CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PRODUTO COSMÉTICO SÓLIDO COM Prosopis juliflora: AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA, DESENVOLVIMENTO DE FORMULAÇÕES E ESTUDO DA
EFICÁCIA HIDRATANTE E ANTI-RUGAS
AUTOR DISCENTE: GABRIEL AZEVEDO DE BRITO DAMASCENO ORIENTADOR: MÁRCIO FERRARI
COORIENTADORA: RAQUEL BRANDT GIORDANI
NATAL-RN 2019
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PRODUTO COSMÉTICO SÓLIDO COM Prosopis juliflora: AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA, DESENVOLVIMENTO DE FORMULAÇÕES E ESTUDO DA
EFICÁCIA HIDRATANTE E ANTI-RUGAS
Tese apresentada à Coordenação do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, como requisito do curso de Doutorado em Ciências Farmacêuticas.
AUTOR DISCENTE: GABRIEL AZEVEDO DE BRITO DAMASCENO ORIENTADOR: MÁRCIO FERRARI
COORIENTADORA: RAQUEL BRANDT GIORDANI
NATAL-RN 2019
A meus pais, João e Avani, por estarem sempre presentes de forma ativa
em todas as etapas da minha formação pessoal, acadêmica e profissional,
aconselhando e apoiando todas minhas decisões, sempre contribuindo de forma
incondicional para o meu crescimento. Da mesma forma, à minha irmã, Gabriela e
demais familiares, que tiveram sua parcela de incentivo e contribuição na minha
formação.
A Flávia, por ter me acompanhado durante toda essa etapa, me incentivando
a realizar meus sonhos, dando suporte, carinho, atenção, amor, me cobrando e me
ajudando nos momentos de dificuldades. Não posso deixar de agradecer a Hanna,
que se deitava no pé da minha cadeira me forçando a ficar sentado e trabalhando.
Aos meus professores que me ajudaram nessa conquista, representados
especialmente pelo Professor Márcio, à professora Raquel; ao professor Hugo, que
me recebeu no Biopol como se fosse um de seus alunos para o que seria uma
rápida colaboração se tornou algo maior, culminando na minha indicação para uma
temporada no Centro de RMN da UFPR. Representados por estes aqui
mencionados, meu muito obrigados a todos que me ajudaram neste processo.
Aos meus amigos que entenderam o que significava este doutorado e
souberam conviver com minhas reclamações, ausências, desabafos, tristezas e
alegrias também, da seleção até a defesa, muito obrigado.
Aos meus amigos do Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento de
Produtos Cosméticos, por ser uma equipe incrível, onde todos se ajudam em todos
os testes e experimentos, sem vocês, boa parte desses experimentos,
especialmente os testes in vivo, não teriam acontecido. Além de contribuir para que
o dia a dia no laboratório seja o melhor possível. Não posso deixar de agradecer
aos membros do Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais Bioativos-UFRN e em
especial a Fernanda Santos, doutorando do grupo, por todo o empenho e
disposição em contribuir com sua expertise em molecular networking. Sem ela, não
teríamos conseguido chegar aos clusters em tão pouco tempo.
Aos voluntários que participaram desta pesquisa, pela fundamental
colaboração.
Ao Núcleo de Pesquisa em Alimento e Medicamento da UFRN e seus
funcionários pela parceria firmada na doação das matérias – primas e obtenção dos
núcleos sólidos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pela
oportunidade de realização deste Doutorado.
Ao INCT-BioNat que possibilitou a realização de análises no Instituto de
Química da UNESP-Araraquara
A CAPES pelo aporte financeiro no tocante a bolsa de estudos de doutorado
que colaborou na execução desse projeto.
Prosopis juliflora (PJ) é uma planta invasora da Caatinga Nordestina e apresenta em sua composição metabólitos com características químicas de interesse em produtos cosméticos. Este trabalho objetivou o desenvolvimento de formulações cosméticas na forma de núcleo sólido contendo o extrato de PJ que em contato com a água forma um gel para uso tópico em dose única. Teve como objetivo também o estudo in vitro e in vivo de segurança dos extratos e a eficácia clínica hidratante e anti-rugas. A otimização da extração dos frutos de PJ foi conduzida a partir de delineamento experimental estatístico. As amostras foram purificadas por ultrafiltração em centrífuga e cromatografia de gel-filtração, seguido de hidrólise ácida e análise da composição monossacarídica por cromatografia em papel e ressonância magnética nuclear (RMN). A fração menor que 3kDa foi avaliada por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) enquanto a fração maior que 3kDa por RMN. Já a fração total, foi analisada por uma plataforma integrada de RMN. A atividade antioxidante in vitro foi avaliada utilizando diferentes metodologias. A segurança in vitro foi realizada por meio dos testes de citotoxicidade e fototoxicidade, enquanto para a avaliação in vivo foi realizado o teste de compatibilidade cutânea. Foi realizada uma etapa de pré-formulação e escolha da melhor forma de obtenção das formulações que então foram submetidas a um estudo de estabilidade por 90 dias. Por fim, para a avaliação clínica da eficácia hidratante e anti-rugas foi mensurado o conteúdo hídrico do estrato córneo e a perda de água transepidermal (TEWL), antes e 1, 2, 3, 4 e 5h da aplicação e o conteúdo hídrico, TEWL e relevo cutâneo após 30 dias de uso prolongado. O delineamento experimental revelou que as melhores condições extrativas foi a 34ºC/3,5h (PJ2). A fração maior que 3KDa (PJ2) foi caracterizada como uma α-glucana e a fração menor que 3kDa apresentou compostos fenólicos, alguns dos quais inéditos para a espécie, e alcaloides. Resultados esses, que estão de acordo com os obtidos pela rede integrada de RMN para a fração total. As amostras não apresentaram efeitos citotóxicos e fototóxicos nas concentrações testadas, bem como, nenhum voluntário apresentou reações cutâneas, sendo um indício de segurança da matéria-prima. As avaliações in vitro da atividade antioxidante demonstraram o potencial da PJ2 em diferentes etapas da cascata oxidativa. Na etapa de pré-formulação foram delineadas oito formulações e três métodos de obtenção dos núcleos sólidos foram avaliados: compressão direta, moldagem e compressão de granulados obtidos por granulação via úmida. Esta última, possibilitou a incorporação de uma fase emolientes na formulação e se mostrou o método mais adequado à obtenção dos núcleos sólidos estáveis. Após os testes de eficácia clínica, foi possível observar que a formulação aditivada com PJ2 aumentou o conteúdo hídrico da pele em até 5h após a aplicação e que nos testes de longa duração, houve uma melhora do conteúdo hídrico, redução da TEWL e melhora nos parâmetros de relevo cutâneo. Dessa forma, evidenciando a aplicabilidade dessa nova forma e matéria-prima cosmética como agente hidratante e antienvelhecimento.
Palavras chave: Algaroba; Anti-envelhecimento; Cosméticos; Hidratação; Polissacarídeos; Prosopis julifora; Fabaceae.
Prosopis juliflora (PJ) is an invasive plant of Brazilian Caatinga and presents compounds in its metabolic composition of interest in cosmetic products. This work aims the development of cosmetic formulations in the form of a solid core containing PJ extract that upon contact with water will form instantly a gel for single dose use. It also aims the in vitro and in vivo safety study of the extracts and the moisturizing and anti-wrinkle activities clinical efficacy. The samples were purified by centrifugal ultrafiltration and gel filtration chromatography, followed by acid hydrolysis and analysis of the monosaccharide composition by paper chromatography and nuclear magnetic resonance (NMR). The fraction smaller than 3kDa was evaluated by liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) while the fraction greater than 3kDa by NMR. The total fraction was analyzed by an integrated NMR platform. The in vitro antioxidant activity was evaluated using different methodologies. In vitro safety assessment was performed using cytotoxicity and phototoxicity tests using colorimetric method and neutral red and MTT as vital corants. The in vivo safety evaluation was performed through the cutaneous compatibility test. A preformulation step was performed and the most suitable technique of obtaining the formulations was chosen, which were then submitted to a 90 days stability study. Finally, for the clinical evaluation of moisturizing and anti-wrinkle efficacy, the water content of the stratum corneum and transepidermal water loss (TEWL) were measured before and 1, 2, 3, 4 and 5 hours after application. These parameters and skin micro relief were evaluated after 30 days of daily use of the formulations. The experimental design revealed that the best extractive conditions were at 34ºC / 3,5h (PJ2). The fraction greater than 3KDa (PJ2) was characterized as an α-glucan and the fraction smaller than 3kDa presented phenolic compounds, some of which are unpublished for the species, and alkaloids. These results agree with those obtained by the integrated NMR network for the total fraction. The samples did not present cytotoxic and phototoxic effects at the concentrations tested, nor did any volunteers present cutaneous reactions. These results are an indication of safety of the raw material. In vitro antioxidant activity evaluations demonstrated the potential of PJ2 acts in different stages of the oxidative cascade. Eight formulations were delineated in the preformulation stage and three methods of obtaining the solid cores were evaluated: direct compression, molding and compression of granules obtained by wet granulation. The latter allowed the incorporation of an emollient phase in the formulation and proved to be the most suitable method to obtain the stable solid cores. After the clinical efficacy tests, it was possible to observe that the formulation added with PJ2 increased the water content of the skin within 5h after the application. In the long-term tests, there was an improvement of the water content, reduction of TEWL and improvement in the parameters of cutaneous relief. Thus, evidencing the applicability of this new form and cosmetic raw material as a moisturizing and anti-aging agent.
Keywords: Algaroba; Anti aging; Cosmetics; Moisturizing; Polysaccharides; Prosopis juliflora; Fabaceae.
Figura 1 – Prosopis juliflora (SW) D.C na Caatinga do Rio Grande do Norte 16 Figura 2 – Etapas do desenho experimental da presente pesquisa. 75 Figura 3 - Diagrama de Pareto mostrando a influência da Temperatura (T) e do Tempo (t) no rendimento do processo de extração, ao nível de 95% de confiança. 77 Figura 4 - Superfície de resposta para o rendimento (R) em função da variação de temperatura (T) e tempo (t) no processo de extração 78 Figura 5 - Superfície de resposta (A) para a concentração de açúcares totais em função da variação de temperatura (T) e tempo (t) no processo de extração. 80 Figura 6 - Avaliação da citotoxicidade das amostras PJ1, PJ2 e PJ3 de Prosopis
juliflora 84
Figura 7 - Avaliação da citotoxicidade das amostras PJ1, PJ2 e PJ3 de Prosopis juliflora em cultura de células Hacat 3T3 e corante vital NR. 86 Figura 8 - Avaliação da fototoxicidade de PJ1, PJ2 e PJ3 de Prosopis juliflora 89 Figura 9 - Perfil de peso molecular de F2M após permeação em coluna de
gel-filtração 91
Figura 10 - Perfil de peso molecular do pico observado para F2M após permeação
em coluna de gel-filtração entre os tubos 74 e 86. 91
Figura 11 - Perfil de peso molecular do pico observado para F2M após protocolo de escalonamento para permeação em coluna de gel-filtração 92 Figura 12 - Clusters das moléculas observados no modo negativo do Molecular
Networking de interesse cosmético. 105
Figura 13 - Clusters das moléculas observados no modo positivo do Molecular
Networking de interesse cosmético. 106
Figura 14 - Núcleos sólidos obtidos por granulação via úmida seguida de
compressão contendo extrato de P. juliflora 117
Figura 15 - Imagens capturadas pelo Visioscan VC98 de um campo antes e após a aplicação do gel reconstituído a partir do núcleo sólido de PJ2 122 Figura 16 - Variação do percentual dos valores de hidratação superficial do estrato córneo, observados 1, 2, 3, 4 e 5 horas após a aplicação das formulações. 124 Figura 17 - Variação do percentual dos valores de TEWL, observados 1, 2, 3, 4 e
5 horas após a aplicação das formulações 126
Figura 18 – Imagens capturas pelo Visioscan VC98 antes e após a aplicação do gel reconstituído a partir do núcleo sólido durante 30 dias. 129
Quadro 1 - Composição do fator de hidratação natural (NMF). 39 Quadro 2 – Escala de avaliação preconizada pelo International Contact Dermatitis
Research Group Guidelines (IRCDG). 59
Tabela 1 - Metabólitos secundários encontrados em Prosopis juliflora. 20 Tabela 2 - Principais compostos isolados de P. juliflora relatados em literaturas e
suas ações biológicas. 22
Tabela 3 - Potenciais aplicações biotecnológicas da Prosopis juliflora. 29 Tabela 4 - Fatores e níveis para o planejamento fatorial 22 + 2 axiais, com triplicata
no ponto central. 53
Tabela 5 - Matriz do planejamento fatorial 22 + 2 axiais, com triplicata no ponto
central. 53
Tabela 6 - Excipientes e concentrações avaliadas no estudo de pré-formulação, denominados de acordo com o Internacional Nomenclature of Cosmetic
Ingredients, quando aplicável. 66
Tabela 7 - Composição das formulações para incorporação dos extratos de
Prosopis juliflora. 67
Tabela 8 - Composição e concentração de uso da fase molhante dos núcleos
sólidos de P. juliflora 70
Tabela 9 - Composição da formulação dos núcleos sólidos de Prosopis juliflora. 72 Tabela 10 - Parâmetros de avaliação e condições experimentais de otimização do
processo de extração. 76
Tabela 11 - Massas relativas ao processo purificação por ultrafiltração em
centrífuga. 90
Tabela 12 - Composição monossacarídica após processo de hidrólise ácida para as frações de polissacarídeos de Prosopis juliflora. 93 Tabela 13 – Deslocamentos químicos observados para amostras de P. juliflora. 94 Tabela 14 - Estudos das galactomananas de Prosopis juliflora descritos na
literatura. 95
Tabela 15 – Atividade antioxidante de poder redutor pela amostra F2M de P.
juliflora. 98
Tabela 16 – Atividade de sequestro do radical DPPH pela amostra F2M de
Prosopis juliflora. 99
Tabela 17 – Atividade antioxidante de quelação de ferro e cobre pela amostra F2M
Tabela 18 – Atividade antioxidante de sequestro de radicais hidroxila (OH-) e
superóxidos (O2-) pela amostra F2M de Prosopis julifora 101
Tabela 19 - Metabólitos identificados na fração menor que 3 kDa de PJ2. 103 Tabela 20 - Metabólitos anotados pela plataforma integrada de RMN para o extrato
PJ2. 109
Tabela 21 - Análise de tempo de fluxo, ângulo de repouso e compressibilidade das formulações base para obtenção dos núcleos sólidos. 112 Tabela 22 – Escala de fluidez para sistemas particulados 113 Tabela 23 -Composição da formulação veículo utilizada para obtenção dos núcleos sólidos por moldagem e granulação via úmida. 115 Tabela 24 - Composição da formulação dos núcleos sólidos de Prosopis juliflora. 116 Tabela 25 - Resultados do estudo de estabilidade dos núcleos sólidos de P. juliflora
e seu veículo. 118
Tabela 26 - Variação do percentual dos valores de hidratação superficial do estrato córneo, observados 1, 2, 3, 4 e 5 horas após a aplicação das formulações 122 Tabela 27 – Valores de hidratação do estrato córneo, TEWL, da avaliação do microrrelevo cutâneo antes e após 30 dias de uso das formulações e suas
1 INTRODUÇÃO 14 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 16 2.1 Prosopis juliflora 16 2.1.1 Informações botânicas 16 2.1.2 Composição química 17 2.1.3 Usos populares 18 2.1.4 Estudos farmacológicos 28
2.1.5 Usos tecnológicos e biotecnológicos 28
2.1.6 Toxicologia 30
2.2 CARBOIDRATOS 32
2.3 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DE INGREDIENTES COSMÉTICOS 33
2.4 FORMA COSMÉTICA PROPOSTA: NÚCLEO SÓLIDO 36
2.5 HIDRATAÇÃO CUTÂNEA 37
2.6 ENVELHECIMENTO CUTÂNEO 42
2.7 AVALIAÇÃO DA CLÍNICA DA EFICÁCIA COSMÉTICA 45
3 OBJETIVOS 49
3.1 OBJETIVO GERAL 49
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 49
4 MATERIAL, MÉTODOS E CASUÍSTICA 50
4.1 MATERIAL 50
4.2 52
4.2.1 Coleta e identificação dos espécimes vegetais 52 4.2.2 Processo de otimização da extração de polissacarídeos de Prosopis
juliflora 52
4.2.3 Planejamento fatorial e desenvolvimento experimental estatístico 53
4.2.3.1 Análise estatística 54
4.2.4 Caracterização dos extratos 54
4.2.4.1 Determinação do rendimento da extração 54
4.2.4.2 Concentração de açúcares totais 54
4.2.4.3 Capacidade antioxidante total 54
4.2.4.4 Dosagem de compostos fenólicos 55
4.2.4.5 Dosagem de proteínas totais 55
4.2.5 Avaliação da segurança dos extratos de Prosopis juliflora 55 4.2.5.1 Avaliação in vitro da segurança dos extratos de Prosopis juliflora 55
4.2.5.1.1 Cultura de células 56
4.2.5.1.3 Avaliação da fototoxicidade 57 4.2.5.2 Avaliação in vivo da segurança dos extratos de Prosopis juliflora 57
4.2.5.2.1 Voluntários 57
4.2.5.2.2 Avaliação da compatibilidade cutânea 58
4.2.6 Isolamento, purificação e análise de polissacarídeos de Prosopis
juliflora 59
4.2.6.1 Purificação por ultrafiltração em centrífuga 59 4.2.6.2 Análise preliminar da composição química de monossacarídeos por
cromatografia em papel 59
4.2.6.3 Escalonamento do processo de purificação em coluna de gel filtração 60 4.2.6.4 Análise da composição química por Ressonância Magnética Nuclear 60 4.2.6.5 Avaliação in vitro da atividade antioxidante da amostra purificada de
Prosopis juliflora 60
4.2.6.5.1 Capacidade antioxidante total 61
4.2.6.5.2 Poder redutor 61
4.2.6.5.3 Sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). 61
4.2.6.5.4 Quelação de íons de Cobre (Cu2+) 61
4.2.6.5.5 Quelação de íons de Ferro (Fe2+) 62
4.2.6.5.6 Sequestro de Radicais Hidroxila (OH-) 62
4.2.6.5.7 Sequestro de radicais Superóxidos (O2-) 63
4.2.7 Análise qualitativa dos metabólitos de Prosopis juliflora 63 4.2.7.1 Análise qualitativa dos metabólitos secundários de Prosopis juliflora por
espectrometria de massas 63
4.2.7.2 Análise qualitativa da composição química do extrato PJ2 de Prosopis
juliflora por espectroscopia 64
4.2.8 Desenvolvimento das formulações cosméticas 65
4.2.8.1 Estudo de pré-formulação 65
4.2.8.1.1 Seleção dos excipientes da formulação 65
4.2.8.1.2 Formulações e análise de fluxo e compressibilidade 67
4.2.8.2 Obtenção das formulações 69
4.2.8.3 Estudo de estabilidade dos núcleos sólidos 71
4.2.8.3.1 Peso médio 71
4.2.8.3.2 Dureza 71
4.2.8.3.3 Friabilidade 71
4.2.8.3.6 Determinação da umidade 72 4.2.9 Avaliação da eficácia clínica das formulações 73 4.2.9.1 Voluntários e condições experimentais para os testes de avaliação
imediata e em longo prazo 73
4.2.9.2 Avaliação da hidratação do estrato córneo e da perda de água
transepidermal (TEWL) 73
4.2.9.3 Análises estatísticas 74
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 76
5.1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS EXTRATOS 76
5.1.1 Rendimento 76
5.1.2 Concentração de açúcares totais 79
5.1.3 Capacidade antioxidante total 80
5.1.4 Compostos fenólicos e proteínas 81
5.2 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DOS EXTRATOS DE Prosopis juliflora 83
5.2.1 Avaliação in vitro da segurança 83
5.2.1.1 Avaliação da citotoxicidade in vitro 83
5.2.1.2 Avaliação da fototoxicidade in vitro 88
5.2.2 Avaliação in vivo da segurança 89
5.3 ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E ANÁLISE DE POLISSACARÍDEOS
DE P. juliflora 89
5.3.1 Purificação por ultrafiltração em centrífuga 89
5.3.2 Determinação do peso molecular 90
5.3.3 Análise preliminar da composição química de monossacarídeos por
cromatografia em papel 92
5.3.4 Análise da composição química por Ressonância Magnética Nuclear 93 5.3.5 Avaliação in vitro da atividade antioxidante da amostra purificada de
Prosopis juliflora 96
5.3.5.1 Capacidade Antioxidante Total 97
5.3.5.2 Poder redutor 98
5.3.5.3 Sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). 99 5.3.5.4 Quelação dos íons de Cobre (Cu2+) e Ferro (Fe2+) 100 5.3.5.5 Sequestro de Radicais Hidroxila (OH-) e Superóxidos (O2-) 101 5.4 ANÁLISE QUALITATIVA DOS COMPOSTOS SECUNDÁRIOS DE
espectrometria de massas 103 5.4.2 Análise qualitativa da composição química do extrato PJ2 de Prosopis
juliflora por espectroscopia 108
5.5 DESENVOLVIMENTO DAS FORMULAÇÕES COSMÉTICAS 111
5.5.1 Estudo de pré-formulação 111
5.5.1.1 Seleção dos excipientes da formulação 111
5.5.1.2 Formulações, análise de fluxo e compressibilidade 112
5.5.2 Obtenção das formulações 115
5.5.3 Estudo de estabilidade dos núcleos sólidos 117
5.6 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA CLÍNICA DAS FORMULAÇÕES 121 5.6.1 Avaliação imediata da hidratação do estrato córneo e da perda de água
transepidermal (TEWL) 121
5.6.2 Avaliação em longo prazo da hidratação do estrato córneo, da perda de água transepidermal (TEWL) e do microrrelevo cutâneo 125
6 CONCLUSÕES 130
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 132
1 INTRODUÇÃO
A vegetação predominante no semiárido nordestino é um complexo denominado de Caatinga, cuja classificação nem sempre é fácil (PEREIRA et al., 2001). O bioma Caatinga apresenta inúmeras espécies de valor econômico, entretanto, além de estar muito degradado e com evidências de desertificação, é o bioma brasileiro com maior grau de desconhecimento científico. O estudo e a conservação da biodiversidade desse bioma constituem um dos maiores desafios do conhecimento científico brasileiro. Essa é uma região natural exclusivamente brasileira e, portanto, estratégias de agregar valor a tal biodiversidade podem fomentar novas políticas públicas de conservação (SILVA et al., 2016).
Prosopis juliflora (P. juliflora), conhecida popularmente como algaroba, é originária do Peru e foi introduzida em 1944 no Rio Grande do Norte. É uma árvore que cresce com facilidade e rapidez, e não se encontra na lista de plantas em extinção, ao contrário, a falta de manejo adequado, a adaptação regional da espécie e a facilidade da dispersão tornaram a algaroba uma planta considerada invasora (DE SOUZA NASCIMENTO et al., 2014).
Nesse contexto, entende-se que novas aplicações para a algaroba podem representar um maior consumo da espécie e, indiretamente, uma proteção das demais plantas endêmicas da Caatinga que compartilham o mesmo habitat. Além disso, pode contribuir com a melhoria de qualidade de vida de diferentes comunidades e através de produtos de agricultura familiar, propiciando emprego e renda fundamentais na estratégia de desenvolvimento e no manejo sustentável da biodiversidade.
A análise da constituição química já reportada pela espécie indica predominância de polissacarídeos e derivados fenólicos, metabólitos que despertam o interesse para potencial uso como ativos e excipientes em produtos farmacêuticos e cosméticos (IBRAHIM et al., 2013; RINCÓN et al., 2014).
A percepção popular de que o uso de matérias-primas de origem vegetal está associado a produtos mais saudáveis e ecológicos é difundida (ANTIGNAC et al., 2011). No entanto, a interação entre os diversos ativos utilizados e a pele é complexa e não há garantias que as reações indesejáveis estejam ausentes, sendo necessária a avaliação da segurança dos ingredientes utilizados como base da segurança dos produtos cosméticos (ANTIGNAC et al., 2011; GAO et al., 2008; NOHYNEK et al., 2010).
De forma a atingir os objetivos, este projeto permeia campos adjacentes: (i) prospecção fitoquímica dos constituintes da algaroba; (ii) análises cromatográficas e espectrométricas de extratos e frações enriquecidas; (iii) desenvolvimento de estratégias
de extração adequadas; (iv) avaliação da segurança e uso da matéria-prima para produção de cosméticos; (v) desenvolvimento de formulações cosméticas aditivadas com extrato da algaroba; (vi) avaliação da eficácia de produtos cosméticos através da avaliação do conteúdo aquoso do estrato córneo, da perda de água transepidermal e do microrrelevo cutâneo.
Considerando que os consumidores de produtos cosméticos clamam por novidades e que os produtos naturais podem ser amplamente explorados nesse nicho, nesta pesquisa objetivou-se desenvolver um núcleo sólido com extrato de algaroba que ao entrar em contato com a água o produto formará instantaneamente um gel com propriedades hidratante e anti-rugas para ser aplicado em dose única, representando uma inovação no mercado cosmético.
Finalmente, vale ressaltar que não havia dados na literatura científica tampouco depósito ou patentes no Instituto Nacional da Propriedade Industrial – INPI, até o presente momento, sobre o uso da algaroba na área cosmética e nem da forma cosmética proposta. Isso possibilitou o depósito de um pedido de patente e valida o ineditismo da pesquisa e inovação, gerando atividades junto às comunidades, fortalecendo a parceria UFRN, empresa e comunidade, valorizando a competência de cada entidade em prol do desenvolvimento sustentável.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. Prosopis juliflora
2.1.1 Informações botânicas
O gênero Prosopis contem 44 espécies de árvores e arbustos, a maioria deles originados nas Américas, os quais são fixadores de nitrogênio e, em geral, apresentam rápido crescimento e tolerância à seca (TRENCHARD et al., 2008). Prosopis juliflora (SW) D.C (Figura 1) é uma árvore abundante e nativa das regiões de pastagem da América do Sul, América Central e Caribe e está presente nas regiões áridas e semiáridas (DE SOUZA NASCIMENTO et al., 2014; LÓPEZ-FRANCO et al., 2013). A taxonomia do gênero é complexa e sua classificação foi re-organizada diversas vezes (TRENCHARD et al., 2008). De acordo com Tropicos.org., a taxonomia da espécie é Equisetopsida C. Agardh; Magnoliidae Novák ex Takht.; Rosanae Takht.; Fabales Bromhead; Fabaceae Lindl.; Prosopis L. 01 (TROPICOS.ORG, 2015).
Figura 1. Prosopis juliflora (SW) D.C na Caatinga do Rio Grande do Norte
Fonte: Autoria própria
A introdução da algaroba no Brasil não teve total aprovação uma vez que em determinadas áreas, algumas espécies se tornaram daninhas e medidas de manejo e erradicação foram necessárias (TRENCHARD et al., 2008). Estima-se que apenas nas
duas primeiras fases de introdução da espécie, entre os anos de 1942 e 1965, 13,5 milhões de mudas foram disponibilizadas no Nordeste brasileiro (SANTOS; DIODATO, 2017).
O perfil invasor da P. juliflora é bem descrito. A espécie é considerada uma das plantas com maior capacidade invasora (DE SOUZA NASCIMENTO et al., 2014) e se distribuiu por milhões de hectares na América do Sul, Austrália, Ásia, Índia e Sudão (PASIECZNIK et al., 2001). De forma diferente de outras espécies invasoras que são influenciadas por múltiplos fenômenos de introdução, as sementes de P. juliflora presentes no Brasil foram coletadas em uma pequena região do Peru, denominada de Piura, conferindo assim características específicas ao fenômeno de invasão observado aqui (OLIVEIRA; COSTA; FONSECA, 2018).
P. juliflora exerce alelopatia frente a espécies destinadas à agricultura e também plantas exóticas, além de competir diretamente por nutrientes e luminosidade, diminuindo a área foliar, diâmetro do caule, altura das árvores e aumentando a mortalidade de espécies concorrentes, incluindo as da biodiversidade brasileira (DE SOUZA NASCIMENTO et al., 2014).
Adaptada às condições adversas da Caatinga, cresce sob a forma de arbustos e árvores que podem atingir alturas superiores a 12m e diâmetro do tronco superior a 1m de circunferência (BHATIA; GUPTA; SONI, 2014; MENDES, 1989; RINCÓN et al., 2014; RODRIGUES et al., 2013).
Apesar do efeito negativo do perfil invasor da algaroba, aspectos positivos foram relatados em solos degradados na Índia, ao longo das laterais de estradas e pastagens, fornecendo importante fonte de madeira e forragem para animais (NASCIMENTO, 2008). A implementação de medidas preventivas nos estágios iniciais de processos de invasão continuam sendo a melhor forma de manejo para evitar os impactos negativos que espécies invasoras podem trazer à diversos ecossistemas (OLIVEIRA; COSTA; FONSECA, 2018). Em função da difícil erradicação da algaroba e do prejuízo às demais espécies da Caatinga, uma exploração racional da espécie como fonte de recursos sustentáveis, pode ser apontada como interessante forma útil de manejo dessa espécie invasora (SATHIYA; MUTHUCHELIAN, 2011).
Assim, o uso racional da P. juliflora em diferentes áreas de aplicação, pode compor uma estratégia útil de manejo desta espécie invasora, auxiliando a contenção de sua proliferação e o aproveitamento de suas potencialidades, auxiliando a sobrevivência de plantas nativas da Caatinga impactadas por esse perfil invasor (SANTOS; DIODATO, 2017; SATHIYA; MUTHUCHELIAN, 2011).
2.1.2 Composição química
Leguminosas do gênero Prosopis pertencente à subfamília Mimosoideae (Fabaceae), são plantas que produzem gomas e estão distribuídas em regiões áridas e semiáridas (DE SOUZA NASCIMENTO et al., 2014). De acordo com estudos físico químicos realizados por Rincón e colaboradores (2014) a goma da semente da algaroba (coletada em período não chuvoso em Maracaibo, Venezuela) apresentou 8,94% de água, 0,39% de cinzas, 0,60% de proteínas, 0,55% de lipídeos e 98,46% de carboidratos total. As semente de P. juliflora apresentam alta porcentagem de polissacarídeos (manose, galactose, glucose) e galactomananas com diferentes proporções de manose e galactose (RINCÓN et al., 2014). Também foi relatada a presença de flavonoides (IBRAHIM et al., 2013), alcaloides (DOS SANTOS et al., 2013) ramnose e ácido elágico (MALHOTRA; MISRA, 1981a).
Diferentes processos de extração e purificação de frações de polissacarídeos, resultaram em galactomananas com diferentes proporções de manose e galactose, identificadas por técnicas cromatográficas e espectroscópicas, distintas entre si (AZERO; ANDRADE, 2002; 2006; BHATIA, 2013; BHATIA; GUPTA; SONI, 2014; LÓPEZ-FRANCO et al., 2013; RINCÓN et al., 2014; VIEIRA et al., 2007).
Além de macromoléculas, a literatura relata a presença de diferentes classes de metabólitos secundários nas folhas, casca, frutos, raízes e pólen, sendo a maioria dos estudos focado na triagem destes metabolitos como listados na Tabela 1. Há também estudos envolvendo o isolamento e a elucidação estrutural de moléculas como alcaloides que estão relacionados a efeitos tóxicos observados em animais alimentados com a algaroba (Tabela 2) (TABOSA et al., 2000a).
2.1.3 Usos populares
Os frutos da algaroba, com a morfologia clássica das vagens produzidas pelas Fabaceae, são historicamente utilizados como alimento por seres humanos em regiões onde a planta é nativa, principalmente devido ao seu sabor, aroma, e os seus elevados níveis de sacarose e proteínas semelhante ao milho e cevada (BORGES, 2004). Fagg e Stewart (1994) relataram o uso dessas vagens como alimentação humana no Vale do Tehuacan no México, desde 6.500 anos a.C. Outro trabalho relatou o consumo difundido da algaroba na alimentação humana e como fonte de madeira para combustível dentre os nativos nas Américas, datando milhares de anos atrás (GUILHERME et al., 2009).
As vagens da algaroba podem fornecer uma gama de produtos alimentares, tais como farinha, xaropes semelhantes a mel e bebidas alcoólicas e não-alcoólicas (BORGES,
2004; GORGATTI NETTO, 1987; GUILHERME et al., 2009; LIMA; LIMA, 1985; NEGREIROS, 1988; VIEIRA; GUERRA; FREITAS, 1995).
Ao triturar as vagens maduras e secas, obtem-se uma espécie de farinha que pode ser utilizada na fabricação de pães e biscoitos; um extrato aquoso obtido da cocção e infusão origina um xarope semelhante ao mel com alta concentração de proteínas e carboidratos, que pode ser fabricado facilmente nos períodos de seca. Uma bebida refrescante pode ser obtida por maceração com água, bem como uma bebida alcoólica destilada a partir do mosto fermentado e, finalmente, um pó que pode ser utilizado como substituto do café, são os principais usos tradicionais na alimentação humana (BORGES, 2004; GORGATTI NETTO, 1987; GOUVEIA; FIGUEIREDO, 2000; GUSMÃO et al., 2018; MACHADO; FIGUEIREDO, 2000; NEGREIROS, 1988).
Por outro lado, no contexto de alimentação animal, alguns estudos foram realizados avaliando e indicando a utilização da P. juliflora como forragem na criação de codornas (SILVA et al., 2002), tilápias do Nilo (CARVALHO et al., 2012), cavalos (MEDEIROS et al., 2012), ovinos e caprinos (RIET-CORREA et al., 2012).
Em paralelo ao seu amplo uso no campo e na agropecuária descrito na literatura, alguns usos populares medicinais são relatados, principalmente em estudos etnofarmacológicos, tais como adstringente, no tratamento do reumatismo e em picadas de escorpiões e cobras (CHOPRA et al., 1958; CHOPRA; NAYAR; CHOPRA, 1956; NADKARNI, 1954).
Tabela 1 - Metabólitos secundários encontrados em Prosopis juliflora.
(Continua) Parte da planta Classe do
metabólito Composto Tipo de extração Referência
Casca Glicosídeo de flavonol Glicosídeo de isoflavona Canferídeo 3-O-β-Dgalactopiranosídeo Retusina 7-O-neoesperosídeo
Fração éter de extração em acetona Extrato etanólico (NEE' SHUKLA; MISRA, 1981) Frutos Flavonoides Açúcares livres Patulitrina Glicose e sacarose
Extrato etanólico dos frutos (identificação dos flavonoides) e extrato aquoso (identificação dos açúcares livres) (WASSEL; RIZK; ABDEL-BARY, 1972) Folhas Flavonoides Alcaloides Saponinas Fenóis Taninos Fibras Substâncias pécticas -
Triagem fitoquímica realizada por reações clássicas e analisadas por métodos gravimétricos e
espectrofotométricos (IBRAHIM et al., 2013) Folhas Flavonoides Apigenina Luteolina Apigenina -6,8-di-C-glicosídeo Crisoerioll 7-O- glicosídeo Luteolina 7-O- glicosídeo Canferol 3-O-metil eter Quercitina 3-O-metil eter Isoharmentina 3-O- glicosídeo Isoharmentina 3-O-rutinosideo Quercitina 3-O- rutinosideo
Quercitina 3-O- diglicosideo (glucose e arabinose)
Identificação em extratos padronizados e procedimentos cromatográficos
(BRAGG et al., 1978)
Tabela 1 - Metabólitos secundários encontrados em Prosopis juliflora. (Conclusão) Identificado em extratos padronizados e procedimentos cromatográficos Terpenoides Fenóis Flavonoides Cumarinas Carbonil Glicosídeo Saponinas -
Triagem fitoquímica através de reações clássicas em extratos metanólicos, etanólicos, clorofórmio e benzeno (SHARMILA; REBECCA JEYANTHI; SADUZZAMAN, 2013)
Folhas Pigmentos Caroteno, xantofilas e feofitina Identificados em extratos etanólicos (TESORIERE et al., 2005) Vagem Glicosídeo de
ácido elágico
Ácido elágico
4-O-α-L-ramnosilgentiobisídeo Isolado em extrato etanólico
(MALHOTRA; MISRA, 1981c) Vagem Glicosídeo de
ácido elágico Ácido elágico 4-O-rutinosideo Isolado em extrato etanólico
(MALHOTRA; MISRA, 1981b)
Vagem Taninos Taninos Diferentes extratos, dentre eles, extração em
acetona e metanol (MAKKAR; SINGH; NEGI, 1990) Pólen Flavonoides Ácidos cinâmicos Derivado-7-O-R apigenina Derivado de luteolina Flavonol glicosídeo Quercetina-3- glicosídeo
Glicosídeo genisteína ou dihidroquercetina Isorhametina-3-O-R
Chalcone
Derivado de ácido cinâmico
Identificado em extração realizada com etanol 50% por HPLC/DAD (ALMARAZ-ABARCA et al., 2007) Raízes Glicosídeos de flavanona
3′, 4′-dihidroxi 5-metoxi 6-metil flavonona 7-0-β-D-glicopiranosídeo
7,4′-dimetoxy 6,8-dimetil flavonona 5-0-β-D-galactopiranosídeo
Isolado em frações benzeno e acetato de etila oriundas de extrato etanólico
(MALHOTRA; MISRA, 1983) Raízes Glicosídeo de
ácido elágico
3,3’-di-O-metil ácído elágico
4-O-α-L-ramnopiranosil Isolado de extração realizada com acetona (MALHOTRA; MISRA, 1981a) Sementes Aminoácidos Aminoácidos essenciais, exceto lisina,
metionina e cisteína Farinha de sementes
(BHATT; CHOVATIYA; SHAH, 2011)
Tabela 2 - Principais compostos isolados de P. juliflora relatados em literaturas e suas ações biológicas.
(Continua)
Classificação Composto / Estrutura Atividade biológica Referência
Alcaloide Julifloridina Não especificada (AHMAD; BASHA; HAQUE,
1978)
(AHMAD; QAZI, 1983) (AHMAD; SULTANA, 1990) (NAKANO, 2010)
N-metiljulifloridina Não especificada (AHMAD; BASHA; HAQUE,
1978) (AHMAD; QAZI, 1983) (AHMAD; SULTANA, 1990) (NAKANO, 2010) Juliprosopina (Juliflorina) Anti-Alzheimer Anti-Leishmania Antidermorfítica Antibacteriana Ligante de DNA
(AHMAD; BASHA; HAQUE, 1978)
(AHMAD et al., 1986) (KHURSHEED et al., 1986) (AHMAD et al., 1989a) (TABOSA; QUINTANS-JÚNIOR; et al., 2000) (TAPIA et al., 2000)
(CHOUDHARY et al., 2005) (DOS SANTOS et al., 2013; RAHMAN et al., 2011)
Tabela 2 - Principais compostos isolados de P. juliflora relatados em literaturas e suas ações biológicas.
(Continuação) Julifloricina (Diasterioisômero de Julifloricina)
Antidermorfítica e
Antibacteriana (NAKANO, 2010) (AQEEL et al., 1989)
Tabela 2 - Principais compostos isolados de P. juliflora relatados em literaturas e suas ações biológicas. (Continuação) Juliprosina Antibacteriana Antimalárica Antifúngica Ligante de DNA
(DOS SANTOS et al., 2013)
(SINGH; SWAPNIL, 2011)
(RAHMAN et al., 2011)
Isojuliprosina (Diasterioisômero de Juliprosina)
Antifúngica (NAKANO, 2010)
(AHMAD; SULTANA; QAZI, 1989)
3´´´´-oxo-juliprosopina
Inibidor de crescimento de
Tabela 2 - Principais compostos isolados de P. juliflora relatados em literaturas e suas ações biológicas.
(Continuação) Secojuliprosopinal
Inibidor de crescimento de
plantas (NAKANO et al., 2004)
3-oxo-juliprosina
Inibidor de crescimento de
plantas (NAKANO et al., 2004)
3´-oxo- juliprosina
Inibidor de crescimento de
Tabela 2 - Principais compostos isolados de P. juliflora relatados na literatura e suas ações biológicas.
(Continuação) Juliprosineno
Antibacteriana (AHMAD; SULTANA;
QAZI, 1989)
Flavonoide (-)-Mesquitol
Antioxidante (SIRMAH et al., 2009)
Aminoácido L-triptofano Inibidor de crescimento de plantas (NAKANO et al., 2001) (NAKANO, 2010) Glicosídeos Siringina Inibidor de crescimento de plantas (NAKANO et al., 2002) (NAKANO, 2010)
Tabela 2 - Principais compostos isolados de P. juliflora relatados em literaturas e suas ações biológicas. (Conclusão) Precursor de enterolignan a (–)-lariciresinol Inibidor de crescimento de plantas (NAKANO et al., 2002) (NAKANO, 2010)
2.1.4 Estudos farmacológicos
Alguns estudos científicos suportam o uso popular medicinal, especificamente na avaliação da atividade antimicrobiana de diferentes extratos e frações da algaroba (AHMAD, 1991; AHMAD et al., 1986; AHMAD et al., 1988; AHMAD et al., 1989a; b; AHMAD; SULTANA; QAZI, 1989; AL-SHAKH-HAMED; AL-JAMMAS, 1999; AQEEL et al., 1989; ARUNACHALAM; KARPAGASUNDARAM; RAJARATHINAM, 2017; CÁCERES et al., 1995; DOS SANTOS et al., 2013; LIMA; LIMA, 1985; RAJA; SARAVANAKUMAR; VIJAYAKUMAR, 2012; SATISH; RAVEESHA; JANARDHANA, 1999; SINGH; SWAPNIL, 2011), além de atividade antioxidante (ALMARAZ-ABARCA et al., 2007; SIRMAH et al., 2011), antitumoral (SATHIYA; MUTHUCHELIAN, 2011), antimalárica (BATISTA et al., 2018; RAMAZANI et al., 2010; RAVIKUMAR; INBANESON; SUGANTHI, 2012; SIMONSEN et al., 2001), atividade larvicida contra o Aedes albopictus, vetor da dengue e chikungunya (YADAV et al., 2015) e potencial uso em plantações no combate a pragas agrícolas (CAVALCANTE; MOREIRA; VASCONCELOS, 2006; DHIVYA et al., 2018; SIVAKUMAR et al., 2005), atividade anti-helmíntica (ODHIAMBO et al., 2014), anti-emética (HASAN et al., 2012), ação inibitória da colinesterase com possibilidade de uso na terapia do Alzheimer (CHOUDHARY et al., 2005) e mais recentemente, atividade catalítica, antimicrobiana, antibiofilme e cicatrizante de nanopartículas de prata obtidas a partir do extrato das folhas de P. juliflora (ARYA et al., 2019).
Analisando em conjunto a constituição química, os usos populares e os estudos farmacológicos já desenvolvidos, a P. juliflora é uma espécie interessante em relação às suas potenciais ações farmacológicas. Estudos que abordem a exploração racional em relação aos usos populares bem como investigações do potencial farmacológico da espécie podem ser uma alternativa ao manejo sustentável da algaroba, ajudando a evitar os efeitos nocivos do seu perfil invasor e contribuir para a obtenção de novas moléculas bioativas.
2.1.5 Usos tecnológicos e biotecnológicos
Devido à similaridade com a goma arábica, a goma de algaroba obtida das vagens (frutos) é descrito como um agente encapsulante de óleos essenciais e corantes naturais (BERISTAIN; GARCÍA; VERNON-CARTER, 1999; BERISTAIN; VERNON-CARTER, 1994; GOYCOOLEA et al., 1997; KHANNA et al., 1997; MURUGESAN; ORSAT, 2012; VERNON-CARTER et al., 2001) e apresenta potencial de uso como agente emulsificante para
emulsões do tipo óleo em água (CARTER; SHERMAN, 1980; VERNON-CARTER et al., 1996; VERNON-CARTER; PEDROZA-ISLAS; BERISTAIN, 1998).
Acedo-Carrillo e colaboradores (2006) investigaram a influência de diferentes óleos na estabilidade e comportamento eletrocinético de emulsões do tipo O/A estabilizadas pela goma da algaroba. Os autores realizaram um estudo de estabilidade a longo prazo e observaram emulsões com óleo de laranja estáveis na faixa de concentração de 9 a 22% de goma de algaroba, propondo ainda um mecanismo de estabilização eletrostática, semelhante ao da goma arábica.
A indústria farmacêutica e cosmética tem à disposição grande número de excipientes de origem vegetal, principalmente devido à segurança, economia e abundância na natureza, dentre eles, a P. juliflora apresenta estudo de uso como agente aglutinante e sua mucilagem está presente em comprimidos de diclofenaco sódico (PRAJAPATI et al., 2013; SENTHIL SELVI et al., 2010). Outros estudos de utilização da P. juliflora na área farmacêutica, mostram a obtenção de sistemas de liberação modificada contendo combinações da goma da algaroba, quitosana e goma xantana (NOGUEIRA et al., 2003), produção de hidrogéis (REIS et al., 2003) bem como na obtenção de gomas semelhantes à amostras comerciais com potencial uso como em sistemas de liberação modificado do tipo targeting e aplicações em formulações alimentares (VILARÓ et al., 2018).
Além das aplicações relacionadas a medicamentos e cosméticos, a algaroba apresenta diversos outros potenciais na área da biotecnologia, conforme resumidos na Tabela 3.
Tabela 3 - Potenciais aplicações biotecnológicas da Prosopis juliflora.
(Continua)
Parte da planta Aplicação Referência
Biomassa das
sementes Obtenção de bio óleos;
(MASIMALAI;
KUPPUSAMY, 2015) Caule e Raízes Solução verde para descontaminar solos com
metais pesados tais como o Cu e Cd
(SENTHILKUMAR et al., 2005)
Folhas Remoção de produtos químicos tóxicos presentes no efluente de curtume
(SHARMILA;
REBECCA JEYANTHI; SADUZZAMAN, 2013) Folhas Potencial inseticida contra a mosca branca
(CAVALCANTE; MOREIRA; VASCONCELOS, 2006)
Folhas Potencial uso como agente biocida no combate aos cupins (Macrotermes spp)
(BEZUNEH et al., 2019)
Folhas Potencial uso como inibidor de corrosão em metais e concretos
(FOUDA; AWADY; BEHAIRY, 2018; PALANISAMY et al., 2016)
Tabela 3 – Potenciais aplicações biotecnológicas da Prosopis juliflora.
(Conclusão)
Folhas
Desenvolvimento de quantum dots de carbono para a identificação fluorescente de mercúrio e ácido dimercaptossuccínico
(POURREZA; GHOMI, 2019)
Núcleo das
árvores Bioindicador de acúmulo de metais pesados
(BERAMENDI-OROSCO et al., 2013) Sementes Síntese de poliuretano de origem natural (TATHE; JAGTAP,
2013) Sementes Potencial uso como coagulantes para o tratamento
de água
(SALEEM;
BACHMANN, 2019) Sementes
Produção de biodiesel com potencial de
substituição do diesel comum sem modificações nos motores
(ASOKAN et al., 2019)
Vagens Produção de etanol (SILVA et al., 2011)
Vagens e casca Produção de carbono ativado
(KAILAPPAN; GOTHANDAPANI; VISWANATHAN, 2000)
2.1.6 Toxicologia
Apesar da P. juliflora ser utilizada na alimentação de animais e para consumo humano, intoxicação de animais tem sido historicamente relatada nos Estados Unidos (DOLLAHITE, 1957; 1964), Peru (BACA; VALLENAS; NOVOA, 1967) e Brasil (FIGUEIREDO et al., 1995; LIMA et al., 2004; SILVA et al., 2006; TABOSA et al., 2006), sobretudo em bovinos e caprinos. Estudo realizado no estado de Pernambuco, 50 produtores e 11 veterinários foram entrevistados, seis deles relataram ter observado surtos associados com o consumo de vagens de algaroba em lugares onde ela é uma parte importante da alimentação animal com livre acesso a esta fonte de alimento, especialmente na estação seca (ASSIS et al., 2009).
Os efeitos tóxicos são bem descritos em animais que tem a P. juliflora como fonte de alimento (CÂMARA et al., 2009), levando a uma disfunção muscular e popularmente caracterizado no Brasil como "cara-torta" (FIGUEIREDO et al., 1995). Falta de coordenação dos movimentos da mastigação, apreensão difícil de alimentos, salivação excessiva, disfagia e atrofia do músculo masseter localizado na cabeça do gado (TABOSA et al., 2006; TABOSA et al., 2000b), associado a atonia ruminal, anemia, edema submandibular e perda de peso progressiva (KINGSBURY, 1964), são os principais sinais clínicos associados à intoxicação. Esses sinais clínicos são caracterizados por emaciação neuromuscular, lesões histológicas como espongiose, gliose, perda de substância Nissl, vacuolação do pericário dos neurônios dos núcleos motores do trigêmeo (SILVA et al., 2007), finalmente, degeneração e desaparecimento de neurônios motores do núcleo trigêmeo (TABOSA et al., 2006).
Nesse contexto, os primeiros estudos foram desenvolvidos com o objetivo de isolar, purificar e identificar compostos presentes na algaroba, relacionados aos casos de toxicidade (TABOSA et al., 2000a; TABOSA et al., 2000b). Os autores identificaram principalmente os alcaloides piperidinicos juliprosopina, juliprosina e juliprosineno, responsáveis pela atividade tóxica da espécie.
Silva e colaboradores (2007) utilizando culturas de astrócitos de ratos tratados com uma fração enriquecida em alcaloides de algaroba, relataram uma ação direta nas células gliais, induzindo ou ativando citotoxicidade, estimulando a produção de óxido nítrico, podendo estar relacionado aos efeitos tóxicos da espécie em animais. Posteriormente, o mesmo grupo complementou o estudo com testes de citotoxicidade dos alcaloides piperidinicos, juliprosopina e juliprosina em culturas de neurônios da ratos, atribuindo a este compostos os efeitos tóxicos observados nos animais (SILVA et al., 2013).
Por fim, outro estudo evidenciou o efeito da juliprosopina em mitocôndrias de ratos, observando alterações no potencial de membrana, bem como redução da produção de ATP, morte celular e disfunção de neurônios envolvidos na neurotoxicidade da planta (MAIOLI et al., 2012).
No entanto, de acordo com Silva e colaboradores (2017), o envolvimento dessas alterações celulares já relatadas na literatura e o mecanismo de morte celular induzido pelos alcaloides de P. juliflora ainda não havia sido esclarecido totalmente. Dessa forma, os autores avaliaram o envolvimento do dano mitocondrial e da autofagia no mecanismo de morte celular induzido por uma fração total de alcaloides (30μg/mL) e por uma fração de alcaloides composta pelos alcaloides juliprosopina e juliprosina (7,5μg/mL), em um modelo de co-cultura de neurônios e células da glia (SILVA et al., 2017). Os autores observaram que a autofagia é o principal mecanismo de proteção contra morte celular neural, associado com morte celular programada em resposta ao dano mitocondrial, em resposta a indução gerada pelos alcaloides piperidínicos de P. juliflora nas concentrações testadas.
Conforme compilado por Damasceno; Ferrari e Giordani (2017), no aspecto da toxicidade provocada em animais pela P. juliflora, é possível observar uma evolução nos trabalhos publicados na literatura, partindo de relatos de caso à estudos com alcaloides isolados e mecanismo de ação. No entanto, traçando um paralelo das informações toxicológicas com as propriedades farmacológicas, pode-se observar a ausência de estudos que estabeleçam uma clara relação entre a dosagem tóxica da algaroba e seus alcaloides e o potencial dessas como novas moléculas bioativas para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas. Embora haja relatos de toxicidade em animais, há amplo uso
popular medicinal e alimentar de derivados de P. juliflora há muitos anos, o que a credencia para futuras aplicações no âmbito farmacêutico e cosmético.
2.2 CARBOIDRATOS
Os carboidratos são os principais constituintes das espécies vegetais, exibindo uma variedade de funções biológicas tais como função estruturante (celulose), reserva energética (amido), ação defensiva (gomas e mucilagens), metabolismo energético primário e como sinalizador de expressão gênica (THARANATHAN et al., 1987). Embora haja pequenas divergências quanto à classificação, os carboidratos de origem vegetal são classificados em três grandes grupos: mono, oligo e polissacarídeos, os quais podem apresentar uma enorme variedade estrutural refletindo no espectro de atividades desempenhadas (THARANATHAN et al., 1987).
Polissacarídeos oriundos de sementes podem ser classificados em três grupos: o primeiro, formado por compostos presente no endosperma tais como galactomananas; o segundo, compostos de origem da casca das sementes e, o terceiro, formado por compostos da parede celular do endosperma (SOUKOULIS; GAIANI; HOFFMANN, 2018). Estes polissacarídeos constituem uma das principais fontes de hidrocoloides, utilizados em diversas áreas tais como cosmética, farmacêutica e alimentícia, em função de suas características funcionais, promovendo uma demanda crescente por pesquisa e inovação em novas matérias-primas sustentáveis (SOUKOULIS; GAIANI; HOFFMANN, 2018).
Um grande número de excipientes utilizados pela indústria farmacêutica, alimentícia e cosméticas são formados por polímeros naturais, especialmente polissacarídeos como gomas, mucilagens, glucanas e galactomananas, em função de sua segurança, biocompatibilidade e biodegradabilidade, custo e disponibilidade na natureza (PRAJAPATI et al., 2013). Estes polissacarídeos são carboidratos complexos com um ou mais monossacarídeos ligados e uma variedade de substituintes, os quais apresentam elevada quantidade de grupos hidroxilas, podendo levar a retenção de água e, no caso das mucilagens, auxiliar na resistência das espécies vegetais à seca assim como manutenção das condições necessárias para germinação das sementes (CLARKE; ANDERSON; STONE, 1979; PRAJAPATI et al., 2013; THARANATHAN et al., 1987).
Além de aplicações tecnológicas, polissacarídeos de origem vegetal tem sido largamente estudados com importantes atividades biológicas como antioxidante, imunoregulatória, antitumoral antioxidante, neuroproteção, radioproteção, antidiabetes, hepatoproteção, antiosteoporose e antifadiga (JIN et al., 2013) além de ações antiinflamatória e antimicrobiana, em diversos modelos de estudo in vitro (JIAO et al., 2016;
PANDIT; SONG; JEON, 2014). Pesquisas de novos polissacarídeos bioativos tem aumentado nos últimos anos, com destaque às moléculas antioxidantes, que podem agir por diversos mecanismos tais como no combate dos radicais livres, diminuindo a peroxidação lipídica, se mostrando uma potencial fonte de ativos possíveis de serem utilizados na cosmetologia como agentes antienvelhecimento (HUANG; MEI; HU, 2017; LIU; SUN; HUANG, 2018).
2.3 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DE INGREDIENTES COSMÉTICOS
A essência da inovação e desenvolvimento de produtos cosméticos está fundamentada na pesquisa de ingredientes ativos funcionais, seja de origem vegetal, mineral ou sintética, os quais são largamente estudados e muitas vezes lançados ao mercado (GAO et al., 2008). Dessa forma, produtos cosméticos devem ser seguros à saúde humana quando utilizados nas condições normais ou em condições razoavelmente previsíveis de uso (BRASIL, 2012a).
Nesse sentido, a demanda por produtos contendo ativos de origem vegetal, natural e orgânico vem crescendo e movimentando o mercado cosmético durante a última década, associado fortemente a uma maior sensação de segurança e apelo ecológico (ANTIGNAC et al., 2011; FERNANDO et al., 2019). Além de permitir a exploração racional à biodiversidade brasileira, principalmente se a matéria-prima apresenta estudos científicos comprovando a segurança e eficácia além do comprometimento com o desenvolvimento sustentável (FRANQUILINO, 2006).
Os ativos cosméticos de origem vegetal englobam uma variedade de preparações, incluindo desde extratos vegetais, ceras, óleos, polissacarídeos vegetais, até componentes isolados, os quais não são isentos de reações indesejáveis (ANTIGNAC et al., 2011; GAO et al., 2008). As reações mais comuns associadas ao uso de produtos cosméticos estão a irritação da pele, dermatite de contato, fotossensibilização, dentre outras (GAO et al., 2008; NOHYNEK et al., 2010). A interação entre os produtos cosméticos e os tecidos alvo desses é complexa e, sendo assim, estudos não-clínicos e clínicos para avaliação da segurança é um pré-requisito fundamental no desenvolvimento de novas matérias-primas (ANTIGNAC et al., 2011; BARRETO et al., 2017; GAO et al., 2008; NOHYNEK et al., 2010).
Na Europa, o uso de animais para experimentação foi proibido para avaliação de matérias-primas (2004) e produtos cosméticos (2009) tendo sido prorrogado até 2013 para testes mais complexos como carcinogenicidade, sensibilização da pele, toxicidade reprodutiva e toxicocinética (ALMEIDA; SARMENTO; RODRIGUES, 2017). Assim, através da Regulamentação 1223/2009, o Parlamento Europeu juntamente com o Conselho da
União Europeia definiu como marco legal para a proibição o ano de 2013 (EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL, 2009).
A análise da segurança de cada componente individual, é o fundamento da segurança de um produto cosmético (VINARDELL, 2015). Em consequência, o European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) propôs uma lista de métodos in vitro, fundamentados em estudos de culturas de células, para avaliação de ingredientes cosméticos (ALMEIDA; SARMENTO; RODRIGUES, 2017).
No Brasil, o aspecto regulatório acerca da experimentação animal na pesquisa científica ganhou maior destaque em 2008 com a Lei Nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, a Lei Arouca, que regulamenta o inciso VII do § 1o do art. 225 da Constituição Federal, estabelecendo procedimentos para o uso científico de animais (BRASIL, 2008) e com o Decreto nº 6.899, de 15 de julho de 2009, que dispõe sobre a composição do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal - CONCEA, estabelece as normas para o seu funcionamento e de sua Secretaria-Executiva, cria o Cadastro das Instituições de Uso Científico de Animais - CIUCA, mediante a regulamentação da Lei no 11.794, de 8 de outubro de 2008, destinado ao registro de instituições para criação ou utilização de animais com finalidade de pesquisa e ensino, além, dentro outros, do registro de protocolos experimentais e pedagógicos e dos pesquisadores (BRASIL, 2009).
Através deste marco, foi criado o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) com destaque na formulação de normas relativas para utilização humanitária de animais com finalidade de ensino e pesquisa, bem como na introdução de técnicas alternativas ao uso de animais para ensino e pesquisa (BRASIL, 2008). Por fim, foi regulamentado a constituição das Comissões de Ética no Uso de Animais (CEUAs), com finalidade de julgar e aprovar projetos de Instituições de pesquisa, de acordo com as diretrizes postuladas pelo CONCEA (BRASIL, 2008; BRASIL, 2009).
Em 2012, por meio da portaria MCTI n° 491/2012 foi instituída a Rede Nacional de Métodos Alternativos (RENAMA), com duração prevista de cinco anos (renovada por mais três anos por meio da Portaria SEPED/MCTIC N° 3586, de 30 de junho de 2017). A RENAMA é estruturada por duas categorias de laboratórios, os Laboratórios Centrais e os Laboratórios Associados, que, dentre outros têm por objetivos estimular a implantação de ensaios alternativos ao uso de animais, monitorar o desempenho dos laboratórios associados através de comparações interlaboratoriais e promover o desenvolvimento, a validação e a certificação de novos métodos alternativos ao uso de animais.
O processo de validação de novos métodos alternativos, ocorre no âmbito do Centro Brasileiro de Validação de Métodos Alternativos (BraCVAM), em observância ao
Guia 34 da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico – OECD e sob monitoramento e avaliação do CONCEA (BRASIL, 2012b).
Estimulados pela invasão do Instituto Royal e libertação de cães da raça beagle, por parte de ativistas, os Estados de São Paulo (Lei 15.316 de 23 de janeiro de 2014) e Paraná (Lei 18.668 de 22 de dezembro de 2015) proibiram o uso de animais no desenvolvimento de cosméticos, produtos de higiene e perfumes e seus componentes (PARANÁ, 2015; SÃO PAULO, 2014). Enquanto isso, na esfera Federal, ainda se discute a questão, através dos Projetos de Lei PLC 70/2014 (Câmara Federal) e PLS 438/2013 e PLS 45/2014 (Senado Federal). Destes, o PLS 438/2013 foi arquivado enquanto o PLC 70/2014 e PLS 45/2014 encontram-se com a relatoria da Comissão de Assuntos Econômicos e Comissão de Ciência, Tecnologia, Inovação, Comunicação e Informática, respectivamente.
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) publicou um Guia para Avaliação de Segurança de Produtos Cosméticos com finalidade de orientar pesquisadores e formuladores quanto aos estudos de segurança em produtos cosméticos (BRASIL, 2012a). A publicação referencia métodos alternativos, publicados em protocolos da Organization for Economic Cooperation and Development (OECD).
Estudos em culturas de células são mundialmente aceitos e realizados, sendo recomendado a realização de testes in vitro na etapa pré-clínica da avaliação da segurança (ALMEIDA; SARMENTO; RODRIGUES, 2017; BARRETO et al., 2017; FELIPPI et al., 2012). Dentre elas, a avaliação do potencial citotóxico (OECD/GD 129, 2010) e do potencial fototóxico (OECD TG-432, 2004) são metodologias utilizadas para avaliação da segurança, utilizando como parâmetro de resposta, a viabilidade celular após exposição a diferentes concentrações de agentes químicos e posterior exposição à radiação UV, respectivamente (BRASIL, 2012a).
Na avaliação do potencial citotóxico, são utilizadas substâncias capazes de se ligar a células vivas, como o corante vital Neutral Red. Trata-se de um corante catiônico que se difunde através da membrana plasmática e se acumula no lisossoma das células, através de ligações eletrostáticas com a matriz lisossomal, que é aniônica. Agentes tóxicos podem alterar a superfície celular ou a membrana lisossomal, acarretando danos irreversíveis que podem levar à morte celular ou inibição do crescimento celular. Dessa forma, uma vez que a concentração do corante é diretamente proporcional ao número de células vivas, a citotoxicidade é expressa como redução concentração-dependente da captação do corante vermelho neutro pelas células após a exposição ao agente em estudo (OECD/GD 129, 2010).
Ainda de acordo com o guia 129 da OECD, o estudo é realizado para determinar a concentração do agente teste que reduz em 50% a viabilidade celular em comparação ao controle, caracterizando o IC50. O valor de IC50 pode ser utilizado em equações de regressão linear para estimar a dose que provocaria morte em 50% dos animais testados (DL50), que é utilizada para determinar a dose de partida em estudos de toxicidade sistêmica aguda (OECD/GD 129, 2010).
Já para a avaliação do potencial fototóxico, há comparação da citotoxicidade de um produto químico quando testado na presença e na ausência de exposição a uma dose não citotóxica de luz solar simulada (OECD TG-432, 2004).
Além desses testes, outras metodologias já foram validadas e podem ser empregadas na etapa pré-clínica da avaliação da segurança, tais como irritação ocular (OECD 405, 2017) e cutânea (OECD 404, 2015), absorção cutânea (OECD 428, 2004) e corrosividade cutânea em epiderme reconstituída in vitro (OECD 431, 2016).
A partir da comprovação da segurança não clínica, os testes in vivo podem ser realizados, visando a confirmação da segurança do ingrediente, formulações e do consumidor (ANTIGNAC et al., 2011; BARRETO et al., 2017).
2.4 FORMA COSMÉTICA PROPOSTA: NÚCLEO SÓLIDO
Os comprimidos são formas unitárias, contendo o princípio ativo, que apresentam diversas vantagens como exatidão de dose e estabilidade química, física e biológica (DARJI et al., 2018). Os comprimidos orodispersíveis, apresentam-se similar aos comprimidos convencionais, desenvolvidos para serem colocados na boca e rapidamente liberar o princípio ativo mesmo em baixa quantidade de líquidos, formando uma suspensão ou solução do fármaco (AGGARWAL; ASTHANA; ASTHANA, 2013; BHARGAV et al., 2017; CILURZO et al., 2018). Dessa forma, devem apresentar rápida penetração de água através dos poros e capilares, levando à desintegração em 30s a 3 min (CILURZO et al., 2018).
Os excipientes desempenham importante papel no desenvolvimento de formas farmacêuticas e cosméticas. Dentre eles, as classes mais comumente empregadas em formas sólidas são os diluentes (celulose microcristalina, lactose, manitol, sorbitol); aglutinantes (polissacarídeos naturais, amido, gomas, polivinilpirrolidona); agentes desintegrantes e superdesintegrantes (amido glicolato de sódio, croscarmelose sódica, crospovidona) e agentes lubrificantes e deslizantes (estearato de magnésio, de cálcio e de zinco, talco, ácido esteárico) (DARJI et al., 2018).
A obtenção de comprimidos orodispersíveis pode ser realizada por meio de diferentes técnicas, como liofilização, moldagem ou compressão direta, cada uma,