Citocinas do fluido sulcular como possíveis ferramentas no diagnóstico precoce da doença peri-implantar

Texto

(1)Flaviana Soares Rocha. CITOCINAS DO FLUIDO SULCULAR COMO POSSÍVEIS FERRAMENTAS NO DIAGNÓSTICO PRECOCE DA DOENÇA PERI-IMPLANTAR.. Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Uberlândia, para obtenção do Título de Mestre em Clínica Odontológica.. Uberlândia, 2010.

(2) Flaviana Soares Rocha. CITOCINAS DO FLUIDO SULCULAR COMO POSSÍVEIS FERRAMENTAS NO DIAGNÓSTICO PRECOCE DA DOENÇA PERI-IMPLANTAR.. Dissertação apresentada à Faculdade de. Odontologia. da. Universidade. Federal de Uberlândia, para obtenção do. Título. de. Mestre. em. Clínica. Odontológica.. Orientador: Prof. Dr. Darceny Zanetta-Barbosa Co-Orientadora: Profa. Dra. Camilla Christian Gomes Moura. Banca Examinadora: Prof. Dr. Darceny Zanetta-Barbosa Profª. Drª. Camilla Christian Gomes Moura Profª. Drª. Maria Aparecida de Souza Prof. Drª. Virgínia Oliveira Crema. Uberlândia, 2010.

(3) Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP). R672c. Rocha, Flaviana Soares, 1986Citocinas do fluido sulcular como possíveis ferramentas no diagnóstico precoce da doença peri-implantar [manuscrito] / Flaviana Soares Rocha. 2010. 73 f. : il. Orientador:.Darceny Zanetta-Barbosa. Co-orientadora: Camilla Christian Gomes Moura. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-Graduação em Odontologia. Inclui bibliografia. 1. Implantes dentários- Teses. I. Zanetta-Barbosa, Darceny. II. Moura, Camilla Christian Gomes, 1979- . III. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. IV. Título. CDU: 616.314-089.843. Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação.

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(5) Dedico esta conquista à minha família que tanto amo; meus pais, Gerson e Rita Nilza pelo apoio incondicional e exemplo de coragem e determinação que sempre busquei seguir; meus irmãos, Flávio e Fabiana, que sempre estiveram comigo.. I.

(6) AGRADECIMENTOS ESPECIAIS À Deus, que sempre iluminou e guiou os meus caminhos. Aos meus queridos pais, Gerson e Rita Nilza, agradeço de coração pelo amor, carinho, dedicação e confiança incondicionais durante toda minha vida. Por sempre incentivarem meus estudos, e finalmente, por serem meu porto seguro em todos os momentos. “Um pai vale mais do que uma centena de mestres escola.” (George Herbert) Aos meus queridos irmãos, Flávio e Fabiana pelo apoio e torcida constante desde o início da minha vida. Sou muito feliz por tê-los como minha família. “A verdadeira felicidade está na própria casa, entre as alegrias da família.” (Leon Tolstoi) Ao Prof. Dr. Darceny Zanetta-Barbosa, minha eterna gratidão pela orientação, amizade e confiança na minha capacidade de realização. Pelo profissionalismo, exemplo de cirurgião e docente. Espero um dia poder retribuir as oportunidades que me proporcionou. À Profª. Drª. Camilla Christian Gomes Moura. Seu dinamismo e vontade de fazer com que os projetos se concretizem são contagiantes. Agradeço pela amizade e por não ter medido esforços em me ajudar sempre que possível. À Profª. Drª. Paula Dechichi, pela dedicação, paciência, motivação constante e por ser meu refúgio em diversos momentos. À quem devo grande parte do que aprendi como profissional e como pessoa, minha eterna admiração e sincera gratidão por tudo. À Profª. Drª. Maria Aparecida de Souza, pela sua diposição, pelos ensinamentos e orientações durante esse trabalho.. II.

(7) “Uns são homens, alguns são professores, poucos são mestres... Aos primeiros, respeita-se, aos segundos, escuta-se, aos últimos, segue-se...” (Autor desconhecido) À Carla, pela dedicação à realização deste trabalho e ao carinho ao compartilhar expectativas e anseios profissionais. Obrigada pelo respeito e amizade mútuos que construímos. Ao Gustavo, Andréia, Lara e Jonas, que foram ouvintes e confidentes, pela amizade sincera construída nestes anos juntos e pelas palavras de apoio sempre que precisei. Aos que são mais do que amigos, Moline, Janaína, Ana Carolina, Rafael, Elina, Andréa, Queuver e Maiza, pela amizade e companheirismo. Aos amigos do Mestrado, pela amizade e agradável convivência durante esse período. “A vida é em parte o que nós fazemos dela, e em parte o que é feito pelos amigos que nós escolhemos.” (Tennessee Willians) Aos amigos do Laboratório de Biologia Molecular (BIOMOL) e do Laboratório de Histologia, pelo apoio durante a parte experimental deste trabalho. À Cidinha, Hellen, Flaviane, Irene, Abigail e demais funcionários, pela grande colaboração, dedicação e disposição em atender, da melhor forma possível, às nossas necessidades. Enfim, meu carinho e sinceros agradecimentos, a todos que de uma forma ou de outra, contribuíram na execução deste trabalho.. III.

(8) AGRADECIMENTOS À. Faculdade. de. Odontologia. da. Universidade. Federal. de. Uberlândia, pelo apoio constante à pesquisa, ensino e extensão. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de Mestrado. À Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG), pelo auxílio financeiro e financiamento desta pesquisa. Aos professores da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Uberlândia, por ampliarem meus conhecimentos. Aos pacientes, que dispuseram de seu tempo para participarem desta pesquisa.. IV.

(9) SUMÁRIO. Lista de Abreviaturas e Símbolos. 1. Resumo. 2. Abstract. 3. 1. Introdução. 4. 2. Revisão da literatura. 7. 2.1. Implantodontia. 8. 2.2. Mucosa Peri-implantar. 10. 2.3. Doença Peri-implantar. 11. 2.4. Fluido sulcular peri-implantar. 14. 2.5. Interleucina 1β. 17. 2.6. Fator de Crescimento Transformante β. 18. 2.7. Interleucina 10. 19. 2.8. Interleucina 17. 21. 3. Proposição. 22. 4. Material e métodos. 24. 4.1. População. 25. 4.1.1. Seleção dos indivíduos. 25. 4.2. Procedimentos clínicos. 25. 4.2.1 Índice de Placa. 26. 4.2.2 Coleta do fluido sulcular peri-implantar. 26. 4.2.3 Índice Gengival. 27. 4.2.4 Sondagem do sulco peri-implantar. 27. V.

(10) 4.2.5 Nível de inserção clínica. 28. 4.2.6 Supuração de Mobilidade. 28. 4.2.7 Exame radiográfico. 28. 4.2.8 Classificação dos sítios peri-implantares. 29. 4.3. Procedimentos laboratoriais. 29. 4.3.1 Dosagem das citocinas. 29. 4.4. Análise estatística. 33 32. 5. Resultados 5.1. Dados Clínicos. 33. 5.2. Níveis de citocinas nos sítios peri-implantares. 39. 5.3. Correlação entre os parâmetros clínicos e as citocinas. 44. 6. Discussão. 48. 7. Conclusão. 56. Referências. 58. Anexos. 70. VI.

(11) LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS FS. Fluido Sulcular. FSPI. Fluido Sulcular Peri-implantar. IP. Índice de Placa. IG. Índice Gengival. PS. Profundidade de Sondagem. SS. Sangramento à Sondagem. NIC. Nível de Inserção Clínica. S. Supuração. M. Mobilidade. DV. Disto Vestibular. VC. Vestibular Central. MV. Mesio Vestibular. DL. Disto Lingual. LC. Lingual Central. ML. Mesio Lingual. Ig. Imunoglobulina. IL. Interleucina. PGE2. Prostaglandina E2. TNF. Fator de Necrose Tumoral. TGF. Fator de Crescimento Transformante. MMP. Metaloproteinases. G. Aceleração da Gravidade. EP. Erro Padrão. r. Coeficiente de Correlação. ºC. Graus Celsius. mm. Milímetro. µl. Microlitro. pg. Picograma. PBS. Phosphate Buffer Saline. ELISA. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay. 1.

(12) RESUMO O fluido sulcular peri-implantar possui moléculas que podem ser representar biomarcadores, permitindo avaliar a saúde peri-implantar. O objetivo deste estudo foi investigar, em pacientes parcialmente edêntulos, o uso da IL17 e os marcadores bioquímicos clássicos relacionados à inflamação IL1β / TGFβ1 / IL10 como ferramentas no diagnóstico precoce da doença peri-implantar. Em 40 pacientes previamente selecionados, 6 sítios peri-implantares de 91 implantes foram avaliados e classificados como saudável, inflamação leve e inflamação moderada de acordo com a profundidade de sondagem periimplantar e o índice gengival. Dados sobre o índice de placa, perda de inserção clínica, supuração e mobilidade também foram avaliados. O fluido sulcular periimplantar foi coletado utilizando pontas endodônticas de papel absorvente padronizadas e os níveis de IL1β, TGFβ1, IL10 e IL17 foram determinados utilizando ELISA. Os dados foram analisados pelos testes KolmogorovSmirnov, Mann-Whitney (pós-teste de Dunns) e correlação de Spearman. Os níveis médianos de TGFβ1 no grupo saudável foram superiores ao grupo inflamado, independentemente do grau de inflamação. Em todos os grupos, correlação positiva entre IL1β e os parâmetros clínicos profundidade de sondagem e perda de inserção clínica, bem como correlação negativa entre TGFβ1 e o índice de placa foram observadas. No grupo saudável e inflamação leve, houve correlação negativa entre TGFβ1 e os parâmetros profundidade de sondagem e perda de inserção clínica, e correlação positiva entre IL1β e o índice de placa. Apenas no grupo saudável, observou-se correlação negativa entre IL17 e perda de inserção clínica. Correlação entre as citocinas foi observada entre IL1β e IL17, IL10 e IL1β no grupo saudável, entre IL17 e IL10 no grupo inflamação leve, entre IL1β e TGFβ1 no grupo inflamação moderada. As citocinas IL10 e IL17 parecem modular a resposta inflamatória periimplantar. A redução significativa do nível de TGFβ1 nas fases inciais da doença peri-implantar sugere seu uso como marcador imunológico da saúde peri-implantar.. 2.

(13) ABSTRACT. Peri-implant sulcus fluid has molecules that may represent biomarkers, allowing peri-implant health evaluation. The aim of this study was to investigate, in partially edentulous patients, the use of IL17 and, classic inflammation related biochemical markers, IL1β / TGFβ1 / IL10 in early-stage diagnostics of periimplant diseases. In 40 previously selected patients, 6 peri-implant sites of 91 implants were evaluated and classified as healthy, slight inflammation and moderate inflammation in accordance with peri-implant probing depth and gingival index. Data regarding plaque index, clinical attachment loss, suppuration and mobility were also assessed. The peri-implant sulcus fluid was collected using standard paper strips and the levels of IL1β, TGFβ1, IL10 and IL17 were determined by ELISA. The data were analyzed by KolmogorovSmirnov, Mann-Whitney test (Dunns post-test) and Spearman correlation. The median levels of TGFβ1 in healthy group were higher than inflamed group, irrespective of the inflammation degree. In all groups, positive correlation between IL1β and the clinical parameters peri-implant probing depth and clinical attachment loss, and negative correlation between TGFβ1 and plaque index were observed. In healthy and slight inflammation groups, there was a negative correlation between TGFβ1 and the parameters probing depth and clinical attachment loss, and a positive correlation between IL1β and plaque index. Only in healthy group, it was observed correlation between IL17 and clinical attachment loss. Correlation between the cytokines was observed with IL1β and IL17, IL1β and IL10 in healthy group; with IL17 and IL10 in slight inflammation group; with IL1β and TGFβ1 in moderate inflammation group. The cytokines IL10 and IL17 appear to modulate peri-implant inflammation. The significant reduction in the level of TGFβ1 in the initials stages of peri-implant disease suggests its use as an immunological marker of peri-implant health.. Palavras-chave: fluido sulcular peri-implantar, citocinas, implante dental, inflamação.. 3.

(14) INTRODUÇÃO. 4.

(15) 1. INTRODUÇÃO Os. implantes. osseointegrados. representam. uma. importante. alternativa de tratamento para a reposição de elementos dentais perdidos, sendo utilizados com altos índices de sucesso. Entretanto, ainda ocorrem perdas de implantes, tanto nas fases iniciais, bem como nas fases tardias, após os implantes estarem em função mastigatória (Liskmann et al., 2004). Falhas precoces têm sido associadas a fatores inerentes ao indivíduo. (tabagismo,. condição. sistêmica,. disponibilidade. óssea),. ao. procedimento cirúrgico (trauma e superaquecimento ósseo, contaminação) e ao tipo de implante (material, desenho, topografia de superfície) (Exposito et al., 1998). As perdas tardias, por sua vez, estão relacionadas principalmente à falta de habilidade e motivação dos pacientes em controlar os fatores etiológicos responsáveis pela inflamação dos tecidos peri-implantares (Murata et al., 2002; Leonhardt et al., 2002; Kivela-Rajamaki et al., 2003a; Liskmann et al., 2004). Evidências sugerem um papel primário do biofilme bacteriano na etiologia destas inflamações, associado ou não à sobrecarga oclusal (KivelaRajamaki et al., 2003b; Liskmann et al., 2004; Degidi et al., 2006). Inflamações iniciais restritas aos tecidos moles que circundam os implantes. são. denominadas. mucosites.. Este. processo. pode. evoluir. rapidamente para uma inflamação severa, conhecida como peri-implantite, caracterizada pela destruição do osso de suporte e dos tecidos moles adjacentes, levando à perda de estabilidade do implante (Kivela-Rajamaki et al., 2003a; Kivela-Rajamaki et al., 2003b; Yalçin et al., 2005). Os processos inflamatórios peri-implantares evoluem de forma mais rápida que os periodontais. Assim, o monitoramento dos implantes dentais torna-se essencial para a prevenção, detecção precoce da inflamação e, conseqüentemente manutenção dos mesmos (Paolantoio et al., 2000; Yalçin et al., 2005). Os parâmetros comumente utilizados para avaliar a saúde periimplantar são: avaliação da presença de placa, presença de sangramento à sondagem, determinação da profundidade de sondagem e grau de mobilidade, além do exame radiográfico, que permite avaliar relação osso/ implante ao. 5.

(16) longo do tempo (Murata et al., 2002; Kivela-Rajamaki et al., 2003a; KivelaRajamaki et al., 2003b; Liskmann et al., 2004; Tözum et al., 2008). O implante é considerado clinicamente saudável se não houver sangramento, mobilidade, dor ou desconforto, e os tecidos peri-implantares apresentarem aspecto de normalidade (Persson et al., 2001; Watzek, 2004). Entretanto, esses parâmetros clínicos são limitados (McClanahan et al., 2001), pois revelam o grau de destruição promovido pela doença apenas após sua manifestação clínica (Paolantonio et al., 2000; Kivela-Rajamaki et al., 2003b), não permitindo observar alterações iniciais no sítio peri-implantar (Kivela-Rajamaki et al., 2003b; Yalçin et al., 2005). Assim, pesquisas têm investigado métodos de diagnóstico complementares, que possibilitem avaliar alterações na condição de saúde peri-implantar, em estágios ainda não detectáveis em exames clínicos e radiográficos, ou seja, previamente à perda óssea irreversível (Liskmann et al., 2004; Yalçin et al., 2005). O fluido sulcular tem sido utilizado na investigação de doenças que afetam a cavidade oral, embora ainda não seja utilizado como ferramenta de diagnóstico na prática clínica (Kivela-Rajamaki et al., 2003b; Liskmann et al., 2004). Marcadores biológicos presentes no fluido sulcular são extensivamente pesquisados nas doenças periodontais (Murata et al., 2002; Ebersole, 2003; Kivela-Rajamaki et al., 2003a; Kivela-Rajamaki et al., 2003b; Ozmeric 2004; Berglundh et al., 2005; Loos & Tjoa 2005, Yalçin et al., 2005). As semelhanças entre o microambiente periodontal e peri-implantar, levaram os pesquisadores a investigarem na mucosa peri-implantar os mesmos marcadores utilizados no diagnóstico das periodontites (Paolantonio et al., 2000; Liskmann et al., 2004; Yalçin et al., 2005). O estabelecimento de novos padrões de diagnóstico, baseados em biomoléculas presentes no fluido sulcular peri-implantar pode constituir um método complementar para avaliação e acompanhamento longitudinal de diferentes tipos de implantes (Yalçin et al., 2005; Duarte et al., 2009a-b).. 6.

(17) REVISÃO DE LITERATURA. 7.

(18) 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Implantodontia A utilização de implantes com a finalidade de reposição de dentes perdidos representa um grande avanço da Odontologia moderna, permitindo aos pacientes restaurar a função mastigatória, estética e fonética com maior conforto e segurança se comparado com as próteses tradicionais (Misch, 2009).. A. busca. por. um. substituto. aos. dentes. naturais. levou. ao. desenvolvimento de diferentes sistemas de implantes, como os implantes agulhados, subperiostais e laminados, utilizando vários tipos de materiais (Albrektsson, 2005). Os primeiros implantes odontológicos baseavam-se no empirismo e fracassaram devido à falta de estudos clínicos e científicos controlados. Entretanto, na década de 60, Bränemark e colaboradores, fundamentados em pesquisas básicas e clínicas, desenvolveram um novo sistema de implantes, fundamentado na ancoragem direta do implante no tecido ósseo, sem a interposição de tecido mole, fenômeno este, denominado osseointegração, (Amarante & Lima, 2001; Simon & Watson, 2002; Franchi et al., 2005). Bränemark (1985) definiu a osseointegração como sendo “uma conexão estrutural e funcional direta entre o tecido ósseo vivo e ordenado e a superfície de um implante submetido à carga funcional”. Inicialmente não foi possível demonstrar tal fenômeno, devido à ausência de equipamentos que permitissem seccionar o tecido ósseo sem a remoção do implante metálico, o que foi demonstrado por Shroeder et al. em 1976 (Davies, 2003; Amarante & Lima, 2001; Albrektsson, 2005). As altas taxas de sucesso dos implantes endósseos fabricados com ligas de titânio (Adell et al., 1981; Davies, 2003; Lang et al., 2004) provocaram profunda modificação no planejamento e seqüência de tratamento em diversas áreas da reabilitação oral. Novos sistemas de implantes, baseados no protocolo original de Bränemark e colaboradores, foram desenvolvidos com variações no desenho do parafuso, composição do titânio, topografia e. 8.

(19) tratamento de superfície (Amarante & Lima, 2001; Davies, 2003; Li et al., 2004; Xie et al., 2005; Coelho et al., 2009; Dohan Ehrenfest et al., 2010). No entanto, perdas de implantes, tanto nas fases iniciais (período de cicatrização) como tardias (após o período de osseointegração e instalação da prótese), podem ocorrer (Liskmann et al., 2004). As perdas de implantes podem estar relacionadas a falhas durante o procedimento cirúrgico (trauma e superaquecimento ósseo, contaminação) e a confecção da prótese (ocasionando excesso de carga oclusal) ou fatores inerentes ao indivíduo como hábitos parafuncionais (bruxismo e apertamento dental), má higienização, além de problemas sistêmicos como diabetes (Exposito et al., 1998; Murata et al., 2002; Leonhardt et al., 2002; KivelaRajamaki et al., 2003a; Kivela-Rajamaki et al., 2003b; Watzek, 2004; Liskmann et al., 2004). O tabagismo também tem sido apontado como um dos possíveis responsáveis pelo fracasso de implantes, embora muitos fatores relacionados ao comportamento da doença peri-implantar ainda não estejam esclarecidos (Watzek, 2004). Atualmente, são utilizados critérios clínicos e radiográficos para avaliar os diferentes sistemas de implantes em função (Murata et al., 2002; Kivela-Rajamaki et al., 2003a; Kivela-Rajamaki et al., 2003b; Liskmann et al., 2004; Tözum et al., 2008). Clinicamente, um implante é considerado com sucesso se não for observado sangramento, mobilidade, dor ou desconforto e os tecidos peri-implantares apresentarem aparência saudável (Persson et al., 2001; Watzek, 2004). O exame radiográfico permite avaliar a relação osso/implante, possibilitando acompanhar a evolução da perda óssea marginal ao longo do tempo. Entretanto, esses critérios de avaliação não permitem acompanhar alterações iniciais no sítio peri-implantar (Kivela-Rajamaki et al., 2003a; Yalçin et al., 2005). Uma vez que os processos inflamatórios periimplantares evoluem de forma mais rápida que os periodontais (Jovanovic, 1997; Persson et al., 2001; Martelli et al., 2004), o diagnóstico precoce dessas alterações é essencial para o tratamento da doença e manutenção dos implantes (Paolantoio et al., 2000; Yalçin et al., 2005; Misch, 2009).. 9.

(20) 2.2. Mucosa Peri-implantar A mucosa peri-implantar, análoga à gengiva marginal encontrada ao redor da dentição natural, é constituída por lâmina própria densa e colagenosa coberta por delgado epitélio oral estratificado e pavimentoso. Sendo assim, a mucosa peri-implantar possui importante função de proteção e atua como barreira biológica, promovendo vedamento entre meio externo e meio interno (Koka, 1998; Weber & Cochran 1998; Lindhe & Berglundh, 2010). Semelhante ao periodonto de proteção, o epitélio da mucosa periimplantar apresenta uma face voltada para a cavidade oral (externa) e outra que constitui a junção implante-epitélio (interno). A porção externa é revestida por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado, que se continua com o epitélio não-queratinizado que reveste o sulco peri-implantar. Na face voltada para o implante, a mucosa está aderida à superfície do implante por uma porção de epitélio semelhante ao epitélio juncional, denominada junção implante/epitélio. Essa adesão das células epiteliais ao implante é feita por hemidesmossomos e lâmina basal (Bernard et al., 1997; Koka, 1998; Weber & Cochran 1998; Lindhe & Berglundh, 2010). As principais diferenças entre a mucosa peri-implantar e a gengiva marginal residem na composição do tecido conjuntivo, no alinhamento dos feixes de fibras colágenas e na vascularização (Weber & Cochran 1998; Lindhe & Berglundh, 2010). Quando comparada com a gengival marginal, a lâmina própria da mucosa peri-implantar apresenta algumas diferenças quanto à proporção de colágeno e fibroblastos. Na região peri-implantar o tecido conjuntivo apresenta característica de tecido cicatricial, sendo constituído por poucas células e muitas fibras colágenas (Bernard et al.,1997; Jovanovic, 1997; Koka, 1998; Groisman & Vidigal Jr, 2004; Lindhe & Berglundh, 2010). Devido à ausência do cemento e a influência das características da superfície dos implantes, os feixes de fibras colágenas da região supraalveolar, organizam-se paralelamente ao longo eixo dos implantes ou se inserem no periósteo da crista óssea alveolar não ocorrendo feixes de fibras perpendiculares ao implante. Assim, a adesão entre mucosa peri-implantar e. 10.

(21) superfície do implante é mais frágil que a adesão entre dente e gengiva (Buser et al., 1992; Bernard et al., 1997; Koka, 1998; Weber & Cochran 1998;; Machtei et al., 2006; Lindhe & Berglundh, 2010). Nos tecidos periodontais a vascularização provém de duas origens, uma a partir de vaso supraperiostal, que forma os capilares das papilas do conjuntivo subjacente ao epitélio oral e ao plexo vascular lateral ao epitélio juncional. A outra origem é derivada do plexo vascular do ligamento periodontal, que emite ramificações em direção coronária, passando pela crista alveolar e terminando na porção supra-alveolar da gengiva livre (Jovanovic, 1997; Koka, 1998; Weber & Cochran 1998; Lindhe & Berglundh, 2010). Já na mucosa peri-implantar a vascularização é garantida apenas pelo vaso sangüíneo supraperiosteal localizado externamente ao processo alveolar, que origina o plexo de capilares e vênulas localizado subjacente ao epitélio juncional e ao epitélio oral. Devido à ausência do plexo proveniente do ligamento periodontal, na mucosa peri-implantar, o conjuntivo supra-alveolar apical ao epitélio juncional apresenta-se pouco vascularizado (Jovanovic, 1997; Koka, 1998; Weber & Cochran 1998; Lindhe & Berglundh, 2010). 2.3. Doença Peri-implantar Doença peri-implantar é um termo genérico relacionado às reações infecciosas que ocorrem nos tecidos circundantes ao implante em função, resultando em processo inflamatório com perda óssea ou não. O quadro de mucosite peri-implantar caracteriza-se por um processo inflamatório inicial e reversível, restrito aos tecidos moles que circundam o implante. No entanto, persistindo o agente agressor, esse processo pode evoluir rapidamente para uma inflamação severa e irreversível, denominada peri-implantite. Este estágio avançado da doença é caracterizado pela destruição do osso de suporte e dos tecidos moles adjacentes, levando ao comprometimento do implante devido à perda de ancoragem (Weber & Cochran 1998; Kivela-Rajamaki et al., 2003a; Kivela-Rajamaki et al., 2003b; Martelli et al., 2004; Yalçin et al., 2005; Liskmann et al., 2006; Misch, 2009; Lindhe & Berglundh, 2010).. 11.

(22) Estudos em animais e em humanos têm demonstrado semelhanças clínicas, radiográficas e histológicas entre a infecção periodontal e periimplantar (Liskmann et al., 2006). O mesmo mecanismo patogênico responsável pela instalação da doença periodontal parece existir nos tecidos peri-implantares, ainda com o agravante de evoluir de forma mais rápida e agressiva que no dente (Jovanovic, 1997; Persson et al., 2001; Martelli et al., 2004). O sulco peri-implantar, que é semelhante ao sulco gengival, atua como nicho propício para a colonização e crescimento de microorganismos orais (Liskmann et al., 2006). Assim, o acúmulo de placa na superfície dos implantes e no sulco peri-implantar, inicialmente leva ao comprometimento do epitélio e aumento no infiltrado inflamatório do tecido conjuntivo (Jovanovic, 1997), entretanto, com a progressão da doença, pode haver comprometimento total da osseointegração e perda do implante (Schou et al., 1993; Misch, 2009; Lindhe & Berglundh, 2010). Um dos critérios utilizados para avaliação clínica dos tecidos periodontais é a profundidade de sondagem (Ataoglu et al., 2002; Murata et al., 2002; Yalçin et al., 2005; Liskmann et al., 2006; Strbac et al., 2006; Tözum et al., 2007; Renvert, et al., 2007; Lachmann et al., 2007; Tözum et al., 2008; Duarte et al., 2009a; Duarte et al., 2009b). No entanto, nos tecidos periimplantares, este parâmetro torna-se menos confiável, devido à disposição das fibras colágenas paralela à superfície do implante (Kivela-Rajamaki et al., 2003; Misch, 2009; Lindhe & Berglundh, 2010). Além disso, apenas a medida quantitativa da profundidade de sondagem, não é capaz de fornecer informações conclusivas a respeito do estado de saúde/doença periimplantares porque pode ser influenciada por mudanças na anatomia e posição da mucosa (Dinato & Polido, 2001; Misch, 2009; Lindhe & Berglundh, 2010). Por ser o principal fator etiológico das doenças peri-implantares, a placa bacteriana é utilizada como critério de monitoramento da saúde dos implantes, bem como da capacidade de higienização dos pacientes (Ataoglu et al., 2002; Murata et al., 2002; Yalçin et al., 2005; Liskmann et al., 2006; Strbac et al., 2006; Tözum et al., 2007; Renvert et al., 2007; Lachmann et al., 2007;. 12.

(23) Duarte et al., 2009a; Duarte et al., 2009b). O índice de placa isoladamente, não permite identificar a presença de alterações ou mesmo o nível de risco apresentado pelo paciente, mas, estatisticamente, níveis mais baixos de placa, tendem a desenvolver menos doença (Dinato & Polido, 2001; Renvert et al., 2007). A presença de sangramento, por sua vez, demonstra as alterações inflamatórias dos tecidos moles circunjacentes aos implantes dentais (Misch, 2009), entretanto, sua relevância clínica é considerada quando correlacionado a outros parâmetros clínicos (Dinato & Polido, 2001). A presença de sangramento pode ser avaliada por meio do sangramento à sondagem (Renvert et al., 2007; Lachmann et al., 2007; Duarte et al., 2009a; Duarte et al., 2009b) e do índice gengival (Ataoglu et al., 2002; Murata et al., 2002; Yalçin et al., 2005; Liskmann et al., 2006; Strbac et al., 2006; Tözum et al., 2007; Duarte et al., 2009a; Duarte et al., 2009b). De acordo com Ericsson & Lindhe (1993), freqüentemente ocorre sangramento à sondagem mesmo ao redor de implantes saudáveis. Dessa forma, as diferenças na inserção dos dentes e implantes contra-indicam este parâmetro nas comparações entre esses sítios. O índice gengival, por representar a tendência ao sangramento espontâneo da mucosa, poderia ser mais apropriado para avaliação da inflamação periimplantar (Tözum et al., 2005). A supuração (Duarte et al., 2009a; Duarte et al., 2009b) e a mobilidade (Tözum et al., 2008) peri-implantar são elementos indicativos do estágio avançado da doença, quando, na maioria das vezes já não é possível estabelecer formas de tratamento de modo a manter os implantes (Dinato & Polido, 2001; Misch, 2009). Da mesma forma, o exame radiográfico, que também é utilizado para determinar a condição de saúde dos implantes (Murata et al., 2002; Renvert et al., 2007; Tözum et al., 2007; Tözum et al., 2008; Duarte et al., 2009a; Duarte et al., 2009b) , só permite avaliar a perda óssea quando está avançada, e praticamente irreversível (Kivela-Rajamaki et al., 2003a; Misch, 2009). As limitações dos exames disponíveis dificultam o estabelecimento da condição clínica dos implantes e têm estimulado a busca por marcadores. 13.

(24) biológicos que possam ser utilizados como métodos de diagnóstico precoce da saúde peri-implantar (Liskmann et al., 2004). Métodos dessa natureza têm sido bastante estudados na doença periodontal com objetivo de identificar marcadores biológicos presentes no fluido sulcular (Ataoglu et al., 2002; Murata et al., 2002; Kivela-Rajamaki et al., 2003b; Yalçin et al., 2005; Gurkan et al., 2006; Strbac et al., 2006; Tözum et al., 2007; Renvert et al., 2007; Lachmann et al., 2007; Tözum et al., 2008; Duarte et al., 2009a; Duarte et al., 2009b). A semelhança entre o microambiente periodontal e peri-impalntar (Yalçin et al., 2005) sugere que estes microambientes compartilhem os mesmos marcadores o que torna viável à implantodontia avaliar métodos de diagnóstico complementares estudados na periodontia. Alguns desses estudos verificaram modificações na composição do fluido sulcular (Ozmeric 2004, Griffiths, 2003; Loos & Tjoa, 2005; Tozum et al., 2005) em indivíduos com periodontite e peri-implantite, incentivando sua utilização como ferramenta de diagnóstico. 2.4. Fluido Sulcular Peri-implantar (FSPI) A cavidade oral possui uma complexa flora microbiana, composta por microorganismos permanentes e transitórios. Além disso, há uma variedade de nichos, tais como: a superfície dental, a língua e o sulco gengival, que favorecem o estabelecimento e o desenvolvimento da microbiota. Muitos desses microorganismos estabelecem uma relação de simbiose com o hospedeiro, entretanto, algumas espécies são patogênicas. Assim, o meio bucal representa uma porta para diversos patógenos envolvidos direta ou indiretamente em doenças infecciosas locais e/ou sistêmicas (Ebersole 2003; Lindhe & Berglundh, 2010). Entre as diversas funções que a mucosa oral desempenha, a principal delas é a de proteção. Diante desse desafio antigênico, o próprio revestimento epitelial da mucosa, representa uma barreira natural, protegendo os tecidos mais profundos do ambiente contaminado que é a cavidade oral (Ten Cate; 2001; Ebersole 2003; Lindhe & Berglundh, 2010). Para manter a. 14.

(25) homeostasia do meio, existem vários mecanismos do sistema imune que contribuem para controlar a colonização microbiana e dentre eles estão o fluido sulcular e a saliva, que servem como fatores mecânicos, minimizando a acumulação bacteriana, além de apresentarem biomoléculas que participam dos mecanismos de imunidade inata e adquirida (Lindhe & Berglundh, 2010). O fluido sulcular gengival foi identificado no século XIX, mas somente a partir da década de 50, sua composição e possível papel nos mecanismos de defesa da cavidade oral começaram a ser elucidados (Carranza & Bulkacz, 1997; Lindhe & Berglundh, 2010). Os tecidos periodontais e peri-implantares apresentam semelhanças na constituição, na microbiota e também em relação à presença de um fluido protetor, o fluido sulcular (Paolantonio et al., 2000; Lindhe & Berglundh, 2010), o qual é constantemente produzido (Ebersole, 2003; Lindhe & Berglundh, 2010). Localizado banhando a região dos sulcos gengival e peri-implantar, o fluido sulcular é formado devido à permeabilidade do epitélio juncional, que permite a passagem de componentes macromoleculares provenientes do soro e do meio intersticial gengival. Assim, este fluido é constituído por ultra-filtrado do plasma sanguíneo e contém enzimas e proteínas individuais, tais como: proteases inibidoras, microglobulinas, fibrinogênio, albumina, lipoproteínas, bem como mediadores inflamatórios, fatores de crescimento, como fator de crescimento e transformação β (TGF-β) e imunoglobulinas (IgG e IgA). Além destes componentes, o fluido contém células descamadas dos epitélios juncional e sulcular, bem como células de defesa (neutrófilos, linfócitos e monócitos) que migram constantemente do tecido conjuntivo subjacente para o sulco. No fluido também podem ser encontradas bactérias e acúmulos de elementos do seu metabolismo (Carranza & Bulkacz, 1997; Ten Cate, 2001; Ebersole 2003; Goodson 2003, Ozmeric 2004; Lindhe & Berglundh, 2010). Devido à sua consistência fluida e fluxo constante, o fluido sulcular age como fator de limpeza mecânica, minimizando o acúmulo de bactérias. As moléculas da imunidade inata e adquirida presentes no fluido também contribuem para a homeostasia do meio (Ten Cate; 2001; Ebersole 2003). Devido a essas características, o fluido gengival vem sendo estudado como. 15.

(26) método de diagnóstico para determinar o estado de atividade da doença periodontal ou risco do indivíduo à doença (Carranza & Bulkacz, 1997; Goodson, 2003; Ozmeric, 2004; Lindhe & Berglundh, 2010). No periodonto saudável, alguns constituintes do fluido, como IgG e IgA, e enzimas como a colagenase II, apresentam-se em níveis baixos, atuando de forma protetora (Ebersole, 2003). Já no periodonto inflamado, ocorre aumento do volume de fluido sulcular e mudanças na composição deste exsudato, que passa a apresentar mais componentes vasculares e celulares pró-inflamatórios (Ebersole, 20003; Loos e Tjoa, 2005). Apesar da presença de microrganismos patogênicos ser necessária para o desenvolvimento inicial da doença, a amplificação e progressão deste processo parece ser altamente dependente da resposta imune e inflamatória gerada pelo hospedeiro em resposta às bactérias ou à seus produtos. Alguns estudos têm evidenciado a importância do fluido sulcular nos mecanismos de defesa do periodonto (Ebersole, 20003; Loos e Tjoa, 2005). Porém, somente na última década, pesquisadores propuseram métodos de análise que permitissem sua utilização no diagnóstico da doença periodontal (Goodson, 2003). Para análise do fluido foi desenvolvida metodologia para coleta com pontas de papel absorvente e mensuração do volume de fluido por meio do aparelho Periotron® (Goodson, 2003; Perinetti & Spoto, 2004). Além de medir variações no volume de fluido gengival em função do estado de saúde do periodonto, as pesquisas avaliaram o comportamento das macromoléculas presentes no fluido em função do estágio de evolução da periodontopatia (Griffiths, 2003). Segundo Loos e Tjoa (2005) existem aproximadamente 100 componentes do fluido sulcular que podem ser utilizados como marcadores de saúde periodontal, e futuramente poderão ser utilizados rotineiramente no monitoramento de indivíduos com periodonto saudável. A dosagem de citocinas pró e anti-inflamatórias no fluido sulcular peri-implantar tem potencial para uso na clínica odontológica e também em pesquisas. Citocinas são polipeptídeos envolvidos na mediação e regulação das respostas imune e inflamatória. Essas proteínas são produzidas por vários. 16.

(27) tipos celulares distintos e atuam sobre diversas células. Comprovadamente, muitas funções originalmente atribuídas a uma citocina são propriedades partilhadas por diversas citocinas diferentes, sendo que elas podem também, interagir modificando, ampliando ou reduzindo seus efeitos (Abbas et al., 2008). A síntese de determinada citocina pode ser influenciada por outras, levando à formação de cascatas em que uma segunda ou terceira citocina regula as ações biológicas da primeira. Em geral, as citocinas participam da imunidade inata, apresentação de antígenos, diferenciação, ativação e recrutamento celulares, regulam a expressão de moléculas de adesão, assim como o crescimento e diferenciação celulares (Feldmann et al., 1998; Abbas et al., 2008). 2.5. Interleucina 1β (IL1β) A IL1 foi uma das primeiras citocinas descritas e é amplamente estudada (Dinarello, 1994). A família da IL1 é composta por três polipeptídios, interleucina-1α (IL1α), interleucina-1β (IL1β) e antagonista do receptor da interleucina-1 (IL1Ra) (Dinarello,1994). Essa citocina é um dos vários mediadores da inflamação que foram identificados no fluido sulcular (Nicolau et al., 2003; Konradsson & Van Dijken, 2005). Nos últimos anos, estudos procuram elucidar a correlação entre as condições clínicas dos implantes osseointegrados, com a concentração da IL1β no fluido sulcular peri-implantar. A IL1 β é produzida principalmente pelos monócitos e macrófagos, mas também pode ser sintetizada por fibroblastos e células ósseas (Tatakis et al., 1988; Gruica et al., 2004), além de leucócitos e células do epitélio juncional (Gemmell et al., 1998; Page, 1991).. Entre os. efeitos biológicos da IL1β estão sua capacidade de estimular linfócitos T, proliferação de linfócitos B, estímulo da produção de PGE2 pelos monócitos e fibroblastos, e liberação de metaloproteinases que degradam as proteínas da matriz. Além disso, a IL1β também promove o recrutamento de osteoclastos e a reabsorção óssea, afetando também a quimiotaxia para neutrófilos e a ativação dessas células (Tatakis et al., 1988; Gruica et al., 2004).. 17.

(28) Kao et al. (1995), Panagakos et al. (1996) e Murata et al. (2002), demostraram que a concentração de IL1β no fluido sulcular peri-implantar, está aumentada na condição de doença, quando comparada à saúde peri-implantar. A observação de que a concentração da IL1β no fluido sulcular aumenta de acordo com o grau de severidade da doença (saúde, mucosite e periimplantite), sugere que esta citocina esteja relacionada à rápida e ampla destruição do tecido de suporte observado durante a progressão do processo inflamatório (Panagakos et al., 1996). Assim, IL1 β poderia ser um indicador para o monitoramento da saúde/doença em implantes osseointegrados (Kao et al., 1995). Ataoglu et al. (2002), por sua vez, ao avaliarem pacientes fumantes e não fumantes que apresentavam implantes, demonstraram níveis elevados de IL1β em sítios peri-implantares com sinais clínicos de inflamação quando comparado aos sítios saudáveis. Esses dados sugerem que o monitoramento da concentração de IL1β pode auxiliar o diagnóstico de saúde peri-implantar em pacientes não fumantes. Machtei et al. (2006), ao avaliarem a presença de IL1β no fluido sulcular de dentes e de implantes com diferentes plataformas em pacientes edêntulos parciais, observaram uma correlação positiva entre os níveis de IL1β e a perda óssea em dentes e implantes. Os autores sugerem seu possível uso como marcador da reabsorção óssea. 2.6. Fator de Crescimento e Transformação β (TGFβ) O TGFβ é uma citocina multifuncional, com papel tanto pró como anti-inflamatório, o que a torna uma proteína interessante no monitoramento das patologias peri-implantares e periodontais (Cornelini et al., 2003). Esta citocina é expressa em 5 isoformas, porém apenas TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 são expressos em mamíferos, sendo o primeiro o mais comum. É considerada uma citocina anti-inflamatória devido à capacidade de supressão da imunidade celular e humoral, bem como da produção de citocinas inflamatórias e atividade das células apresentadoras de antígenos. Entretanto também é considerada. 18.

(29) pró-inflamatória pela atividade quimiotática para neutrófilos e linfócitos (Steinsvoll et al., 1999). Além disso, está envolvida na embriogênese (multiplicação e diferenciação celular), inflamação, regulação da resposta imune, adesão e migração celular, formação da matriz extracelular, angiogênese e reparo tecidual (Saito et al., 1999). Schultze-Mosgau et al. (2006), ao compararem a produção de TGF β1 na mucosa em pacientes com implantes saudáveis, sem implantes e irradiados. Encontraram níveis mais elevados nos grupos com implantes saudáveis e os irradiados, e níveis baixos nos grupos sem implantes, sugerindo o efeito positivo desta citocina para o sucesso dos implantes, uma vez que há estímulo à proliferação dos fibroblastos, bem como síntese das proteínas da matriz extracelular e moléculas de adesão. Gürkan et al. (2006), ao avaliarem indivíduos com diferentes formas de doença periodontal, observaram um aumento dos níveis de TGFβ1 no fluido sulcular de indivíduos com periodontite quando comparados aos indivíduos com gengivite, atribuindo a esta citocina um papel modulatório importante na doença periodontal, podendo regular quadros inflamatórios. Cornelini et al. (2003), por sua vez, ao avaliarem a presença de TGF β1 na mucosa ceratinizada ao redor de implantes saudáveis e com periimplantite, encontraram níveis mais elevados desta citocina em implantes com inflamação, de forma semelhante aos resultados encontrados por Duarte et al. (2009a) com IL10, atribuindo ao TGF β1 papel importante na homeostasia dos tecidos e controle da degradação tecidual (Steinsvoll et al., 1999; Cornelini et al., 2003), estimulando os fibroblastos e células endoteliais (Cornelini et al., 2003). 2.7. Interleucina 10 (IL10) A IL10 é uma das citocinas com características imuno-regulatórias mais destacadas do sistema imune humano (Conti et al., 2003). É produzida por várias células do sistema de defesa, incluindo monócitos/macrófagos ativados, linfócitos T e linfócitos B, embora os macrófagos e monócitos. 19.

(30) parecem a ser fonte predominante de síntese de IL10 endógena em humanos (Conti et al., 2003). Essa citocina atua na inibição da síntese de citocinas próinflamatórias, incluindo TNF-α, IL6, IL8 e IL12, bem como na supressão de várias atividades das células apresentadoras de antígenos (Grimbaldeston et al., 2007). Além disso, é capaz de ativar a produção de IL1Ra, um antagonista da IL1, bem como limitar a duração e extensão da resposta inflamatória (Konradsson & Van Dijken, 2005). Sua ausência está associada com a maior susceptibilidade a qualquer tipo de doença infecciosa (Helminem et al., 1999), o que indica um papel protetor contra destruição tecidual (Duarte et al., 2009ab). Goutoudi et al. (2004) avaliaram o efeito da terapia periodontal nos níveis de IL10 e IL1β no fluido sulcular de pacientes com periodontite crônica e observaram relação inversa entre os níveis dessas citocinas e o estado de saúde periodontal do indivíduo, com níveis mais altos IL10 nos sítios saudáveis. Duarte et al. (2009a), ao avaliarem biópsias da mucosa periimplantar em indivíduos edêntulos parciais e totais, encontraram níveis baixos de IL10 em implantes saudáveis se comparado aos com inflamação, porém, não encontraram diferença significante de acordo com a severidade do processo inflamatório. Duarte et al., (2009b) avaliaram a presença de IL10 no fluido sulcular peri-implantar de indivíduos saudáveis, com mucosite e com peri-implantite antes e após diferentes terapias mecânicas anti-infecciosas. Não encontraram diferenças significativas nos níveis de IL10 entre implantes saudáveis e com inflamação, embora aqueles com inflamação tenham apresentado valores mais elevados. Liskmann et al. (2006), por sua vez, encontraram níveis mais elevados de IL10 na saliva de pacientes totalmente edêntulos cujos implantes apresentavam-se com doença peri-implantar e demonstraram correlação positiva entre os níveis desta citocina com os parâmetros clínicos profundidade de sondagem, índice gengival e sangramento à sondagem. Duarte et al., (2009b) e Liskmann et al. (2006) sugerem que os níveis elevados de IL10 estão. 20.

(31) relacionados à tentativa do organismo em manter o equilíbrio local, o que reforça sua importância na modulação da inflamação peri-implantar. 2.8. Interleucina 17 (IL17) A IL17, recentemente descoberta, também é apontada como uma das citocinas chave na patologia do periodonto, embora seu papel ainda não esteja completamente esclarecido (Vernal et al., 2005). A IL17 tem sido considerada fator chave no desenvolvimento da osteoartrite e no conseqüente desencadeamento da reabsorção da matriz óssea e cartilaginosa pelos clastos. No entanto, estudos recentes apontaram um papel regulador para esta citocina (Pinkerton et al., 2008). Alguns estudos demonstram a presença da IL17 nos tecidos periodontais doentes (Vernal et al., 2005; Honda et al., 2008). Sua presença estaria relacionada à expressão de metaloproteinases, interleucinas próinflamatórias como IL1β e TNF-α (Beklen et al., 2007), bem como indução da reabsorção óssea (Takayanagi, 2007; Inoue & Takayanagi, 2009), contribuindo para maior severidade da doença (Takahashi et al., 2005; Colic et al., 2007;). Dessa forma, variações nos níveis de IL17 podem ser determinantes na progressão da doença, sendo que fatores microbianos, imunológicos e genéticos podem estar envolvidos em tal regulação. Outros autores, pelo contrário, sugerem que a IL17 estaria relacionada à integração entre a imunidade inata e adaptativa, atuando de modo distinto na presença ou ausência de inflamação (Harrington et al., 2006, 2006; Yu et al., 2007; Bi et al., 2007). Kawaguchi et al. (2004) sugerem ainda que esta citocina tem participação nos mecanismos de defesa do organismo, com potencial atividade protetora contra invasão bacteriana. No entanto, o papel desta citocina na progressão da doença peri-implantar e seu potencial como marcador precoce da inflamação ainda não foram investigados.. 21.

(32) PROPOSIÇÃO. 22.

(33) 3. PROPOSIÇÃO O presente estudo teve como objetivos: • Determinar o nível das citocinas IL1β, TGFβ1, IL10 e IL17 no fluido. sulcular. peri-implantar. em. indivíduos. parcialmente. edentados,. reabilitados com implantes osseointegrados. • Verificar a correlação entre os níveis dessas citocinas e os parâmetros clínicos de avaliação peri-implantar. • Determinar um possível marcador biológico de saúde periimplantar.. 23.

(34) MATERIAL E MÉTODOS. 24.

(35) 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. População 4.1.1. Seleção dos indivíduos Participaram deste estudo indivíduos parcialmente edêntulos, que receberam implantes dentais na clínica do curso de Especialização em Implantodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Uberlândia. Os critérios observados para inclusão dos indivíduos foram: • indivíduos saudáveis, sem alteração sistêmica que pudesse interferir na condição peri-implantar. • não-fumantes. • não estivessem grávidas ou lactantes. • não utilizassem medicamentos como antibióticos, antiinflamatórios, imunossupressores ou qualquer outra medicação que pudesse interferir na condição peri-implantar, nos últimos 3 meses. • não apresentassem história de terapia periodontal ou peri-implantar durante os últimos 6 meses. • possuíssem implantes e as respectivas próteses, em função, há pelo menos 6 meses. Todos os procedimentos foram previamente autorizados pelo Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo seres humanos da Universidade Federal de Uberlândia (parecer nº. 370/06 - Anexo 1). Os indivíduos foram orientados sobre os procedimentos e assinaram termo de consentimento livre e esclarecido autorizando a realização dos mesmos. 4.2. Procedimentos clínicos Inicialmente foram coletados dados referentes à identificação dos pacientes, tais como idade e gênero. Foi realizada anamnese sobre a condição. 25.

(36) sistêmica atual dos indivíduos e sobre os motivos que levaram à perda do elemento dentário. Em seguida, nova ficha foi preenchida para avaliar o índice de placa (IP), além das condições de higiene oral do indivíduo. Após o preenchimento desses dados, em cada indivíduo, foi coletado o fluido sulcular peri-implantar (FSPI) em todos os implantes presentes. Após essas coletas, foram medidos o índice gengival (IG), a profundidade do sulco peri-implantar (PS), o nível de inserção clínica (NIC) e, em seguida, foram obtidas tomadas radiográficas. A presença de supuração (S) e mobilidade (M) também foram avaliadas. O exame clínico foi realizado em 6 sítios peri-implantares (distovestibular:DV, vestibular central:VC, mesial-vestibular:MV, disto-lingual:DL, lingual central :LC e mesio-lingual:ML) por um único examinador treinado e calibrado. Uma ficha clínica, especialmente confeccionada para a pesquisa (Anexo 2), permitiu o registro dos parâmetros clínicos avaliados, bem como dados biológicos de interesse. 4.2.1. Índice de Placa (IP) A presença de placa foi avaliada através do índice de placa de Silness e Löe (1964) modificado por Mombelli et al. (1987), e foram atribuídos valores obedecendo ao seguinte critério: Escore 0: não foi detectada presença de placa bacteriana; Escore 1: placa reconhecida apenas através do uso de sonda; Escore 2: placa identificada a olho nu; Escore 3: quando houver placa em abundância. 4.2.2. Coleta do fluido sulcular peri-implantar (FSPI) Em cada indivíduo, previamente à coleta, foi realizada remoção de placa supragengival sem tocar a gengiva marginal. A saliva da superfície da coroa dos implantes a serem avaliados eram gentilmente secas com jato de ar e os mesmos eram isolados com roletes de algodão para evitar contaminação. Em seguida, pontas endodônticas de papel absorvente padronizadas número. 26.

(37) 30 - Maillefer, Dentsply, Suíça - (Perinetti & Spoto, 2004) foram introduzidas aproximadamente 1mm no interior do sulco peri-implantar, e deixadas por 30 segundos para absorção do fluido sulcular (Yalçin et al., 2005). As amostras contaminadas com sangue foram descartadas e repetida a coleta. Em cada implante foram utilizadas 6 pontas, uma para cada face: disto-vestibular (DV), vestibular central (VC), mesial-vestibular (MV), distolingual (DL), lingual central (LC) e mesio-lingual (ML). Imediatamente após a coleta, as pontas foram colocadas individualmente em tubos cônicos de 1.5mL (Eppendorf) estéreis contendo 400µl de solução tampão de armazenagem (50nM de tampão Tris-HCl, pH 7,5, contendo 0,15M de NaCl e 1mM de CaCl2) e mantidas em banho de gelo até serem iniciados os procedimentos para extração do fluido absorvido. Para a extração do fluido sulcular absorvido pelas pontas endodônticas, os tubos foram centrifugados a uma velocidade 10.000G por 300 segundos e o sobrenadante contendo os fluidos foi coletado, distribuído em alíquotas e congelado a -20°C para posterior dosagens de citocinas. 4.2.3. Índice Gengival (IG) O índice gengival (Mombelli et al. 1987) foi avaliado após percorrer levemente a margem da mucosa peri-implantar utilizando sonda clínica introduzida superficialmente no sulco peri-implantar sem encontrar resistência. Foram atribuídos valores a cada um dos sítios obedecendo ao seguinte critério: Escore 0: ausência de sangramento Escore 1: presença de pontos isolado de sangramento Escore 2: presença de sangramento formando um colar Escore 3: presença de sangramento abundante 4.2.4. Sondagem do sulco peri-implantar (PS) Após a coleta das amostras de fluido, foram obtidas as profundidades de sondagem do sulco peri-implantar utilizando uma sonda. 27.

(38) periodontal milimetrada estéril (Golgran/Brasil®, São Paulo, SP, Brazil). A sonda era introduzida paralelamente ao longo eixo do implante de forma suave, até encontrar ligeira resistência, tendo sempre o cuidado para não causar dano à região, obtendo-se 6 medidas em milímetros (mm): DV, VC, MV, DL, LC, ML (Yalçin et al., 2005). 4.2.5. Nível de inserção clínica (NIC) O nível de inserção clínica (NIC) foi avaliado a partir de um ponto de referência da prótese sobre implante (margem cervical da coroa sobre o implante) até o ponto mais apical do sulco peri-implantar utilizando uma sonda periodontal milimetrada estéril (Golgran/Brasil®, São Paulo, SP, Brazil). Nos casos em que a margem cervical da coroa sobre o implante estava subgengival, o NIC era o valor da própria profundidade de sondagem periimplantar (PS). A avaliação do NIC foi realizada em 6 sítios peri-implantares (DV, VC, MV, DL, LC, ML), obtendo-se 6 medidas em milímetros (mm). 4.2.6. Supuração (S) e Mobilidade (M) A presença de supuração nos implantes foi avaliada através de pressão digital na mucosa peri-implantar no sentido ápico-coronal, sendo utilizado um índice dicotômico: presente (1) e ausente (0). Através de índice semelhante, a mobilidade foi avaliada utilizando espelho clínico apoiado sobre a região vestibular da coroa dos implantes e levemente forçada contra esta superfície. Os implantes que apresentassem supuração ou mobilidade, não foram considerados no presente estudo, em que avaliamos os estágios iniciais da doença peri-implantar. 4.2.7. Exame radiográfico Em todos os indivíduos foram obtidas radiografias periapicais de cada implante, padronizadas pela técnica do paralelismo ou cone longo com. 28.

(39) uso de posicionadores de filme radiográfico. Esses exames radiográficos, de caráter complementar, tiveram o intuito de avaliar a presença de perda óssea ou lesões nos implantes, porém, não foram utilizados para classificação dos sítios peri-implantares. 4.2.8. Classificação dos sítios peri-implantares Inicialmente os sítios peri-implantares dos pacientes foram alocados em 2 grupos: sem inflamação (saudável) e com inflamação (mucosite). Foram considerados sem inflamação os sítios que possuíssem índice gengival igual a zero e com inflamação os com índice gengival maior ou igual a 1 (Tozum et al., 2007). Imediatamente após, os sítios peri-implantares com inflamação (mucosite) foram subdivididos considerando a severidade da inflamação, sendo que o índice gengival igual a 1 representa a inflamação leve e o índice gengival maior que 1 representa a inflamação moderada (Tozum et al., 2007). A periimplantite foi considerada como profundidade de sondagem peri-implantar maior que 4mm, índice gengival maior que 1 e índice de placa maior que 1 (Strbac et al., 2006 adaptado).. Os sítios que se incluíam no grupo peri-. implantite não foram considerados no presente estudo, em que avaliamos os estágios iniciais da doença peri-implantar. 4.3. Procedimentos laboratoriais 4.3.1. Dosagem das citocinas A concentração das citocinas foi determinada utilizando \kits comerciais de ELISA de captura (eBioscience, San Diego, CA, USA) para as citocinas IL1β, TGFβ1, IL10 e IL17 de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Resumidamente placas de alta afinidade com 96 poços foram adsorvidas com 100µL/poço do anticorpo de captura, monoclonal, obtido de rato, anti-citocina de humano, na concentração adequada para cada citocina e incubadas overnight à temperatura de 4ºC. As placas foram lavadas 5 vezes. 29.

(40) com PBS-Tween e bloqueadas com 200µL/poço de solução bloqueadora por 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-Tween e incubadas overnight à 4°C com 100µL/poço das amostras ou do padrão correspondente à cada citocina. As placas foram novamente lavadas 5 vezes com PBS-Tween e incubadas por 1 hora à temperatura ambiente com 100µL/poço do anticorpo de detecção conjugado a Biotina, na concentração adequada para cada citocina (Biotin-conjugate anti-human antibody). Após 5 lavagens com PBS-Tween, foram adicionados 100µL/poço do conjugado peroxidase-estreptavidina (Avidin-HPR), com período de incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. As placas foram novamente lavadas 5 vezes com PBS-Tween e receberam 100µL/poço do substrato enzimático (1X TBM solution), permanecendo protegidas da luz por 15 minutos à temperatura ambiente. Após este período, os níveis de absorbância foram obtidos a 450nm utilizando uma Leitora de ELISA (Titertek Multiskan Plus Flow Laboratories, Mclean, VA, EUA). As concentrações de cada citocina foram obtidas e quantificadas por um programa de computador (Programa Microplate Manager® 4.0, BIO-RAD – Molecular Bioscience Group, Hercules, CA, USA) utilizando-se uma curva padrão previamente estabelecida com quantidades conhecidas dos padrões das citocinas (standard curve range IL1β: 4-500 pg/ml, TGFβ1: 60-8000 pg/ml, IL10: 2-300 pg/ml e IL17: 4-500 pg/ml). Os resultados obtidos foram expressos em pg/mL. 4.4. Análise estatística A análise estatística foi realizada através do programa GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad Prism version 5.0 for Windows, San Diego, CA, USA). Primeiramente, foi verificada a normalidade dos utilizando o teste Kolmogorov-Smirnov. Uma vez detectada a ausência de normalidade, os dados clínicos e dosagem das citocinas foram avaliados utilizando testes nãoparamétricos. O teste Kruskall-Wallis com correção Dunns foi utilizado para avaliar os parâmetros clínicos e os níveis das citocinas nos sítios saudáveis, com inflamação leve ou moderada. O teste de correlação de Spearman foi. 30.

(41) utilizada para testar possíveis relações entre os níveis das citocinas entre si e com os parâmetros clínicos. O nível de significância para todas as análises foi estabelecido em 5% (p<0,05).. 31.

(42) RESULTADOS. 32.

(43) 5. RESULTADOS 5.1. Dados Clínicos Foram avaliados 91 implantes dentais em 40 indivíduos parcialmente edêntulos, sendo 15 homens e 25 mulheres, entre 25 e 65 anos de idade (média de idade 50,5 anos). Os implantes estavam em função por um período médio de 35 meses, variavam em diâmetro de 3.3 a 5.0 mm e em comprimento de 8.5 a 15.0 mm. Dentre os motivos que levaram à perda dental, 36,26% dos indivíduos relataram cáries dentais; 15,38% insucesso no tratamento endodôntico e/ou protético; 14,28% perda dental devido a traumas ou fratura; 13,19% perda devido à doença periodontal; 4,40% agenesia dental e 16,49% não souberam informar o motivo que levou à perda dental (Figura 1). Dentre os 91 implantes dentais avaliados, 76,92% eram do tipo hexágono externo, 23,08% hexágono interno e nenhum cone Morse (Figura 2). Dentre os 546 sítios peri-implantares avaliados, 476 (87,18%) eram do grupo saudável, 32 (5,86%) eram do grupo inflamação leve e 38 (6,96%) eram do grupo inflamação moderada (Figura 3). Para as variáveis categóricas os resultados foram apresentados como número e porcentagem e para as variáveis contínuas os dados foram apresentados como média e erro padrão (dados clínicos) e mediana (dosagens das citocinas). A profundidade de sondagem nos sítios peri-implantares saudáveis (1,60mm ± 0,02) foi significativamente menor quando comparada à dos sítios com inflamação (2,51mm ± 0,14; p<0,0001; Figura 4). Os sítios periimplantares do grupo saudável apresentaram profundidade de sondagem mais elevada quando comparados aos sítios com inflamação leve (2,28mm ± 0,21; p<0,01) e moderada (2,71mm ± 0,18; p<0,001). No entanto, não houve diferença significante ente os sítios com inflamação leve e moderada quando comparados entre si (p>0,05) (Figura 5). O nível de inserção clínica nos sítios peri-implantares saudáveis (1,82mm ± 0,04) foi significativamente menor quando comparada ao dos sítios. 33.

(44) com inflamação (2,51mm ± 0,13; p<0,0001; Figura 6). Os sítios periimplantares do grupos saudável apresentaram nível de inserção clínica mais elevada quando comparados aos sítios com inflamação moderada (2,72mm ± 0,18; p<0,0001). No entanto, não houve diferença significante ente os sítios saudáveis quando comparados aos com inflamação leve (2,29mm ± 0,20; p>0,05) e entre os com inflamação leve quando comparados aos com inflamação moderada (p>0,05) (Figura 7). A porcentagem de sítios com índice de placa igual a zero é maior no grupo saudável (71,43%) se comparado aos grupos inflamação leve (43,75%) e moderada (26,32%). A porcentagem de sítios com índice de placa igual a 1 foi maior no grupo inflamação moderada (31,58%) em comparação com os grupos inflamação leve (31,25%) e saudável (19,95%). Do mesmo modo, porcentagem de sítios com índice de placa igual a 2 foi maior no grupo inflamação moderada (42,10%) em comparação com os grupos inflamação leve (25,00%) e saudável (8,62%). Houve diferença significativa entre a freqüência de distribuição dos valores de índice de placa entre os grupos saudável e inflamação (p<0,0001), saudável e inflamação leve (p<0,0001), saudável e inflamação moderada (p<0,0001) e entre inflamação leve e moderada (p=0,0008) (Figuras 8 e 9). Mobilidade e supuração não foram observadas em nenhum dos implantes incluídos no presente estudo.. 34.

(45) Figura 1: Causas da perda dental.. Figura 2: Tipos de implantes avaliados.. Figura 3: Distribuição dos sítios peri-implantares nos grupos avaliados.. 35.

(46) Figura 4: Profundidade de Sondagem nos sítios peri-implantares dos grupos Saudável e Inflamação (*p<0,0001).. Figura 5: Profundidade de Sondagem nos sítios peri-implantares dos grupos Saudável, Inflamação leve e Inflamação moderada (*p<0,01; **p<0,001).. 36.

(47) Figura 6: Nível de Inserção Clínica nos sítios peri-implantares dos grupos Saudável e Inflamação (*p<0,0001).. Figura 7: Nível de Inserção Clínica nos sítios peri-implantares dos grupos Saudável, Inflamação leve e Inflamação moderada (*p<0,0001).. 37.

(48) Figura 8: Freqüência de distribuição do Índice de placa nos sítios periimplantares dos grupos Saudável e Inflamação (*p<0,0001).. Figura 9: Freqüência de distribuição do Índice de placa nos sítios periimplantares dos grupos Saudável, Inflamação leve e Inflamação moderada (*p<0,001; **p<0,0001).. 38.

(49) 5.2. Níveis de citocinas nos sítios peri-implantares Em todos os sítios experimentais foi detectada a presença das citocinas. Os níveis médios de IL1β foram maiores no grupo saudável (23,64pg/ml ± 1,50) quando comparados ao grupo com inflamação (22,33pg/ml ± 2,69), no entanto, a diferença não foi significante (p=0,65) (Figura 10). O grupo inflamação moderada (25,32pg/ml ± 3,92) apresentou maiores níveis médios de IL1β quando comparado aos grupos saudável e inflamação leve (18,78pg/ml ± 3,59), porém, não houve diferença significante (p=0,51) (Figura 11). Houve diferença estatisticamente significante entre os níveis médios de TGFβ1 no grupo saudável (1646,00pg/ml ± 109,90) quando comparado ao grupo com inflamação (509,30pg/ml ± 98,24; p<0,0001) (Figura 12). Também foi encontrada diferença significante entre os níveis médios de TGFβ1 entre o grupo saudável quando comparado aos grupos inflamação leve (546,10pg/ml ± 113,10; p<0,01) e inflamação moderada (471,60pg/ml ± 155,50; p<0,001). No entanto, não houve diferença significante entre os níveis de TGFβ1 nos grupos inflamação leve e inflamação moderada quando comparados entre si (p>0,05) (Figura 13). Os níveis médios de IL10 foram maiores no grupo com inflamação (10,76pg/ml ± 1,81) quando comparado ao grupo saudável (8,97pg/ml ± 0,67), porém não foram significantes (p=0,39) (Figura 14). Os níveis médios de IL10 foram maiores no grupo inflamação moderada (13,52pg/ml ± 3,01) quando comparado aos grupos saudável e inflamação leve (7,47pg/ml ± 1,57), porém, não foram significantes (p=0,52) (Figura 15). Os níveis médios de IL17 foram maiores no grupo saudável (35,89 pg/ml ± 3,43) quando comparado ao grupo com inflamação (31,31pg/ml ± 4,59), porém, não houve significância nos resultados (p=0,19) (Figura 16). Não houve diferença significante entre os níveis de IL17 nos grupos saudável, inflamação leve (24,72 pg/ml ± 5,78) e inflamação moderada (36,86 pg/ml ± 6,86) quando comparados entre si (p=0,25) (Figura 17).. 39.

(50) Figura 10: Níveis de IL1β nos sítios peri-implantares dos grupos Saudável e Inflamação (p>0,05).. Figura 11: Níveis de IL1β nos sítios peri-implantares dos grupos Saudável, Inflamação leve e Inflamação moderada (p>0,05).. 40.