Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory
25 72408
TESTE PARA A CONFIRMAÇÃO DE HBs Ag EM SORO OU PLASMA HUMANOS
883665 – 2013/12
ÍNDICE
1. UTILIZAÇÃO PREVISTA ... 3
2. PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO ... 3
3. REAGENTES ... 3
4. AVISOS E PRECAUÇÕES ... 4
5. AMOSTRAS ... 5
6. PROCEDIMENTO ... 5
7. LIMITAÇÃO DO TESTE ... 7
8. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ... 7
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 9
1. UTILIZAÇÃO PREVISTA
O ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory é utilizado para confirmar a presença de Ag de superfície da hepatite B (HBs Ag) em amostras de soro ou plasma humanos consideradas reativas pelo ensaio de rastreio Monolisa™ HBs Ag ULTRA (códigos 72346/72348).
2. PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory utiliza o princípio de neutralização pela adição em excesso de anticorpos a anti-HBs (diluente anti-HBs: reagente de neutralização) dos Ag HBs encontrados em amostras de soro ou plasma humanos.
Recomenda-se o teste repetido de amostras consideradas positivas pelo ensaio de rastreio Monolisa™ HBs Ag ULTRA com os reagentes do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory
Caso uma amostra seja HBsAg positiva, os anticorpos anti-HBs no reagente de neutralização saturam os determinantes de antigénio HBs da amostra que já não conseguirão unir-se ao anticorpo fixado na fase sólida. Será observada uma diminuição na densidade ótica ao comparar a mesma amostra na qual o reagente de neutralização é substituído pelo diluente de controlo negativo que não contém anticorpos anti- HBs. Serão analisadas várias diluições da amostra, conforme necessário, para ter em consideração variações na concentração de HBs Ag.
Este teste inclui os seguintes passos de reação:
1) Incubação dos controlos e amostras positivas em HBs Ag com o reagente de neutralização e o conjugado na presença de anticorpos anti-HBs fixados na fase sólida.
Por cada amostra são fornecidas cavidades de controlo através da substituição do reagente de neutralização com o diluente de controlo negativo.
O resto do procedimento é idêntico para o protocolo para o kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA:
2) Lavagem e desenvolvimento da atividade da enzima ligada à fase sólida através da adição do substrato.
3) Paragem do passo de desenvolvimento, seguida da leitura das densidades óticas a 450/620-700 nm e interpretação dos resultados.
3. REAGENTES
3.1. Descrição
Identificação no rótulo Descrição
Apresentação /Preparação
72408
RA Neutralization reagents
Reagentes de neutralização
Tampão Tris NaCl (pH 8.0) com soro de ovelhas e soro humano negativo em antigénio HBs e em anti-HCV e anticorpos anti-HIV1/2 e suplementado com anticorpos anti-HBs.
Conservante: ProClin™ 300 (0,25%)
1 frasco 0,7 ml Pronto a ser
utilizado
RB Negative control diluent
Diluente de controlo negativo
Tampão Tris NaCl (pH 8.0) com soro de ovelhas e soro humano negativo em antigénio HBs e em anti-HCV e anticorpos anti-HIV1/2.
Conservante: ProClin™ 300 (0,25%)
1 frasco 0,7 ml Pronto a ser
utilizado
RC Sample diluent
Diluente de amostra
Solução salina fisiológica de 0,85%.
Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)
1 frasco 27 ml Pronto a ser
utilizado
3.2. Requisitos de armazenamento e manuseamento Este kit deve ser armazenado a +2-8 °C.
Cada item do kit preservado a +2-8 °C pode ser utilizado até à data de validade indicada na embalagem (salvo indicação em contrário). Após a abertura e na ausência de contaminação, os reagentes RA, RB e RC conservados a +2-8 °C podem ser utilizados até à data de validade indicada na etiqueta.
4. AVISOS E PRECAUÇÕES
Para utilização em diagnóstico in vitro. Para utilização por profissionais de saúde.
4.1. Precauções de Saúde e Segurança
• Este kit de teste apenas deve ser manuseado por pessoal qualificado, com formação em procedimentos laboratoriais e familiarizado com os respetivos potenciais perigos. Use vestuário de proteção, luvas e proteção ocular/facial adequadas e manuseie de acordo com as Boas Práticas Laboratoriais exigidas.
• O material de origem humana utilizado para a preparação dos reagentes RA e RB foi testado e considerado negativo em termos de antigénio HBs e anticorpos anti-HIV1, anti-HIV2 e anti-HCV.
Nenhum método de teste conhecido pode oferecer total garantia da ausência de agentes infeciosos.
Por conseguinte, todos os derivados de sangue humano, reagentes e amostras humanas devem ser manuseados como meios capazes de transmissão de doença infeciosa, cumprindo as Precauções Universais recomendadas para agentes patogénicos transmissíveis pelo sangue, conforme definido pelos regulamentos locais, regionais e nacionais.
• Salpicos biológicos: Os salpicos de material de origem humana devem ser tratados como potencialmente infeciosos.
Os salpicos que não contenham ácido devem ser imediatamente descontaminados, incluindo a área salpicada, os materiais e quaisquer superfícies ou equipamento contaminados, com um desinfetante químico adequado que seja eficaz para os resíduos biológicos potencialmente perigosos das amostras envolvidas (normalmente, uma diluição de 1:10 de lixívia de uso doméstico, 70-80% de etanol ou isopropanol e iodofor, como Wescodyne™ Plus a 0,5%, etc.), devendo ser secos com um pano.
Salpicos que contenham ácido devem ser absorvidos adequadamente (limpos com um pano) ou neutralizados e a área deve ser enxaguada e limpa com um pano até ficar seca; poderá ser necessário eliminar os materiais utilizados para limpar os salpicos como resíduos biologicamente perigosos. Em seguida, a área deverá ser descontaminada com um dos desinfetantes químicos.
NOTA: Não coloque soluções que contenham lixívia na autoclave!
• Elimine todas as amostras e materiais utilizados para realizar o teste como se estes contivessem um agente infecioso. Os resíduos laboratoriais, químicos ou biológicos perigosos devem ser manuseados e eliminados em conformidade com todos os regulamentos locais, regionais e nacionais.
• Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionados com alguns componentes químicos deste kit de teste, consulte a(s) ilustração(ões) indicada(s) nos rótulos e as informações fornecidas no final das instruções de utilização. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em www.bio-rad.com.
4.2. Precauções relacionadas com o protocolo 4.3. Preparativos
A fiabilidade dos resultados depende da implementação correta das Boas Práticas Laboratoriais que se seguem:
• Não utilize reagentes expirados.
• Não misture nem associe reagentes de diferentes lotes num único teste.
• Antes da utilização, aguarde 30 minutos até que os reagentes estabilizem à temperatura ambiente (18- 30 °C).
• Utilize objetos de vidro minuciosamente lavados e enxaguados em água destilada ou, de preferência, material descartável. (Consulte as informações inseridas na embalagem do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA, códigos 72346/72348)
4.4. Processamento
• Consulte as informações inseridas na embalagem do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA (códigos 72346/72348).
5. AMOSTRAS
Consulte as informações inseridas na embalagem do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA (códigos 72346/72348).
As amostras com uma concentração muito elevada de HBs Ag não podem ser neutralizadas pelo reagente de neutralização caso sejam testadas num formato não diluído. (Consulte § 6.6)
NOTA: amostras com uma elevada concentração de HBs Ag, com uma densidade ótica superior a 3000 com o ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA podem ser testadas diretamente quando diluídas para 1/100 no diluente de amostra.
6. PROCEDIMENTO
6.1. Materiais necessários, mas não fornecidos
Consulte as informações inseridas na embalagem do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA (códigos 72346/72348).
6.2. Preparação dos reagentes 6.2.1. Reagentes prontos a utilizar Reagente RA: Reagentes de neutralização Reagente RB: Diluente de controlo negativo Reagente RC: Diluente de amostra
6.3. Procedimento de ensaio
Proceda da seguinte maneira utilizando os reagentes do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA (códigos 72346/72348).
1. Prepare a solução de lavagem (R2) na solução conjugada reconstituída (R6+R7): consulte a secção 7.2 "Preparação dos reagentes", subsecção "Reagentes para reconstituir" nas informações inseridas na embalagem do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA (códigos 72346/72348).
2. Retire a estrutura de apoio da embalagem de proteção e o número necessário de tiras (R1). Volte a colocar as tiras não utilizadas na embalagem. Feche a embalagem e volte a colocá-la a +2-8 °C.
3. Distribua nas cavidades pela seguinte ordem (distribuição de placa aconselhável):
• 100 μl de controlo negativo (R3) do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA kit nas cavidades A1, A2.
• 100 μl de controlo positivo (R4) do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA kit nas cavidades B1, B2.
• 100 μl da primeira amostra a confirmar nas cavidades C1, C2, D1, D2.
• 100 μl da segunda amostra a confirmar nas cavidades E1, E2, F1, F2.
• 100 μl da terceira amostra a confirmar e por aí em diante nas cavidades G1, G2, H1, H2.
Dependendo do sistema utilizado, é possível modificar a posição dos controlos ou a ordem de distribuição.
4. Adicione 20 μl do diluente de controlo negativo (RB) nas cavidades A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1, H1 e 20 μl do reagente de neutralização (RA) nas cavidades A2, B2, C2, D2, E2, F2, G2, H2, etc.
5. Distribua 50 μl de solução do conjugado reconstituído (R6 + R7) em todas as cavidades.
Homogeneíze cada mistura utilizando um mínimo de 3 aspirações.
6. Continue com o passo 7 e todos os passos subsequentes contidos na secção 7.3
"PROCEDIMENTO" nas informações inseridas na embalagem do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA (códigos 72346/72348).
6.4. Critérios de validação do teste 1. Para o controlo negativo (R3)
Os valores do controlo negativo (R3) com a adição do diluente de controlo negativo (RB) ou do reagente de neutralização (RA) deverão ser inferiores ou iguais a 0,080 unidades DO.
Para este mesmo controlo negativo (R3), a razão de reatividade deverá ser inferior a 0,8.
2. Para o controlo positivo (R4)
Para o controlo positivo (R4) com a adição do diluente de controlo negativo (RB), a densidade ótica registada deverá ser superior a 0,800.
Para este mesmo controlo positivo (R4), a percentagem de inibição deverá ser superior ou igual a 50%.
Para amostras com uma percentagem de inibição < 50% e com uma razão de reatividade ≥ 0,8 é necessário voltar a testar estas amostras diluídas no diluente de amostra (1/100; 1/10 000; 1/1 000 000;
etc., diluição de 100X) para obter a razão de reatividade < 0,8 (amostra não confirmada neste caso) ou confirmação da neutralização da amostra testada (percentagem de inibição ≥ 50%).
6.5. Cálculo/Interpretação dos resultados 1) Razão de reatividade dos controlos e das amostras
Para o controlo positivo (R4) e o controlo negativo (R3) do kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA, calcule:
Controlos DO com RB
Razão de reatividade = --- [(DO R3 com RB + DO R3 com RA)/2] + 0,050 Por cada amostra, calcule:
Amostras DO médias com RB
Razão de reatividade = --- [(DO R3 com RB + DO R3 com RA)/2] + 0,050 2) Percentagem de inibição
Calcule as percentagens de inibição das densidades óticas registadas para o controlo positivo (R4) e para o controlo negativo (R3) tratadas com o reagente de neutralização (RA) e o diluente de controlo negativo (RB).
(Controlos DO com RB) - (Controlos DO com RA)
Percentagem de inibição = --- X 100 (Controlos DO com RB)
Calcule as percentagens de inibição das densidades óticas registadas para as amostras tratadas com o reagente de neutralização (RA) e o diluente de controlo negativo (RB).
(Amostras DO médias com RB) - (Amostras DO médias com RA) Percentagem de inibição = --- X 100
(Amostras DO médias com RB) 3) Interpretação dos resultados
Uma amostra será confirmada como positiva em termos de HBs Ag caso a razão de reatividade seja superior ou igual a 0,8 e a percentagem de inibição seja superior ou igual a 50%.
Razão de reatividade da
amostra Percentagem de inibição Interpretação
≥ 0,8 ≥ 50 Confirmada
≥ 0,8 < 50 Não confirmada; ????
< 0,8 Qualquer resultado Não reativo*
* Não confirmada em termos de amostras diluídas
Exemplos:
Teste Valores DO com RA
Valores DO com RB
Razão de reatividade da
amostra
Percentagem
de inibição Interpretação Controlo
positivo (R4) 0,095 2,025 32,66 95% Confirmada Controlo
negativo (R3) 0,011 0,013 0,21 15% Não reativo Amostra 1 0,009
0,007
0,027
0,023 0,40 68% Não reativo Amostra 2 2,585
2,570
3,906
3,880 63,00 34%
Não confirmada;
para diluição Amostra 2
Dil. 1/100
0,049 0,045
2,079
2,058 33,36 98% Confirmada Amostra 3 0,132
0,140
0,151
0,161 2,52 13%
Não confirmada;
para diluição Amostra 3
Dil. 1/100
0,032 0,028
0,036
0,032 0,55 12% Não confirmada
7. LIMITAÇÃO DO TESTE
O ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory está estritamente limitado à confirmação da presença do antigénio de superfície da hepatite B (HBs Ag) no soro e plasma humanos.
As amostras que testem repetidamente fracamente positivas (razão inferior a 2) com o ensaio Monolisa™
HBs Ag ULTRA e que sejam determinadas como não reativas para uma amostra não diluída com o ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory (razão de reatividade inferior a 0,8) deverão ser interpretadas com cuidado. Recomenda-se a repetição do teste nestes pacientes com outro método ou com uma segunda amostra obtida posteriormente.
Os anticorpos heterofílicos e HAMA em amostras de soro ou plasma poderão provocar interferências no ensaio. Estes anticorpos poderão estar presentes em amostras de indivíduos regularmente expostos a animais ou que tenham sido tratados com produtos de soro animal. Os resultados inconsistentes com observações clínicas necessitam de testes adicionais.
8. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
8.1. Medição precisa
O desempenho do ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory associado ao Monolisa™ HBs Ag ULTRA foi determinado por amostras de teste de pacientes clínicos com infeção por hepatite B aguda e crónica ou com doenças não relacionadas com a infeção por hepatite B e de amostras comerciais e painéis de seroconversão.
Além disso, o limite de sensibilidade foi testado utilizando o painel EFS HB francês e as normas da WHO(código NIBSC 00/588).
A reprodutibilidade do ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory foi determinada pela análise de 4 amostras: 1 amostra negativa (amostra 1), 2 amostras positivas HBs Ag (amostras 2 e 3) e 1 amostra positiva HBs Ag elevada (amostra 4).
Os resultados são apresentados nas seguintes tabelas:
8.2. Repetibilidade
A repetibilidade intra-análise foi avaliada testando estas 4 amostras 30 vezes na mesma execução.
N = 30 Amostra 1
(razão = 0,37)
Amostra 2 (razão = 1,32)
Amostra 3 (razão = 3,39)
Amostra 4 (razão = 18,39) Média da
percentagem de inibição
4 85,37 94,89 98,38
Desvio padrão
(SD) 12,6 1,59 0,66 0,21
CV (%) NA 1,86 % 0,69 % 0,22 %
8.3 Precisão intermédia
A reprodutibilidade intra-análise foi avaliada através do teste destas 4 amostras em duplicado durante 20 dias em 2 execuções independentes em cada dia.
N = 40 Amostra 1
(razão = 0,37)
Amostra 2 (razão = 1,32)
Amostra 3 (razão = 3,39)
Amostra 4 (razão = 18,39) Média da
percentagem de inibição
3,74 81,46 92,76 98,08 Desvio padrão
(SD) 15,84 7,07 3,43 0,75
CV (%) NA 8,68% 3,70% 0,76%
Os resultados obtidos durante estes estudos de reprodutibilidade estão conforme o esperado.
8.4. Sensibilidade analítica
O painel HB de sensibilidade EFS Ag HBs, composto por 6 amostras com concentração entre 0,10 e 0,70 ng/ml, e a 2.ª norma internacional, 2004 HBs Ag WHO (NIBSC 00/588), com diluição de 1 IU/ml para 0,008 IU/ml, foram testadas.
Todas as amostras positivas do painel de sensibilidade EFS HB e todas as amostras WHO NIBSC positivas diluídas no ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA foram confirmadas com o ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory. Estes resultados estão em conformidade com a sensibilidade analítica do ensaio Monolisa™
HBs Ag ULTRA.
Foram efetuados estudos de sensibilidade em 337 amostras positivas a partir do acompanhamento de infeções por VHB crónicas ou agudas, das quais 23 eram amostras com resultado positivo alto e 47 eram amostras no intervalo de cut-off. Todas as amostras positivas foram confirmadas com o ensaio Monolisa™
HBs Ag ULTRA Confirmatory. Um total de 15 painéis de seroconversão de VHB comercial (45 amostras) bem documentados foram também estudados. Todas as amostras positivas foram neutralizadas.
8.5. Especificidade analítica/Estudo transversal da reatividade
Foi testado um painel interno de 16 amostras positivas falsas com o ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA com o ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory e em todas elas não houve confirmação.
A análise de 102 pacientes com diferentes patologias ou estados não associados à hepatite B (mulheres grávidas, fator reumatoide, anticorpos antinucleares, anticorpos antirrato ou outras infeções virais ou bacterianas) foi testada com o ensaio Monolisa™ Ag HBs ULTRA Confirmatory e confirmada como negativa. Além disso, foram testadas 37 amostras positivas com HBs Ag e também positivas com diferentes marcadores (amostras de fatores reumatoides, amostras de anticorpos antinucleares, anticorpos antirrato ou amostras de infeções virais) com o ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory, todas estas amostras foram confirmadas como positivas em termos de HBs Ag.
23 amostras positivas de HBs Ag do Painel de co-infeção PCA201 BBI (com HBV, HIV, HCV e/ou HTLV) foram todas elas confirmadas com o ensaio Monolisa™ HBs Ag ULTRA Confirmatory como puras ou após a diluição.
8.6. Efeito de "hook"
Uma concentração de HBs Ag superior a 10 mg/ml foi neutralizada após diluição desta amostra.
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. COUROUCE A.M., LEE H., DROUET J., CANAVAGGIO M. and SOULIER J.P. (1983)
- Monoclonal antibodies to HBs Ag: a study of their specificities for eight different HBs subtypes.
Developments in Biological Standardization, 54, 527-534.
2. COUROUCE A.M., PLANCON A. and SOULIER J.P. (1983)
- Distribution of HBs Ag subtypes in the world. Vox Sang. 44, 197-211.
3. DAVID G.S., PRESENT W., MARTINIS J., WANG R., BATHOLOMEW R., DESMOND W. and SEVIER E.D., (1981)
- Monoclonal antibodies in the detection of hepatitis infection. Medical Laboratory Sciences, 38, 341- 348.
4. DROUET J., COUROUCE A.M., KALIL J., LEE H., and FELLOUS M. (1981)
- Monoclonal antibodies to HBs Ag produced by murine hybridomas. In viral hepatitis, edited by Szmuness W. Alter H.J., Maynard J.E. The Franklin Institute Press, 706.
5. FIELDS H.A., DAVID C.L., BRADLEY D.W. and MAYNARD J.E. (1983)
- Experimental conditions affecting the sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of hepatitis B surface antigen (HBs Ag) - Bulletin of the World Health Organization, 61, 1, 135-142.
6. LEE H.H., COUROUCE A.M., PERE M., CANAVAGGIO M., DROUET J. and SOULIER J.P. (1983) - Monoclonal antibodies to HBs Ag; a study of their specificities against HBs Ag subtypes and their utilization in ELISA. International Association of Biological Standardization. International Symposium on Monoclonal Antibodies: Paris, France.
7. SOULIER J.P., COUROUCE A.M., LEE H. DROUET J., MULLER A. and CANAVAGGIO M. (1983) - Monoclonal antibodies against HBs antigen. Bulletin Biotest (vol. 4, 353-358).
8. WANDS J.P., CARLSON R.L., SCHOEMAKER H., ISSELBACHER K.J. and ZURAWSKI V.R. (1981) - Immunodiagnosis of hepatitis B with high-affinity IgM monoclonal antibodies. Proc. Nat. Acad. Sci., 78, 2, 1214-1218.
9. M. CANAVAGGIO, A.M. COUROUCE, M. PERE, H. LEE
- Spécificité d'anticorps monoclonaux dirigés contre le déterminant a de l'Ag HBs (1985). Nouvelle Revue Française d'Immuno-hématologie (Springer International), 27, 2, 134.
10. J. DROUET, G. CHARRIER, A.M. COUROUCE, M. PERE, J.F. DELAGNEAU, J. ROISIN (1985) - Nouveaux réactifs de dépistage de l'Ag HBs et de dosage de l'anticorps anti-HBs. Nouvelle Revue Française d'Immuno-hématologie (Springer International), 27, 2, 134
12 [PT]
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