G e n é tic a B a c te ria n a

(1)

G enética B acteriana

o

genoma bacteriano consiste no conjunto total de gen~s transportados pelas bactérias quer em seu cromossomo ou em seus elementos genéticos extracromossômicos, uando presentes. O cromos somo bacteriano difere do cromossomo humano em vários aspectos. O cromos somo de uma bactéria típica como aE s c h e r i c h i a c a l iconsiste em uma única molécula de DNA circular, de filamrnto duplo, ~ontendo aproximadamente 5milhões de pares de bases (ou 5.000 quilobase pares [kb]) medindo aproximadamente 1,3 mm (isto é,cerca de 1.000 vezes o diâmetro da célula). Osme- nores cromos somos bacterianos (encontrados nos mico- plasmas) possuem cerca de um quarto desse tamanho. Em comparação, os seres humanos apresentam duas cópias de 23 cromossomos, que representam 2,9 X 10⁹pares de ba- sescom 990 mm de comprimento. Cada genoma contém muitos o érons, ue são constituídos or enes. Os eu- cariontes geralmente apresentam uas cópias distintas de cada cromos somo (eles são, por conseguinte, diplóides).

Asbactérias apresentam somente uma cópia de seus cromossomos elas são ha lóides). Considerando que asbac- térias ossuem apenas um único cromossomo, aateraçao do ene (mutação) Irá exercer um efeito mais óbvio sobre a cél a. ém isso,a estrutura do cromossomo bacteriano é mantidã referentemente por oliaminas, como a es er- mina e a es ermidina, o ue or histonas.

s actérias tam em contêm e ementos enéticos extracromossômicos como os plasmídios ou bacterió- faB:Js (vírusbacterianos). Esses elementos são independen- tes o cromossomo bacteriano e, em muitos casos, podem ser transmitidos de uma célula para outra.

Os genes são seqüências de nucleotídios com determinada função biológica; como exemplos temos os genes das proteínas estruturais (cístrons, que são genes codificado- res), genes do RNA ribossomal e sítios dereconhecimento e ligação para outras moléculas (promotores e operadores).

Os promotores e operadores são seqüências de nucleotí- dios que controlam aexpressão de um determinado ~e ao influencIar as sequencIas aserem transcntas emA mensageiro (RNAm) (ver discussão mais adiante).

Os opérons são grupos de um ou mais genes estruturais ex ressos a artir de um determinado romotor ue

izam em um elemento ara o término da transcri ão.

Por conseguinte, todos os genes que codificam asenzimas de uma determinadil via podem ser coordenadamente re- gulados. Os opérons com muitos genes estruturais são

policistrônicos. O opéron la c da E. c ali inclui todos os genes necessários para o metabolismo da lactose, assim como os mecanismos de controle para desativar (na pre- .sença de glicose) ou ativar (na presença de galactose ou de indutor) esses genes somente quando necessários. O opéron la cinclui uma seqüência repressora, uma seqüên- cia promotora e genes estruturais para a enzima 13- galactosidase, uma permease, e uma acetilase (Fig. 5.1). O opéron la cserá discutido posteriormente neste capítulo.

(2)

Repressor Beta-galactosidase Permease Aeetilase

A0 tl~1 ^z I~

RNAm

I I ~

Repressor

B

o_, ^_l~--z--I~

Nenhum RNAml a e RNAm.~

~ c

~~~~essor ~ Repressor

C [!:]I l~ _

RNAm

t ~

^RNAm

1

Repressor ~

T

Indutor

d ~ ^9'

alolactose Repressor

t

Transgalaetosldação ^{m a tlv o}

Lactose

W

^T

¹¹¹ ^...•• ^1--_'\--

^ATP

CAP AMPe Adenilato

Repressor ciclase

DRNAm

[~].J;"

~

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RNAm

J~====z====~ I I I ~

R,p"=' ~ + ~tc7o.~ : ~

J

000 ~ ~

>-- ....•~~~ 00 O O ~Q)O

~ 000

e

Indutor

O

^Repressor

o o

W

^inativo

CAP TAMPe ..•••••I--A-d-e~~-i1a-to-ATP

Repressor eiclase

[~]·· .. .·.·!> .· j~ ====Z ===~

RNAm ~-

t

Nenhum RNAml a e

Repressor ~ ~ ativo _

z I~ '

~

~ ~ ~

000 @G ^Eil 00

nos cromossomos filhos, cada um com seu par de forquilhas de crescimento para a síntese de novo DNA. A polimerase deslo- ca-se ao longo do filamento do DNA, incorporando o nucleo- tídio apropriado (complementar) em cada posição. Areplicação se completa quando as duas forquilhas de replicação fazem um ângulo de 180 graus a partir da origem. O'processo de replicação do DNA exerce uma forte tensão de torcão sobre QUNe cir-

~ular cromossomial; essa tensão é aliviada elas to oisomera-

~ por exemp o, girase).1 topoisomerase é essencial para as ,bactérias, constituindo o aJvo dos antibióticos quinolônicos:.

z:::t:::::;::±: ---

R e g u la ç ã o d a E x p re s s ã o G ê n ic a

As bactérias desenvolveram mecanismos para se adaptar rá- pida e eficientemente às mudanças de concentração de nutri- entes em seu ambiente. Quando necessário, as bactérias ati- vam um conjunto completo de enzimas e evitam sintetizar a

Fig. 5.1A,O opéron da lactose é transcrito como RNAmensa- geiro (RNAm) policistrônico a partir de um promotor (P) e tra- duzido em três proteínas: ~-galactosidase (Z), permease (Y) e acetilase (A). O gene la c1codifica a proteína repressora. B , O opéron da lactose não é transcrito na ausência de um indutor alolactose, umavez que o repressor compete com a RNA poli- meras e no sítio operador (O). C, O repressor, complexa do com o indutor, não reconhece o operador devido a uma alteração de conformação no repressor. O opéron l a cé então transcrito em um nível baixo.D,E s c h e r i c h ia c o l icrescendo em meio de cultura pobre, na presença de lactose como fonte de carbono. Tanto o indutor quanto o complexo CAP-AMPc estão ligados ao promotor, que está totalmente "ativado", e verifica-se um alto nível de transcrição e tradução do RNAm l a c . E ,O crescimento de^E^.

co l i em meio de cultura pobre sem lactose resulta na ligação do

complexo CAP-AMPc à região promotora e na ligação do repressor ativoà seqüência do operador, uma vez que não há qualquer indutor disponível. O resultado será a ausência de trans- crição do opéron l a c . CAP = proteína ativadora do gene catabólito; AMPc = adenosina monofosfato cíclico; ATP = adenosina trifosfato.

~nzima ou enzimas de determinada viaquando o substrato está ausente.

~ primeiro lugar, a organização dos genes de uma via bioquímica em um opéron, com mecanismos de controle g,enético apropriados, permite a produção coordenada das t;,nzimas necessárias em resposta aum estímulo nutricional.

:gm segundo lugar, a transcrição do gene é regulada diretamente pelas proteínas repressoras (que se ligam aos operado- resfem resposta a sinais nutricionais no interior da célula ...Em terceiro lugar. a velocidade de síntese de proteína pelo ribossomo pode regular atranscricãg QQ§rrg,carionJ:,es. A ausência Qe uma membrana nuclear nos procariontes para separar os Q.ois processos permite ao ribossomo se ligar ao RNAm à medida que ele está sendo transcrito apartir do DNA.*

R e g u la ç ã o T ra n s c ric io n a l

O início da transcrição pode estar sob controle positivo ou negativo. Os genes sob controle negativo são expressos"a

(3)

Múltiplas Forquilhas de Crescimento

{! )

_ ;

Filamento seguidor

~5' 11' Filamento líder

Fig. 5.2 Admitindo-se um tempo de40 minutos paracompletar um ciclo dereplicação e considerando-se um novo início a cada20mi- nutos, oinício da síntesedo DNA precede adivisãocelular.Múlti- plasforquilhas decrescimento podem seriniciadasnacélula antes da completa formação do septo e divisãocelular.As célulasfilhas

"nascemgrávidas".

um aumento na freqüência de iniciação da transcrição. O complexo CAP-AMPc pode aumentar a transcrição do opéron através da interação proteína-proteína com aRNA polimerase ou através de uma interação proteína-DNA.

O o éron tri tofano (o éron contém os enes estru- mrais necessários à iossíntese o triptofano epossui meça- nismos de controle duplos transcricionais (Fig. 5.3). Embora o triptofano seja essencial para a síntese de proteínas, um ex- cesso de triptofano na célula pode ser tóxico; conseqüente- mente, ~uasíntese deve ser regulada. No nível de DNA, a

roteína re ressora é ativada or um aumento da concentra-

~o intracelular dotriptofano,.Jlara impedir atranscrição:l:i9 nível de síntese de roteína, ará ida tradu ão de um" e tí- qio teste' no início do RNAm, na presença de triptofano, promove a formação de uma alçade filamento duplo no RNA, Quefinaliza o processo de transcricão. A mesma alça é forma- da se não houver nenhuma síntese de proteína, uma situação em que não há necessidade de síntese de triptofano. Esse mecanismo re Ia asíntese do tri tofano no nível de RNAm em um processo enominado atenuação, no gual a síntese do RNAm é prematuramente finalizada.

R e g u la ç ã o P ó s -tra n s c ric io n a l o u P ó s -tra d u ç ã o A velocidade ea eficiência dasíntese de proteínas podem ser controladas por outros fatores. Estes podem incluir a estrutura do RNAm ou as concentrações do RNA transportador (RNAt) e de aminoácidos na célula. Com o RNAm policis- trônico, o controle da tradução pode resultar em diferenças na quantidade decadaproteína expressa a partir de cada gene.

Por exemplo, para o opéron la c,al3-galactosidase, agalacto- sídio permease e aacetilase são produzidas àrazão de 10:5 :2.

O DNA transmite a informação genética; conseqüentemen- te,as células devem ser capazes de replicar o DNA com pre- cisão. Além disso, lesões adicionais ao DNA devem ser minimizadas através da elabora ão de eficientes sistemas de reparo do DNA. fuses sistemas decontenção de esão são tão importantes para avida de uma célula que uma bactéria deve edicar uma rande uantidade de seu enoma ara especifi- c-ª!:e controlar asenzimas envo vi as nesse sistema.

M u ta ç õ e s q u e A fe ta m o D N A

Uma mutação se refere a qualql}er mudança na seqüência de bases do DNA. A alteração de uma única base pode resultar em uma transição, na qual uma purina é substituída por outra urina ou na ual uma irimidina é substituída or outra eirimidina. Po e também ocorrer uma transversão, niLqual, por'exemplo, uma purina é substituída por uma pirimidina e yice-versa. Uma mutação silenciosa é uma alteração no ní- vel de DNA que não resulta em qualquer mudança de ami- noácido na proteína codificada. Esse tipo de mutação ocorre porque mais de um códon pode codificar um aminoácido.

Uma mutàção de sentido equívoco resulta na inserção de um aminoácido diferente na proteína, mas essa pode ser ~a muta ão conservativa se o novo aminoácido a resenta ro- 12..riedadessemelhantes (por exemp o, va ina substituindo a

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Fosforribosil ontroniloto isomerose/indol 3-glicerol-fosfato

sin te ta s e

Triptofono sintetase alfa Fosforribosil

antronilato tronsferase

Triptofano sintetase beta Repressor

~--

CQ --~ __

^D^_~C_~

RNAm Nenhum RNAm t r p

!

^Repressor

1

~inativo

r · 8.

. ^Repressorativo

O

Co-repressor (triptofano)

1-0:---

ATG PeptídiaTGA

.---.--.--b

^líder

d-.

L::EW W__

^2_~~~ ^__ ^E_~

BBaixa concentração de Trp

A Alta concentração deTrp

V J.. .AA J J JJ Nenhum RNAm

t r p policistrônico

RNAm t r p policistrônico

C Ausência de síntese de proteína

Nenhum RNAm V J.. .AA JJ JJ t r p policistrônico

alanina). Fina mente uma muta ão sem sen .do modifica o

,çódon gue codifica um aminoácido em um có onje

terminalização (porexemplo, TAG [timidina-adenina-guanina]), &zendo com que oribossolllQ sedesprenda doRNAm e Ill\ralise prematuramente a síntese daproteína.

Podem ocorrer alterações mais drásticas nas proteínas quando estão envolvidas várias bases. Por exemplo, uma pequena depleção ou inserção que n ã o ée m m ú l t i p l o s d e t r êsproduz uma mutação por deslocamento do quadro de leitura. Em conseqüência, ocorre uma alteração na estrutura de leitura, resultando geralmente em um peptídio sem sentido e

Fig. 5.3 Regulação do opéron do triptofano ( t r p ) . A, O opéron t r p

codifica as cinco enzimas necessárias para a biossíntese do triptofano.

Esse opéron t r p se encontra sob duplo controle. B, A conformação da proteína repressora inativa é alterada após a sua ligação pelo triptofano co-repressor. O repressor ativo (R) resultante se liga ao operador (O), bloqueando qualquer transcrição do RNAm dot r p pela RNA polimerase. C, O opéron trp também está sob o controle de um mecanismo de atenuação-antiterminação. Acima dos genes estruturais estão o promotor (P), o operador eum líder (L), que pode ser transcrito em um pequeno peptídio contendo dois triptofanos (IV) próximo à extremidade distal. O RNAm líder possui quatro repeti- ções (1,2,3 e 4) que podem formar pares diferentes de acordo com adisponibilidade do triptofano, resultando em terminação precoce da transcrição do opéron ^{t r p} ou em sua transcrição completa. Na presença de alta concentração de triptofano, as regiões 3 e 4 do RNAm líder podem formar pares, originando um grampo de termi- nação, não ocorrendo nenhuma transcrição do opéron t r p. Entre- tanto, na presença de pouco ou nenhum triptofano, os ribossomos permanecem na região 1 durante a tradução do peptídio líder, devi- doàseqüência dos códons do triptofano. Em seguida, as regiões 2 e 3 podem parear, formando o grampo de antiterminação e levando à transcrição dos genes ^t^rp^. Finalmente, as regiões 1:2 e 3:4 do RNAm líder podem parear, acarretando também a paralisação da transcri- ção antes do primeiro gene estrutural t r p E. A= adenina; G = guanina; T = timina.

em truncamento prematuro da proteína. As mutações nulas, que destroem completamente a função gênica, surgem uando ocorrem extensa inser ão deleção ou rearran'o pro- nunciado na estrutura do cromossomo. Ainserção de longas seqüências e N muitos milhares de pares de bases) por.

recombinação, transposição ou durante a engenharia genéti- ca pode produzir mutações nulas ao separar as partes deum gene, inativando-o.

Muitas mutações ocorrem espontaneamente na natureza (por exemplo, por erros da polimerase); entretanto, as muta- ções podem também ser induzi das por agentes físicos ou

(5)

químicos. Entre os agentes físicos utilizados para induzir mu- tações em bactérias temos o calor, que resulta na desamina- ção dos nucleotídios; a luzultravioleta, que induz aformação dedímeros depirimidina; e aradiação ionizante, como os raios X,que originam radicais hidroxila muito reativos que podem ser responsáveis pela abertura deum anel de uma base oupor quebras de filamentos simples ou duplos no DNA.

Os agentes químicos mutagênicos podem seragrupados em três classes. A primeira classe éconstituída pelos análogos de bases nucleotídicas; eles são incorporados ao DNA durante a replicação e acarretam pareamento equívoco e freqüentes erros durante areplicação do DNA. A semelhança entre 05- bromouracil e atimidina permite a suaincorporação aoDNA.

Entretanto, um rearranjo estrutural da molécula permite a ligação do 5-bromouracil àguanina em vez da adenina, alte- rando o par de bases T-A para

G-c.

A segunda classe é constituída por moléculas planas poli- cíclicas, como obrometo de etídio ou osderivados da acridina;

constituem exemplos de substâncias que induzem mutação por deslocamento do quadro de leitura. Inserem-se (ou inter- calam-se) entre as bases à medida que elas se empilham na dupla hélice, causando a adição ou adeleção deuma única base. Esses agentes de intercalação aumentam o espaçamento entre sucessivos pares de bases destruindo o esqueleto regular de açúcar-fosfato e diminuindo oespaço entre as voltas da hélice. Essas alterações levam a erros freqüentes durante a replicação do DNA.

A terceira classe éconstituída por substâncias químicas capazes de reagir com o DNA; elas atuam diretamente sobre o DNA, resultando na modificação da base normal em outra estrutura quimicamente diferente. Asbases modifica- daspodem fazer pareamentos anormais ou não fazer qualquer pareamento. O dano pode causar aremoção dabase do arca- bouço do DNA. Essa classe inclui o ácido nitroso (HNO) e agentes alquilantes, como anitroso guanidina e o sulfonato de etilmetano que são conhecidos por adicionarem grupos meti! ou etil aos anéis das bases do DNA.

5',llllllli3' ••5"1'1 iiii3 '

3" I , I , , , , I5'A baselesada é reconhecida 3" I , I I , , , '5' A baselesada éreconheci- pelo glicosilase,quedivaali· Umaendonudease APrec~

da pela endonuclease, que gação entre o açúcar do nhece osítio AP ec1iva o c1ivaoarcabouço fosfodiés- nucleotídio e o arcabouço fos- arcabouço fosfodiéster pró-

ter emambosos lodos fodiéster ximo aolocalda base au·

da lesão sente

(l ^t .l

5'T0 : , : : : T~ • 5';-r-r-r--' -,--,3'

3'---5 Provavelmenteocorreumaou_3' ' . , " , 5' Asexonucleases transportam Ira fenda nooutro lado do sí- B

ofragmento doDNA que foi tioAP cortado e que apresentava a baselesado

l

5'T'"TõO H T3'

3" , , , !, I '5' A

A DNA palimerase I preen- che o lacuna da 3'OH livre

ADNA ligose sela a fendo entreofragmento recém-sintetizado e oFjlomento origi- nal doDNA

5'

T""T""T"!T,-

^{r' "}^{r 3}^'

Fig. 5.4 A, Mecanismos de reparo por excisão generalizada. B,Me- canismo de reparo por excisão especializada. AP =apurínica (endonuclease).

Inúmeras bactérias, especialmente muitas espécies bacterianas patogênicas, são promíscuas com o seu DNA. A troca de DNA entre células permite o intercâmbio de genes e carac- terísticas entre essas células, produzindo assim novas cepas bacterianas. Essa troca pode ser vantajosa para o receptor, especialmente se o DNA alterado codifica resistência a anti- bióticos. O DNA transferido pode ser integrado no cromossoma do receptor ou mantido de modo estável como elemen- to extracromossômico (plasmídio) ou em um vírus bacteriano (bacteriófago) e transferido para asbactérias filhas como unidade de replicação autônoma.

Os plasmídios são pequenos elementos genéticos que se replicam independentemente do cromos soma bacteriano. Os plasmídios são, em sua maioria, moléculas de DNA de filamento duplo, circulares, que variam de 1.500 a400.000 pares de bases. Entretanto, aBo r r eli a b u r g d orfer i , o agente eti- ológico da doença de Lyrne, e aB or r eli a her m s i i , são singula- res entre todas aseubactérias, uma vez que possuem plasmí- dios lineares. De maneira semelhante ao DNA cromossômi- co bacteriano, têm a capacidade de replicação autônoma e, em conseqüência, são considerados réplicons. Alguns plas- mídios, como oplasmídio F deE sche ri c h iac o l i ,são epissomas, o que significa que eles podem se integrar ao cromossoma do hospedeiro.

Os plasmídios transportam informação genética, que pode não ser essencial mas pode fornecer uma vantagem seletiva à bactéria. Por exemplo, os plasmídios podem conferir altos níveis de resistência antibiótica, podem codificar aprodução de bacteriocinas ou toxinas epodem conter genes capazes de conferir uma vantagem peculiar no metabolismo de alguns

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Vetor pBR322 (4.363pb)

1início

14 20 26 37

~

51 55 62 73 75

82 94 103 112 126

Fig. 5.5Plasmídios. O plasmídio pBR322éum dosplasmídiosuti- lizadospara a donagem do DNA. Esseplasmídio codifica resistên- ciaàampicilina (Amp) eàtetraciclina (Tet) euma origem de repli- cação (ori).O sítio dedonagem múltipla noplasmídio pGEM for- nece diferentes pontos de divagem de enzimas de restrição para a inserção de DNA dentro dogene da l3-galactosidase(la cZ ). Ele é flanqueado por promotores debacteriófagosparapermitir a expres- sãodirecional do RNAmensageiro da seqüênciadonada.

substratos (Fig. 5.5). O número de cópias de plasmídio pro- duzido pela célula édeterminado pelo plasmídio particular.

O número de cópias éa relação entre ascópias do plasmídio eo número de cópias do cromossoma. Essa relação pode ser tão pequena quanto 1,no caso dos grandes plasmídios, ou de até 50,nos pequenos plasmídios.

Os grandes plasmídios (20 a120 kb), como o fator de fer- tilidade F encontrado emE.c a li ,ou ofator de transferência de resistência (80 kb), podem, com freqüência, mediar sua própria transferência de uma célula para outra por um processo deno- minado conjugação (ver adiante seção sobre conjugação). Es- ses plasmídios conjugativos codificam todos osfatores neces- sários para a sua transferência. Outros plasmídios podem ser transferidos para uma célula bacteriana por um mecanismo diferente daconjugação, como atransformação ou transdução.

Esses termos serão discutidos posteriormente neste capítulo.

Os bacteriófagos são vírus bacterianos. Esses elementos genéticos extracromossômicos podem sobreviver fora de uma

célula hospedeira uma vez que o genoma de ácido nucléico (que pode ser DNA ou RNA) é protegido por uma capa de proteína (Fig. 5.6).

Os bacteriófagos infectam as células bacterianas e ou se replicam em grandes números causando alisecelular (infec- ção lírica) ou, em alguns casos, integram-se ao genoma do hospedeiro sem causar asuamorte (estado lisogênico), como o bacteriófago À de E. c ali(Fig. 5.7). Alguns bacteriófagos lisogênicos transportam genes de toxinas (por exemplo, o corinefago 13transporta o gene da toxina diftérica). O bacte- riófago À permanece lisogênico enquanto houver síntese de uma proteína repressora que impede a desintegração do fago esua replicação independentemente do cromossoma do hospedeiro. Essa reação pode ser deflagrada se oDNA da célula hospedeira sofrer lesão por irradiação ou por qualquer outro mecanismo ou sea célula não puder mais produzir aproteína repressora, um sinal de que acélula hospedeira não está mais saudável enão constitui mais um local adequado para "carre- gamento livre".

Os transposons são elementos genéticos móveis (Fig. 5.8) que podem passar de uma posição para outra no genoma ou entre diferentes moléculas deDNA. Os transposons mais simples sãodenominados seqüências de inserção. Os transposons complexos transportam outros genes, como os genes que con- ferem resistência aos antibióticos. Algumas vezes os transposons seinserem nos genes, inativando-os. Se ainserção e a inativação ocorrerem em um gene que codifica uma proteína essencial, acélula morrerá.

Algumas bactérias patogênicas utilizam um mecanismo semelhante para coordenar a expressão de um sistema de fatores devirulência. Os genes para a atividade podem ser agru- pados em uma ilha de virulência ou de patogenicidade, que écircundada por elementos móveis semelhantes aos transposons, o que permite aos genes se moverem dentro dos cromossomas e para outra bactéria. A unidade genética total pode ser desencadeada por um estímulo ambiental (por exemplo, pH, calor, contato com asuperfície dacélula hospedeira) como meio de coordenar a expressão de um processo complexo. Por exemplo, a ilha SPI-l de Salman el la codifica 25 genes que permitem à bactéria penetrar em células não-fagocíticas.

A troca de material genético entre células bacterianas pode ocorrer por um de três mecanismos: (1)conjugação, que éo . acasalamento ou troca quase sexual de informação genética deuma bactéria (o doador) para outra bactéria (o receptor);

(2) transformação, que resulta na aquisição de novos marca- dores genéticos por incorporação de DNA estranho ou exó- geno; ou (3) transdução, que é a transferência de informa- ção genética deuma bactéria para outra através deum bacte- riófago. A conjugação ocorre na maioria das eubactérias, se- não em todas. Em geral, aconjugação ocorre entre membros

(7)

C~J

(~)

(~) (~)

(~)

Fig. 5.7 Infecção lisogênicade bactéria por bacteriófago tempera- do.A,O fagoinfectauma bactéria sensível,eoDNA do fagoé injetado.B,O DNA do fago torna-se integrado nocromossoma bacteriano. C, A bactéria se multiplica, aparentemente não-afetada pela infecção. Ela foilisogenizada. D, Ocasionalmente o DNA do fago sofre excisão do cromossoma bacteriano, adquire o controle da cé- lulaesereplica.E,Uma célulaindividual(ou,porindução, todasas células)produz componentes do fago.F,Os componentes são posteriormente organizados em partículas de fagos. G, Finalmente, a célula sofre lise e libera partículas maduras de fagos.

de uma mesma espécie, mas foi também demonstrada a sua ocorrência entre procariontes e células vegetais, animais e fungos.

Atransformação é o processo pelo qual as bactérias cap- tam fragmentos de DNA desnudo e o incorporam em seus genomas. A transformação foi o primeiro mecanismo de trans- ferência genética descoberto em bactérias. Em 1928, Griffith observou que avirulência dos pneumococos estava relacionada com a presença de uma cápsula polissacarídica que circunda- va a célula e que extratos de células portadoras de cápsulas produziam colônias lisas que podiam transferir essa caracte-

____________ 1F É Ó C 'B 'Á

____ ~ ~Beta-Iactamase~

t-- ·

Sítio res

DNAde E . c o l ;

2.i

~ ^cab

Segmento G DNA de

passível E. col;

de inversão ~

~~~

+ +

~enes para a cabeça e a uda

Repetição invertida da

esquerda

Repetição invertida do

direita

Fig. 5.8 Transposons. A,Asseqüências de inserção codificam ape- nasumatransposase (t n p) e possuem repetições invertidas (15 a 40 pares debases) emcada extremidade. B,Os transposons compostos contêm uma região central que codifica a resistência aos antibióti- cos, ou toxinas, flanqueadas por duas seqüências de inserção (1S),que podem ser diretamente repetidas ou invertidas. C, Tn3, um mem- broda famíliadotransposon TnA.A regiãocentral codificatrês genes - uma transposase (mpA), uma resolvase (mpR)e uma l3-lactamase - conferindo resistência à ampicilina. Um sítio de resolução (sítio Res) é utilizado durante o processo replicativo de transposição. Essa região centraléflanqueada, em ambas asextremidades, por trechos repetidos diretos de 38pares de bases. D, O transposon associado ao fagoé exemplificado por um bacteriófago p.

rística para bactérias não-capsuladas, geralmente aparecendo com bordas rugosas. Os estudos de Griffith levaram Avery, MacLeod e McCarty a identificar o DNA como o princípio transformador, cerca de 15 anos mais tarde.

As bactérias gram-positivas e gram-negativas são capazes de capturar e manter o DNA exógeno de maneira estável (Fig.

5.9). Certas espécies são naturalmente capazes de capturar DNA exógeno (essas espécies são denominadas competen- tes), e incluem H aem o p hil u s i n f l u-enzae , S tr ep t o c oc cu s pn e um o - n ia e, espécies deBaci l l u s e espécies deNeis s eria . A competên- cia se desenvolve no final da fase do crescimento logarítmico, algumas vezes antes de uma população entrar na fase estaci- onária. A maioria das bactérias não exibe uma capacidade na- tural de captação de DNA. São utilizados métodos químicos ou de eletroporação (uso de pulsos de alta voltagem) para induzir a entrada de plasmídios e outros DNA em E . c o l ie outras bactérias.

C o n ju g a ç ã o

A transferência genética em E . c o l ifoi descrita pela primeira vez por Lederberg e Taturn em 1946, quando eles observa-

(8)

cromossoma~

bactenano . ~~.

---

• Captação

+de DNA

~)

Integração por ,

recombinação

.J

[ID0U

^"" ^Degradação

Transformação com plasmídio

Plasmídio de DNA

O O

(~:~~:o

• Captação +do plasmídio

~

Fig. 5.9 Transformação bacteriana. O DNA estranho pode ser cap- tado ou forçado a penetrar em bactérias e a se incorporar em seu genoma ou se manter como um plasmídio. Esse processo "transforma" a bactéria em um novo microrganismo.

ram troca semelhante a uma troca sexual entre duas cepas mutantes de E . c o l iK12. A conjugação é o processo pelo qual o DNA é transferido diretamente por contato entre duas cé- lulas, durante o acasalamento das bactérias. A conjugação resulta na transferência unidirecional do DNA de uma célula doadora (ou macho) para uma célula receptora (ou fêmea) através do pilus sexual. O tipo de união (sexo) da célula de- pende da presença (masculino) ou ausência (feminino) de um plasmídio conjugativo, como o plasmídio F de E . c o l i . O plasmídio F é definido como conjugativo porque ele transporta todos os genes necessários para a sua própria transferên- cia, incluindo a capacidade de produzir os pili sexuais e inici- ar a síntese do DNA na origem de transferência (OriT) do plasmídio. Além de E . c o l i ,a transferência ocorre em bacte- róides, estreptococos, s t r e p t o m y c e s e clostrídios. Muitos dos grandes plasmídios de conjugação especificam colicinas ou resistência a antibióticos.

O plasmídio F se auto transfere convertendo as células re- ceptaras em células masculinas F+(Fig. 5.10). Se um fragmen- to do DNA cromossâmico for incorporado ao plasmídio, ele passa a ser designado plasmídio F primo (F'). Quando ele se transfere em uma célula receptora, transporta esse fragmen- to consigo e também a converte em células masculina F'. Se a seqüência do plasmídio F for integrada ao cromossoma bacteriano, a célula é denominada célula Hfr. Hfr significa alta freqüência de combinação ( h i g h f r e q u e n c y o f r e c o m b i n a t i o n ) .

O DNA transferido por conjugação não é constituído por uma dupla hélice, mas por uma molécula de filamento simples. A mobilização se inicia quando uma proteína codificada pelo plasmídio efetua uma clivagem sítio-específica de fila-

As células entram em contato, e o processo de conjugação se in ic ia

Fenda no filamento único em OriT e ligação de proteína na extremidade 5', iniciando a replicação em circulo

oDNA de filamento único é transferido, e ocorre síntese do filamento complementar

As células se separam no final da transferência

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mento único na OriT. A"marca" inicia a replicação do círcu- lo, e o filamento linear deslocado édirecionado para a célula receptora. O DNA de filamento único transferido adquire uma nova estrutura circular eseu filamento complementar é sintetizado.

Uma importante propriedade do plasmídio Féasua capacidade de integração aocromossoma bacteriano, gerando uma célula Hfr. Essa integraçao do plasmídio F envolve a quebra eareligação de ambas asmoléculas deDNA. Nas células Hfr, os genes envolvidos na mobilização etransferência ainda são expressos. Assim, a conjugação pode ainda ser iniciada por uma marca no sítio OriT no cromossoma para transferir uma par- te da seqüência do plasmídio seguida por DNA cromossômi- co e, às vezes, embora raramente, pelo restante do plasmídio F na outra extremidade do cromossoma. Seriam necessários 100 minutos a 37°C para transferir ogenoma masculino completo para o receptor feminino. Entretanto, a frágil conexão entre os pares de bactérias é geralmente quebrada e a trans- ferência interrompida antes de ser completada, o que explica por que apenas as seqüências cromossômicas adjacentes ao F integrado são habitualmente transferidas. Interrupções arti- ficiais de um cruzamento entre um par Hfr e F- foram de utilidade para aconstrução de um mapa coerente do DNA cromossômico deE. ca li.Nesses mapas, aposição de cada gene é fomecida em minutos de acordo com o seu momento de entrada em uma célula receptora em relação auma origem fixa (Fig.5.11).

Os plasmídios conjugativos R (resistência a antibiótico) foram encontrados em bactérias gram-positivas como estreptococos, s t repta m y ces e clostrídios. Em vez deutilizar pili, o par é mantido junto por uma molécula de adesina presente na superfície da célula doadora.

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Fig. 5.11 Mapa cromossômico dos genesdeEs c h e r i c hia c oli.Os nú- meros representam o tempo (em minutos) necessário para transferir segmentos de DNA daorigem daprimeira cepaHfr. (Modifica- do de Bachmann BJ,Low KB,Taylor AL:Ba e t e r i ol Re v 4 0:1 1 6 - 1 67,

1976.)

T ra n s d u ç ã o

A transferência genética por transdução é mediada por vírus bacterianos (bacteriófagos) (Fig. 5.12), osquais apanham fragmentos de DNA e os empacotam dentro de partículas do bacteriófago. O DNA é liberado nas células infectadas e torna-se incorporado ao genoma bacteriano. A transdução pode ser classificada como especializada se os fagos em questão transferem determinados genes (geralmente aqueles adjacentes aos seus sítios de integração no genoma) ou generalizada

Infecção por fogo, degradação do DNA do hospedeiro

Replicoção dofogo

Organização do DNA viralebacteriano

pelo fogo

Fogode transdução

A

^célula ^sofre^lise,^ofogo infecta outracélula e libera ODNA da célula doadora

Integração do

I

DNA dodoador.

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se a seleção das seqüências for aleatória devido a reunião aci- dental do DNA do hospedeiro no capsídio do fago.

As partículas de transdução generalizada devem conter principalmente DNA bacteriano e pouco ou nenhum DNA do fago. Por exemplo, o fago Pl de E . c o l i codifica uma nuclease que degrada o DNA cromossômico do hospedeiro E . co li.Uma pequena percentagem das partículas resultantes do fago acondiciona os fragmentos de DNA em seus capsídios.

O DNA encapsulado, em lugar do DNA do fago, éinjetado em uma nova célula hospedeira, onde pode se recombinar com o DNA homólogo do hospedeiro. Aspartículas transdutoras generalizadas são importantes no mapeamento genético dos cromossomas bacterianos. Quanto mais próximos dois genes estiverem no cromossoma bacteriano, maior a probabilidade de co-transdução.

T ra n s p o s o n s C o n ju g a tiv o s

Os transposons podem transferir DNA no interior de uma célula de uma posição para outra no genoma ou do DNA cro- mossômico para um plasmídio ou vice-versa. Os transposons encontrados em bactérias podem ser divididos em três classes: seqüência de inserção, transposons cófiíPÍexos e transposons fago-associados. Os elementos de seqüência de inser- ção são os transposons mais simples; variam em comprimen- to de 150 a 1.500 pares de bases e possuem repetições invertidas de 15 a 40 pares de bases em suas extremidades (ver Fig.

5.8). As seqüências de inserção transportam apenas a infor- mação genética necessária para a sua própria transferência (isto é,o gene que codifica a transposase). As seqüências deinser- ção podem ser detectadas quando se inserem em um gene e interrompem ou inativam o gene ou liberam aexpressão do gene adjacente.

R e c o m b in a ç ã o

A incorporação do DNA em um cromossoma ocorre por re combinação. Existem dois tipos de recombinação: homólog e não-homóloga. A recombinação homóloga (legítima ocorre entre seqüências de DNA estreitamente relacionada e geralmente substitui uma seqüência por outra. O processl requer um conjunto de enzimas produzidas (em E . c o lz )pelo genes r e c.A recombinação não-homóloga (ilegítima) ocorr entre seqüências de DNA diferentes e, em geral, produz in serções, deleções ou ambas. Esse processo, em geral, reque enzimas especializadas de recombinação (algumas vezes sítio específicas), como as produzidas por muitos transposons bacteriófagos lisogênicos.

E n g e n h a ria G e n é tic a

A engenharia genética, também conhecida como tecnologi do DNA recombinante, utiliza astécnicas e ferramentas d{

senvolvidas pelos geneticistas bacterianos para purificar, am plificar, modificar eexpressar seqüências gênicas específic A utilização da engenharia genética e da "clonagem" revoh:

cionou abiologia e a medicina. Asferramentas básicas da er genharia genética são (1) vetores de clonagem, que podeI ser utilizados para liberar as seqüências de DNA nas bactér as receptivas e amplificar a seqüência desejada; (2) enzim~

de restrição, que são utilizadas para clivar o DNA reprod~

tível em seqüências definidas (Quadro 5.1);e (3) DNA ligasl a enzima que une o fragmento ao vetor de clonagem.

Os vetores de clonagem devem permitir ainserção d DNA estranho, mas ainda devem ser capazes de se replic:

normalmente na bactéria hospedeira. Muitos tipos de vet<

res são utilizados. Os plasmídios vetores, como pue, pBR32:

M icrorganism o E nzim a S ítio de R econhecim ento

Aci n e t o b a e t e r c alcoa c eti c u s AccI 5'GTI@ CB1AC

CA C D (X) TG

Ba c il lu s a m y l oliqu e f a c i e n s H BarnHI 5'GIGATC C

C CTAGIG

E s che r i chi a c oliRY13 EcoRI 5'GIAATTC

C TTAAIG

Ha em o p h i l u s i n f l u en z a e Rd HindIII 5' AIAGCT T

T TCGAIA

H. inf lu e n z a e sorotipo c,1160 HincII 5'G T (1)

I

(X) A C

C A(X) Ct) T G

Pr o v i d e nci a stu a rt ii 164 PstI 5'CiGCAIG

GACGTC

Se r r ati a m a r c e s c e n s SmaI 5'C C C IGGG

GGG CCC

S~ ap hyloc oc cusau re u s 3A Sau3AI 5'IGA T C

CTAGI

Xa nt h omo n a s m a lv a ce ar um XmaI 5'CICCGG G

G GGCCIC

G e n é tic a B a c te ria n a