Avaliação in vitro da atividade antioxidante da amostra purificada de Prosopis juliflora

A fração F2M (34ºC/3,5h - Fração maior que 3kDa) obtida da P. juliflora, foi avaliada quanto ao seu potencial antioxidante in vitro por diferentes metodologias com o objetivo de estudar os prováveis mecanismos de ação e em quais etapas do processo oxidativo essa matéria-prima pode atuar obtendo, dessa forma, um panorama mais completo da atividade antioxidante.

5.3.5.1 Capacidade Antioxidante Total

Os resultados apresentados para F2M em relação à CAT demonstraram que a fração de polissacarídeos maiores que 3kDa apresentou antioxidante total equivalente a 11,21mg/g de ácido ascórbico, na concentração de 5 mg/mL. É interessante observar que quando comparada ao CAT realizado com essa mesma amostra sem passar pelo processo de purificação por ultrafiltração, houve um aumento na capacidade antioxidante total, provavelmente, resultado do processo de purificação. Antes do processo de purificação, os extratos brutos apresentaram CAT na faixa de 0,04mg/g e 0,12mg/g. Considerando que em estudos envolvendo atividade biológica de polissacarídeos são necessárias etapas de purificação, por exemplo, de proteólise e que diversos compostos como proteínas, lipídeos, fibras, xilose e pentoses podem ser considerados impurezas e então, considerados contaminantes (VIEIRA et al., 2007), o aumento da atividade pode estar relacionado com a remoção dessas impurezas e, consequente, maior concentração de substâncias ativas.

Esta metodologia verifica a capacidade de os compostos antioxidantes doarem elétrons para o molibdato (VI) reduzindo-o a molibdato (V) e subsequente formação de um complexo verde de fosfato Mo (V) em um pH ácido. Assim, a presença de atividade antioxidante total indica que os constituintes F2M da P. juliflora interagem com os sistemas que enviam elétrons para minimizar o ataque de radicais (ZHANG; LIU; LIN, 2014).

Barreto e colaboradores (2017), utilizando fração enriquecida em polissacarídeos do resíduo industrial de Agave sisalana, cultivada na Caatinga Nordestina demonstrou a capacidade antioxidante total equivalente a 917,48mg/g de ácido ascórbico, demonstrando o potencial antioxidante de polissacarídeos e sua aplicabilidade em produtos cosméticos. Nesse contexto, um recente estudo realizou um delineamento experimental estatístico do tipo composto central com o objetivo, dentre outros, de otimizar as condições extrativas de polissacarídeos das folhas de Arthrocnemum indicum em função da capacidade antioxidante e atividade antiglicação (MZOUGHI et al., 2018). Dentre os resultados, os autores observaram que o extrato obtido nas melhores condições encontradas apresentou CAT de 35,81mg/g de ácido ascórbico e o consideraram como possível matéria-prima antioxidante. Resultado este bastante inferior ao observado por Barreto e colaboradores (2017), mas próximo aos nossos valores. Dessa forma, mesmo com um valor de CAT mais baixo, é necessário a avaliação dessa atividade por outros métodos para que se possa determinar potencial uso antioxidante em formulações cosméticas.

5.3.5.2 Poder redutor

Os resultados para o teste de poder redutor estão expostos na Tabela 15. O teste de poder redutor é importante indicador do potencial antioxidante de compostos, uma vez que essa atividade está relacionada a presença de compostos doadores de hidrogênio, que podem quebrar a cadeia de radicais livres, bem como reagir com precursores de peróxidos e prevenir sua formação (GORDON, 1990; ZHAO et al., 2017).

Tabela 15 – Atividade antioxidante de poder redutor pela amostra F2M de P. juliflora. Concentração (mg/mL) Atividade (%) 0,25 13,82 0,50 16,13 1,00 35,71 2,00 20,52

Fonte: Autoria própria

Wang e colaboradores (2017) obtiveram polissacarídeos extraídos das raízes de Periploca sepium e em seguida submeteram a processos de descoloração, retirada de proteínas e purificação por cromatografia de troca iônica e gel filtração em Sephadex G- 100. Os autores observaram que os polissacarídeos eram formados por unidades de ramnose, arabinose, manose, glicose e galactose, os quais apresentaram atividades antioxidante avaliadas por diferentes metodologias, dentre elas o sequestro do DPPH (10µg/mL a 50 µg/mL), avaliação da capacidade antioxidante total (100µg/mL a 500 µg/mL) e poder redutor (10µg/mL a 50 µg/mL), sendo considerado uma alternativa de origem natural ao uso na indústria cosmética, alimentos funcionais e farmacêutica (WANG et al., 2017).

Zhang, Liu e Lin (2014) observaram poder redutor de 37% para polissacarídeos obtidos de Agave sisalana na concentração de 4,0mg/mL, sendo considerado pelos autores como um poder redutor moderado. Valor semelhante foi observado para F2M na concentração de 1,0 mg/mL, demonstrando assim o potencial antioxidante mediado por esse mecanismo para nossa amostra. Ainda de acordo com os autores, o poder redutor pode estar associado à ação antioxidante frente a radicais hidroxilas (ZHANG; LIU; LIN, 2014), sendo os grupamentos hidroxilas dos polissacarídeos, responsáveis pela doação de elétrons aos radicais livres, estabilizando-os e interrompendo a cadeia oxidativa (CHEN et al., 2012; ZHA et al., 2009; ZHANG; LIU; LIN, 2014)

5.3.5.3 Sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH).

Os resultados para avaliação do sequestro do radical DPPH estão expressos na Tabela 16. É possível observar que a fração avaliada foi capaz de sequestrar o radical DPPH de forma concentração dependente em todo o intervalo de concentrações testado. O ensaio do sequestro de radicais DPPH é um método amplamente utilizado, de simples execução e baixo custo, onde a atividade antioxidante é avaliada por meio do fornecimento de radicais livres (2,2-difenil-1-picrilhidrazila) em uma solução contendo compostos antioxidantes capazes de promover a redução (CARMONA-JIMÉNEZ et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2016).

Souza e Correia (2013) realizaram um estudo físico-químico e da atividade antioxidante da farinha da algaroba. A farinha foi obtida a partir das vagens da espécie, utilizando um moinho de facas após a secagem em estufa de ar circulante. Os resultados da atividade antioxidante pelo método do DPPH mostraram valores de 80,52µmol equivalente de Trolox/g de amostra que, segundo os autores confirmava a atividade antioxidante das amostras. Embora o método de extração e a metodologia de análise sejam diferentes dos empregados no presente trabalho, os resultados encontrados pelos autores corroboram para a atividade antioxidante das vagens, mesma parte da planta utilizada no presente estudo.

Tabela 16 – Atividade de sequestro do radical DPPH pela amostra F2M de Prosopis juliflora. Concentração (mg/mL) Atividade (%) 0,00 0,0 0,10 1,8 0,15 20,8 0,25 58,5 0,50 59,0 1,00 63,2 2,00 65,6

Fonte: Autoria própria

Adicionalmente, García-Andrade e colaboradores (2013) avaliaram a atividade antioxidante de extratos de folhas de Prosopis laevigata em acetona e frações purificadas através do método de sequestro do DPPH. Os autores calcularam uma IC50 de 3000ppm ou 3mg/mL para os extratos brutos e 0,312mg/mL e 0,093 mg/mL para as frações purificadas. Dessa forma, mesmo sendo espécies e metodologias extrativas diferentes, é

possível estabelecer uma correlação entre os estudos apresentados e a atividade antioxidante da nossa espécie, a qual com concentrações mais baixas exerce a mesma atividade de sequestro de DPPH.

Os resultados apresentados pelos experimentos CAT, poder redutor e sequestro de radicais DPPH, demonstraram a capacidade da amostra (F2M) de inibir os radicais livres e dessa forma atuar no estágio de iniciação de oxidação de compostos celulares (MELO- SILVEIRA et al., 2014). Analisando em conjunto os testes de poder redutor e sequestro do radical DPPH, pode-se verificar que a fração tem potencial uso em produtos voltados à prevenção dos sinais do envelhecimento, evitando a propagação da cascata oxidativa.

Palanisamy e colaboradores (2017) utilizaram estes três métodos para a avaliação da atividade antioxidante de uma fucana obtida da alga marrom Sargassum polycystum. Na concentração de 1,0mg/mL, o composto apresentou 65,3% de atividade antioxidante total, 67,56% para o teste de poder redutor e 61,2% de atividade de sequestro de DPPH, sendo considerado como um potente agente antioxidante (PALANISAMY et al., 2017). Considerando o resultado do teste de sequestro de DPPH, a proximidade entre os valores obtidos pelos autores e a atividade da fração de polissacarídeos de P. julifora na mesma concentração, podemos demonstrar o potencial antioxidante de nossa amostra e a importância da utilização de testes complementares na investigação.

5.3.5.4 Quelação dos íons de Cobre (Cu2+) e Ferro (Fe2+)

Os resultados para os testes de quelação de íons metálicos demonstroram que F2M tem maior atividade via quelação de cobre (Tabela 17). Os agentes quelantes tem ação importante na cascata antioxidante uma vez que eles removem íons metálicos que poderiam participar na produção de radicais hidroxilas, minimizando assim a produção de espécies reativas de oxigênio e a peroxidação lipídica (ZHANG et al., 2012).

Tabela 17 – Atividade antioxidante de quelação de ferro e cobre pela amostra F2M de P. juliflora. Concentração (mg/mL) Quelação Cu 2+_{(%) Quelação Fe}2+_(%) 0,25 40,61 13,28 0,50 53,73 18,55 1,00 62,64 29,29 2,00 59,71 42,62

Zhang e colaboradores (2017), avaliaram o potencial antioxidante de polissacarídeos de Grifola frondosa objetivando a obtenção de um produto natural com efetiva atividade antioxidante. Através do teste de quelação de íons metálicos, os autores observaram uma ação de 27,09% para a quelação do ferro na concentração de 1mg/mL, resultados bastante semelhantes ao observado pela F2M de P. juliflora.

Dessa forma, a fração F2M apresenta potencial de ação antioxidante preventiva na fase de propagação, impedindo a formação de radicais livres (MELO-SILVEIRA et al., 2014).

5.3.5.5 Sequestro de Radicais Hidroxila (OH-_{) e Superóxidos (O} 2-)

Os resultados para os testes de sequestro de radicais hidroxila e superóxido estão apresentados na Tabela 18. É possível observar que F2M apresentou uma elevada ação de sequestro de radicais hidroxilas, enquanto que apenas na mais alta concentração testada houve atividade contra radicais superóxido.

Tabela 18 – Atividade antioxidante de sequestro de radicais hidroxila (OH-_{) e superóxidos}

(O2-) pela amostra F2M de Prosopis julifora. Concentração (mg/mL) Sequestro OH - _{(%) Sequestro O2}- _(%) 0,25 54,01 --- 0,50 100,93 --- 1,00 113,15 --- 2,00 113,43 _26,47

Fonte: Autoria própria

Os radicais superóxido são produzidos por sistemas enzimáticos em reação de auto oxidação bem como por sistemas não enzimáticos, por meio da transferência de elétrons, reduzindo o oxigênio molecular, podendo oxidar compostos como o ácido ascórbico e reduzir complexos férricos como o citocromo C e ácido férrico-etilenodiaminotetracético (Fe3+-EDTA) (ARUOMA, 1998).

Já o radical hidroxila é considerado o mais reativo em comparação aos demais radicais de oxigênio, sendo capaz de interagir com praticamente qualquer molécula biológica tais como proteínas e DNA, causado a formação de compostos tóxicos e levando ao dano celular (ARUOMA, 1998; ZHANG et al., 2012; ZHAO et al., 2017).

A formação de radicais hidroxila está relacionado à metais de transição, especialmente cobre e ferro. Na ausência desses íons o peróxido de hidrogênio está

razoavelmente estável. A formação do radical hidroxila se dá quando há uma perturbação na homeostasia desses metais, por meio de uma reação de Fenton (ARUOMA, 1998; ZHANG et al., 2012).

No entanto, várias biomoléculas de origem vegetal já foram estudadas e a ação contra os radicais hidroxila não advém de ação direta desses compostos e sim, da atividade quelante de íons férricos e cúpricos, inativando a reação de Fenton, assim podem ter papel importante na proteção contra radicais hidroxila (ARUOMA, 1998; MACDONALD; GALLEY; WEBSTER, 2003; ZHANG; LIU; LIN, 2014; ZHANG et al., 2012).

Nesse contexto, é possível observar uma correlação entre a atividade de quelação de metais, especialmente o cobre, e a atividade de sequestro de hidroxilas de F2M nas mesmas concentrações. Uma vez que a atividade de sequestro de radicais hidroxila foi bem maior numericamente que a atividade de quelação de metais, podemos sugerir que a F2M estaria atuando tanto pela remoção de íons Cu2+ e Fe2+ bem como por outros mecanismos.

Em estudo realizado com polissacarídeos de Enteromorpha prolifera os autores obtiveram formas quimicamente substituídas desses polissacarídeos e avaliaram a atividade contra radicais hidroxila e superóxido. Observaram valores de sequestro do radical hidroxila entre 84,6% e 89,4% e, 62,9% a 65,4% em relação ao radical superóxido, indicando uma potencial matéria-prima antioxidante para uso industrial (SHAO et al., 2017). Já Zhang e colaboradores (2017) utilizando os polissacarídeos de Grifola frondosa observaram atividade sequestrante do radical peróxido (39,21%) e hidroxila (87,9%).

Por fim, Zhang, Liu e Lin (2014) avaliaram o potencial de polissacarídeos obtidos do resíduo de Agave sisalana em combater radicais hidroxila, obtendo valor de 37% de atividade e considerando esses polissacarídeos detentores de moderada ação antioxidante enquanto que F2M apresentou valores bem superiores aos observados pelos autores. Segundo Zhang e colaboradores (2012), remover os radicais hidroxila é aspecto importante para a defesa antioxidante do organismo, sendo os ativos que atuam por esse mecanismo extremamente importante nesse aspecto, dessa forma, corroborando o elevado poder antioxidante de nossa amostra.

Diante do exposto, a fração de polissacarídeos de P. juliflora atuou em todas as etapas da cascata oxidativa: na fase da iniciação , conforme demonstrado pelos testes de CAT, poder redutor e sequestro do DPPH; na fase de propagação, impedindo a formação de radicais livres, conforme os testes de quelação de metais de transição e, por fim na fase de terminação, no sequestros dos radicais superóxido e hidroxila, evidenciando o potencial multitargeting deste nova matéria-prima vegetal.

5.4 ANÁLISE QUALITATIVA DOS COMPOSTOS SECUNDÁRIOS DE Prosopis juliflora 5.4.1 Análise qualitativa dos metabólitos secundários de Prosopis juliflora por espectrometria de massas

Os resultados do molecular networking para a fração de metabólitos inferior a 3kDa de PJ2 estão apresentados na Tabela 19 e Figuras 12 e 13. Foram identificadas 22 moléculas, dentre elas, 3 foram anotadas pelo Global Natural Product Social Molecular Networking (GNPS), 2 através de banco de dados in house e 17 utilizando banco de dados externos: MassBank e Dictionary of Natural Products (Apêndice D).

Tabela 19 - Metabólitos identificados na fração menor que 3 kDa de PJ2.

(Continua) Molécula Cluster Tempo de Retenção (min) Fragmento Principal (m/z) Modo Daidzina NM5 2,5 415,39 Negativo Trealose NM3 2,6 341,45 Negativo 295-O-hexosideo NM5 4,1 457,44 Negativo Triptofano [M+H]- _{7,4 203,01 Negativo} Canferol-3-O-alfa-L-arabinosídeo NM9 8,4 417,41 Negativo Juliprosina [M+Cl]- _{8,7 661,32 Negativo} Isojuliprosina [M+Cl]- _{8,7 661,32 Negativo} Prosoflorina [M+Cl]- _{8,7 661,32 Negativo} Apigenina-6-C-glucosídeo-8-C- arabinosídeo NM6 9,6 563,5 Negativo

Genisteína 8-C-glucosídeo NM7 10,6 431,33 Negativo

Isoharmentina 3-O-rutinosídeo NM8 11,1 623,57 Negativo

Homoorietina NM1 21,4 444,39 Negativo

Orietina NM1 21,4 447,39 Negativo

Miricetina NM1 21,6 317,08 Negativo

Escaposina NM4 21,8 321,52 Negativo

Peracetato de luteolina NM1 22,3 453,17 Negativo

Tabela 19 - Metabólitos identificados na fração menor que 3 kDa de PJ2.

(Conclusão)

Galato de catequina NM1 28,4 441,37 Negativo

Epigalocatequina NM2 28,6 302,42 Negativo 3',6-Dimetilflavona PM1 2,0 251,01 Positivo Daidzina PM1 2,5 417,07 Positivo Acetato de 5- (6-acetiloxi-3,5,7- trimetoxi-4-oxocromen-2-il) -2- metoxifenilo PM1 3,2 459,05 Positivo Saponarina PM1 8,6 595,14 Positivo Isômero de Apigenina-6-C- glucosídeo-8-C-arabinosídeo PM1 9,3 565,14 Positivo Patulitrina PM3 11,2 495,14 Positivo Julifloridina [M+H]+ _{29,1 301,07 Positivo} 3-oxo-juliprosopina PM2 29,6 644,5 Positivo

Secojuliprosopinal [M+Na]+ _{29,9 600,49 Positivo}

Fonte: Autoria própria

Dentre as moléculas anotadas algumas merecem destaque em função de seu potencial uso cosmético. Nesse contexto, a trealose, presente no cluster NM3, é um dissacarídeo não-redutor presente em bactérias, fungos, plantas e alguns invertebrados, formado por duas unidades D-glicopiranose unidas por uma ligação α-glicosídica nos carbonos 1 e 1’, especificamente descrita como O-α-D-glicopiranosil-(1→1)-α-D- glicopiranosil, além de apresentar os isômeros αβ e ββ (CAI et al., 2018; HUDSON, 1916; TAGA; SENMA; OSAKI, 1972; TERAMOTO; SACHINVALA; SHIBATA, 2008).

Esta molécula exerce um efeito de proteção contra estresses de seca, congelamento e pressão osmóticos, estabilizando membranas e outras macromoléculas conferindo viabilidade celular a espécies vegetais e animais expostos a ambientes extremos de total ausência de água (HIGASHIYAMA, 2002; ROSER, 1991).

A trealose é utilizada como ativo em produtos comerciais inclusive com ação hidratante e em composições de formulações anti-sinais (OHTAKE; WANG, 2011). Nesse contexto, YANG et al. (2010) avaliaram a capacidade de absorção e retenção de água de amostras de α-α-trealose e derivados carboximetil e quarternário de amônia e obtiveram resultados superiores ao do ácido hialurônico, demonstrando que a presença desse composto em nosso extrato de trabalho evidencia o potencial uso cosmético.

Figura 12 - Clusters das moléculas observados no modo negativo do Molecular Networking de interesse cosmético.

Onde: (1) = Peracetato de luteolina; (2) = Miricetina; (3) = Homoorietina; (4) = Orietina; (5) = Galato de catequina; (6) = Iridina; (7) = Epigalocatequina; (8) = Trealose; (9) = Genisteína 8-C-glucosídeo; (10) = Isoharmentina 3-O-rutinosídeo e (11) = Canferol-3-O-alfa-L-arabinosídeo. Fonte: Autoria própria.

Figura 13 - Clusters das moléculas observados no modo positivo do Molecular Networking de interesse cosmético.

Onde: (1) = Daidzina; (2) = Acetato de 5- (6-acetiloxi-3,5,7-trimetoxi-4-oxocromen-2-il) -2- metoxifenilo; (3) = 3',6-Dimetilflavona; (4) = Saponarina; (5) = Apigenina-6-C-glucosídeo-8-C-arabinosídeo. Fonte: Autoria própria.

Os compostos fenólicos são classificados em diversas categorias e apresentam várias atividades de interesse da cosmetologia, dentre elas anti-envelhecimento, hidratante e antioxidante (DE OLIVEIRA; DARIO, 2019). Além disso, uma vez que o consumidor prefere compostos de origem natural, os compostos fenólicos são um alvo importante para o desenvolvimento de novas matérias-primas cosméticas (DZIAŁO et al., 2016). No entanto, informações sobre a identificação e quantificação desses compostos não são comuns nas matérias-primas cosméticas uma vez que os fabricantes preferem caracterizar o conteúdo total de compostos fenólicos. Por outro lado, há um interesse emergente em uma maior caracterização das matérias-primas, especialmente aquelas de maior valor agregado ao consumidor, corroborando com a proposta do nosso estudo (SKOREK et al., 2016).

Assim, compostos fenólicos podem atuar como agente anti-envelhecimento por meio de diversos mecanismos, dentre eles, como compostos antioxidantes discutidos no item 5.3.5, estimuladores do processo de renovação celular da pele e da síntese de colágeno e elastina e como inibidores da síntese de melanina (DZIAŁO et al., 2016).

Os polifenóis compõem um dos maiores grupos de metabólitos especializados com potencial atividade inibitória da tirosinase (CHANG, 2009). Nesse contexto, derivados de compostos identificados para a P. juliflora apresentam esta atividade já relatada na literatura. Derivados da luteolina, identificada no cluster NM1, foram avaliados em culturas de melanomas (murine melanoma B16F10) estimuladas pelo hormônio estimulador de α-melanócito, tendo os autores observado que os compostos estudados inibiram a melanogênese celular de forma comparável à arbutina, um dos compostos despigmentantes mais utilizados em cosméticos, por meio de efeito inibitório na atividade enzimática da tirosinase (AN et al., 2008). Resultado semelhante foi observado por Kim e colaboradores (2004) e No e colaboradores (1999), onde a derivados de epigalocatequina (cluster NM2) e catequina (cluster NM1) apresentaram atividade inibitória da tirosinase. Já Burger e colaboradores (2017) avaliaram derivados de luteolina e apigenina (Cluster PM1) de Reseda luteola L. e observaram esta mesma ação. Derivados de quercetina, miricetina e canferol também apresentam relatos de atividade inibitória da tirosinase (CHANG, 2009; MATSUDA et al., 1995; XIE et al., 2003) bem como o extrato de Pueraria thunbergiana o qual apresentava as isoflavonas daidzina, gliciteina e genistina em sua composição, reduziu a pigmentação induzida pela radiação UVB e ambos se mostraram como potenciais ativos despigmentantes (HAN et al., 2015).

Além disso, Barroso e colaboradores (2014) obtiveram e caracterizaram extratos de Helichrysum stoechas (L.) Moench, observando uma composição formada por 18 compostos fenólicos, dentre os quais derivados de miricetina, quercetina, isorhamnetina e canferol e atividade antioxidante confirmada pelos métodos do sequestro do radical DPPH, inibição do branqueamento de β-caroteno e inibição da peroxidação lipídica, os quais foram veiculados em microesferas visando a utilização em formulação cosméticas. Por fim, recentemente Zuo e colaboradores (2019) realizaram o isolamento direcionado de moléculas de Otholobium pubescens por meio da avaliação da inibição da tirosinase in vitro que diversos compostos fenólicos, dentre eles a daidzina, mesma molécula anotada em nossos clusters NM5 e PM1, apresentou 24,20% de inibição da tirosinase, contra 77,94% do β-arbutin utilizado como controle positivo, ambos na concentração de 1mg/mL.

Além disso, até o presente momento, os metabólitos daidzina, trealose, 295-o- hexosideo, homoorietina, orietina, miricetina, escaposina, iridina, galato de catequina, epigalocatequina, ácido glucurônico, xantofilia e genisteina foram observadas pela primeira vez para a espécie.

Vale destacar ainda a presença dos alcaloides 3-oxo-juliprosopina, Julifloridina, Secojuliprosopinal, Juliprosina, Isojuliprosina e Prosoflorina já relatados na literatura para a espécie (AHMAD; SULTANA; QAZI, 1989; NAKANO et al., 2004), os quais, a princípio não apresentam aplicações como ativos cosméticos e não inviabilizaram a segurança do extrato utilizado neste trabalho.

Dessa forma, embora o desenvolvimento de formulações despigmentantes não seja objetivo do nosso estudo, a presença desses compostos com potencial atividade antioxidante, hidratante e inibitória da tirosinase nos extratos de P. juliflora demonstram o potencial de uso da P. juliflora em formulações cosméticas de diferentes áreas dos cuidados com a pele.

5.4.2 Análise qualitativa da composição química do extrato PJ2 de Prosopis juliflora