TRIAGEM VIRTUAL DE NOVOS COMPOSTOS COM POTENCIAL ATIVIDADE

Para a descoberta de novos potenciais candidatos a fármacos anti- inflamatórios, foram utilizadas a base de dados da ZINC (Zinc_Drug Database, Zinc_Natural_Stock e Zinc_FDA_BindingDB) e a base Chembridge (DIVERSet™-EXP e a DIVERSet™-CL) de compostos comercialmente disponíveis para triagem virtual. Neste trabalho dois métodos de diferentes princípios de triagem virtual foram aplicados:

1) Busca e triagem virtual baseada em farmacóforo tendo como estratégia a construção do modelo farmacofórico usando o programa Discovery Studio 4.0;

2) Busca e triagem virtual baseada em ligante (similaridade de forma e eletrostática) usando os programas ROCS e EON, respectivamente;

3.5.1 Triagem virtual baseada em farmacóforo (pharmacophore-based virtual

screening)

A triagem virtual foi realizada com as bases ChemBrigde_DIVERSet, ChemBrigde_DIVERSet_Exp, Zinc_Drug Database, Zinc_Natural_Stock e Zinc_FDA_BindingD no programa Discovery Studio 4.0, usando a melhor hipótese do modelo farmacofórico obtido como restrição para pesquisar a base de dados. Inicialmente, para cada molécula na base de dados, o método de geração de confôrmero “Fast” com uma tolerância de energia máxima de 20 Kcal/Mol, duas opções de busca no banco de dados foram empregadas no Discovery Studio 4.0, “Fast/Flexible” e “Best/Flexible” (MANTOANI et al, 2014).

A primeira filtragem foi feita com o intuito de obter as moléculas Top 5000 (FitValue) para cada base (geração de confôrmero “Fast”), na sequência, os compostos com melhores ajustes aos modelos farmacofóricos foram selecionados. Posteriormente, o experimento de triagem virtual (segunda filtragem) foi realizado usando a opção “Best/Flexible” para obter os Top 100 (FitValue) de cada base, e para

isso foi definido o “Maximum Omitted Features” opção para “Zero”, a melhor hipótese do modelo farmacofórico obtido foi utilizado para triagem dos compostos do banco de dados que se encaixam em todas as características do modelo farmacofórico (ver Figura 6).

Os cálculos dos valores foram baseados em subestruturas químicas coincidem com as restrições das localizações das características farmacofóricas e os seus desvios de distância dos centros. Altos valores de ajuste indicam bons resultados, seguindo esse critério, os melhores compostos classificados em relação às restrições farmacofóricas foram filtradas para o modelo farmacofórico investigado, e essas moléculas resultantes foram novamente filtrados em termo de predições das propriedades farmacocinéticas usando o programa QikProp e toxicológica usando o programa DEREK, respectivamente.

3.5.2 Triagem virtual baseada em ligante (ligand-based virtual screening)

Neste método de sobreposição baseado na forma, as moléculas são alinhadas pela maximização do volume de sobreposição entre uma estrutura pivô (neste caso será usada a molécula UK-432097) e cada molécula contida na base de dados para a obtenção das melhores moléculas para serem posteriormente filtradas no programa Qikprop e Derek.

O UK-432097 foi usado para alinhar (molécula de referência), com os compostos da base de dados de melhor pontuação gerada pelo programa ROCS a partir da função de escore “ComboScore”. Estes compostos ora selecionados foram então usados em experimentos posteriores para análise de similaridade eletrostática, por intervenção do programa EON. O ROCS realiza uma sobreposição baseada na forma e pontuação dos alinhamentos obtidos. Como já mencionado anteriormente, o programa EON não executa alinhamentos e depende, portanto, do resultado do alinhamento realizado com o programa ROCS (GRANT; GALLARDO; PICKUP, 1996). As bases de dados foram inicialmente filtradas via triagem farmacofórica para obter as Top 5000 (FitValue) de cada base, após isso, foram ranqueadas usando o algoritmo do programa ROCS 2.4.1 (HAWKINS; SKILLMAN; NICHOLLS, 2007; ROCS, 2015) para gerar e pontuar as sobreposições tridimensionais da base de dados com a estrutura de referência do agonista UK-432097, utilizando duas etapas de triagem para obter as Top 2000 (FitValue) de cada base, (ver Figura 6).

Após o alinhamento ter sido realizado, foram selecionados os Top2000 dos melhores compostos de cada base de dados estudada que serviram como uma pequena e nova “base de dados” para os cálculos realizados posteriormente com o programa EON. Os compostos “Top2000” resultante da filtragem do UK-432097 foram alinhados através da maximização do volume de sobreposição, na qual também é levada em conta a sobreposição adequada de grupos funcionais com propriedades semelhantes (por exemplo, aceitadores de ligação de hidrogênio, anéis aromáticos, etc.) em ambos os cálculos de alinhamento e sobreposição.

Dentre os compostos selecionados, o “ComboScore” (classifica os compostos por uma combinação de sua similaridade por forma e similaridade química; é a soma da sobreposição da forma e da cor dos compostos), considerando uma escala que varia de 0 a 2, onde 2 é a melhor sobreposição possível e “0” significa nenhuma similaridade; o “TanimotoCombo” (Tanimoto da forma + Tanimoto da cor) varia para uma escala de 0 a 2, onde 2 representa uma correspondência exata de ambas as formas e grupos funcionais entre duas moléculas; o “ShapeTanimoto” (classificação de similaridade baseada apenas na forma, ele é a medida padrão da similaridade por forma) varia, em escala de 0 a 1, onde 1 representa uma correspondência exata (GRANT; GALLARDO; PICKUP, 1996).

Assim, foram selecionados os “Top100” dos melhores compostos classificados e similares ao UK-432097 baseados na classificação eletrostática, essa classificação considera uma pontuação Eletrostática de Tanimoto (ET_combo), além de calcular novas cargas parciais para as moléculas de entrada usando o MMFF94, que é a soma do coeficiente eletrostático de Tanimoto Poisson-Boltzmann (ET_pb) e o “shape Tanimoto” (ST). A pontuação “ET_combo” para os melhores “Top100” compostos que obtiveram resultados mais próximos de 2, e representam a melhor sobreposição possível, e 0 significa nenhuma similaridade; já o EON_shape_Tanimoto, uma pontuação do tipo Tanimoto, onde valores mais próximos de 1 representam uma correspondência/identidade exata (GRANT; GALLARDO; PICKUP, 1996).

Os resultados do ROCS e do EON são altamente dependentes da molécula pivô. Para identificar potentes agonistas do receptor A2AAR, é importante conhecer as

exigências químicas desses agonistas, assim como, as similaridades estruturais e eletrostáticas com compostos ativos conhecidos de referência.

No final do processo foram selecionados dentre os 2000 melhores compostos, apenas os “Top100” de cada base de dados, perfazendo assim um total de 500

compostos. Seguindo este critério, as melhores moléculas classificadas serão novamente filtradas em termo de predições das propriedades farmacocinéticas usando o programa QikProp, e toxicológica usando o programa DEREK, como pode ser observado na Figura 6.

Figura 6. Triagem virtual baseada em ligantes (farmacóforo e ligante) usando os programas Discovery Studio 4.0, ROCS V2.4.1 (Rapid Overlay of Chemical Structures – similaridade por forma) e EON (similaridade eletrostática).

3.6 DETERMINAÇÃO DAS PROPRIEDADES FARMACOCINÉTICAS E TOXICOLÓGICAS DOS NOVOS COMPOSTOS SELECIONADOS

Estudos farmacocinéticos e toxicológicos foram realizados em compostos resultantes da triagem virtual (Top 100) de cada base de compostos comerciais de acordo com as seguintes propriedades farmacocinéticas (#star, "Regra das Cinco", absorção intestinal humana, QPPCaco, QPPMDCK, QPlogPo/w, CNS e QPlogBB) e toxicológicas (Previsão de Alerta de Toxicidade via grupos toxicofóricos), foram preditas com Shrodinger's Suite QikProp (SCHRODINGER, 2011; LAOUI;

POLYAKOV, 2011 ) e Derek Nexus Software (LHASA LIMITED, 2007; MARCHANT; BRIGGS; LONG, 2008), respectivamente.