UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA MEDICINAL E MODELAGEM MOLECULAR

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Texto

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA MEDICINAL E MODELAGEM MOLECULAR

KELTON LUIS BELÉM DOS SANTOS

PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS COM ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA NO RECEPTOR ADENOSINA TIPO A2A (A2AAR)

BELÉM 2017

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PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS COM ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA NO RECEPTOR ADENOSINA TIPO A2A (A2AAR)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Medicinal e Modelagem Molecular (PPGQMMM) da Universidade Federal do Pará (UFPA), como requisito para aquisição do título de Mestre em Química Medicinal e Modelagem Molecular.

Orientador: Prof. Dr. Cleydson Breno Rodrigues dos Santos

BELÉM 2017

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S237p Santos, Kelton Luis Belém dos

Planejamento de Fármacos com Atividade Anti-inflamatória no Receptor Adenosina Tipo A2A (A2AAR) / Kelton Luis Belém dos Santos. - 2017.

110 f. : il. color.

Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-graduação em Química Medicinal e Modelagem Molecular (PPGQM3), Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Pará, Belém, 2017.

Orientação: Prof. Dr. Cleydson Breno Rodrigues dos Santos

1. Inflamação. 2. Receptor de Adenosina A2A. 3. Triagem Virtual. 4. Análise QSAR. 5. Propriedades Farmacocinéticas e Toxicológicas. I. Santos, Cleydson Breno Rodrigues dos, orient. II. Título

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Dedico esta dissertação a minha mãe, Neide Corrêa Belém e aos meus Irmãos, Kelen Naia Corrêa Belém e Kaelton Adriel Corrêa Belém.

Dedico também aquelas pessoas que duvidaram da minha capacidade e disseram que eu não iria conseguir.

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Inicialmente quero agradecer a minha mãe, Neide Corrêa Belém pelo apoio dado a mim no decorrer desta trajetória. Quero agradecer também ao meu orientador, Prof. Dr. Cleydson Breno Rodrigues do Santos pelo apoio e colaboração no decorrer de dois anos, tendo paciência e sabedoria nas horas de orientação, agradecer o apoio pelas broncas.

Agradecer as bancas examinadoras da Qualificação e de Defesa pelas sábias colaborações dadas a este projeto que ajudaram a refinar e definir melhor os objetivos e que ajudaram de forma ímpar para a finalização do projeto.

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“O único lugar onde o sucesso vem antes do trabalho é no dicionário.” (Desconhecido)

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A2AAR – Receptor de Adenosina A2A

RLM – Regressão Linear Múltipla

QSAR – Quantitative Structure Activity Relationship ROCS – Rapid Overlay of Chemical Structures EON - Electrostatic Similarity for Lead-Hopping RO5 – Rules of Five

AOH – Absorção Oral Humana TV – Triagem Virtual

PDB – Protein Data Bank

ADME/TOX – Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção / Toxicidade. RA – Receptores de Adenosina

GPCR – G protein–coupled receptor FDA – Food and Drug Administration

PASS – Prediction of Activity Spectra of Substances ATP – Adenosina Trifosfato

AMP – Adenosina Monofostato

AMPc – Adenosina Monofostafo Cíclico ET – Eletrostatic Tanimoto CF – Características Farmacofóricas NA – Número de Átomos GH – Grupo Hidrofóbico VM – Volume Molar PM – Polarizabilidade Molar r – Coeficiente de Correlação

r² - Coeficiente de Correlação ao Quadrado r²A – Variância Explicada

SEE – Erro Padrão Estimado F – Razão de Variância

ALH – Aceitadores de Ligação de Hidrogênio DLH – Doadores de Ligação de Hidrogênio COPD – Cronic Obstructive Pulmonary Disease

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integridade do organismo contra agentes nocivos endógenos ou exógenos. As doenças inflamatórias constituem um grupo complexo e heterogêneo de doenças, sendo causa importante de morbidade e mortalidade. O receptor de adenosina A2A

(A2AAR) tem uma importância considerável no processo anti-inflamatório. Para a

busca de novos agonistas com atividade anti-inflamatória, o 6-(2,2- diphenylethylamino)-9-((2R,3R,4S,5S)-5-(ethylcarbamoyl)-3,4-dihydroxytetrahydrofu-ran-2-yl)-N-(2-(3-(1-(pyridin-2-yl)piperidin-4-yl)ureido)ethyl)-9H-purine-2-carboxamide (UK-432097) e um conjunto de 20 compostos encontrados no banco de dados BindingDB foram utilizados para gerar várias hipóteses farmacofóricas, sendo validado o modelo farmacofórico via base contaminada. As propriedades moleculares calculadas foram utilizadas para a construção de modelos QSAR (bi-, tri-, tetra-, penta- e hex-paramétricos) através do modelo de Regressão Linear Múltipla (RLM) para a predição da atividade biológica dos novos agonistas oriundos da triagem virtual baseada em farmacóforo em cinco base de dados de compostos comerciais. Além disso, o servidor web PASS foi usado para prever a atividade biológica. Após a sequência metodológica, os resultados da triagem virtual foram possíveis selecionar dois compostos com atividade promissora por apresentar características específicas delineadas no trabalho, além de apresentarem perfis farmacocinéticos e toxicológicos satisfatórios, podendo serem utilizados em ensaios biológicos futuros para confirmar sua atividade e seletividade anti-inflamatória frente ao receptor A2AAR.

PALAVRAS-CHAVE: Inflamação, Receptor de Adenosina A2A, Triagem Virtual, Análise QSAR; Propriedades Farmacocinéticas e Toxicológicas.

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Figura 2. Sinalização adenosinérgica. Esquema representativo dos diferentes receptores de adenosina, bem como das diferentes proteínas G, às quais estão acoplados e os diferentes sistemas de transdução de sinal (adaptado de

http://www.herbalzym.com/2012/01/caffeine-competitively-inhibits-different-adenosine-receptors/) ... 25 Figura 3. Região do anel purínico responsável pela atividade agonista no A2AAR. . 28

Figura 4. Estrutura dos principais agonistas A2AAR. ... 31

Figura 5. Estruturas do Tiaconazol R e Fluconazol R, respectivamente. ... 37 Figura 6. Triagem virtual baseada em ligantes (farmacóforo e ligante) usando os programas Discovery Studio 4.0, ROCS V2.4.1 (Rapid Overlay of Chemical Structures – similaridade por forma) e EON (similaridade eletrostática). ... 50 Figura 7. Compostos selecionados com os seus respectivos valores de EC50 (A2AAR).

... 54 Figura 8. Modelo farmacóforo para os agonistas obtido com o servidor web PharmaGist. As cores do farmacofórico em azul-claro significa 2 características de anéis aromáticos, verde para 4 aceitador de hidrogênio e azul escuro 1 região positiva. ... 56 Figura 9. Avaliação dos modelos farmacofóricos gerados. ... 57 Figura 10. Modelo farmacofórico selecionado para a triagem virtual. Esfera Azul (grupo hidrofóbico), em rosa (doador de ligação de hidrogênio) e laranja (aromático). A) hipótese farmacofórica testados com um conjunto de compostos selecionados. B) hipótese farmacofórica e a análise do sitio ativo: as três características estão em regiões de interações com sete aminoácidos importantes para a atividade biológica no receptor A2AAR (HIS264, THR256, ASN253, PHE168, SER277, HIS278 e THR88).

... 58 Figura 11. Importância da característica hidrofóbica para a atividade biológica do agonista do A2AAR através do efeito metila. ... 67

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Tabela 2. Matriz de correlação de Pearson dos parâmetros usados neste estudo. . 59

Tabela 3. Regressão e parâmetros estatísticos do modelo biparamétricos. ... 61

Tabela 4. Regressão e parâmetros estatísticos do modelo triparamétricos. ... 62

Tabela 5. Regressão e parâmetros estatísticos do modelo tetraparamétricos. ... 63

Tabela 6. Regressão e parâmetros estatísticos dos modelos pentaparamétrico... 64

Tabela 7. Relação entre os parâmetros selecionados para a construção dos modelos paramétricos. ... 65

Tabela 8. Variação dos valores da qualidade estatística dos modelos selecionados. ... 66

Tabela 9. Aplicação dos modelos QSAR, bi-, tri-, tetra-, penta- e hexaparamétrico (Equações 2-6). ... 72

Tabela 10. Compostos selecionados via triagem virtual baseada em farmacóforo para compra e ensaios biológicos. ... 73

Tabela 11. Compostos selecionados via triagem virtual baseada em similaridade-ligante para compra e ensaios biológicos usando o composto UK-432097 como pivô (PDB 3QAK)... 75

Tabela 12. Parâmetros Físico-Químicos relacionados à RO5 para os compostos obtidos via triagem virtual baseada em ligante (farmacóforo). ... 78

Tabela 13. Valores de predições farmacocinéticas: #star, “Rule of Five”, Absorção Oral Humana (AOH), absorção oral humana (%), QPPCaco, QPPMDCK, QPlogPo/w, SNC e QPlogBB para o UK-432097 e compostos obtidos via triagem virtual. ... 82

Tabela 14. Descritores dos compostos resultantes da triagem virtual. ... 86

Tabela 15. Aplicação das melhores equações QSAR via RLM para compostos oriundos da Triagem Virtual (TV). ... 87

Tabela 16. Predição de atividade biológica dos compostos resultantes da triagem virtual usando o PASS. ... 88

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1 OBJETIVOS ... 17

1.1 OBJETIVO GERAL ... 17

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 17

2 REFERENCIAL TEÓRICO ... 18

2.1 INFLAMAÇÃO ... 18

2.2 ADENOSINA E SEUS RECEPTORES ... 19

2.3 OS RECEPTORES DE ADENOSINA NO MECANISMO DE SÍNTESE, LIBERAÇÃO E REMOÇÃO DA ADENOSINA INTRA E EXTRACELULAR ... 21

2.4 A FUNÇÃO DO RECEPTOR ADENOSINA TIPO A2A (A2AAR) NO PROCESSO ANTI-INFLAMATÓRIO ... 23

2.4.1 O desenvolvimento de agonistas farmacologicamente ideais para receptor de adenosina tipo 2A (A2AAR) ... 26

2.5 QUÍMICA MEDICINAL E O PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS ... 32

2.5.1 Metodologias aplicadas no planejamento e desenvolvimento de fármacos ... 33

2.5.1.1 BindingDB e o Protein Data Bank (PDB) ... 33

2.5.1.2 Farmacóforo ... 34

2.5.1.3 Derivação do Farmacóforo via Servidor Web Pharmagist e o Programa Discovery Studio ... 35

2.5.1.4 Modelagem Molecular ... 36

2.5.1.5 Banco de Compostos Comerciais ... 37

2.5.1.6 Triagem Virtual (Screening Virtual) ... 37

2.5.1.7 Métodos QSAR ... 40

2.5.1.8 Os programas aplicados ao estudo das propriedades farmacocinéticas e toxicológicas ... 41

3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 44

3.1 SELEÇÃO DOS COMPOSTOS AGONISTAS NO RECEPTOR A2AAR ... 44

3.2 GERAÇÃO DO MODELO FARMACOFÓRICO ... 44

3.3 AVALIAÇÃO DO MODELO FARMACOFÓRICO... 44

3.4 CONSTRUÇÃO DOS MODELOS DE REGRESSÃO LINEAR MÚLTIPLA (QSAR) ... 45

3.5 TRIAGEM VIRTUAL DE NOVOS COMPOSTOS COM POTENCIAL ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA ... 47

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3.5.2 Triagem virtual baseada em ligante (ligand-based virtual screening) 48 3.6 DETERMINAÇÃO DAS PROPRIEDADES FARMACOCINÉTICAS E

TOXICOLÓGICAS DOS NOVOS COMPOSTOS SELECIONADOS ... 50

3.7 PREDIÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA VIA MODELOS QSAR ... 51

3.8 PREDIÇÃO DE ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DOS COMPOSTOS DA TRIAGEM VIRTUAL ... 51

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 53

4.1 SELEÇÃO DOS COMPOSTOS AGONISTAS A2AAR ... 53

4.2 GERAÇÃO E AVALIAÇÃO DO MODELO FARMACÓFORO ... 55

4.2.1 Avaliação das hipóteses farmacofóricas ... 56

4.3 CONSTRUÇÃO DOS MODELOS QSAR VIA REGRESSÃO LINEAR MÚLTIPLA (RLM) ... 59 4.3.1 Modelos Biparamétricos ... 60 4.3.2 Modelos Triparamétricos ... 61 4.3.3 Modelos Tetraparamétricos ... 63 4.3.4 Modelos Pentaparamétricos ... 64 4.3.5 Modelo Hexaparamétrico ... 64

4.3.6 Relação entre os modelos com melhor qualidade estatística ... 65

4.3.7 Avaliação do Poder Preditivo dos Modelos Selecionados ... 70

4.3 TRIAGEM VIRTUAL ... 73

4.3.1 Triagem Virtual Baseada em Farmacóforo ... 73

4.3.2 Triagem Virtual Baseada em Ligante (Similaridade) ... 74

4.4 PREDIÇÕES FARMACOCINÉTICAS E TOXICOLÓGICAS ... 76

4.4.1 Disponibilidade Oral ... 77

4.4.2 Análise do Perfil Farmacocinético dos Compostos Triados ... 78

4.4.3 Análise do Perfil Toxicológico dos Compostos Triados ... 83

4.5 APLICAÇÃO DOS MELHORES MODELOS QSAR PARA COMPOSTOS RESULTANTES DA TRIAGEM VIRTUAL ... 85

4.6 PREDIÇÃO DE ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA VIA SERVIDOR WEB PASS ... 88

CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 90

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INTRODUÇÃO

A indústria farmacêutica é responsável por desenvolver, produzir, comercializar fármacos e outros produtos farmacêuticos, controlando um mercado que movimenta cerca U$880 bilhões por ano (THOMSON REUTERS, 2012). A manutenção desse mercado depende do desenvolvimento de fármacos mais eficazes e seguros, o que leva a um investimento anual de aproximadamente U$ 48,5 bilhões em pesquisa, desenvolvimento e inovação (PD&I) (PHRMA, 2013).

A descoberta e introdução de fármacos no mercado pela indústria farmacêutica, é considerada por especialistas uma atividade complexa, multifatorial, competitivo, demorada, de alto investimento, envolvendo a aplicação de técnicas e metodologias modernas (LIMA, 2007a; PHRMA, 2007). Desde a concepção do projeto até a introdução de um único fármaco no mercado, existe um custo em média, de 12 a 15 anos em PD&I, podendo ultrapassar o valor de US$ 1,2 bilhão (PAUL et al, 2010).

Na tentativa de maximizar a relação tempo-produção, as indústrias farmacêuticas desenvolveram a estratégia de síntese combinatorial, viabilizando por síntese paralela ou na forma de mistura, de centenas ou milhares de compostos por dia (LIMA, 2007a).

Mesmo que o processo de PD&I de novos fármacos seja exemplificado linearmente para fins didáticos. Na prática, uma rede com diferentes fases do processo ocorre concomitantemente, visto que, da concepção do projeto até a introdução do produto no mercado, diferentes compostos são avaliados e inúmeras modificações estruturais são propostas com o objetivo de encontrar uma estrutura ideal (BAXTER et al, 2013). Apesar de longa e complexa, a descoberta de uma inovação radical aumenta os lucros e serve de modelo para a criação, posterior, de uma ou mais inovações incrementais (LIMA, 2007a).

O efeito terapêutico de um composto, parâmetros físico-químicos e suas propriedades farmacocinéticas (absorção, distribuição, metabolismo e excreção, juntamente com toxicidade - ADME/TOX) são avaliados in silico, in vitro e in vivo. Essa avaliação ganha tempo e recursos financeiros ao processo de PD&I, visto que eliminam candidatos com propriedades inadequadas antes de seguirem para estudos clínicos, estima-se que a taxa de insucesso deste processo seja superior a 90%. As principais razões incluem perda de eficácia clínica, propriedades farmacocinéticas inadequadas, toxicidade, reações adversas, concorrência e limitações farmacotécnicas (HUGHES et al, 2011; LIMA, 2007a).

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O processo para a obtenção de novos fármacos tem mudado muito através dos anos. Até aproximadamente a década de 80, novos medicamentos eram descobertos através de testes do tipo caixa–preta em células ou modelos–animais. Essa metodologia tradicional de desenvolvimento de fármacos, também chamada de “triagem cega”, consiste em testar aleatoriamente várias micromoléculas em ensaios biológicos, sem nenhum conhecimento dos mecanismos de ação e/ou interação da molécula ligante. Embora a maioria dos fármacos terapeuticamente úteis disponíveis hoje tenham sido descobertos através desse processo, aos poucos essa metodologia mostrou-se ineficiente devido à probabilidade cada vez menor de se encontrar um novo fármaco, sendo necessário testar milhões de compostos em alguns casos. Esse fato resultou em um grande aumento no tempo e nos custos envolvidos para a descoberta e o desenvolvimento de novos fármacos (LOMBARDINO; LOWE, 2004).

Para a concretização do planejamento racional, informações de diferentes áreas do conhecimento humano são utilizadas, sobretudo aquelas relacionadas aos níveis eletrônicos do fármaco, atividade biológica, parâmetros físico-químicos, tais como: hidrofóbicos, estéricos e eletrônicos, relacionados com a atividade biológica (COHEN et al, 1990).

O planejamento racional de fármacos configura como uma poderosa ferramenta no âmbito da química, farmácia, biotecnologia e entre outras ciências para o desenvolvimento de novos compostos bioativos, pois se utiliza de técnicas combinadas como tecnologia computacional, estatística aplicada e estudo de interação biológica, tornando possível substituir os ensaios ou experimentos biológicos dispendiosos envolvendo materiais toxicamente perigosos ou compostos instáveis pela utilização de propriedades físico-químicas calculadas, que podem ser utilizados para prever as respostas de interesse para novos compostos (COHEN et al, 1990; SANTOS et al, 2014a)

As doenças inflamatórias constituem um grupo complexo e heterogêneo de doenças, sendo causa importante de morbidade e mortalidade. A inflamação é um mecanismo homeostático complexo gerado para proteger a integridade do organismo contra agentes nocivos endógenos ou exógenos (MEDZHITOV, 2008).

A molécula de adenosina é um nucleosídeo endógena ubíqua que regula uma série de processos fisiológicos. Esses efeitos são mediados pela interação de ligação com receptores de adenosina (RA’s) que são membros do receptor acoplado a proteína G (GPCR), são conhecidos para serem quatro subtipos distintos AR, que são

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denominados A1, A2A, A2B e A3. Adenosina está envolvida no câncer e cardioproteção,

e especificamente, uma grande quantidade de interesse encontra-se centrado sobre o receptor A2A e o seu papel em ações protetoras e anti-inflamatórias (HASKO;

CRONSTEIN, 2004; DI VIRGILIO et al, 2005; HAUSLER et al, 2012).

Há pouco tempo, ocorreu a elucidação da Proteína GPCR, onde se encontra, a estrutura cristalina do A2AAR com o antagonista ZM241385 como ligante, localizadas

nos códigos PDB por ordem cronológica 3EML (JAAKOLA, et al, 2008), 3RFM, 3REY, 3PWH (DORE et al, 2011), 3UZA, 3UZC (CONGREVE et al, 2012), 4EIY (LIU et al, 2012) e 5IU4 (SEGALA et al, 2016). Isso gerou uma busca para cristalizar o receptor com outros ligantes, tendo destaque os agonistas seletivos no receptor de adenosina do tipo A2A (A2AAR), dentre eles o agonista seletivo UK-432097, código PDB 3QAK

(XU et al, 2011). Um número de agonistas farmacologicamente importantes exibindo seletividade A2AAR tem sido sintetizado, como por exemplo, o YT-146 e DPMA

demonstraram efeitos cardioprotetores, enquanto CGS-21680 tem sido utilizada para estudar a transmissão neuronal (HASKO; CRONSTEIN, 2004; DI VIRGILIO et al, 2005; HAUSLER et al, 2012) e o regadenoson, comercializado como Lexiscan, agonista aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), utilizado como dilatador coronário para imagiologia nuclear cardíaca. (GARNOCK-JONES; CURRAN, 2010; TOSH et al, 2012; RUIZ; LIM; ZHENG, 2014; PRETI et al, 2015).

O A2AAR é um receptor que protege o corpo contra os danos causados por

várias doenças, como a asma, inflamação, pneumonia, aterosclerose, derrame cerebral, infarto do coração, doenças nos rins induzidas pelo diabetes, entre várias outras doenças, isso gerou um grande interesse clínico no desenvolvimento de agonistas de A2AAR (agonistas são moléculas que ativam o receptor, tendo assim uma

resposta biológica). Agonistas de A2AAR seriam potenciais medicamentos contra

esses danos, em especial no processo anti-inflamatória, pois o composto de maior potencial (UK-432097) se mostrou cancerígeno nos testes clínicos (MANTELL, 2009; MÜLLER; JACOBSON, 2011).

O agonista UK-432097 (6-(2,2-diphenylethylamino)-9-((2R,3R,4S,5S)-5- (ethylcarbamoyl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)-N-(2-(3-(1-(pyridin-2-yl)piperidin-4-yl)ureido)ethyl)-9H-purine-2-carboxamide), desenvolvido pela Pfizer, foi descoberto na pesquisa para os agonistas seletivos A2AAR para o tratamento de inflamação, e

como um inalante para o tratamento da doença pulmonar obstrutiva crônica. Em 2013, o composto foi encerrado a partir fase II de ensaios clínicos, apresentando resultado

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insatisfatório de eficácia, onde apresentou atividade cancerígena (MANTELL, 2009; MÜLLER; JACOBSON, 2011).

A área de interação do ligante UK-432097 demonstrou uma extensa rede de interações ligante-receptor, incluindo onze (11) ligações de hidrogênio, uma interação aromática de empilhamento (π-π), e numerosas interações de Van der Waals não polares. Além disso, foi encontrada na estrutura um núcleo bicíclico que estende de um modo semelhante como ZM241385, e estão envolvidos em numerosas interações importantes que ancoram a molécula na cavidade de ligação. A principal característica para tornar o UK-432097 ativo é a presença do anel de ribose, que se insere profundamente para uma região predominantemente hidrófilo da cavidade de ligação e formam numerosas ligações de hidrogênios importantes, explicando assim a elevada afinidade dos agonistas A2AAR (XU, et al, 2011; SHONBERG et al, 2015).

A descoberta da estrutura cristalina do A2AAR nos dá uma oportunidade de

colocar essas descobertas anteriores em um contexto atômico 3D e usar o conhecimento das interações atômicas para prever novos ligantes substituídos ou compostos similares que possuem comportamento agonistas com melhor seletividade e eficácia terapêutica (HAUSLER et al, 2012; TOSH et al, 2012).

Diante do exposto, a pergunta norteadora é: Quais são os compostos com maior eficácia anti-inflamatória no receptor A2AAR resultantes da triagem virtual?

Neste projeto de pesquisa se propõem conhecer compostos com atividade anti-inflamatória no receptor A2AAR utilizando SAR, QSAR, triagem virtual, propriedades

farmacocinéticas e toxicológicas. Ao final, os resultados serão usados para estimar os compostos mais promissores com atividade agonista, seletividade para o receptor A2AAR, com potencial ação anti-inflamatória e que possam ser indicados como

candidatos à futuros ensaios biológicos e clínicos.

Assim justifica-se estudar os compostos com atividade agonista no receptor A2AAR

dentro do processo de planejamento racional de fármacos para tornar possível a obtenção de resultados significativos com excelentes previsões e com rapidez sobre compostos potencialmente ativos com ação anti-inflamatórios, já que o composto conhecido apresenta atividade satisfatória, porém, sendo cancerígeno (composto UK-432097). Nesse sentido, a importância na busca de novos fármacos com bons resultados farmacocinéticos e toxicológicos é pertinente diante do resultado mostrado pelo composto UK-432097.

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1 OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GERAL

• Realizar o planejamento de fármacos com potencial atividade anti-inflamatória no receptor de adenosina tipo A2A (A2AAR).

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Selecionar compostos agonistas no PDB e BindingDB e construir o modelo farmacofórico a partir do UK-432097.

• Selecionar novos compostos com potencial atividade anti-inflamatória a partir de banco de dados comerciais;

• Determinar as propriedades farmacocinéticas e toxicológicas dos novos compostos selecionados;

• Predizer a atividade anti-inflamatória in silico dos compostos com as melhores propriedades farmacocinéticas e toxicológicas via QSAR e PASS;

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2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 INFLAMAÇÃO

A inflamação é um mecanismo homeostático complexo gerado para proteger a integridade do organismo contra agentes nocivos endógenos ou exógenos (MEDZHITOV, 2008), é antes de tudo, processo útil e benéfico para o organismo, compensando quebra de homeostasia e repondo normalidade tissular (FUCHS; WANNMACHER, 2010). Endotoxinas derivadas de bactérias Gram-negativas, como o lipopolissacarídeo (LPS), promovem a liberação de inúmeros mediadores inflamatórios, incluindo quimiocinas, citocinas, eicosanóides, espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico (BONE; GRODZIN; BALK, 1997).

Os nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares da adenina têm sido descritos como importantes mediadores inflamatórios. A adenosina trifosfato (ATP) é considerada uma molécula pró-inflamatória, enquanto que a adenosina, produto final da hidrólise do ATP, parece desempenhar ações protetoras e anti-inflamatórias (HASKO; CRONSTEIN, 2004; DI VIRGILIO et al, 2005).

A inflamação também é considerada uma resposta de defesa que ocorre após dano celular causado por micróbios, agentes físicos (radiação, trauma, queimaduras), químicos (toxinas, substâncias cáusticas), necrose tecidual e/ou reações imunológicas. A reação inflamatória aguda caracteriza-se por uma série de eventos inter-relacionados, entre os quais aumento no fluxo sanguíneo e permeabilidade vascular na região afetada, exsudação de fluido (edema), dor localizada, migração e acúmulo de leucócitos inflamatórios dos vasos sanguíneos para dentro do tecido, formação de tecido de granulação e reparo tecidual (LIMA et al, 2007b).

Conforme Lima (et al, 2007b), as respostas de defesa, incluindo inflamação, são geralmente benéficas para o organismo, agindo para limitar a sobrevivência e proliferação dos patógenos invasores, promover a sobrevivência do tecido, reparo e recuperação, e conservar a energia do organismo. Entretanto, uma inflamação extensiva, prolongada ou não regulada é altamente prejudicial ao organismo, processos pró-inflamatórios são regulados por uma série equivalente de processos anti-inflamatórios teciduais.

Todavia, apesar de ser considerada como uma resposta de defesa do organismo tornou-se claro que as reações inflamatórias ou imunológicas inadequadas formam um componente significativo de muitas, se não da maioria, das doenças

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encontradas na clínica. Consequentemente, os fármacos anti-inflamatórios são extensamente empregados em todos os ramos da medicina (RANG; DALE, 2008).

A inflamação é uma resposta normal de proteção às lesões teciduais causadas por trauma físico, agentes químicos ou microbiológicos nocivos, é a tentativa dos organismos de inativar ou destruir os organismos invasores, remover os irritantes e preparar o cenário para o reparo tecidual, quando a recuperação está completa. Esses efeitos são mediados pelo aumento da Adenosina Monofostato Cíclico (AMPc) intracelular, levando à ativação da proteína-quinase e ao relaxamento da musculatura lisa (CLARK, 2013).

Indutores endógenos são moléculas próprias, inócuas quando compartimentalizadas intracelularmente ou em tecidos restritos, mas que ativam sensores em macrógrafos se exteriorizadas por lesão citopática ou necrose. ATP, íons K+, ácido úrico, HMGB1 (high mobility group box-1 protein) e membros da Família

S100 ligadoras de cálcio são exemplos de substâncias que extravasam da célula necrótica, desencadeiam resposta inflamatória e são percebidas por purinorreceptores (P2X7) na membrana de macrógrafos, inflamassoma-NALP3 e receptores do Tipo Toll (TLR) (FUCHS; WANNMACHER, 2010).

2.2 ADENOSINA E SEUS RECEPTORES

Drury e Szent-Györgyi (1929) descrevem impressionantes efeitos cardiovasculares da adenosina quando injetados em mamíferos. Naquele tempo, foi evidenciado a ação da adenosina em vários sistemas de órgãos e funções do organismo. A adenosina é um nucleosídeo (ver Figura 1) que ocorre naturalmente, é formada no corpo por degradação de nucleótidos de adenina (RUIZ; LIM; ZHENG, 2014; CHEN; ELTZSCHIG, FREDHOLM, 2013). Pode ser formada intracelularmente, bem como extracelular, mas age em sentido regulamentar apenas no extracelular receptores. Tal ação da adenosina parece ser filogeneticamente antiga e representa um universal sistema de comunicação intracelular em animais e plantas (ABBRACCHIO, 1996).

Conforme Linden (2001), “a adenosina é uma molécula de sinalização primordial que evoluiu para modular as respostas fisiológicas em todos os tecidos mamíferos", possuindo ação protetora e homeostático.

Adenosina é um nucleosídeo purínico que está amplamente distribuída pelo corpo classificada como neuromodulador endógeno e agonista purinérgico, produzida

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bioquimicamente através da união de uma base púrica adenina com uma D-ribose formando um dos maiores ribonucleotídeos do organismo (SAWINOK, 1999, VALÉRIO, 2009).

Figura 1. Estrutura do nucleosídeo - Adenosina.

Segundo Fredholm (et al, 2001) e Abbracchio (et al, 1995), existem quatro subtipos de receptores de adenosina (A1, A2A, A2B e A3) que foram clonados e

identificados em humanos e roedores, ambos estão acoplados à proteína G (GPCRs) com sete domínios transmembranares que sinalizam através de transdução uma variedade de mecanismos (OLAH; STILES, 1995; FERREIRA, 2012).

Classicamente, os receptores A1 e A3, que estão acoplados à proteína G

“inibitória” (Gi ou Go), possuem uma ação inibitória na atividade da enzima adenil ciclase, o que resulta numa diminuição dos níveis intracelulares de AMPc (PEARSON et al, 2003; PIRES, 2008). Os receptores A2A e A2B, acoplados à proteína G

estimulatória (Gs), agem positivamente sobre a adenil ciclase, tendo um papel estimulatório sobre essa enzima produzindo um aumento dos níveis de AMPc intracelular (FREDHOLM et al, 2001; LINDEN, 2001; RIBEIRO; SEBASTIÃO; MENDONÇA, 2002; PIRES, 2008), é possível encontrar receptores A2A também no

coração, plaquetas, timo, leucócitos e no pulmão (FERREIRA, 2012).

Os receptores de adenosina estão envolvidos em diversas vias fisiológicas e patológicas, assim, eles têm sido considerados como alvos potenciais para o desenvolvimento de fármacos contra diferentes patologias. O principal desafio para atingir esse objetivo é a inibição seletiva de um subtipo de receptor em relação aos outros (PAZ, 2012). Além do seu papel no metabolismo energético, a adenosina atua na sinalização celular, uma vez que ela se liga a receptores específicos presentes na superfície da célula e regula, desta forma, alguns processos fisiológicos (FREDHOLM, 2007). N O OH OH N N N NH2 OH

(21)

O efeito modulatório sobre a formação, degradação e o transporte da adenosina é o que determina os níveis intra e extracelulares de adenosina. A modulação de concentrações de adenosina extracelular, por exemplo por inibidores do metabolismo de adenosina, pode produzir atividades farmacológicas como antinociceptiva e anti-inflamatória (SAWYNOK, REID, LIU, 1999; MILLAN, 2002), uma vez que a adenosina modula diversos processos fisiológicos mediados por certos receptores de membrana pertencentes a uma classe específica de receptores denominada P1 (receptores purinérgicos), os quais são acoplados a adenil ciclase via proteína G. Assim, a ativação desses receptores purinérgicos pode desempenhar importantes funções por meio de mecanismos mediados por quatro receptores diferentes de adenosina: A1, A2A, A2B e A3 (KLINGER; FREISSMUTH; NANOFF; 2002;

VALÉRIO, 2009). Cada receptor possui uma ação característica, mediando diferentes eventos. Portanto, cada receptor deve ser ativado por diferentes limites de concentração de adenosina (FREDHOLM et al, 1994).

2.3 OS RECEPTORES DE ADENOSINA NO MECANISMO DE SÍNTESE, LIBERAÇÃO E REMOÇÃO DA ADENOSINA INTRA E EXTRACELULAR

A molécula adenosina endógena ativa tanto receptor A1 quanto A2A e esses

receptores podem coexistir em um mesmo terminal nervoso (CORREIA-DE-SÁ; SEBASTIÃO; RIBEIRO, 1991). O padrão de atividade elétrica, a fonte extracelular de adenosina, bem como sua concentração determinam que tipo de receptor será preferencialmente ativado (GOMES, 2007).

Portanto, estímulos de alta frequência favorecem a liberação de ATP, e formação de adenosina extracelular, ativando preferencialmente receptores A2A,

enquanto que estímulos de baixa frequência favorecem a liberação de adenosina e preferencialmente a ativação de A1 (CORREIA-DE-SÁ; TIMOTEO; RIBEIRO, 1996).

Isso mostra que a adenosina extracelular em baixa concentração, estimula a ativação predominantemente do receptor A1, no caso contrário, existe a predominância da

ativação dos receptores A2A (CORREIA-DE-SÁ; RIBEIRO, 1996; GOMES, 2007).

A adenosina pode ser formada intra ou extracelularmente, sendo continuamente produzida sob condições normais (FREDHOLM et al, 2001). A adenosina intracelular é formada pela ação de uma endonuclease seletiva ao AMP e a taxa de formação da adenosina através deste mecanismo é controlado principalmente pela quantidade de AMP. A via para produção de adenosina envolve

(22)

uma cascata de desfosforilação de ATP e de Adenosina Difosfato (ADP) finalizada sob ação de enzimas do tipo 5´-nucleotidases localizadas tanto na membrana celular quanto no interior celular (SCHUBERT; KOMP; KREUTZBERG, 1979; DUNWIDDIE; DIAO; PROCTOR, 1997; ZIMMERMANN et al, 1998; ZIMMERMANN; BRAUN, 1999; ZIMMERMANN, 2000; VALÉRIO, 2009). Assim, o metabólito adenosina é produzido principalmente pela quebra de nucleotídeos de adenina intra ou extracelular (ZIMMERMANN, 2000; HASKO; CRONSTEIN, 2004).

A adenosina também pode resultar da hidrólise da S-adenosilhomocisteína (SAH) pela enzima S-adenosilhomocisteína hidrolase (SAHH), a qual catalisa uma reação de transmetilação que produz ao mesmo tempo adenosina e homocisteína (BROCH; UELAND,1980; DEUSSEN; LLOYD; SCHRADER, 1989; BOROWIEC et al, 2006; VALÉRIO, 2009). Acredita-se que sob condições normais, a maior fração de adenosina é originada da SAH, ou seja, do meio intracelular. Contudo, sob condições de hipoxia, isquemia e estresse metabólico, a adenosina é derivada principalmente da ação da 5'-nucleotidase (SIEGEL, 1999).

Por outro lado, trabalhos da literatura já demonstraram que um inibidor seletivo da SAH hidrolase (adenosina-2,3-dialdeído) não influenciou a liberação de adenosina tanto em condições normais quanto sob condições de isquemia, indicando que esta via não apresenta uma contribuição significativa na produção de adenosina no cérebro (LATINI; PEDATA, 2001; GOMES, 2007).

Existem duas enzimas que constituem as principais vias de remoção da adenosina: adenosina cinase e adenosina deaminase. A adenosina intracelular pode ser convertida em AMPc por fosforilação através da adenosina cinase ou em inosina pela degradação através da adenosina deaminase (LLOYD; FREDHOLM, 1995). A adenosina cinase é importante quando há baixos níveis de adenosina intracelular, enquanto a adenosina desaminase é crucial em altas concentrações de adenosina (FREDHOLM et al, 2005).

A remoção de adenosina extracelular é dada em parte pela receptação através do transportador bidirecional, seguida por sua fosforilação à AMP pela enzima adenosina cinase, e em parte por sua degradação à inosina pela enzima adenosina deaminase. Embora a adenosina deaminase seja principalmente encontrada no meio citosólico, já foi descrita em vários tecidos, inclusive no cérebro, na forma de uma ectoenzima (FRANCO; CANELA; BOZAL, 1986).

(23)

Inibidores da adenosina deaminase, como por exemplo, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-adenosina (EHNA), aumentam, a concentração extracelular de adenosina em diferentes condições experimentais (PHILLIS; WALTER; SIMPSON, 1991; SCIOTTI; VAN WYLEN, 1993; GOMES, 2007). A maior parte da degradação de adenosina é, no entanto, intracelular e com isso, inibidores de transportadores da adenosina, como o dipiridamol, também aumentam a concentração intersticial de adenosina (GOMES, 2007).

Em relação ao Metabolismo intracelular de adenosina, a adenosina citosólica pode ser oriunda da atividade da e-5’-NT sobre o AMP extracelular e atingir o espaço intracelular através de transportadores nucleosídeos (NT), ser oriunda do metabolismo da S-adenosilhomocisteína pela SAHH, ou do catabolismo de ATP/ADP/AMP a adenosina pela enzima cN-I. A adenosina intracelular pode ser metabolizada novamente a AMP ou ser convertida a inosina pela enzima Adenosina Deaminase (ADA). A inosina (que, também, pode ser proveniente da atividade da cN-II sobre o IMP), então, pode ser exportada para o espaço extracelular por transportadores nucleotídeos ou ser convertida à hipoxantina pela enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (BOROWIEC et al, 2006).

A hipoxantina pode, por sua vez, atingir o espaço extracelular por atravessar passivamente a membrana plasmática ou ser convertida em xantina pela enzima Xantina Oxidase (XO), por conseguinte, a xantina pode atingir o espaço extracelular por atravessar passivamente a membrana plasmática ou ser convertida a ácido úrico pela enzima XO, e o ácido úrico pode atingir o espaço extracelular por atravessar passivamente a membrana plasmática e, assim, ser excretado (BOROWIEC et al, 2006).

2.4 A FUNÇÃO DO RECEPTOR ADENOSINA TIPO A2A (A2AAR) NO PROCESSO

ANTI-INFLAMATÓRIO

A molécula de adenosina é um nucleósido de purina úbiquo que medeia uma variedade de processos fisiológicos, patofisiológicos e biológicos, tais como os relacionados com o sistema cardiovascular, rim, sistema nervoso central, cancro e inflamação, através da ativação dos receptores de adenosina (RA’s), é encontrada na maior parte das células, incluindo neurônios, mas também de células gliais (DUNWIDDIE; MASINO, 2001; CHEN; ELTZSCHIG, FREDHOLM, 2013; RIBEIRO; SEBASTIÃO; MEDONÇA, 2002; RODRÍGUEZ et al, 2015a; SHONBERG et al, 2015).

(24)

Receptores de adenosina tipo A2A são reguladores importantes de diferentes

funções da microglia, como a liberação de mediadores inflamatórios e proliferação. Está envolvida no câncer e cardioproteção, e especificamente, uma grande quantidade de interesse está centrado sobre o receptor A2A e o seu papel em ações

protetoras, recuperação óssea e anti-inflamatórias (GEBICKE-HAERTER et al, 1996; HASKO; CRONSTEIN, 2004; SAURA et al, 2005; DAI et al, 2010; HAUSLER et al, 2012; DI VIRGILIO et al, 2005; GOMES et al, 2013; MEDIERO et al, 2015).

Como citado, a adenosina é distribuída naturalmente por todo o corpo como um intermediário metabólico. Demonstrou estar acumulada no espaço extracelular no local da inflamação (LAPPAS; SULLIVAN; LINDEN, 2005) em resposta ao estresse metabólico e dano celular, e há evidências de que este pode desempenhar um papel chave na preservação da homeostase (CANAS et al, 2009; RIVERA-OLIVER; DÍAZ-RIOS, 2014).

As respostas fisiológicas da adenosina ocorrem como um resultado da sua ligação aos receptores de adenosina (RA’s), e estudos indicam que a ativação do sistema de adenosina (especificamente o subtipo do A2AAR da adenosina) podem

conduzir à regulação negativa da resposta inflamatória (TARKOWSKI et al, 1999; TARKOWSKI et al 2001; WYSS-CORAY, 2006; QUERFURTH; LAFERLA, 2010; CSÓKA; HASKO, 2011; RIVERA-OLIVER; DÍAZ-RIOS, 2014).

Adenosina é um agonista nativo, não seletivo, de vida curta presente no corpo humano (JACOBSON; MÜLLER, 2016). Além do seu papel no metabolismo energético, a adenosina atua na sinalização celular, uma vez que ela se liga aos receptores específicos presentes na superfície da célula e regula, desta forma, alguns processos fisiológicos (FREDHOLM, 2007).

As funções biológicas da adenosina extracelular são mediadas por quatro subtipos de receptores de adenosina diferentes: A1 e A3, receptores acoplados a

proteína G (Gi), cuja ativação inibe a produção da enzima adenil ciclase com consequente inibição da produção de AMPc a partir do ATP. Os receptores de adenosina A2A e A2B, acoplados à proteína G (Gs) quando ativados estimulam a

produção da adenil ciclase promovendo aumento do AMPc intracelular, consequentemente diminuindo a concentração de ATP (FREDHOLM et al, 2001; RIBEIRO; SEBASTIÃO; MEDONÇA, 2002). (Ver Figura 2)

De acordo com Jacobson e Müller (2016), moléculas precursoras de nucleotídeos tais como o ATP podem ser prejudicial em modelos neuroprotetoras

(25)

através da ativação P2Rs, e é mais vulgarmente observado que P2Y ou antagonistas de P2X são mais protetora do que agonistas P2. O agonista de adenosina nativa possui uma curta duração in vivo e, portanto, ele tem um uso limitado em modelos de neuroproteção (CHEN; ELTZSCHIG, FREDHOLM, 2013).

Figura 2. Sinalização adenosinérgica. Esquema representativo dos diferentes receptores de adenosina, bem como das diferentes proteínas G, às quais estão acoplados e os diferentes sistemas de transdução de sinal (adaptado de

http://www.herbalzym.com/2012/01/caffeine-competitively-inhibits-different-adenosine-receptors/)

A molécula de adenosina é liberada em locais de inflamação, o AMPc é um importante regulador da função dos monócitos/macrófagos. A produção de AMPc é estimulada por compostos tais como adenosina e “prostaglandina E”, que se ligam aos receptores associados à proteína G-específicos que ativam a adenil ciclase, neste sentido, o aumento do AMPc também pode modular os efeitos de citocinas inflamatórias em função dos neutrófilos (SULLIVAN; CARPER; MANDELL, 1995). A adenosina tem sido sugerida para ser uma reguladora fundamental da inflamação, estudos sugerem que o aumento da liberação de adenosina podem ser utilizados para diminuir inflamação (CRONSTEIN, 1994).

A partir dos pressupostos acima colocados pelos autores, a inflamação ocorre devido ao aumento na concentração de ATP, neste caso, um agonista ativando o Receptor A2A tem-se um aumento na produção de AMPc a partir do ATP (diminuindo

(26)

a concentração, diminui também a inflamação), consequentemente tendo um papel anti-inflamatório.

Fortes evidências a partir de ensaios in vitro e in vivo indicam que a adenosina pode atuar como um inibidor potente da inflamação. O uso medicinal da adenosina é limitada pelo seu rápido metabolismo e pelos seus efeitos cardiovasculares potentes; No entanto, é possível que novos agonistas altamente seletivos, possam ser desenvolvidos para diminuir a inflamação, sem os efeitos secundários indesejados (hipotensão, bradicardia) experimentadas pelos indivíduos tratados com adenosina. Mais recentemente, a atenção tem sido dirigida para os agentes que promovem a liberação de adenosina em locais inflamados para utilização no tratamento de doenças inflamatórias em desenvolvimento (CRONSTEIN, 1994).

Os efeitos anti-inflamatórios podem se manifestar quando ocorre a ativação do A2AAR, e análogos sintéticos de adenosina, podem promover a recuperação na

sepsia1. Isto pode reduzir a síntese de citocinas pró-inflamatórias em vários tipos de

células (SIVAK et al, 2016).

2.4.1 O desenvolvimento de agonistas farmacologicamente ideais para receptor de adenosina tipo 2A (A2AAR)

Os receptores de adenosina (RA’s) surgiram como novos alvos de drogas. A maior parte dos dados sobre a afinidade/potência e a seletividade dos ligantes de AR descritos na literatura foi obtido para a espécie humana. No entanto, os estudos pré-clínicos são na sua maioria realizados em camundongo ou em rato, e os agonistas de AR padrão e antagonistas são frequentemente utilizadas para estudos em roedores sem saber sua seletividade nas espécies estudadas (ALNOURI et al, 2015).

Considerando a identidade de sequência total ao nível de aminoácidos, a partes de A2AAR humano possui 49% de identidade de sequência de aminoácidos com A1AR,

58% com A2BAR humano, e apenas 41% com a A3AR humano. Dentro dos sete

domínios transmembranares, os resíduos críticos para a interação com o ligante estão localizados para a parte extracelular do receptor e são altamente conservadas, com uma identidade de 71% (RUIZ; LIM; ZHENG, 2014).

1 A sepsia ou o septicaemia: é uma infecção geral grave do organismo causado por germes

patogênicos. É uma inflamação sistêmica potencialmente fatal (síndrome de resposta inflamatória sistêmica ou SIRS) causada por uma infeção grave.

(27)

O A2AAR é o maior subtipo AR consistindo de 412 aminoácidos de seres

humanos e de 410 aminoácidos de rato e camundongo. A porcentagem de homologia de sequência de aminoácidos de A2AAR nas três espécies foi determinada como

sendo: 82% para humano x rato e humano x camundongo, e de rato x camundongo de 96% (RUIZ; LIM; ZHENG, 2014).

O A2AAR representa a maioria dos reguladores importantes da resposta

autoimune inata. A ativação do A2AAR inibe a liberação de mediadores

pró-inflamatórios por células imunes diminuindo assim reações inflamatórias (HASKÓ et al, 2000; LAPPAS; RIEGER; LINDEN, 2005), portanto, tem potencial como agentes inflamatórios, antirreumáticos, imunossupressores e sua atividade anti-inflamatória e efeitos hipotensivos tem sido recentemente obtida por abordagem pró-droga (FLÖGEL et al, 2012; ALNOURI et al, 2015).

A importância fisiológica de RA’s e seu grande potencial como alvos de drogas em consideração, é óbvio que a questão de diferenças de espécies é fundamental. Os ratos e camundongos, por exemplo, são os animais mais empregados em estudos pré-clínicos, é extremamente importante conhecer e considerar possíveis diferenças na potência e a seletividade dos ligantes do receptor que são aplicadas, como ferramentas farmacológicas para estudos de validação do alvo (ALNOURI et al, 2015). A descoberta recente da estrutura do A2AAR, permite uma compreensão

profunda do processo de reconhecimento molecular de agonistas de AR, proporcionando excelentes oportunidades para planejamento baseado em estrutura e ligante. Os agonistas A2AAR com perfil de forte seletividade estão em desenvolvimento

contínuo (RODRÍGUEZ et al, 2015b).

O estudo da estrutura cristalina nos dá uma oportunidade única de colocar estas descobertas anteriores em um contexto atômico 3D e usar o conhecimento das interações atômicas para prever novos ligantes substituídos ou compostos similares que possuem comportamento agonistas (HAUSLER et al, 2012; TOSH et al, 2012).

Como o próprio nome sugere, o ligante endógeno dos quatro receptores de adenosina é molécula de adenosina. Considerando que o anel purínico da adenosina é essencial para atividade agonista (ver Figura 3), diversos grupos de pesquisa têm estudado derivados de adenina no desenvolvimento de fármacos para os receptores (BEUKERS; MEURS; IJZERMAN, 2006). A própria molécula de adenina apresenta baixa seletividade pelos RA’s conforme estudos realizados por Bruns (1981) e Paz (2012).

(28)

Figura 3. Região do anel purínico responsável pela atividade agonista no A2AAR.

A adenosina (Adenoscan®) (1) e regadenoson (Lexiscan®) (11) são utilizados em imagiologia (refere às técnicas e processos usados para criar imagens do corpo humano para propósitos clínicos) de estresse do miocárdio e para o tratamento de taquicardia supraventricular agindo sobre A2AAR de vasos coronários sanguíneos que

leva à dilatação e uma queda na pressão arterial (CHENG, 2007; NAIR, 2011; CHEN; ELTZSCHIG, FREDHOLM, 2013).

O NECA (N-etilcarboxaminoadenosina) (2) e CGS-21680 (2-[p-(2-carbonil-etil)-feniletilamino]-5-N-etilcarboxaminoadenosina) (3) são agonistas A2AAR potentes em

todas as três espécies (rato, camundongo e humano), ambos os nucleosídeos mostraram afinidade semelhante. O CGS-21680 (3) é o melhor agonista A2AAR dos

compostos testados, mas a sua potência e, especialmente, a sua seletividade é moderada (ALNOURI et al, 2015), ver Figura 4.

NECA (2) possui efeito antifadiga no corpo humano (ZHENG; HASEGAWA, 2016), foi durante muito tempo considerado como um agonista do A2AAR seletivo, mas

esse ponto de vista não pode ser mais acolhido. Outro análogo de 2-substituído do NECA (2) e o HENECA (2-hexil-5-N-etilcarboxaminoadenosina) (4), também exibe seletividade no A2AAR, mas que também se liga e ativa os receptores A2A atípicos no

hipocampo de rato.

O Apadenoson (ATL146e ou Stedivaze) (5) foi desenvolvido como um novo agonista que é 50 vezes mais potente do que o CGS 21680 (3) no receptor humano (MONOPOLI et al, 1994; CUNHA; CONSTANTINO; RIBEIRO, 1997; RIEGER et al, 2001; FREDHOLM, 2003), é um agonista A2AAR altamente seletivo, sendo testado

para imagens de perfusão miocárdica. Em 2000, a Adenosine Therapeutics, desde então adquirida pela Forest Laboratories, licenciou Apadenoson da Universidade de Virginia. Em 2009, o primeiro ensaio clínico de fase III em imagiologia de perfusão

N O OH OH N N N NH2 OH Anel Purínico

(29)

miocárdica foi iniciado, seguido por um segundo ensaio de fase III em junho de 2011. No entanto, em maio de 2012, um maior desenvolvimento foi interrompido, e não foram relatados os dados clínicos (MÜLLER; JACOBSON, 2011; RUIZ; LIM; ZHENG, 2014), ver Figura 4.

Com a elucidação da estrutura cristalina GPCR, e designadamente, a estrutura cristalina do A2AAR com um antagonista ligado (ZM241385) têm sido relatados pelos

pesquisadores (JAAKOLA et al, 2008). Isso levou ao aumento dos esforços para cristalizar o receptor com outros ligantes, com destaque para os agonistas seletivos A2AAR. Subsequentemente, o agonista seletivo A2AAR, UK-432097 (6), foi usado para

sondar a estrutura interna do local ativo (XU et al, 2011).

O agonista seletivo UK-432097 (6) foi desenvolvido pela Pfizer, descoberto na pesquisa para os agonistas seletivos A2AAR para o tratamento de inflamação, e como

um inalante para o tratamento da doença pulmonar obstrutiva crônica. Em 2013, o composto foi encerrado a partir de II de ensaios clínicos de Fase seguinte pobres resultados de eficácia, possuindo atividade cancerígena (MANTELL et al, 2009; MÜLLER; JACOBSON, 2011). A estrutura ligada por agonista do A2AAR em complexo

com UK-432907 (6) foi resolvida utilizando um complexo A2AAR-T4L-DC humana

engenharia, onde T4 lisozima foi inserida IL3, e o C-terminal foi truncado por 96 resíduos de aminoácidos. O UK-432907 (6) exibiu a maior estabilidade térmica (temperatura de fusão 65°C) de agonistas testados rastreados para a estabilização do receptor (XU et al, 2011; SHONBERG et al, 2015), ver Figura 4.

A cavidade de ligação ao ligando de UK-432097 (6) demonstrou uma extensa rede de interações ligante-receptor, incluindo 11 ligações de hidrogênio, uma interação aromática de empilhamento (π-π), e numerosas interações de van der Waals não polares. Dado o núcleo bicíclico comum de UK-432097 (6) e a maioria dos ligantes do receptor de adenosina (incluindo ZM241385), a porção alinhada bem ao núcleo de estruturas cristalinas inativo A2AAR. Além disso, foi encontrada a estrutura

que se estende desde o núcleo bicíclico de um modo semelhante como ZM241385, e estão envolvidos em numerosas interações importantes que ancoram a molécula para a cavidade de ligação. A principal característica definidora foi a presença do anel de ribose de UK-432097 (6), que se insere profundamente para uma região predominantemente hidrófilo da cavidade de ligação e formam numerosas ligações de hidrogênios, que são importantes para a ligação de elevada afinidade dos agonistas A2AAR (XU, et al, 2011; SHONBERG et al, 2015).

(30)

Agonistas farmacologicamente importantes exibindo seletividade A2AAR têm

sido sintetizados, como por exemplo, o YT-146 (2-octynyl-adenosina) (7) e DPMA (N6-[2(3,5-dimetoxifenil)-2-(2-metilfenil) de etiol]-adenosina) (8) que demonstraram efeitos cardioprotetores (BRIDGES, 1989; YONEYAMA et al, 1992), enquanto CGS-21680 (3), com base na evidência de que a 2-substituição de NECA teve sua seletividade aumentada, tem sido utilizada para estudar a transmissão neuronal. No entanto, ao avaliar nos seres humanos, é menos potente e menos seletivo do que em ratos (HUTCHISON, 1990; FREDHOLM, 2003; DIÓGENES et al, 2004; MAYER et al, 2006). Binodenoson (MRE-0470 ou WRC-0470) (9), é um agonista A2AAR seletivo, era

um candidato clínico para imagiologia de perfusão miocárdica, desenvolvido pela King Pharmaceuticals, a empresa apresentou uma aplicação de nova droga New Drugs Application (NDA) em 2008, mas o pedido foi rejeitado pela Food and Drug Administration (FDA), órgão regulador, similar a Agência de Vigilância Sanitária (ANVISA) no Brasil. O desenvolvimento do Binodenoson parece ter sido interrompido após a Pfizer adquirir a King Pharmaceuticals, uma vez que Binodenoson (9) não está listado no pipeline2 da Pfizer (RUIZ; LIM; ZHENG, 2014).

O Sonedenoson (MRE-0094) (10) estava em desenvolvimento pela King Pharmaceuticals e tem mostrado promessa para úlceras do pé diabético e cicatrização de feridas (MÜLLER, 2011). No entanto, os ensaios clínicos não demonstraram a eficácia clínica desejada, e o seu desenvolvimento foi interrompido. Além disso, Forest Laboratories Inc. tem vindo a investigar agonistas do receptor A2A para o potencial

tratamento da infecção por Clostridium difficile (doenças gastrointestinais associadas a antibióticos) (RUIZ; LIM; ZHENG, 2014), ver Figura 4.

O agonista Regadenoson (11), licenciado como Lexiscan®, é um vasodilatador coronariano, que tem encontrado aplicação também em diagnóstico como um também agente radionuclídeo para imagiologia de perfusão miocárdica, sendo este aprovado pela FDA em 2008 e comercializado pela Astellas Pharma (GARNOCK-JONES; CURRAN, 2010; TOSH et al, 2012; RUIZ; LIM; ZHENG, 2014; PRETI et al, 2015), contudo, do dia 20 de novembro de 2013, a FDA advertiu sobre raro, mas grave risco de ataque cardíaco e morte com drogas teste de estresse nuclear cardíaca dentre eles o Lexiscan (regadenoson) e Adenoscan (adenosina) (FDA, 2013), ver Figura 4.

2 Metodologia de estratégias mercadológicas utilizados pelas empresas na produção de determinada

coisa, passando por diversas etapas, como se fosse um filtro para chegar na produção do produto final mais viável.

(31)

O BVT115959 agonista (estrutura não revelada) na fase clínica I demostrou que é seguro e bem tolerado, e os resultados de um estudo de fase clínica II iniciada em março de 2012, além disso, mostrou tolerabilidade e eficácia promissor nos pacientes diabéticos, também é candidato a uma nova terapia para a dor neuropática (MÜLLER; JACOBSON, 2011; RUIZ; LIM; ZHENG, 2014; PRETI et al, 2015).

O agonista ATL-1223 (estrutura não revelada), produzido pela Lewis and Clarck Pharmaceuticals (http://www.lncpharma.com/) possui propriedades anti-inflamatórias que ajudam na preservação a frio prolongada pós morte cardíaca, no tratamento de transplante, conforme testes realizados em suínos (LAPAR et al, 2011; WAGNER et al, 2016).

Na Figura 4 são ilustradas as estruturas dos principais agonistas farmacologicamente descobertos para o alvo de adenosina.

Figura 4. Estrutura dos principais agonistas A2AAR.

A utilização de agonistas do receptor A2A como agentes potenciais para o

tratamento de artrite reumatoide também tem sido proposta, mas não há relatórios clínicos ainda disponível (RUIZ; LIM; ZHENG, 2014).

(32)

2.5 QUÍMICA MEDICINAL E O PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS

Segundo a IUPAC, a química medicinal é definida como “uma disciplina baseada na química, envolvendo aspectos das ciências biológica, médica e farmacêutica, cuja missão é o planejamento, descoberta, invenção, identificação e preparação de compostos biologicamente ativos, o estudo do metabolismo, interpretação do mecanismo de ação a nível molecular e o desenvolvimento de relações entre a estrutura química e a atividade biológica (SAR)” (WERMUTH; GANELLIN; LINDBERG, 1998; LIMA, 2007a).

A química medicinal possui papel imprescindível na identificação e otimização de estruturas, assim como na compreensão das bases moleculares da ação de fármacos, se molda como uma ciência inter-, multi- e transdisciplinar, que permeia entre a química, a farmacologia, bioquímica, biologia molecular, bioinformática, toxicologia, física, entre outras (IMMING, 2008).

Os trabalhos brasileiros na área da Química Medicinal são significativos a partir da década de 90, intensificando nos anos 2000. Esse dado é tendencioso, pode sugerir a interpretação errônea de que a Química Medicinal brasileira tenha iniciado nesse período, entretanto, conforme Lima (2007a), os primeiros trabalhos de Química Medicinal datam da década de 70.

Desde os primórdios da civilização, a procura de uma terapêutica para as principais patologias que afetam a humanidade tem sido uma preocupação constante (CALIXTO; SIQUERIA, 2008). Os povos antigos tentavam curar doenças comendo, bebendo ou aplicando substancias, muitas vezes extratos de plantas, agora referidos como fitoterápicos. Originalmente, as tentativas de descobrir novos medicamentos e cura foram baseadas em intuição e observações empíricas. Durante o século passado, no entanto, a busca por novos fármacos mudou drasticamente. Avanços no conhecimento da biologia humana, novas tecnologias e, mais recentemente, considerações de mercado alteraram a forma como os fármacos estão sendo descobertos (TSINOPOULOS; MCCARTHY, 2012).

Durante a primeira parte do século passado, quando o conhecimento e a tecnologia eram limitados, houve mínimo ou nenhum planejamento estratégico e o desenvolvimento de novos fármacos foi dominado pela “sorte científica”. Entretanto, o avanço na compreensão da biologia e química do organismo humano permitiu que se desenvolvessem soluções específicas para o tratamento de inúmeras doenças (TSINOPOULOS; MCCARTHY, 2012).

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O processo de planejamento e desenvolvimento de novos fármacos é complexo, envolve várias áreas do conhecimento e tipos de ensaios. Os ensaios desenvolvidos durante essas fases visam responder uma série de questionamentos científicos sobre um novo composto, como a avaliação de sua potência, eficácia, segurança e estabilidade. Cada uma dessas etapas soma custos e demanda tempo, modelando todo o panorama da indústria farmacêutica (PHRMA, 2007). Por esse motivo, o espaço químico investigado precisa ser reduzido. O conjunto de estratégias e ferramentas que se baseiam no conhecimento de um alvo molecular e seus planejamento de fármacos. A área da ciência que racionaliza o estudo de propriedades biológicas, farmacológicas e das relações estrutura-atividade de fármacos é denominada química medicinal (NOGUEIRA; MONTANARI; DONNICI, 2009).

Os grandes avanços da genômica e proteômica nas últimas décadas, associados à evolução das técnicas de cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear (RMN), contribuíram bastante para elucidação das estruturas de proteínas envolvidas nos mais diversos processos biológicos (BERMAN et al, 2013). Além disso, a introdução de técnicas e recursos computacionais permitiram a visualização e o estudo de proteínas e ligantes, o que revolucionou todo o processo de PD&I de novos fármacos (YOUNG, 2009).

O conhecimento da estrutura do alvo molecular ou do complexo ligante-alvo permite o planejamento e desenvolvimento de inibidores enzimáticos ou agonistas/antagonistas de receptores, através do processo de complementaridade molecular (estéreo/eletrostática). Neste processo, planeja-se um candidato com propriedades estruturais adequadas para o reconhecimento molecular e aumento da afinidade pelo receptor biológico.

2.5.1 Metodologias aplicadas no planejamento e desenvolvimento de fármacos 2.5.1.1 BindingDB e o Protein Data Bank (PDB)

Lançado na web em 2000, BindingDB (www.bindingdb.org) é o primeiro banco de dados acessível ao público, possui informações de afinidade proteína-ligante calculados. Ele é projetado para suportar o acesso a conjuntos de dados focados, como os dados de afinidade associados a um determinado alvo de drogas, bem como análises expansivas aproveitando a abrangência de um grande e crescente conjunto

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de dados. As propriedades de dados da BindingDB atualmente representam cerca de 1,2 milhão de afinidades de moléculas pequenas e proteínas medidas, envolvendo cerca de 490 000 moléculas pequenas e vários milhares de proteínas (5500 unidades) (LIU et al, 2007; GILSON et al, 2016).

Desenvolvido em 1971, o Protein Data Bank (PDB - www.pdb.org) consiste em um repositório mundial de livre acesso para arquivos sobre a disposição tridimensional (3D) de macromoléculas, como proteínas, enzimas, cadeias de ácidos nucleicos. Estas macromoléculas podem estar isoladas ou complexadas à micromolécuas, como substratos, cofatores enzimáticos e/ou fármacos. Este recurso é alimentado pela informação sobre as formas 3D de proteínas, ácidos nucleicos, e montagens complexas que auxilia estudantes e pesquisadores a entender todos os aspectos da biomedicina, da agricultura, da síntese de proteína para a saúde e doenças (BERMAN et al, 2013, TAVARES et al, 2015).

2.5.1.2 Farmacóforo

O conceito de farmacóforo foi inicialmente introduzido em 1909 por Ehlich, como “uma estrutura molécula (phóros) que carrega características essenciais, responsáveis pela ação biológica de um fármaco (pharmacon’s) (RODRIGUES, 2012). De acordo com a IUPAC, “o modelo farmacóforo é um conjunto de recursos estéricos e eletrônicos que é necessário para garantir az interações supramoleculares ideais com um alvo ativando (ou bloqueando) a sua resposta biológica (WERMUTH; GANELLIN; LINDBERG, 1998; YANG, 2010).

O farmacóforo representa o conjunto de domínios funcionais das moléculas ligantes em comum, através dos quais se define os tipos de interação que fazem com o sítio receptor. A análise por métodos computacionais, dos possíveis conjuntos de grupos farmacofóricos associados a cada molécula ativa, permite a derivação do padrão farmacofórico comum ao conjunto de análogos ativos em questão, é um arranjo tridimensional (3D) de características que são essenciais para uma molécula ligante, a fim de interagir com um receptor de modo específico. A identificação de um farmacóforo pode servir como um modelo importante no desenvolvimento racional de fármacos, uma vez que pode auxiliar na descoberta de novos compostos que pode ligar-se a um receptor alvo (INBAR et al, 2007).

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Já Barreiro e Fraga (2008), definem o Farmacóforo como um conjunto de características eletrônicas e estéricos que identifica um ou mais grupos funcionais ou subunidades estruturais, necessários ao melhor reconhecimento molecular pelo receptor e, portanto, para o efeito farmacológico. Farmacóforo não é uma molécula real, nem associações de grupos funcionais; ao contrário, é um conceito abstrato que representa as diferentes capacidades de interações moleculares de um grupo de compostos com o sítio receptor e pode ser considerado como a região molecular do fármaco essencial à atividade desejada.

O farmacóforo inclui todas as principais características envolvidas na interação do ligante com o sítio receptor. Através desse conhecimento alguns grupos químicos podem ser incorporados a determinados ligantes a fim de elevar a especificidade, visando otimizar sua atividade biológica. Na prática, o farmacóforo engloba características químicas específicas, tais como potencialidade para realização de ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas e hidrofóbicas, entre outras (RODRIGUES, 2012).

2.5.1.3 Derivação do Farmacóforo via Servidor Web Pharmagist e o Programa Discovery Studio

Conforme Schneidman-Duhovny (et al, 2008) e Silva (et al, 2015), o servidor web PharmaGist gera farmacóforos 3D a partir de um conjunto de moléculas que são conhecidos por se ligarem a um receptor alvo comum. O método procura de forma eficiente por possíveis farmacóforos e relata os mais altos valores de “scores”. Os farmacóforos candidatos são detectados por alinhamento múltiplo flexível dos ligantes de entrada, onde a flexibilidade dos ligantes é tratada de forma expressa e de uma maneira determinista no processo de alinhamento. Outra vantagem importante do método é a capacidade de detectar farmacóforos comuns para subconjuntos de ligantes de entrada, uma característica que faz PharmaGist tolerante a “outliers” e vários modos de ligação.

No Discovery Studio (BIOVITA FOUNDATION, 2007), um farmacóforo é definido como as características essenciais ou subestruturas químicas, além de suas respectivas localizações tridimensionais que são responsáveis pelas semelhantes atividades biológicas de um conjunto de compostos. Normalmente, as características farmacofóricas são grupos hidrofóbicos, aromáticos, aceitadores de ligação de

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hidrogênio, doadores de ligação de hidrogênio, ionizáveis positivos e ionizáveis negativos, entre outros. O programa Discovery Studio é capaz de realizar uma rápida modelagem e identificação do farmacóforo, com ou sem a presença da estrutura-alvo.

2.5.1.4 Modelagem Molecular

A modelagem molecular é aplicada no planejamento de fármacos, consistindo na geração, manipulação ou representação de estruturas moleculares e cálculo das propriedades físico-químicas associadas. Segundo a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), modelagem molecular é a investigação das estruturas e das propriedades moleculares pelo uso de química computacional e técnicas de visualização gráfica, visa fornecer uma representação tridimensional, sob um dado conjunto de circunstancias (WERMUTH; GANELLIN; LINDBERG, 1998).

Os objetivos da modelagem molecular, de forma mais especifica, podem proporcionar a visualização tridimensional e realizar a análise conformacional de fármacos; analisar o tamanho e o formato do grupo farmacofórico; verificar a importância da natureza e o grau de substituição de grupos funcionais; relacionar a estrutura e as propriedades físicas de uma mesma série de fármacos; observar os aspectos estereoquímicos dos fármacos e sua relação com atividade biológica, bem como prever os mecanismos moleculares envolvidos na ação dos fármacos (CARVALHO et al, 2003).

A modelagem molecular é essencial para a concepção e descoberta de drogas. Atualmente, modelagem molecular é uma ferramenta muito importante para a descoberta de medicamentos e otimização dos protótipos existentes e desenho racional de candidatos a fármacos (SANTOS et al, 2015).

Estratégias de otimização computacionais de medicamentos foram utilizadas para o agente antifúngico Tioconazol R (Figura 5); com o objetivo de aumentar a solubilidade e polaridade do medicamento administrado por via tópica, modificações na estrutura química do composto foram inseridas através da introdução de substituinte polar (-OH) e substituição de anéis heterocíclicos (imidazol e tiofeno) por sistemas polares (anel triazol) e deram origem ao fármaco Fluconazol R (Figura 5), que apresentou maior solubilidade e atividade contra infecções, administrado por via oral (PATRICK, 2001).

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Figura 5. Estruturas do Tiaconazol R e Fluconazol R, respectivamente.

2.5.1.5 Banco de Compostos Comerciais

A ZINC Database contém mais de 35 milhões de compostos, essa base de dados é atualizada regularmente e pode ser usada gratuitamente no próprio web-server ou por meio de download, foi desenvolvida por John Irving Laboratório Shoichet no Departamento de Produtos Farmacêutico-Químico da Universidade da Califórnia em San Diego (IRWIN; SHOICHET, 2005; IRWIN et al, 2012), pode ser obtida através do site: http://zinc.docking.org/.

A base Chembridge oferece duas bibliotecas, complementares DIVERSet™ de 50.000 compostos cada. Ambas as bibliotecas DIVERSet™ (DIVERSet™-EXP e a DIVERSet™-CL) são projetadas para fornecer a maior cobertura do espaço farmacóforo dentro de 50.000 compostos, mantendo a diversidade estrutural. A abordagem de biblioteca DIVERSet™ tem sido aplicada com sucesso em várias versões da biblioteca DIVERSet™-EXP e DIVERSet™-CL, desde o seu lançamento inicial e levou a mais de 100 citações em publicações científicas com revisão por pares, essas bibliotecas foram concebidas para serem complementares de modo que elas possam ser combinadas para criar uma biblioteca de diversidade com mais de 100.000 compostos comerciais (CHEMBRIDGE CORPORATION, 2011).

2.5.1.6 Triagem Virtual (Screening Virtual)

Uma das estratégias a serem utilizadas no planejamento racional de fármacos é a triagem virtual. É uma técnica computacional usada para busca e descoberta de novos candidatos a fármacos a partir de um banco de dados de compostos. Seu objetivo é direcionar a busca por compostos com propriedades desejadas (potência,

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