DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BARTONELOSE EM MACACOS BUGIOS DE CATIVEIRO NO ESTADO DE SÃO PAULO

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XIII CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA – FCAV/UNESP

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Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 9,2017. Número especial. (ISNN 2178-9436).

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BARTONELOSE EM

MACACOS BUGIOS DE CATIVEIRO NO ESTADO DE SÃO

PAULO

MOLECULAR DIAGNOSIS OF BARTONELLOSIS IN HOWLER

MONKEYS IN THE STATE OF SÃO PAULO

Cristiane Maria Fernandes de Melo(1)

Natalia Serra Mendes(2)

Jorge Alfonso Morales-Donoso(3)

Victória Valente Califre de Mello(4)

Simone de Jesus Fernandes(5)

Inalda Angelica de Souza Ramos(6)

Marcos Rogério André(7)

Márcia Ferreira da Rosa Sobreira(8)

Resumo

O objetivo deste trabalho foi realizar a detecção molecular de Bartonella spp. em amostras de sangue de macacos bugios, pela PCR convencional (cPCR), baseados no fragmento gênico, gene citrato-sintase (gltA). O experimento foi realizado em zoológicos e criatórios de primatas no Estado de São Paulo. Foram colhidas amostras de sangue de 50 macacos bugios, através da veia cefálica, em tubos de ensaio com EDTA e submetidas ao congelamento de 80 °C. Após a extração de DNA, realizou-se ensaios de cPCR para o fragmento gênico (350 pb) do gene gltA de Bartonella spp. De 50 macacos bugios avaliados, nenhum animal amostrado mostrou-se positivo para Bartonella spp.

Palavras-chave: Bartonella, Primatas, PCR

Abstract

The objective of this work was to perform the molecular detection of Bartonella spp. In blood samples from howler monkeys by conventional PCR (cPCR), based on the gene fragment, citrate synthase gene (gltA). The experiment was carried out in zoos and primate breeding in the State of São Paulo. Blood samples were collected from 50 howler monkeys through the cephalic vein in EDTA test tubes and subjected to 80 ° C freezing. After DNA extraction, ________________________________________________________________________________

1_{Doutoranda no Programa de Medicina Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista}

“Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castelane, S/N - Vila Industrial, Jaboticabal - SP, 14884-900, E-mail: crisalicemelo@gmail.com , Tel: (16) 98111-5737; 2._{Mestranda no Programa de Microbiologia Agropecuária, Faculdade de Ciências}

Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP); 3 _{Mestre em Genética e Melhoramento}

Animal, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), 4

Mestranda no Programa de Microbiologia Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), 5_{Mestranda no Programa de Microbiologia Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrarias e}

Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), 6_{Doutoranda no Programa de Medicina}

Veterinária, Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), 7

Professor Doutor no Departamento de Patologia Animal, Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) 8_{Professora Doutora de Patologia Clínica no Centro Universitário Moura Lacerda, Faculdade}

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cPCR assays were performed for the gene fragment (350 bp) of the gltA gene of Bartonella cephalic vein in EDTA test tubes and subjected to 80 ° C freezing. After DNA extraction, cPCR assays were performed for the gene fragment (350 bp) of the gltA gene of Bartonella spp. Of 50 howler monkeys evaluated, no sampled animals were positive for Bartonella spp.

Keywords: Bartonella, Primates, PCR.

1. Introdução

Bartonella spp. são hemoparasitas de ampla variedade de hospedeiros, tendo vários

mamíferos como reservatórios, e vários membros do gênero são patógenos de importância médica e veterinária (HUANG et al., 2011). São classificados como bacilos aeróbicos, fastidiosos, gram-negativos (ZEAITER et al., 2002). Diante disto, o trabalho teve como objetivo realizar a detecção molecular de Bartonella spp. em macacos bugios de cativeiro no Estado de São Paulo.

2. Materiais e Métodos

Este estudo foi aprovado pelo Sistema de Autorização da Biodiversidade (SISBIO, n° de cadastro: 51662-2) e pelo Comitê de Ética de Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual Paulista-Júlio de Mesquita (protocolo: 5.595/16). No período de abril de 2016 a fevereiro de 2017, colheu-se sangue 50 macacos bugios Alouatta no Estado de São Paulo, em criatórios e Zoológicos, que atuam como CETAS (Centro de Triagem de Animais Selvagens) e recebem animais apreendidos pela polícia ambiental: Projeto Mucky (Itu), nos zoológicos de Sorocaba, Guarulhos, Ilha Solteira, Catanduva, Olímpia, Guaíra, Ribeirão Preto, CEMPAS Botucatu. Após a captura, os animais foram sedados com Zoletil (50 mg/kg) e realizada a antissepsia da região da veia cefálica com chumaço de algodão embebido em álcool iodado, para coleta de 5 mL de sangue através de punção venosa e aspiração em seringas descartáveis, submetidas ao congelamento de - 80 °C. Depois de cada coleta, foi realizada a extração de DNA genômico com o Kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Valência, Califórnia, USA), de acordo com as recomendações do fabricante.

Em seguida, as amostras foram submetidas à PCR convencional, analisando-se o gene endógeno, GAPDH (450 pb), utilizando os oligonucleotídeos iniciadores GAPDH-F (5’- CCTTCATTGACCTCAACTACAT-3’) e GAPDH-R (5’- CCAAAGTTGTCATGGATGACC-3’), e as seguintes concentrações de reagentes: 5 μLde

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DNA alvo, tampão da PCR (PCR Buffer 10X- 100nM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM KCl), 1,0 mM Cloreto de Magnésio (Life Technologies®), 0,6 mM deoxinucleotídeos (dNTPs), 1,5 U Taq DNA Polymerase (Life Technologies®), 1,25 μL de Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Aldrich®). Os ciclos de amplificação foram de: 94ºC por 5 minutos, seguidos por 35 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 50ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto, seguido por uma extensão final a 72ºC por 5 minutos (BIRKENHEUER et al., 2003). Posteriormente, as amostras positivas no gene endógeno, foram submetidas a ensaios de cPCR para o fragmento gênico:

gltA de Bartonella spp. (NORMAN et al., 1995 e BIRTLES e RAOULT, 1996), com

utilização na PCR de 0.5 µM de cada oligonucleotídeo iniciador, (BhCS.1137 (AATGCAAAAAGAACAGTAAACA) e CSH1f (GCGAATGAAGCGTGCCTAAA), 5 µL de DNA, 25 µL de buffer, 1.0 mM MgCl2, 0.8 mM deoxynucleotide triphosphate (dNTPs), 1.0 U Taq DNA Polymerase (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), para controle positivo utilizou-se uma amostra sabidamente positiva de obtido de um felino naturalmente infectado (número de acesso no GenBank: KC331015) e para controle negativo foi utilizado 5 µL de água ultrapura esterelizada. As amostras foram posteriormente submetidas a reação no termociclador. Os produtos amplificados por meio dos ensaios de cPCR foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,0% corado com brometo de etídeo (0,5 μL/mL) em tampão de corrida TEB pH 8,0 (44,58 M Tris-base; 0,44 M ácido bórico; 12,49 mM EDTA). A eletroforese foi realizada a 90V/150mA durante 60 minutos. Para a determinação dos produtos, foi utilizado um marcador de peso molecular de 100 pares de base (Life Technologies®). Os resultados foram visualizados e analisados por meio de um transiluminador de luz ultravioleta (ChemiDoc MP Imaging System, Bio Rad®).

3. Resultados e Discussão

Todos os 50 macacos bugios avaliados mostraram-se negativos para Bartonella spp. Li et al., (2013), trabalhando com Macaca mulatta e Macaca fascicularis na China, detectaram

Bartonella quintana, por meio da PCR, sendo amostras positivas para o gene gltA.

No Japão, Sato et al., (2015), descreveram em Macaca fusca a infecção por Bartonella

quintana, onde os animais apresentaram bacteremia alta, mesmo sem apresentar sinais

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gorilla gorilla, sugerindo que estes animais atuam como reservatórios. No Brasil, Bonato et

al., (2015), ao amostrarem primatas na Amazônia, detectaram amostras negativas, sendo através da PCR em tempo real, relacionadas ao gene NuoG.

Estudo em seres humanos, com amostras de sangue no Brasil, mostraram que 3% dos indivíduos eram bacterêmicos para Bartonella spp., quando testado por um líquido de enriquecimento de cultura antes da realização da PCR (PITASSI et al., 2015). A cultura líquida em placas de ágar, seguida por amplificação de DNA utilizando PCR pode facilitar o crescimento e detecção de tipos selvagens específicos de Bartonella (DUNCAN et al., 2007).

5. Conclusão

Este trabalho contribuiu na busca de possíveis reservatórios de Bartonella spp. em diferentes localidades do Estado de São Paulo, podendo-se confirmar através da PCR convencional, que as amostras colhidas foram negativas, em relação a estas localidades. Outro método que poderia ser empregado para diagnóstico seria o isolamento e cultivo dos agentes em questão, contribuindo para uma melhor caracterização molecular e antigênica dos patógenos, através de estudos futuros.

Apoio Financeiro:

Fundação CAPES, Ministério da Educação.

Referências

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