al. (2003) obtiveram 0,5% de prevalência de E. coli O157:H7 em 422 amostras de fezes de bezerros. Mechie et al. (1997), utilizando enriquecimento e separação imunomagnética (IMS), identificaram 4,3% de amostras de fezes positivas para E. coli O157:H7 em rebanho leiteiro. Hussein e Sakuma (2005) relataram que as taxas de prevalências, de E. coli O157:H7, variaram de 0,2% a 8,4% em vacas, entre 1,6% a 3,0% em novilhas e 0,4% a 40% em bezerros.
Boop et al. (1999) relataram que com a utilização da IMS há maior isolamento de STEC do sorogrupo O157. A variação nas freqüências observadas nos vários estudos é em parte decorrente de diferentes técnicas utilizadas para o isolamento de E. coli O157:H7 (ARMSTRONG et al., 1996).
1 Anti-soros O26, O55, O111, O119, O114, O125, O142, O158, O86, O126, O127 e O128. Probac do Brasil Produtos Bacteriológicos Ltda. São Paulo-SP.
Besser et al. (2001) descreveram que os bovinos são reservatórios de E. coli O157:H7, e que alimentos de origem bovina contaminados são importantes vias de transmissão do microrganismo para o homem, ressaltando o impacto do presente estudo, em virtude dos riscos em saúde pública do sorotipo O157:H7 de E. coli.
Tabela 1. Sorogrupos de linhagens enteropatogênicas de E. coli isoladas em sete propriedades leiteiras na região de Ribeirão Preto-SP, no período de janeiro a junho de 2005.
Categoria Sorogrupos Número de Amostras Positivas
Vacas Bezerros Leite Água O158 O55 O142 O114 O26 O125 O126 O111 O157 O55 O125 O158 O142 O158 O55 25 20 10 8 6 4 2 1 4 3 1 1 1 1 1
Os sorogrupos de EPEC mais freqüentes foram O158 e O55. Alguns sorogrupos identificados (O55, O26, O125 e O142), coincidem com sorogrupos isolados de fezes diarréicas de crianças na região de Ribeirão Preto - SP (MEDEIROS, 1999), enfatizando o possível papel da contaminação ambiental pelos bovinos e sua relação com a saúde pública. Entre os sorogrupos estudados o O55 foi o segundo mais freqüente (Tabela 1), considerado um dos mais importantes sorogrupos de EPEC, devido a sua freqüência de isolamento e pela sua estreita relação com diarréia em crianças (GOMES et al. 1989).
Pelayo e Falcão (1989) analisaram 59 amostras de leite cru "tipo C" e identificaram EPEC clássicas em 15,3% da amostragem, pertencentes aos sorogrupos O55, O114, O125 e O142.
Das linhagens de E. coli isoladas da água, o sorogrupo O55 foi identificado em uma amostra. Dentre as amostras de leite foi identificado o sorogrupo O158. Os sorogrupos identificados na água e no leite correspondem aos sorogrupos de EPEC mais freqüentes nas amostras de fezes, decorrente, provavelmente, da capacidade de contaminação cruzada da água e produtos de origem animal, pelas fezes de bovinos.
Na Figura 1 pode-se observar que as linhagens de E. coli apresentaram resistência aos antimicrobianos penicilina G (100%) e novobiocina (100%), e foram sensíveis ao cloranfenicol (96,6%) e a gentamicina (89,8%). Baptista (2005) avaliou a resistência de linhagens de E. coli isoladas de fezes de bezerros diarréicos e vacas com mastite em Ituverava
– SP, a tetraciclina e o trimetoprim revelaram taxas de resistência semelhantes às encontradas no presente estudo. Entretanto, a resistência das linhagens à ampicilina (24%) foi menor que a encontrada no presente trabalho (73,9%). Todas as linhagens de E.coli estudadas foram resistentes a três ou mais drogas pertencentes a diferentes grupos de antimicrobianos. A ocorrência de multirresistência observada é preocupante quando comparada aos resultados de Lazaro et al. (1994), que obtiveram 45,8% de resistência múltipla em E. coli. Entretanto, Medeiros (1999) também encontrou alta taxa de multirresistência em E. coli isoladas de diarréia em crianças na região de Ribeirão Preto – SP (98,74%). A alta multirresistência possivelmente deve-se à presença de plasmídeos portando genes de resistência (NAKANO et al., 1988) e/ou decorrente do uso indiscriminado dessas drogas na terapêutica de rotina dos animais.
AMP: Ampicilina, Ampicillin; CEF: Cefalotina, Cefalotyne; CLO: Cloranfenicol, Chloramphenicol; ENO: Enrofloxacina, Enrofloxacyne; EST: Estreptomicina, Streptomycin; ERI: Eritromicina, Erythromycin; GEN: Gentamicina, Gentamicin; NEO: Neomicina, Neomycin; NOV: Novobiocina, Novobiocina; PEN: Penicilina, Penicillin; SZT: Sulfatiazina, Sulfatiazin; TET: Tetraciclina, Tetracycline; TRI: Trimetoprim, Trimetropim.
Figura 1. Percentagem de resistência das 88 cepas EPEC. CONCLUSÃO
Neste estudo foram detectadas 88 cepas EPEC provenientes de amostras de água, leite de conjunto e fezes de bovinos, coletadas em sete propriedades leiteiras, e distribuídas em nove sorogrupos distintos. Também foram isoladas duas cepas O157:H7 provenientes de fezes de bezerros. Como as fezes bovinas representam uma importante fonte de contaminação ambiental por EPEC, devido à possível transmissão destes agentes aos humanos, são necessárias medidas de controle e contenção dos níveis de contaminação nas propriedades e nos produtos de origem animal. O elevado índice de multiresistência encontrado entre as linhagens analisadas é bastante preocupante e exige uma normatização para garantir uma utilização mais racional das drogas antimicrobianas.
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AGRADECIMENTOS
À FAPESP pelo auxílio financeiro ao trabalho, à CAPES pela bolsa de mestrado concedida e ao Instituto Adolfo Lutz de São Paulo-SP.
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Recebido em: 19/03/2007 Aceito em: 12/06/2007
