José Marcos Sanches Junior

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL

José Marcos Sanches Junior

AVALIAÇÃO DO PAPEL DA PROTEÍNA ANTI-INFLAMATÓRIA

ANEXINA A1 NA REGULAÇÃO DO INFLAMASSOMA NLRP3 E NAS

INFECÇÕES POR CANDIDA ALBICANS E CANDIDA AURIS:

ESTUDO IN VITRO E CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL LIPIDÔMICO

São Paulo 2020

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional, da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.

José Marcos Sanches Junior

AVALIAÇÃO DO PAPEL DA PROTEÍNA ANTI-INFLAMATÓRIA

ANEXINA A1 NA REGULAÇÃO DO INFLAMASSOMA NLRP3 E NAS

INFECÇÕES POR CANDIDA ALBICANS E CANDIDA AURIS:

ESTUDO IN VITRO E CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL LIPIDÔMICO

São Paulo 2020

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional, da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.

Sanches Junior, José Marcos

Avaliação do papel da proteína anti-inflamatória Anexina A1 na regulação do Inflamassoma NLRP3 e nas infecções por Candida Albicans e Candida Auris: estudo in vitro e caracterização do perfil lipidômico / José Marcos Sanches Junior. – São Paulo, 2020. xix, 101f.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Biologia Estrutural e Funcional.

Título em inglês: Evaluation of the role of Anexin A1

anti-inflammatory protein in the regulation of NLRP3 Inflammasome and in the infections by Candida Albicans and Candida Auris: in vitro study and lipidomics profile characterization

1. Ac2-26. 2. Inflamação. 3. Lipidômica. 4. Macrófago. 5. Neutrófilo. 6. Nigericina.

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL

Chefe do departamento: Profa. Dra. Sandra Maria Miraglia Valdeolivas

iv

José Marcos Sanches Junior

Avaliação do papel da proteína anti-inflamatória anexina A1 na regulação do inflamassoma NLRP3 e nas infecções por Candida albicans e Candida auris:

estudo in vitro e caracterização do perfil lipidômico

Orientadora: Profa. Dra. Cristiane Damas Gil

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública realizada a ________/_________/_________, considerou o candidato:

( ) Aprovado ( ) Reprovado Membro titular Nome: ... Instituição: ... Assinatura: ... Membro titular Nome: ... Instituição: ... Assinatura: ... Membro titular Nome: ... Instituição: ... Assinatura: ... Membro titular Nome: ... Instituição: ... Assinatura: ... Presidente da banca Nome: ... Instituição: ... Assinatura: ...

v

Dedicatória

Dedico à vida.

À vida e suas vicissitudes. A ela que, a cada despertar, renova-nos a coragem da luta e nos estimula a buscarmos,

dentro de uma imensidade de possibilidades, a melhor versão de nós.

À vida e suas delícias, suas dores,

felicidade e sofrimento que nos fortalecem.

À vida-escola que nos ensina o certo e o errado no decorrer de caminhos ora suaves, ora tortuosos.

À vida e suas surpresas, suas contradições,

sua incomensurável capacidade de nos emocionar. Do riso ao pranto, da queda à ascensão,

nada é vão. Nem o erro é desperdício.

À vida e seus diferentes pontos de vista,

por meios dos quais podemos ressignificar tudo.

vi

Agradecimentos

À Deus, meus Orixás e meus guias espirituais, pela força e dedicação, coragem para vencer qualquer obstáculo e ter determinação para alcançar meus objetivos. Agradeço a Ele que me proporciona a garra de viver cada dia com a alegria de ter um dia melhor que o outro e a luz recebida todos os dias.

Em especial, à minha querida orientadora, que neste período me ensinou a arte da ciência, a ter o brilho nos olhos a cada passo que dei, a ter respeito, e ser uma pessoa mais centrada e determinada. Agradeço imensamente à Professora Cristiane, pelos ensinamentos e por ser essa pessoa maravilhosa, amiga e mãe. Agradeço pelo seu respeito, sua paciência e carinho. Agradeço pelas inúmeras possibilidades e por me fazer buscar o meu melhor nesta caminhada, me fazendo enxergar sempre o lado bom das coisas e acreditar que sempre é possível quando há esforço e dedicação. Agradeço à Deus por ter me colocado ao seu lado, Cris, e poder aprender e crescer como profissional e pessoa. Obrigado, muito obrigado por tudo Cris.

Ao nosso grupo de trabalho, em especial, Izabella, Rebeca, Vivian e Mab com quem pude dividir momentos difíceis e alegrias, mais risadas do que angústias. Obrigado meninas, vocês são mais que especiais.

Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da UNIFESP, que me possibilitou inúmeras possibilidades de aprendizado. Pela viabilização e apoio que tive para estar presente no Congresso Internacional “Annexins 2019” na cidade de Münster, Alemanha. Ao Nilton Camillo, que com muita disposição e atenção, sempre me ajudou em todos os trâmites do doutorado. À coordenadora do Programa, Profa. Dra. Sintia Belangero e, mais recentemente, Profa. Dra. Isabel Céspedes.

Ao CEDEME, pelo fornecimento dos animais utilizados para realização deste trabalho.

vii

À Profa. Dra. Karina Bortoluci, que abriu as portas do CTCmol para o desenvolvimento deste projeto e pela sua colaboração nos trabalhos com o inflamassoma NLRP3.

À Laura Branco, com quem tive o prazer de trabalhar e aprender todo o protocolo para ativação do inflamassoma NLRP3. Obrigado pela paciência e dedicação.

Às Profas. Dras. Vanessa Moreira, do Departamento de Farmacologia da UNIFESP, e Sonia Oliani, da UNESP e do Programa de Pós-Graduação da UNIFESP, pela colaboração para o desenvolvimento deste trabalho.

À equipe do Laboratório Multidisciplinar da Universidade São Francisco, pela colaboração com os experimentos de lipidômica, especialmente à Profa. Dra. Patrícia Carvalho, Dra. Anna Fernandes e Gustavo Duarte.

Ao Prof. Dr Arnaldo Colombo do Laboratório de Micologia da UNIFESP, pela parceria e colaboração e, em especial à Luana Rossato, pelos ensinamentos, parceria, paciência e dedicação.

Aos meus amigos de longa data, Karolayne e André, que mesmo de longe acompanham minha trajetória e torcem pelo meu sucesso.

À minha grande amiga Renata, que acompanhou todos os passos desta trajetória. A ela que esteve ao meu lado sempre que precisei, seja rindo ou chorando, na religião e na loucura. Obrigado Renata por ser essa pessoa maravilhosa, por essa energia incrível e amizade, amizade esta que vai além desta vida.

Ao meu amigo Everton, a quem esteve presente neste último ano, me ajudando nas questões espirituais, sendo amigo e conselheiro sempre, dividindo risadas e angústias.

A todos que de alguma forma estiveram presentes e torceram para que eu chegasse até aqui.

viii

À minha cachorra Babú, que dividiu comigo os momentos finais deste trabalho, pela parceira, lealdade, amizade.

Especialmente agradeço imensamente as mulheres da minha vida: Mãe, Vó, minhas irmãs Fabiane e Fernanda, minhas sobrinhas lindas Maria Clara e Carolina. Sou muito grato por Deus ter colocado vocês na minha vida e me fazer ser a pessoa que sou hoje. De alguma forma todas vocês colaboraram para que eu chegasse até aqui e fico muito feliz em poder contar com cada uma de vocês, sempre com amor e dedicação. A todos amigos e familiares que sempre confiaram e torceram pela minha felicidade e sucesso.

Agradeço ao meu falecido pai, homem trabalhador, professor, empresário, visionário e que amou sua família. Obrigado pelo pouco que tive do senhor, mas este pouco me fez crescer e me tornar o homem que sou hoje.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo custeio da minha bolsa de estudo para o Doutorado no período de dezembro de 2017 até julho de 2020.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), por viabilizar financeiramente os insumos deste trabalho.

ix SUMÁRIO

Dedicatória ... v

Agradecimentos ... vi

Lista de Figuras ... x

Lista de Tabelas ... xii

Lista de siglas, símbolos e abreviaturas ... xiii

RESUMO... xvi

ABSTRACT ...xvii

1 INTRODUÇÃO ... 1

1.1 Resposta inflamatória e inflamassomas ... 1

1.2 Anexina A1 ... 10

1.3 Infecções por Candida albicans e Candida auris ... 15

1.4 Mediadores lipídicos e lipidômica ... 19

2 JUSTIFICATIVA ... 23

3 OBJETIVOS ... 24

3.1 Objetivo geral ... 24

3.2 Objetivos específicos... 24

4. RESULTADOS ... 25

4.1 Artigo publicado na Cells ... 26

4.2 Artigo submetido ... 42

4.3 Artigo Submetido ... 67

5. CONCLUSÃO ... 90

REFERÊNCIAS ... 92 Anexos ... Anexo A – Aprovação do CEUA ...

x

Lista de Figuras

Figura 1. Esquema do processo de recrutamento e migração de leucócitos

para o sítio de inflamação... 2

Figura 2. Domínios estruturais dos TLRs. LLR: leucine rich repeats; TM: transmembrana; TIR: Toll-IL-1 receptor………. 4

Figura 3. Domínios estruturais dos NLRs, AIM2 e da proteína adaptadora ASC... 5

Figura 4. Ativação do NLRP3. PAMPs virais ou bacterianos ou DAMPs ativam a via do inflamassoma pela ativação do TLR induzindo a ativação do NFκB e expressão do NLRP3 e da pró-IL-1β (sinal 1)... 8

Figura 5. Esquema repre22sentativo da morte celular por piroptse mediada por GSDMD. 9 Figura 6. Estrutura molecular da proteína Anexina A1... 10

Figura 7. Biossíntese da proteína anexina A1... 11

Figura 8. Morfologias da C. albicans... 17

Figura 9. Morfologia da C. auris... 18

Figura 10. Principais fosfolipídios das biomembranas... 20

Figura 11. Via da piroptose e produção de lipídios mediadores... 21

Figura 12. Lack of endogenous Annexin A1 (AnxA1) produced a marked release of IL-1β in macrophages. (Figura 1 do artigo 4.1)………….. 31

Figura 13. Lack of endogenous AnxA1 increased NLRP3 levels in nigericin-stimulated macrophages. (Figura 2 do artigo 4.1)……… 32

Figura 14. Nigericin-stimulated WT macrophages increase AnxA1 endogenous levels. (Figura 3 do artigo 4.1)……….. 33

Figura 15. Principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLSDA) score plots of the lipid fraction. (Figura 4 do artigo 4.1)……….. 34

Figura 16. Lipidomic analysis of WT and AnxA1-/- macrophage supernatants. (Figura 5 do artigo 4.1)……….. ₃₅

Figura 17. NLRP3 inflammasome activation in WT and AnxA1-/- neutrophils. (Figura 1 do artigo 4.2)……….. 52

xi

Figura 18. Expression of NLRP3 in WT and AnxA1-/- nigericin-stimulated neutrophils. (Figura 2 do artigo 4.2)……… ₅₃ Figura 19. Lipidomic analysis of WT and AnxA1-/- neutrophils supernatants.

(Figura 3 do artigo 4.2)………. ₅₅ Figura 20. WT and AnxA1-/- neutrophils show similar Candida spp.

phagocytosis index. (Figura 1 do artigo 4.3)………. ₇₆ Figura 21. AnxA1-deficient neutrophils exhibited enhanced inflammatory

response. (Figura 2 do artigo 4.3)………... ₇₇ Figura 22. Lipidomic analysis of supernatants from WT and AnxA1

-/-neutrophils after C. albicans and C. auris coculture. (Figura 3 do artigo 4.3)... ₇₉

xii

Lista de Tabelas

Tabela 1. Statistical and chemical data of differential features (Tabela 1 do artigo 4.2)... 75

xiii

Lista de siglas, símbolos e abreviaturas

µg - micrograma µM - micromolar

ABC – do inglês, ATP-binding cassete transporter Ac1-26 - peptídeo mimético da proteína anenixa A1

Ac2-26 – peptídeo mimético da proteína anenixa A1

Ac2-7 - peptídeo mimético da proteína anenixa A1

Ac9-25 - peptídeo mimético da proteína anenixa A1

AIM - do inglês, absent in melanoma

AMD – degeneração macular associada à idade ANOVA - do inglês, analysis of variance

AnxA1 – proteína anexina A1 AnxA1-/- - anexina A1 nocaute

AnxA12-50 - peptídeo mimético da proteína anexina A1

ASC - do inglês, apotosis-associated speck-like protein containing a CARD ATCC – do inglês, American Type Culture Collection

ATP - do inglês, adenosine triphosphate

BIR - do inglês, Baculovirus inhibitor of apoptosis protein repeat Ca2+ - Cálcio

CARD - do inglês, caspase activating and recruitment domain CD – células dendríticas

Cer – ceramida

CEUA – Comitê de Ética no Uso de Animais CHCl3 – clorofórmio

COX2 – ciclooxigenase 2

DAMP - do inglês, Damage-associated molecular pattern DG – diacilglicerol

DGTS – do inglês, diacylglyceryl-trimethylhomoserine DMSO – do ingles, dimethyl sulfoxide

DNA - do inglês, deoxyribonucleic acid

ELISA - do inglês, enzyme-linked immuno sorbent assay ERK - do inglês, extracellular signal-regulated kinase

xiv FAHFA – ácido graxo

FDR – do ingles, false discovery rate FPR – do inglês, formyl peptide receptor GC – glicocorticoide

GlcADG – glicosildiacilglicerol

GRE - do inglês, glucocorticoid response elements GSDMD – gasdermina D

HMDB – do inglês, Human Metabolome Data Base i.p. - intraperitoneal

IFN - Interferon IL - Interleucina

IRF - do inglês, IFN responsive fator JNK - do inglês, c-Jun N-terminal K+ - potássio

kDa – quilodalton

LC – do inglês, liquid chromatography LDH – lactato desidrogenase

LPS - lipopolissacarídeo bacteriano LRR - do inglês, leucin rich repeat M - Molar

MAPK - do inglês, Mitogen Activated Protein Kinase MeOH – metanol

ml - mililitro mM - milimolar

MSU - do inglês, monosodium urate crystals

MTT – do inglês, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide NADPH - do inglês, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase NAIP - do inglês, NLR Family Apoptosis Inhibitory Protein

NETs – do inglês, neutrophil extracellular traps NF-κB - do inglês, nuclear fator-κB

ng - nanograma Nig – nigericina

xv repeat (LRR)-containing protein)

NLRC - do inglês, NLR family, CARD domain containing NLRP - do inglês, NLR family pyrin domain

nm – nanômetros

NO - do inglês, nitric oxide

NOD - do inglês, Nucleotide-binding oligomerization domain PA – ácido fosfatídico

PAMP - do inglês, Pathogen associated molecular pattern PBS - do inglês, phosphate buffered saline

PC – fosfatidilcolina PE – fosfatidiletalonamina

PE-cer – fosfatidiletalonamina ceramida PFFA – do inglês, P-fluoro-DL-phenylalanine PG – fosfatidilglicerol

pg – picograma PI – fosfatidilinositol

PRR - do inglês, Pattern Recognition Receptors PS – fosfatidilserina

PYD - do inglês, PYRIN domain QC – do inglês, quality control RE - retículo endoplasmático

RNAm – ácido ribonucleico mensageiro ROS - do inglês, reactive oxygen species SM – esfingomielina

TG – triacilglicerol Th - do inglês, T helper

TLR - do inglês, Toll-like receptor TNF - do inglês, tumor necrosis fator WT - do inglês, Wild-type

α – alfa β – beta γ - gamma

xvi RESUMO

Avaliação do papel da proteína anti-inflamatória Anexina A1 na regulação do Inflamassoma NLRP3 e nas infecções por Candida Albicans e Candida Auris:

estudo in vitro e caracterização do perfil lipidômico

Objetivo: Avaliar o papel da AnxA1 na regulação do inflamassoma NLRP3 e na infecção por C. albicans e C. auris em macrófagos e neutrófilos isolados, bem como avaliar o perfil dos lipídios liberados por essas células após a ativação do NLRP3 e nas infecções por Candida spp. Metodologia: Camundongos machos C57BL/6 selvagens (WT) e nocautes para AnxA1 (AnxA1-/-) receberam injeção intraperitoneal de solução de amido a 1,5% ou carragenina a 0,3% para obtenção de macrófagos e neutrófilos do lavado peritoneal, respectivamente. Essas células foram estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS), (por 3 horas), seguida da administração dos agonistas de NLRP3, nigericina (1 hora) ou ATP (30 minutos). Também foi verificado a ação do peptídeo mimético da AnxA1 (Ac2-26) em neutrófilos ativados pelo NLRP3. Para

verificar a resposta de neutrófilos em infecções fúngicas, bem como a relação da AnxA1 nestas condições, estas células foram cocultivadas com as cepas de C. albicans e C. auris por 4 horas. Resultados: Nos macrófagos evidenciou-se que a falta de AnxA1 exacerba a liberação de IL-1β após a indução da ativação do inflamassoma NLRP3, bem como acarreta mudanças no perfil lipídico, tendo as ceramidas como os principais lipídios mediadores. A expressão de NLRP3 foi maior em macrófagos AnxA1-/- tratados com nigericina e pontos de colocalização foram verificados entre o inflamassoma NLRP3 e AnxA1, evidenciando a participação dessa proteína na regulação do NLRP3. Em neutrófilos, a AnxA1 endógena demonstrou ser importante para a ativação do NLRP3, uma vez que a liberação de IL-1β foi inferior quando comparado aos WT. A adição do peptídeo Ac2-26 reduziu a

liberação de IL-1β pela via de ativação do inflamassoma NLRP3 em neutrófilos WT, mas não reverteu a liberação desta citocina em neutrófilos AnxA1-/-. Potenciais biomarcadores lipídicos relacionados ao estresse e ativação celular, incluindo esfingolipídios específicos e glicerofosfolipídios, foram identificados no sobrenadante dos neutrófilos de ambos genótipos após ativação por nigericina. O tratamento com Ac2-26 aumentou a concentração de fosfatidilserinas e fosfocolinas oxidadas,

biomarcadores lipídicos relacionados à via da resolução inflamatória. Neutrófilos AnxA1-/- cocultivados com C. albicans ou C. auris apresentam maior expressão de COX-2 e ativação das MAPKs em relação aos WT. A falta de AnxA1 promoveu diferença no perfil lipídico, tendo maior proeminência de glicerofosfolipídios, tanto em neutrófilos co-infectados quanto no grupo AnxA1-/- controle. Conclusão: A AnxA1 desempenha diferentes papeis na sinalização do inflamassoma NLRP3 com base em sua localização intra ou extracelular e tipo celular. Além disso, regula a ativação dos neutrófilos pela infecção por Candida spp., evidenciando seu potencial imunomodulador em doenças inflamatórias e infecciosas.

Palavras chave: Ac2-26; ATP; Inflamação; Lipidômica; Macrófago; Neutrófilo;

xvii ABSTRACT

Evaluation of the role of Anexin A1 anti-inflammatory protein in the regulation of NLRP3 Inflammasome and in the infections by Candida Albicans and

Candida Auris: in vitro study and lipidomics profile characterization

Objective: To evaluate the role of the anti-inflammatory protein ANXA1 in the regulation of the NLRP3 inflammasome and in infection by C. albicans and C. auris in isolated macrophages and neutrophils, as well as to evaluate the profile of the lipids released after the activation of NLRP3 and in coinfection by Candida spp. Methodology: Male C57BL/6 wild (WT) mice and knockouts for AnxA1 (AnxA1-/-) received intraperitoneal injection of 1.5% starch solution or 0.3% carrageenan to obtain macrophages and neutrophils from the peritoneal lavage, respectively. These cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS, 3 hours), followed by the administration of NLRP3 agonists, nigericin (1 hour) or ATP (30 minutes). AnxA1 mimetic peptide (Ac2-26) action on NLRP3 activated neutrophils was also verified. To

check the response of neutrophils in fungal infections, as well as the relationship of AnxA1 in these conditions, these cells were incubated with the strains of C. albicans and C. auris for 4 hours. Results: In macrophages, it was evidenced that the lack of AnxA1 exacerbates the release of IL-1β after inducing the activation of the NLRP3 inflammasome, as well as causing changes in the lipid profile, with ceramides as the main mediating lipids. The expression of NLRP3 was higher in AnxA1-/- macrophages treated with nigericin and colocalization points were verified between the inflammasome NLRP3 and AnxA1, showing the participation of this protein in the regulation of NLRP3. In neutrophils, endogenous AnxA1 proved to be important for the activation of NLRP3, since the release of IL-1β was lower when compared to WT. The addition of Ac2-26 reduced the release of IL-1β by the NLRP3 inflammasome

activation pathway in WT neutrophils, but did not reverse the release of this cytokine in AnxA1-/- neutrophils. Potential lipid biomarkers related to cell stress and activation, including sphingolipids and glycerophospholipids, were identified in supernatant of neutrophils from both genotypes after nigericin treatment. Treatment with Ac2-26

increased the concentration of phosphatidylserines and oxidized phosphocholines, lipid biomarkers related to the inflammatory pathway. AnxA1-/- neutrophils cocultured with C. albicans or C. auris show higher COX-2 expression and MAPKs performance compared to WT. The lack of AnxA1 promotes a difference in the lipid profile, with greater prominence of glycerophospholipids, either in coinfected neutrophils or in AnxA1-/- control group. Conclusion: The AnxA1 plays different roles in the signaling of the NLRP3 inflammasome based on its intra or extracellular location and cell type. In addition, it regulates the activation of neutrophils by Candida spp. infection, highlighting its immunomodulatory potential in inflammatory and infectious diseases. Keywords: Ac2-26; ATP; Inflammation; Lipidomics; Macrophage; Neutrophil;

1 1 INTRODUÇÃO

1.1 Resposta inflamatória e inflamassomas

A resposta inflamatória é um mecanismo de caráter protetor às infecções ou aos danos celulares. Este processo é relativamente complexo e envolve a ativação das células do sistema imune, recrutamento de leucócitos para o tecido atingido e assim, promove a resolução da resposta inflamatória, eliminação das células danificadas e reparação dos tecidos afetados (DINH; DRUMMOND; SOBEY; CHRISSOBOLIS, 2014). A IL-1 e o fator de necrose tumoral (TNF) são liberados por macrófagos e estimulam a ativação das células endoteliais por meio da expressão em sua superfície das moléculas de adesão selectinas e integrinas que regulam a migração leucocitária para o local da lesão e/ou infecção (ABBAS; K.; LICHTMAN; PILLAI, 2019), evento ilustrado pela Figura 1. A partir da ativação endotelial ocorre a marginação leucocitária, seguida do rolamento dessas células com o auxílio das selectinas. Integrinas e quimiocinas ativam os leucócitos que, uma vez aderidos ao endotélio (integrinas auxiliam na adesão), sofrem a diapedese, ou seja, a transmigração dos leucócitos do vaso sanguíneo para o sítio da inflamação. Ainda, além de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6 e TNF serem liberadas durante o processo inflamatório, outros mediadores como quimiocinas (ex. CXCL2), enzimas proteolíticas e mediadores lipídicos (ex. prostaglandinas e leucotrienos) atuam como componentes fundamentais na resposta inflamatória, desencadeando edema, dor e alterações vasculares (ABBAS; K.; LICHTMAN; PILLAI, 2019; KUWABARA; ISHIKAWA; KONDO; KAKIUCHI, 2017).

2

Figura 1. Esquema do processo de recrutamento e migração de leucócitos para o sítio de inflamação. Fonte: (ABBAS; K.; LICHTMAN; PILLAI, 2019)

Como linha de frente no processo inflamatório, os neutrófilos são as primeiras células ativadas a desempenharem seu papel na inflamação. Objetivando a eliminação de patógenos, os neutrófilos ativam o processo de fagocitose, degranulação de seus mediadores biológicos e as NETs (do inglês, neutrophil extracellular traps), que são as armadilhas extracelulares de neutrófilos (ZAWROTNIAK; RAPALA-KOZIK, 2013). As NETs integram também um mecanismo do sistema imune inato em resposta às infecções, principalmente caracterizada pela morte celular programada dos neutrófilos (netose), liberando assim seu conteúdo intracelular para resolução da infecção (BRINKMANN; REICHARD; GOOSMANN; FAULER et al., 2004; JORGENSEN; LOPEZ; LAUFER; MIAO, 2016; KAPLAN; RADIC, 2012). A produção de NETs é tida como um fator importante na resposta imune contra infecções, mas também os altos níveis de produção de NETs já foram observados em doenças autoimunes e inflamatórias crônicas, bem como no câncer (ZAWROTNIAK; RAPALA-KOZIK, 2013).

A inflamação aguda é caracterizada por elementos fundamentais da imunidade inata, tendo os neutrófilos e macrófagos como as principais células deste processo. O influxo exacerbado de células que intimamente se relacionam com o processo inflamatório acarreta na manutenção da inflamação que se torna crônica, gerando doenças que acarretam na perda de funções e danos mais graves de órgãos, tais como atrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerativa, lúpus e gota

3

(ALIVERNINI; TOLUSSO; FERRACCIOLI; GREMESE et al., 2018). As doenças que se relacionam com o processo inflamatório, seja ele agudo ou crônico, são mediadas por receptores de membranas ou citoplasmáticos que ativam vias de sinalização especificas que geram diferentes respostas no organismo.

O sistema imune inato possui receptores de reconhecimento padrão (PRRs) para sequências moleculares específicas presentes em microrganismos e conservadas durante a evolução, os padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs, do inglês Pathogen Associated Molecular Patterns). O reconhecimento dos PAMPs por meio dos PRRs desencadeia a ativação de cascatas de sinalização vinculadas à resposta imune e ao processo inflamatório, objetivando o controle e eliminação do agente infeccioso para reparo do tecido (AKIRA; UEMATSU; TAKEUCHI, 2006). Os PRRs são representados por receptores na superfície celular, por exemplo os TLRs (do inglês, Toll-like receptors) e CTLs (do inglês, C-type lectins), e por sensores citoplasmáticos, tais como NLRs (do inglês, nucleotide-binding oligomerization domain [NOD], leucine rich repeats-containing protein), RLRs, (do inglês, retinoic acid inducible gene-I (RIG-I)-like receptors) e ALRs (do inglês absent-in-melanoma (AIM)-like receptors (KIM; SHIN; NAHM, 2016).

Os TLRs são glicoproteínas presentes nas membranas celulares e estes possuem um domínio N-terminal, com 16 a 18 sequências ricas em leucinas (LRRs). Esta região dos TLRs é voltada para a face extracelular da membrana e é responsável pelo reconhecimento de PAMPs e DAMPs (do inglês, Damage-associated molecular patterns). Os TLRs possuem um domínio transmembrânico e uma porção C-terminal voltada para o citosol da célula. A porção C-terminal atua como um receptor para IL-1 (TIR, do inglês Toll-IL-1 receptor). Os TLRs podem estar distribuídos nas membranas plasmáticas, sendo representados principalmente pelos receptores TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR10, TLR11, TLR12, TLR14, mas também estar associados às vesículas endossomais e do retículo endoplasmático (RE), como os TLR3, TLR7, TLR8 e TLR9. A atividade de reconhecimento de PAMPs e DAMPs extracelulares exercida pelos TLRs ativa NF-κB e INF, induzem respostas relacionadas à inflamação, por meio da produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas (KAWAI; AKIRA, 2007).

4

Figura 2. Domínios estruturais dos TLRs. LLR: leucine rich repeats; TM: transmembrana; TIR: Toll-IL-1 receptor. Fonte: (MATSUSHIMA; MIYASHITA; ENKHBAYAR; KRETSINGER, 20Toll-IL-15). (Adaptado)

Os NLRs compõem uma grande família de receptores citoplasmáticos, dividida entre os receptores NOD, NLRA (do inglês, acidic transactivation domain), NLRB (NLR BIR - do inglês, baculovirus inhibitior of apoptosis protein repeat), NLRC (NLR CARD - do inglês, caspase activation and recruitment domain) e NLRP (NLR Pyrin [PYD] domain containing) (KIM; SHIN; NAHM, 2016; KONG; YUAN; CHENG, 2017; PLATNICH; MURUVE, 2019). Os membros da família NLRs compartilham muitas características estruturais comuns. Todos possuem um domínio N-terminal de repetição rica em leucina (LRR), um domínio central NACHT (do inglês, a sigla em sua forma subdividida representa: NA [NAIP – neuronal apoptosis inhibitor protein], C [CIITA – MHC Class II transactivator/transcription activator, H [HET-E – plant het product] e T [TP1 – telomerase-associated protein 1]) (Figura 3). O domínio NACHT está intimamente relacionado com as atividades da dNTPase e na oligomerização de complexos. Este domínio central possui sequências conservadas que incluem ATP/GTPase-specific P-loop e sítios específicos de ligação para Mg2+ (KIM; SHIN; NAHM, 2016; KOONIN; ARAVIND, 2000; PLATNICH; MURUVE, 2019; TING; LOVERING; ALNEMRI; BERTIN et al., 2008). Os NLRC têm um ou mais domínios de recrutamento de caspase (CARD), enquanto os NLRP apresentam domínios pirina (PYD) que é de longe a subfamília mais bem caracterizada de NLRs e consiste de 14 membros (Figura 3).

5

Figura 3. Domínios estruturais dos NLRs, AIM2 e da proteína adaptadora ASC. O esquema codificado por cores detalha os domínios estruturais dos 14 membros da família NLRP, NLRC4, NOD1 e 2, Pyrin, AIM2, e a proteína adaptadora do inflamassoma ASC. Fonte: (PLATNICH; MURUVE, 2019).

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flagelina bacteriana e peptideoglicanos bacterianos, RNA viral, e hifas provenientes fungos. Além disso, os NLRs reconhecem componentes moleculares das células, tais como o ATP, lipídios, cristais de ácido úrico e ainda advindos ambientais, aos quais amianto, sílica, radiação UV, irritantes da pele e outros já demonstraram ser reconhecidos pela família dos NLRs (DAVIS; WEN; TING, 2011). A ativação dos NLRs promove respostas biológicas que incluem transdução de sinais, ativação de fatores de transcrição, autofagia e a formação dos inflamassomas (MOTTA; SOARES; SUN; PHILPOTT, 2015).

A formação dos inflamassomas é dependente de uma maquinaria que é composta a partir da proteína ASC (do inglês, apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) – uma molécula adaptadora (22 kDa), e pela pró-caspase 1 (BROZ; DIXIT, 2016). A estrutura molecular da ASC é composta por domínios CARD e PYD e seu recrutamento é mediado por interações eletrostáticas e hidrofóbicas, de forma homotípicas, isto é, quando a proteína sensora do NLR conter um domínio N-terminal do tipo PYD, a interação entre NLR e ASC será do tipo PYD-PYD, já para o domínio N-terminal do tipo CARD, a interação será do tipo CARD-CARD (BROZ; DIXIT, 2016). Uma vez formada a plataforma do inflamassoma, ocorre o recrutamento da pró-caspase 1 (45 kDa) que rapidamente sofre clivagem e consequentemente se apresenta na sua forma ativa (caspase 1 – 20 kDa). Aplicada aos inflamassomas, a caspase 1 atua diretamente no processamento das citocinas IL-1β e IL-18, bem como induzem a piroptose (BROZ; DIXIT, 2016; LU; MAGUPALLI; RUAN; YIN et al., 2014; LU; WU, 2015).

Dentre os NLRs existentes, o inflamassoma NLRP3 é o membro mais estudado. Sua plataforma de ativação é constituída pelo adaptor ASC – via PYD-PYD – e caspase 1. O NLRP3 é ativado por diversos patógenos e estruturas relacionadas (PAMPs), bem como DAMPs e irritantes ambientais. Dessa forma reconhece uma variedade de microorganismos, incluindo Staphylococcus aureus, Escherichia coli, vírus Influenza A e Candida albicans, assim como fatores associados a danos ou estresse celular, tais como adenosina trifosfato extracelular (ATP), cristais de ácido úrico e placas β-amiloide, elevados níveis extracelulares de glicose e efluxo de K+ (OZAKI; CAMPBELL; DOYLE, 2015; SCHRODER; TSCHOPP, 2010).

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dendríticas, neutrófilos, linfócitos, células epiteliais e osteoblastos (OZAKI; CAMPBELL; DOYLE, 2015; SCHRODER; TSCHOPP, 2010). A ativação do inflamassoma NLRP3 se dá basicamente por duas etapas, pelo “priming” e pela oligomerização do complexo NLRP3/ASC/caspase 1 (Figura 4). O “priming” é caracterizado pelo primeiro sinal para ativação do NLRP3 e este processo ocorre pela ação dos receptores TLRs, P2X7 e NOD, ou a partir de receptores de citocinas pró-inflamatórias, resultando na ativação de NFκB e posterior expressão de NLRP3 e produção das citocinas pró-IL-1β e IL-18. No segundo sinal da ativação do NLRP3 ocorre a oligomerização do sensor, recrutamento da ASC e pró-caspase 1 (BROZ; DIXIT, 2016; OZAKI; CAMPBELL; DOYLE, 2015). Contudo, o inflamassoma é uma plataforma que desencadeia a piroptose, que é caracterizada por um tipo de morte celular de caráter inflamatório e programada, decorrente da presença de PAMPs e DAMPs (DAVIS; WEN; TING, 2011; ZHONG; KINIO; SALEH, 2013).

Dentre inúmeros estudos acerca do mecanismo de ativação do inflamassoma NLRP3, muito ainda precisa ser elucidado quanto à formação e regulação desta plataforma. Já é sobejamente conhecido que, a ativação do NLRP3 promove a mobilização do K+ de maneiras distintas havendo, portanto, o efluxo de K+ e em contrapartida, o influxo de Ca2+. Um mecanismo conhecido proposto para o efluxo de K+ e do influxo de Ca2+ é via ativação do receptor P2X7 (DI VIRGILIO; DAL BEN; SARTI; GIULIANI et al., 2017; KARMAKAR; KATSNELSON; DUBYAK; PEARLMAN, 2016), mas também pela formação de poros na membrana plasmática provocada por ionóforos, por exemplo pela estreptolisina O e nigericina (HARDER; FRANCHI; MUÑOZ-PLANILLO; PARK et al., 2009; MARIATHASAN; WEISS; NEWTON; MCBRIDE et al., 2006).

A caspase 1 ativada resulta em formação de IL-1β e IL-18 ativas, promoção da liberação de IFN- e ativação de células inflamatórias que podem sofrer piroptose, morte celular caracterizada pela rápida destruição e integridade da membrana celular (SCHRODER; TSCHOPP, 2010). A IL-1β, por sua vez, é um importante mediador inflamatório que pode ser potencialmente gerado em locais de injúria ou ativação imunológica, com a função de coordenar eventos diversos, como o recrutamento de leucócitos para um local de infecção ou lesão até a regulação do sono, apetite ou temperatura corpórea (GARLANDA; DINARELLO; MANTOVANI, 2013).

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Figura 4. Ativação do NLRP3. PAMPs virais ou bacterianos ou DAMPs ativam a via do inflamassoma pela ativação do TLR induzindo a ativação do NFκB e expressão do NLRP3 e da pró-IL-1β (sinal 1). NLRP3 oligomeriza e recruta proteína adaptadora de caspase (ASC) e a procaspase-1 em resposta a um sinal de ativação (sinal 2). NLRP3 pode ser ativado em resposta a um efluxo de potássio por meio do receptor P2X7 ligado ao ATP, em resposta às espécies reativas de oxigênio liberadas pelo dano mitocondrial ou em resposta à catepsina B liberada pelo dano de lisossomos. Uma vez ativado, o NLRP3 produz a ativação da caspase 1 que cliva as proformas precursoras de IL-1β e IL-18 em suas formas maduras. Fonte: (OZAKI; CAMPBELL; DOYLE, 2015).

Além da resposta pró-inflamatória causada pela piroptose, este tipo de morte celular também é caracterizada pela formação de poros na membrana plasmática, bem como causar danos no DNA e lise celular. Estes poros na membrana são formados pela gasderminas, principalmente a gasdermina D (GSDMD). Na formação do inflamassoma NLRP3 o recrutamento e ativação de caspase 1 possibilita não somente a clivagem das isoformas das citocinas IL-1β e IL-18, mas também a ativação de GSDMD que possui um domínio N-terminal formador de poro. Após a clivagem de GSDMD são liberados fragmentos de domínios formadores de poro que irão se associar à membrana plasmática para a formação dos poros (Figura 5). Os poros formados na membrana destas células permitem a facilitada passagem de

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1β e IL-18, além de outras moléculas indicadoras de morte celular (KOVACS; MIAO, 2017; LIU; ZHANG; RUAN; PAN et al., 2016; SBORGI; RÜHL; MULVIHILL; PIPERCEVIC et al., 2016).

Figura 5. Esquema representativo da morte celular por piroptse mediada por GSDMD. Na via canônica, os inflamassomas atuam como sensores para uma variedade de patógenos e insultos celulares. A montagem desses tipos de inflamassomas envolve a multimerização do receptor (púrpura), ASC (verde) e caspase 1 (azul). Na via não canônica, o LPS é diretamente ligado à caspase 11 (amarela), resultando em sua ativação. A caspase 1 processa IL‐1β (vermelha). As caspases 1 e 11 processam a GSDMD (laranja), o que resulta na liberação de fragmentos de GSDMD Nterm (provenientes da região N-terminal clivada). Estes fragmentos formam um grande poro na membrana plasmática. A formação desses poros resulta em rápida perda da integridade da membrana plasmátca, dissipação do gradiente eletroquímico e, na morte celular. Fonte: (SBORGI; RÜHL; MULVIHILL; PIPERCEVIC et al., 2016).

A ativação de NLRP3 está associada com a patogênese de várias doenças inflamatórias crônicas, tais como aterosclerose, síndrome metabólica, degeneração macular associada à idade (AMD), doença de Alzheimer e gota. De fato, o NLRP3 parece ser ativado pelos vários subprodutos metabólicos associados com essas doenças, por exemplo, pelos cristais de urato monossódico na gota, placas beta-amiloides na doença de Alzheimer, depósitos proteicos (drusas) na AMD, polipetídeos amiloides das ilhotas pancreáticas na diabetes tipo 2, e colesterol na aterosclerose (HANEKLAUS; O'NEILL, 2015; KONG; YUAN; CHENG, 2017).

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Assim, considerando o envolvimento da ativação do inflamassoma NLRP3 na patogênese de várias doenças inflamatórias crônicas, investigações que visem a inibição farmacológica dessa via de sinalização e de suas citocinas efetoras IL-1β e IL-18 representam uma estratégia potencial para controlar esses processos inflamatórios. Neste contexto, destacamos a anexina A1 (AnxA1), proteína de 37 kDa capaz de mimetizar a ação anti-inflamatória dos glicocorticoides por meio da inibição da síntese de eicosanoides e fosfolipase A2, afetando dessa forma componentes da reação inflamatória e liberação do ácido araquidônico (FLOWER, 1988; PERRETTI; GAVINS, 2003).

1.2 Anexina A1

Anexina A1 (AnxA1) é uma proteína pertencente a uma superfamília de anexinas que possuem afinidade aos fosfolipídios de membrana de maneira dependente de Ca2+ (GERKE; CREUTZ; MOSS, 2005). Treze membros da família das anexinas foram descritos e clonados em mamíferos, e, estruturalmente, essas proteínas compreendem dois domínios: uma pequena região N-terminal, específico para cada membro da família de anexinas, e uma região C-terminal, formada por quatro a oito dobras repetidas de uma sequência conservada de 70 a 75 aminoácidos, responsável pela afinidade ao cálcio e consequente ligação aos fosfolipídios (RESCHER; GERKE, 2004). A região N-terminal da AnxA1 – extremidade amina – possui locais específicos para glicosilação e fosforilação, para ação de peptidases e clivagens proteolíticas de maneira seletiva, sendo esta a região responsável pela ação anti-inflamatória desta proteína (CHUAH; PALLEN, 1989; KIM; KO; KIM; CHOI et al., 2001). Na figura 6 temos uma representação esquemática da estrutura primária da proteína AnxA1.

Figura 6. Estrutura molecular da proteína Anexina A1. Região N-terminal seguida de quatro repetições de aproximadamente 70-75 aminoácidos na região C-terminal.

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A biossíntese de AnxA1 ocorre pela indução dos glicocorticoides (GC). Os GCs são hormônios esteroides que atuam como uma importante classe endógena de anti-inflamatórios. A síntese de AnxA1 ocorre inicialmente pela entrada dos GCs na célula, onde é reconhecido por receptores citoplasmáticos de corticoides. Associados, receptor e a molécula de GC entram no núcleo e se ligam às sequencias de GRE (do inglês, glucocorticoid response elements) e genes responsivos a glicocorticoides (Figura 7). A interação entre GRE e os GCs associados ao seu receptor permite que ocorra a transcrição e expressão de genes anti-inflamatórios, incluindo o gene especifico para transcrição de AnxA1. O RNAm da AnxA1 é traduzido na proteína AnxA1 que pode ser secretada e interagir com o receptor de membrana FPR2 (do inglês, formyl peptide receptor 2) e, consequentemente, exercer um papel anti-inflamatório (YANG; MORAND; LEECH, 2013). Não obstante à produção de AnxA1 via glicocorticoides, vários estudos demonstraram que a biossíntese de AnxA1 pode ocorrer a partir de estímulos inflamatórios, os quais induzem sua formação como um mecanismo regulador da inflamação (SUGIMOTO, et al., 2016; GALVÃO; DE CARVALHO; VAGO; SILVA et al., 2020; SANCHES; BRANCO; DUARTE; OLIANI et al., 2020).

Figura 7. Biossíntese da proteína anexina A1. Fonte: (YANG; MORAND; LEECH, 2013)

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O mecanismo de secreção da AnxA1 é de fundamental importância na sua ação anti-inflamatória mediante à ligação aos receptores na membrana plasmática, seja de forma autócrina ou parácrina (BUCKINGHAM; FLOWER, 1997; TAYLOR; PHILIP; JOHN; COVER et al., 2000). Em neutrófilos, por exemplo, após sua ativação por meio de quimiocinas, a AnxA1 é mobilizada dos grânulos de gelatinase para a membrana plasmática, possibilitando atuar como um regulador negativo do influxo leucocitário (OLIANI; PAUL-CLARK; CHRISTIAN; FLOWER et al., 2001). Nestas células, mais que 60% da AnxA1 citoplasmática está presente em grânulos de gelatinase, e sua mobilização para a membrana, bem como sua secreção ocorrem de forma rápida (PERRETTI; CHRISTIAN; WHELLER; AIELLO et al., 2000). Além de estar relacionada à redução o influxo de leucócitos e da produção e secreção de citocinas pró-inflamatórias, a AnxA1 induz apoptose em neutrófilos e facilita sua fagocitose pelos macrófagos (EUZGER; FLOWER; GOULDING; PERRETTI, 1999). Durante o processo inflamatório, a AnxA1 em sua isoforma intacta (37 kDa) pode ser clivada pela proteinase-3 e elastase em neutrófilos, e, consequentemente, estar em sua isoforma inativa (33 kDa), além de gerar peptídeos provenientes de sua região N-terminal (EUZGER; FLOWER; GOULDING; PERRETTI, 1999; RESCHER; GOEBELER; WILBERS; GERKE, 2006; VONG; D'ACQUISTO; PEDERZOLI-RIBEIL; LAVAGNO et al., 2007). Em macrófagos, já foi demonstrado que o transporte de AnxA1 é mediado pelo transportador ABC (do inglês, ATP-binding cassete transporter) (VONG; D'ACQUISTO; PEDERZOLI-RIBEIL; LAVAGNO et al., 2007). Todavia, o transporte da AnxA1 nos diferentes tipos celulares, ainda é objeto de estudo e melhores elucidações são necessárias.

A AnxA1 pode ser especialmente encontrada em células relacionadas aos processos de defesa como neutrófilos, mastócitos, eosinófilos e monócitos (OLIANI; GIL, 2006). Esta proteína é particularmente abundante em neutrófilos, nos quais pode representar cerca de 4% do total de proteínas citosólicas (ERNST; HOYE; BLACKWOOD; JAYE, 1990). A AnxA1 apresenta múltiplas funções em diferentes sistemas, entre elas, a fusão de membranas, fagocitose, proliferação e apoptose (KAMAL; FLOWER; PERRETTI, 2005). Nesse aspecto, a AnxA1 está relacionada a várias condições patológicas, como câncer, doenças autoimunes e processos inflamatórios (LIM; PERVAIZ, 2007; OLIANI; GIL, 2006).

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largamente estudada, acumulando ao longo do tempo, constatações de que a AnxA1 atua de forma reguladora no processo inflamatório e caracterizando-a como uma potencial molécula anti-inflamatória (WALLNER; MATTALIANO; HESSION; CATE et al., 1986). Estudos mostram que a AnxA1 demonstrou potencial ação na inibição da via de ativação do NFκB e produção de citocinas (PERRETTI; D'ACQUISTO, 2009; YANG; AEBERLI; DACUMOS; XUE et al., 2009; ZHANG; HUANG; ZHAO; RIGAS, 2010). Em contrapartida, altos níveis da expressão de AnxA1 foram relacionados à progressão do processo inflamatório, transição de tecido epitelial para mesenquimal, além de estimular genes associados à angiogênese no câncer de mama (OKANO; OSHI; BUTASH; KATSUTA et al., 2019). Todavia, o efeito modulador da AnxA1 na regulação do processo inflamatório e de doenças relacionadas à inflamação é significativamente expressivo em diversos modelos experimentais (GALVÃO; DE CARVALHO; VAGO; SILVA et al., 2020; GIMENES; ANDRADE; MELLO; RAMOS et al., 2015; PARISI; CORRÊA; GIL, 2019; SANCHES; BRANCO; DUARTE; OLIANI et al., 2020; SCHLOER; HÜBEL; MASEMANN; PAJONCZYK et al., 2019; STUQUI; DE PAULA-SILVA; CARLOS; ULLAH et al., 2015).

O desenvolvimento da linhagem de camundongos deficientes para o gene da AnxA1 (AnxA1-/-) permite o melhor entendimento da proteína AnxA1 endógena em diversos aspectos da biologia da célula e no processo inflamatório. Em modelos de inflamação, induzidos pela carragenina ou zymosan, os animais AnxA1-/- exibem uma resposta exacerbada aos estímulos inflamatórios caracterizada por um aumento na migração dos leucócitos e na síntese de IL-1β (HANNON; CROXTALL; GETTING; ROVIEZZO et al., 2003). Estudos já demonstraram, a partir de diversos modelos experimentais de inflamação, que camundongos AnxA1-/- apresentam maior influxo leucocitário e exacerbam a resposta inflamatória (GALVÃO; VAGO; BARROSO; TAVARES et al., 2017; GIMENES; ANDRADE; MELLO; RAMOS et al., 2015; PARISI; CORRÊA; GIL, 2019)

Além disto, apresentam uma resistência parcial ou completa aos efeitos anti-inflamatórios dos GCs (WATSON; SPARKMAN, 2008). Os leucócitos polimorfonucleares aumentam sua capacidade de migração in vivo e in vitro, enquanto os macrófagos demonstraram falhas no processo de fagocitose nesses animais. Ressaltamos ainda, que os macrófagos AnxA1-/- peritoneais estimulados

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por LPS apresentam maior expressão do RNAm do TLR4 e produção de IL-1β em relação às células selvagens (DAMAZO; YONA; D'ACQUISTO; FLOWER et al., 2005).

Outro aspecto relevante da ação da proteína AnxA1 é a inibição da via cicloxigenase 2 (COX-2) e produção de eicosanoides (JORGENSEN; LOPEZ; LAUFER; MIAO, 2016; SEIDEL; NEYMEYER; KAHL; RÖSCHEL et al., 2012; SERHAN; CHIANG, 2004). Os eicosanoides, como as prostaglandinas e leucotrienos, são mediadores lipídicos que possuem papel crucial no início da resposta inflamatória aguda (FLOWER, 2006; SERHAN; SAVILL, 2005). Além disso, os eicosanoides estão também relacionados com os inflamassomas que são ativados após a infecção com patógenos e levam a ativação da caspase 1. Uma vez ativada, a caspase 1 promove a produção de eicosanoides, os quais auxiliam no tráfico e liberação de leucócitos e também na neutralização e remoção de patógenos. Porém, a ativação sistêmica dos inflamassomas leva a produção de grande quantidade de eicosanoides (―eicosanoid storm‖) em minutos, esses mediadores rapidamente iniciam a inflamação e perda do fluido vascular, culminando com efeitos patológicos (VON MOLTKE; TRINIDAD; MOAYERI; KINTZER et al., 2012).

Recentemente nosso grupo de pesquisa mostrou que os macrófagos nocautes para AnxA1 exacerbam a liberação de IL-1β via ativação do inflamassoma NLRP3. A ausência de AnxA1 mostrou que os macrófagos além de secretarem mais IL-1β em relação aos controles, liberam lipídios mediadores da inflamação, tais como ceramidas. (SANCHES; BRANCO; DUARTE; OLIANI et al., 2020). A AnxA1, portanto, também está relacionada com a regulação do inflamassoma NLRP3.

Desde a identificação da AnxA1 como um mediador endógeno das ações anti-inflamatórias dos glicocorticoides (HAN; ABENDSCHEIN; KELLEY; GROSS, 2000), sua atividade e seu papel protetor, assim como de seus peptídeos miméticos, especialmente o Ac2-26, têm sido explorados em diversas investigações. Outros

peptídeos miméticos da proteína AnxA1 também demonstraram um efeito regulador da resposta inflamatória tais como SAnxA1 (super AnxA1 - resistente à proteinase 3), AnxA12-50, acetilados (Ac1-26, Ac9-25 e Ac2-7), tanto em modelos in vivo quanto in

vitro (SUGIMOTO; VAGO; TEIXEIRA; SOUSA, 2016). Neste contexto, nosso grupo de pesquisa vem estudando o papel da AnxA1 endógena e exógena, evidenciando

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seu potente papel anti-inflamatório em modelos experimentais de inflamação aguda (GIROL; MIMURA; DREWES; BOLONHEIS et al., 2013; STUQUI; DE PAULA-SILVA; CARLOS; ULLAH et al., 2015), crônica (GIBBS; CAROLLO; DAMAZO; OLIANI et al., 2002), alérgica (GIMENES; ANDRADE; MELLO; RAMOS et al., 2015; MARMORATO; GIMENES; ANDRADE; OLIANI et al., 2019; PARISI; CORRÊA; GIL, 2019), neuroinflamação (GIMENES; ANDRADE; PINOTTI; OLIANI et al., 2019) e mais recentemente na regulação do inflamassoma NLRP3 (SANCHES; BRANCO; DUARTE; OLIANI et al., 2020).

A administração desses peptídeos miméticos da AnxA1 é capaz de regular as respostas inflamatórias, incluindo a liberação de IL-1β, em diversos modelos animais, tais como isquemia-reperfusão do miocárdio (VAN DER BIJL; VAN EYK, 2001), uveíte induzida por lipopolissacarídeo (LPS) (GIROL; MIMURA; DREWES; BOLONHEIS et al., 2013) e peritonite induzida pela miotoxina do veneno de Bothrops moojeni (STUQUI; DE PAULA-SILVA; CARLOS; ULLAH et al., 2015). Além disso, a AnxA1 e seus peptídeos miméticos ligam-se a uma classe específica de receptores transmembrana acoplados à proteína G, os receptores para peptídeos formilados (FPR), que são mais abundantes em leucócitos aderentes, e promovem a ativação celular e a sinalização intracelular, com o destacamento dos leucócitos do endotélio (GAVINS; YONA; KAMAL; FLOWER et al., 2003).

Associados, esses dados revelam que a AnxA1 desempenha um papel significante no controle da cascata inflamatória, mas sua relação com a via do inflamassoma NLRP3 foi pouco explorado. Além disso, poucos trabalhos relatam o papel dessa proteína nas infecções fúngicas, tais como as causadas pela Candida albicans e Candida auris.

1.3 Infecções por Candida albicans e Candida auris

Os fungos são pequenos microrganismos que compõem, dentre sua grande diversidade, a microbiota humana e estão presentes na boca (SIQUEIRA; SEN, 2004) e vagina (BAROUSSE; STEELE; DUNLAP; ESPINOSA et al., 2001), por exemplo. Uma grande quantidade dos fungos que coabitam de forma comensal o organismo, pertence ao gênero Candida (SIQUEIRA; SEN, 2004). Dente as espécies de Candida, muitas já foram isoladas da cavidade oral e oito delas estão associadas às infecções, destacando-se a Candida albicans que representa um

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fungo comensal, que a partir de desequilíbrios internos ou agentes diversos externos, torna-se patogênica (BAROUSSE; STEELE; DUNLAP; ESPINOSA et al., 2001; SEGAL, 2005).

O equilíbrio entre a microbiota, o sistema imunológico, e a integridade do tecido epitelial são fatores fundamentais para a manutenção da Candida em seu estado comensal no hospedeiro (GONCALVES; FERREIRA; ALVES; HENRIQUES et al., 2016; KAEWSRICHAN; PEEYANANJARASSRI; KONGPRASERTKIT, 2006; MOYES; WILSON; RICHARDSON; MOGAVERO et al., 2016; NETEA; MARÓDI, 2010). Todavia, perturbações na homeostase local ou sistêmica, seja por fatores fisiológicos ou externos, podem levar ao crescimento descontrolado da C. albicans e, consequentemente, desencadear resposta pró-inflamatória, alterações no pH e osmolaridade, causar danos teciduais e até mesmo disseminação do fungo de forma sistêmica, causando sepse (BENSEN; MARTIN; LI; BERMAN et al., 2004; PRIGNEAU; PORTA; POUDRIER; COLONNA-ROMANO et al., 2003; RUHNKE, 2002).

Os mecanismos de adaptação e patogenicidade da Candida estão associados aos fatores de virulência, dos quais incluem adesões, formação de biofilme, produção de enzima hidrolítica extracelular, formação e crescimento do fungo e comutação fenotípica (transição de levedura para hifas ou pseudo-hifas) (GONCALVES; FERREIRA; ALVES; HENRIQUES et al., 2016; TAMURA NK, 2007). O dimorfismo da Candida configura um dos seus mecanismos fundamentais de virulência e adaptação durante o processo infeccioso. As leveduras são caracterizadas por uma morfologia arredondada destas células, podendo apresentar ligeiros brotamentos axiais ou bipolares (Figura 8A). Esta forma em que o fungo se apresenta facilita o processo de disseminação pelo sangue. As pseudo-hifas se apresentam em um padrão alongado, semelhante à elipse e de forma septada. As hifas são mais alongadas, tendo a C. albicans um representante deste processo do dimorfismo levedura-hifa (Figura 8B e C). As hifas e pseudo-hifas podem ser classificadas como modelos filamentosos e estes colaboram para o processo mecânico de invasão do tecido, bem como dificultar o processo de fagocitose exercido pelos neutrófilos e macrófagos (SHARECK; BELHUMEUR, 2011).

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Figura 8. Morfologias da C. albicans. A: levedura; B: pseudo-hifas; C: hifas. As fotos-micrografias apresentadas representam 5 μm e as hifas 1 mm. Fonte: (SUDBERY, 2011). (Adaptado).

Macrófagos e neutrófilos são as principais células contra as infecções por Candida. Por meio do reconhecimento do fungo pelo sistema imune inato, os receptores destas células detectam a presença dos PAMPs, iniciando assim a resposta imunológica (GIL; GOZALBO, 2006), dos quais os receptores de manose, TLRs, receptores de varredura e dectina-1 possibilitam reconhecer o fungo invasor (UNDERHILL; OZINSKY, 2002). Já foi demonstrado que os TLRs desempenham importante papel no reconhecimento da C. albicans por leucócitos (GIL; GOZALBO, 2006; NETEA; MARÓDI, 2010; NETEA; VAN DER GRAAF; VAN DER MEER; KULLBERG, 2004; NETEA; VAN DER GRAAF; VONK; VERSCHUEREN et al., 2002; VILLAMÓN; GOZALBO; ROIG; O'CONNOR et al., 2004), desencadeando a liberação de citocinas pró-inflamatórias (NETEA; STUYT; KIM; VAN DER MEER et al., 2002). Nas fases iniciais de uma infecção por C. albicans, ocorre a secreção de TNF-α por macrófagos, recrutando neutrófilos para realizar uma resposta antifúngica (DIAMOND; LYMAN; WYSONG, 1991). Contudo, os neutrófilos são fundamentais na defesa contra infecções por Candida, atuando diretamente em leveduras e hifas por meio da produção de peróxido de hidrogênio via NADPH-oxidase (MARÓDI et al., 1998). Ainda, os neutrófilos possuem hidrolases lisossomais, tais como peroxidases e mieloperoxidases, que atuam na eliminação do patógeno e resolução da infecção (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013; MARÓDI; TOURNAY; KÁPOSZTA; JOHNSTON et al., 1998). Um dos mecanismos que os neutrófilos também realizam para controlar uma infecção fúngica é entrar em morte celular via netose, liberando seu conteúdo citoplasmático (NETs), rico em enzimas lisossomais para eliminação do fungo (KAPLAN; RADIC, 2012; ZAWROTNIAK; RAPALA-KOZIK, 2013).

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Estudos vêm sendo realizados para verificar os fatores de virulência da C. auris, e, mecanismos de aderência, formação de biofilme, fosfolipases e produção de proteinases contribuem para a patogenicidade deste fungo (CHATTERJEE; ALAMPALLI; NAGESHAN; CHETTIAR et al., 2015; JOHNSON; DAVIS; HUTTENLOCHER; KERNIEN et al., 2018). A C. auris pode ser tolerante às altas temperaturas, tensão osmótica e possuem uma capacidade de produzir enzimas líticas e biofilme (BEN-AMI; BERMAN; NOVIKOV; BASH et al., 2017). Ainda, a C. auris é capaz de evadir os mecanismos de resposta imune inata e da produção de NETs, aumentando assim os índices de mortalidade pela infecção sistêmica deste fungo (CORSI-VASQUEZ; OSTROSKY-ZEICHNER, 2019; ROSSATO; COLOMBO, 2018). A figura 9 ilustra a morfologia da C. auris.

Figura 9. Morfologia da C. auris. Fotomicrografia evidenciando a forma de levedura de C. auris que não apresenta dimorfismo (levedura-filamentos) Fonte: (LARKIN; HAGER; CHANDRA; MUKHERJEE

et al., 2017)

As infecções por fungos geram inúmeras respostas celulares, tendo as MAPKs (do inglês - Mitogen Activated Protein Kinases) uma via de suma importância durante as infecções fúngicas. ERK (do inglês – extracellular-signal-regulated kinase) e p38 são consideravelmente expressas quando há infecção por Candida (MOYES; MURCIANO; RUNGLALL; ISLAM et al., 2011), onde o fungo libera a candidalisina, uma toxina peptídica citolítica anfipática, responsável por desestabilizar a integridade de membranas plasmáticas do hospedeiro (MOYES; WILSON; RICHARDSON; MOGAVERO et al., 2016), tendo as expressões das MAPKs como moléculas indicadoras da presença do fungo e de possíveis lesões

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celulares. A infecção por C. albicans também promove a ativação da COX-2 que está intimamente relacionada no metabolismo do ácido araquidônico e consequente síntese e liberação dos eicoisanoides, promovendo assim maior resposta inflamatória frente à infecção (ABDEL MEGEED; FAYED; ABOOD; KADRY, 2018).

1.4 Mediadores lipídicos e lipidômica

Diante da importância dos leucócitos na resposta inflamatória e nos mecanismos contra patógenos, tais como fungos, e ainda por emitirem respostas por vesículas extracelulares (HICKEY; KUBES, 2009), as quais são ricas em mediadores imunológicos, ácidos nucleicos, proteínas e lipídios (GUTIÉRREZ-VÁZQUEZ; VILLARROYA-BELTRI; MITTELBRUNN; SÁNCHEZ-MADRID, 2013), nosso estudo também buscou avaliar os potenciais lipídios mediadores durante a ativação do inflamassoma NLRP3 e nas infecções por C. albicans e C. auris.

Os lipídios representam uma classe de macromoléculas de fundamental importância para os sistemas orgânicos. A abordagem lipidômica, uma vertente da metabolômica, traz consigo uma perspectiva precisa e ampliada para melhor entendimento dos sistemas biológicos e sua relação em muitas doenças (WANG, 2015). As principais classes lipídicas podem ser caracterizadas pelos ácidos graxos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, lipídios esteróis, lipídios prenol, sacarolípidos e policetídeos. Os perfis lipídicos são caracterizados pelas principais classes de lipídios, tais como ésteres de colesteril, ceramidas, mono (MG), di (DG) e triacilgliceróis (TG), fosfolipídios de membrana, como esfingomielinas (SM), fosfatidilcolinas (PC), fosfatidiletanolaminas (PE), fosfatidilserinas (PS) e lisofosfolipídios (FAHY; SUBRAMANIAM; BROWN; GLASS et al., 2005).

Os lipídios possuem características moleculares diversas em tamanho e composição. De modo geral, os lipídios apresentam estruturas polares e apolares e, portanto, são considerados moléculas anfipáticas. A cabeça dos lipídios possui características polares, um radical e um fosfato, os fosfolipídios, por exemplo, podem conter uma serina, colina, etalonamina ou inositol (Figura 10). Os lipídios mais abundantes nas células são os fosfolipídios e estes compõem as membranas biológicas, plasmática e também de veiculas intra e extracelulares. Já em menor quantidade os esfingolipídios e colesterol também colaboram para estrutura e

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fisiologia celular. Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos de cadeia longa, geralmente contendo de 14 a 24 carbonos, e nas membranas biológicas entre 16 e 18 carbonos. Os ácidos graxos podem ser saturados ou insaturados, onde a quantidade de insaturações pode influenciar na espessura da bicamada lipídica e na fluidez da membrana. Sabe-se que o aumento de insaturações promove maior permeabilidade da bicamada de fosfolipídios nas membranas devido aos espaços entre os fosfolipídios (ALBERTS B; JOHNSON A; P., 2006; NELSON; COX, 2011).

Figura 10. Principais fosfolipídios das biomembranas. Os fosfolipídios são formados por uma cauda apolar, composta pelas cadeias de ácidos graxos, e uma cabeça polar, constituída pelo glicerol, um fosfato e um álcool. Normalmente nesse radical são encontradas etanoamina, colina e serina. No caso da cardiolipina, um lipídio encontrado na membrana interna das mitocôndrias, o grupo R é formado por uma molécula de glicerol, constituindo assim um fosfolipídio ―duplo‖. Na composição dos lipídios, os ácidos graxos, o glicerol e o fosfato recebem o nome de ácido fosfatídico. No entanto, o que dá nome ao fosfolipídio é o radical que ele apresenta no grupo R. Fonte: (CARVALHO, 2013).

Assim como fosfolipídios inositois, as fosfatidilserinas desempenham papel essencial na célula, atuando também na sinalização celular, principalmente indicando morte celular. Ainda, serinas são largamente encontradas nas em microvesículas e micropartcículas liberadas pelas diversas células (MOOBERRY; KEY, 2016). Essas vesículas extracelulares desempenham importantes funções no organismo, tais como sinalização, resposta inflamatória e morte celular. Elas podem ser classificadas como exossomos ou micropartículas e são compostas basicamente por lipídios e proteínas presentes na membrana celular (COLOMBO; RAPOSO; THÉRY, 2014; VAN DER POL; BÖING; HARRISON; STURK et al., 2012).

Dentre as classes dos lipídios, cada uma apresenta uma particularidade ao que se remete à sua ação, de forma específica, nos sistemas biológicos. Os lipídios podem atuar como mediadores de respostas celulares, na sinalização, processo inflamatório, sinalização e morte celular (RINSCHEN; IVANISEVIC; GIERA;

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SIUZDAK, 2019; SHEVCHENKO; SIMONS, 2010). Após danos teciduais e morte celular, os DAMPs estimulam o recrutamento de neutrófilos estes promovem o reconhecimento por meio dos TLRs e NLRs presentes nestas células (PITTMAN; KUBES, 2013). Este mecanismo de reconhecimento pode levar à ativação e inflamassomas, como o NLRP3, o qual promove a produção de lipídios mediadores relacionados ao processo inflamatório e danos teciduais, tendo as ceramidas, por exemplo, como um mediador lipídico que é altamente expresso durante a inflamação (ALBEITUNI; STIBAN, 2019) e morte celular (CHAURASIA; SUMMERS, 2018) (Figura 11).

Figura 11. Via da piroptose e produção de lipídios mediadores. Fonte: (SANZ; SANCHEZ-NIÑO; IZQUIERDO; GONZALEZ-ESPINOZA et al., 2014).

Contudo, o estudo dos lipídios torna-se cada dia mais usual na comunidade científica, devido sua diversidade e importância biológica, sendo estas macromoléculas potenciais biomarcadores para inúmeras doenças (HYOTYLAINEN; ORESIC, 2014). A lipidômica surgiu a fim de proporcionar uma visão global das redes lipídicas nos sistemas biológicos e suas ações no processo de saúde e

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doença (HAN; GROSS, 2003; LAGARDE; GELOEN; RECORD; VANCE et al., 2003; QUEHENBERGER; DENNIS, 2011; SHEVCHENKO; SIMONS, 2010) 72-75. A integração desta perspectiva ―ômica‖ pode ser aplicada para construção de redes dentre os diferentes componentes moleculares, elucidando diferentes processos bioquímicos (YIN; XU, 2014). O estudo dos metabólitos, a partir da espectrometria de massas, vem sendo largamente utilizado em diversos sistemas e suas interações frente à patógenos, bem como em danos celulares, proporciona uma visão ampla e fidedigna sobre o metabolismo e em diversas doenças (MAYERS; WU; CLISH; KRAFT et al., 2014; SREEKUMAR; POISSON; RAJENDIRAN; KHAN et al., 2009; WIKOFF; ANFORA; LIU; SCHULTZ et al., 2009; YIN; XU, 2014).

23 2 JUSTIFICATIVA

A AnxA1 desempenha um papel significante no controle da cascata inflamatória, especialmente relacionada à regulação de IL-1β, mas sua relação com a via do inflamassoma NLRP3 e infecções por Candida albicans e Candida Auris não foi estabelecida. Assim, o desenvolvimento desse trabalho possibilitou um melhor entendimento acerca dos processos de resposta frente à ativação e regulação do inflamassoma NLRP3 em macrófagos e neutrófilos, bem como na resposta inflamatória em infecções por Candida albicans e Candida auris em neutrófilos.

24 3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar o papel da proteína anti-inflamatória AnxA1 na ativação e regulação do inflamassoma NLRP3 em neutrófilos e macrófagos isolados, bem como nas infecções por Candida albicans e Candida auris.

3.2 Objetivos específicos

• Avaliar o papel da AnxA1 na ativação e regulação do inflamassoma NLRP3 em macrófagos de camundongos selvagens (WT) e nocautes para ANXA1 (AnxA1-/-), bem como caracterizar o perfil dos lipídios liberados pela indução da piroptose;

• Avaliar o papel da AnxA1 em neutrófilos WT e AnxA1

na ativação e regulação do inflamassoma NLRP3 pelas vias clássicas de ativação, bem como o perfil dos lipídios liberados;

• Avaliar o papel da AnxA1 em neutrófilos WT e AnxA1

na infecção por Candida albicans e Candida auris, bem como o perfil dos lipídios liberados.

25 4. RESULTADOS

Os resultados desta tese de Doutorado serão demonstrados na forma de artigos. O item 4.1 remete-se ao primeiro trabalho já publicado e os itens 4.2 e 4.3 são referentes aos artigos submetidos em revistas indexadas em bases de dados internacionais.

26 4.1 Artigo publicado na Cells

Título: Annexin A1 Regulates NLRP3 Inflammasome Activation and Modifies Lipid Release Profile in Isolated Peritoneal Macrophages.