MATHEUS HENRIQUE GOUVEIA GOMES
AVALIAÇÃO DO USO DE HIDROLISADOS PROTEICOS
DE ARROZ COMO MATERIAL DE PAREDE NA
MICROENCAPSULAÇÃO DE ÓLEO POR SPRAY DRYER
EVALUATION OF THE USE OF RICE PROTEIN
HYDROLYSATES AS WALL MATERIAL IN THE
MICROENCAPSULATION OF OIL BY SPRAY DRYER
CAMPINAS 2019
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
MATHEUS HENRIQUE GOUVEIA GOMES
AVALIAÇÃO DO USO DE HIDROLISADOS PROTEICOS
DE ARROZ COMO MATERIAL DE PAREDE NA
MICROENCAPSULAÇÃO DE ÓLEO POR SPRAY DRYER
EVALUATION OF THE USE OF RICE PROTEIN
HYDROLYSATES AS WALL MATERIAL IN THE
MICROENCAPSULATION OF OIL BY SPRAY DRYER
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Engenharia de Alimentos.
Dissertation presented to the Faculty of Food Engineering of the University of Campinas in partial fulfilment of the requirements for the degree of Master in Food Engineering
Orientador: Profª. Drª. Louise Emy Kurozawa
CAMPINAS 2019 Este trabalho corresponde à versão
final da dissertação defendida pelo aluno Matheus Henrique Gouveia Gomes, e orientado pela Profa. Dra. Louise Emy Kurozawa
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Gomes, Matheus Henrique Gouveia, 1991-
G585a GomAvaliação do uso de hidrolisados proteicos de arroz como material de parede na microencapsulação de óleo por spray dryer / Matheus Henrique Gouveia Gomes. – Campinas, SP: [s.n.], 2019.
GomOrientador: Louise Emy Kurozawa.
GomDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Gom1. Microencapsulação. 2. Spray drying. 3. Emulsões. 4. Hidrólise enzimática. 5. Proteína de arroz. I. Kurozawa, Louise Emy. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Evaluation of the use of rice protein hydrolysates as wall material
in the microencapsulation of oil by spray dryer
Palavras-chave em inglês: Microencapsulation Spray drying Emulsions Enzymatic hydrolysis Rice protein
Área de concentração: Engenharia de Alimentos Titulação: Mestre em Engenharia de Alimentos Banca examinadora:
Louise Emy Kurozawa [Orientador] Miriam Dupas Hubinger
Carmen Sílvia Fávaro Trindade
Data de defesa: 01-04-2019
Programa de Pós-Graduação: Engenharia de Alimentos
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0003-1762-0866
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Louise Emy Kurozawa ORIENTADOR – FEA/UNICAMP
Profa. Dra. Miriam Dupas Hubinger MEMBRO TITULAR – FEA/UNICAMP
Profa. Dra. Carmen Sílvia Fávaro Trindade MEMBRO TITULAR – FZEA/USP
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Não fui eu que lhe ordenei? Seja forte e
corajoso! Não se apavore, nem se desanime,
pois o Senhor, o seu Deus, estará com você por
onde você andar.
Josué 1:9AGRADECIMENTOS
À Deus toda honra, toda glória, todo louvor, toda gratidão e toda adoração. Seja grato em qualquer circunstância.
Dedico a vocês, meus pais, Izaias Gouveia e Cida Gouveia, essa dissertação e o título de mestre conquistado. Sem vocês nada disso seria possível, minha eterna gratidão e amor por vocês. Obrigado por tudo!
À minha maravilhosa noiva, Déborah Tenório, por sempre acreditar em mim, por ser minha melhor psicóloga, por sempre estar ao meu lado mesmo estando longe fisicamente, pelos incentivos e conselhos durante essa minha jornada, por ser minha fã número 1... Poderia preencher esse espaço de agradecimento só pra você, pois sei o quanto você contribuiu para essa conquista. Você é a melhor, te amo!
À minha querida orientadora, Profa. Dra. Louise Emy Kurozawa, por toda orientação conduzida, competência, todo apoio e confiança depositada.
Aos meus irmãos, Davi e Izaias Júnior, por todo apoio e incentivo durante essa longa jornada acadêmica. Não poderia deixar de agradecer à minha querida cunhada, Amanda Kawano, por sempre me ajudar e se preocupar comigo. Pessoas como você são raras.
Aos meus companheiros de laboratório e grupo de pesquisa (LINA), Camila, Diana, Fernanda, Juliana, Bianca, Amanda, e em especial a Bruna por me “socorrer” nas horas que mais precisava, jamais vou esquecer. Deixo aqui um agradecimento em especial para a querida Patrícia Cardoso, obrigado por sempre ser solícita comigo.
Ao meu nobre amigo de longas datas, Allan, um obrigado de coração por sempre estar ao meu lado me ajudando e dando forças durante todas essas conquistas desde a graduação. Você merece o melhor sempre, você é o cara!
Aos meus amigos que fiz nessa árdua jornada, Jéssika, Marciano e Fleury. Obrigado pelo companheirismo e apoio mútuo. Acreditem, aprendi muito com vocês!
Agradeço aos membros da banca examinadora pelas contribuições para melhoria do meu trabalho, por meio de sugestões, correções e por aceitarem participar da minha banca.
À Unicamp e ao Departamento de Engenharia de Alimentos por possibilitar a complementação da minha formação acadêmica.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro que possibilitou a realização deste trabalho.
Enfim, agradeço a todos que contribuíram de forma direta ou indireta para a realização desse trabalho.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
RESUMO
Nos últimos anos, o uso de proteínas vegetais em várias aplicações alimentares é uma tendência crescente na indústria de alimentos. Na microencapsulação por spray-drying, esses biopolímeros têm sido usados como um material de parede para uma variedade de compostos ativos. No entanto, devido à estrutura molecular complexa, as propriedades emulsificantes das proteínas não são totalmente exploradas. Sendo assim, a hidrólise enzimática é uma técnica adequada para melhorar as propriedades funcionais das proteínas, incluindo capacidade emulsificante e solubilidade, além de aumentar a capacidade antioxidante ao expor aminoácidos antioxidantes presentes na cadeia proteica. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar hidrolisados proteicos de proteínas de arroz como material de parede junto com a maltodextrina e avaliar o potencial antioxidante desses hidrolisados em micropartículas de óleo de linhaça secas por spray-drying. Foram utilizadas duas enzimas com ação catalíticas distintas, Alcalase e Flavourzyme, na hidrólise limitada (grau de hidrólise (GH) 1, 2, 4, 8 e 10%) de proteínas isoladas de arroz. A enzima Alcalase produziu peptídeos menores e com maior capacidade antioxidante, consequentemente apresentaram emulsões mais instáveis no maior grau de hidrólise, isso devido à forte tendência a agregação entre os peptídeos gerados e baixa capacidade emulsificante. Em contraste, as emulsões estabilizadas com hidrolisados da Flavourzyme exibiram gotículas de óleo menores e maior estabilidade durante a secagem (GH 10%) comparadas com a proteína intacta e os hidrolisados da Alcalase. Refletindo a forte tendência antioxidante observadas nos testes de DPPH e FRAP, os hidrolisados da Alcalase exibiram um potencial maior do que o a proteína isolada e hidrolisados da Flavourzyme para reduzir a oxidação lipídica das micropartículas de óleo de linhaça durante o armazenamento, como demonstrado pelo teste Rancimat e índice de peróxido. Além disso, a análise de DSC mostrou que as micropartículas obtidas com hidrolisados proteicos apresentaram valores de Tg menores que aqueles contendo proteínas não hidrolisadas. A utilização de enzimas com atividade em sítios ativos distintos resulta em peptídeos com tamanhos, funcionalidade e capacidade antioxidante diferentes que influenciam diretamente na etapa de emulsificação e na estabilidade das micropartículas.
PALAVRAS CHAVES: microencapsulação, spray drying, emulsão, hidrólise enzimática, proteína de arroz, peptídeos, estabilidade, oxidação lipídica.
ABSTRACT
In recent years, the use of plant protein in various food applications is an increasing trend in the food industry. In the process of microencapsulation by spray-drying these biopolymers have been used as a wall forming material for a variety of active compounds. However, due to the complex molecular structure, the emulsifying properties of the proteins are not fully exploited. Thus, enzymatic hydrolysis is a suitable technique for improving the functional properties of proteins, including emulsifying ability and solubility, and increasing the antioxidant capacity by exposing antioxidant peptides present in the protein chain. Therefore, the present work aimed to evaluate the protein hydrolysates of rice proteins as wall material of dried linseed oil microcapsules by spray-drying. The use of two distinct catalytic enzymes, Alcalase and Flavourzyme, in the limited hydrolysis (degree of hydrolysis (GH) 1, 2, 4, 8 and 10%) of proteins isolated from rice, proved that the different peptides obtained influenced the of stable emulsions, in protecting the microcapsules against oxidation and structure. The enzyme Alcalase produced smaller peptides with higher antioxidant capacity, consequently they presented more unstable emulsions with the increase of the degree of hydrolysis, due to the strong tendency of aggregation between the peptides generated. In contrast, emulsions stabilized with Flavourzyme hydrolysates exhibited lower oil droplets and greater stability during drying (10% GH) compared to intact protein and Alcalase hydrolysates. Reflecting the strong antioxidant tendency observed in the DPPH and FRAP tests, Alcalase hydrolysates exhibited a greater potential than the isolated protein and Flavourzyme hydrolysate to reduce lipid oxidation of linseed oil microcapsules during storage as demonstrated by the test Rancimat and peroxide index. In addition, DSC analysis showed that microparticles encapsulated by protein hydrolysates had lower Tg values than those containing non-hydrolyzed proteins. The use of enzymes with activity at distinct active sites results in peptides with different sizes, functionality and antioxidant capacity that will directly influence in the emulsification and stability of the microcapsules.
Keywords: microencapsulation, spray-drying, emulsion, enzymatic hydrolysis, rice protein, peptides, stability, lipid oxidation.
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica
Figura 1. Esquema geral do mecanismo da oxidação lipídica. ... 24 Figura 2. Diferentes tipos de micropartículas... 27 Figura 3. Corte longitudinal de um grão de arroz. ... 31 Figura 4. Diagrama dos possíveis mecanismos de instabilidade em emulsões em alimentos. ... 34 Figura 5. Classificação das proteases de acordo com o mecanismo de ação. ... 36 Figura 6. Ilustração da estabilização da emulsão O/A através de produtos da hidrólise de proteína. ... 38 Figura 7. Esquema do processo de secagem por spray drying. ... 43
Capítulo 4 - Improvement of the functional and antioxidant properties of rice protein by enzymatic modification for the microencapsulation of linseed oil
Figure 1. Enzymatic hydrolysis of RPI using Alcalase and Flavourzyme proteases. ... 61 Figure 2. Tris-tricine SDS-PAGE of rice protein isolate (RPI) and protein hydrolysates produced using Alcalase (PHA) or Flavourzyme (PHF). ... 61 Figure 3. Oil droplet size distribution in the emulsions stabilized by protein hydrolysates obtained using Alcalase (PHA) or Flavourzyme (PHF) with different degrees of hydrolysis. RPI is rice protein isolate. ... 68 Figure 4. Effect of the enzymatic hydrolysis of rice protein isolate (RPI) using the proteases: A) Alcalase; and B) Flavourzyme, on the creaming index (%) of the emulsions. ... 70 Figure 5. Backscattering profiles of emulsions stabilized by protein hydrolysates obtained using Alcalase (PHA) and Flavourzyme (PHF): (A) PHA-1; (B) PHA-10; (C) PHF-1; (D) PHF-8; (E) PHF-10; and (F) RPI. The number after PHA and PHF refers to the DH of the protein hydrolysates. ... 73 Figure 6. Particle size distribution of spray dried powders containing rice protein isolate (RPI) or protein hydrolysates obtained using A) Alcalase (PHA) and B) Flavourzyme (PHF). ... 78
Capítulo 5 - Influence of rice protein hydrolysate on physico-chemical properties and lipid oxidation stability on the microparticle of linseed oil obtained by spray-drying
Figure 1. Microphotograph of particles using as wall material maltodextrin combined with: A) PHA, B) PHF, and C) RPI. Upper and bottom images correspond to a magnification of 250 and 5,000, respectively ... 94 Figure 2. Sorption isotherms of spray-dried microcapsules of linseed oil and the fitted GAB model at the a) RPI; b) PHF and c) PHA. Each data point is the average of the three experimental replicates. ... 97 Figure 3.Thermogram of linseed oil encapsulated with PHA. ... 98 Figure 4. Lipid oxidation by peroxide value of free and encapsulated linseed oil stored at 45 °C: (a) during 55 days; (b) first- and second-week of storage. ... 101
LISTA DE TABELAS
Capítulo 3 – Revisão bibliográfica
Tabela 1. Estudos de capacidade antioxidante de peptídeos de diferentes fontes proteicas. ... 40 Capítulo 4 - Improvement of the functional and antioxidant properties of rice protein by enzymatic modification for the microencapsulation of linseed oil
Table 1. Antioxidant capacity (DPPH and FRAP assays) of the rice protein isolate (RPI) and protein hydrolysates obtained using Alcalase (PHA) or Flavourzyme (PHF) with different degrees of hydrolysis (DH) ... 62 Table 2. Oil droplet size D32, polydispersity index (PDI), emulsifying capacity (EC) and
apparent viscosity at shear rate of 30 s-1 (µap30) of linseed oil-in-water emulsions
stabilized by rice protein isolate (RPI) and protein hydrolysates obtained by Flavourzyme (PHF) or Alcalase (PHA) action... 65 Table 3. Encapsulation efficiency (EE), volume mean diameter D4,3 and induction
period (IP) of spray dried powders prepared with rice protein isolate (RPI) or protein hydrolysates obtained with different degrees of hydrolysis using Alcalase (PHA) and Flavourzyme (PHF). ... 76
Capítulo 5 - Influence of rice protein hydrolysate on physico-chemical properties and lipid oxidation stability on the microparticle of linseed oil obtained by spray-drying
Table 1. Estimated values of the GAB model coefficients and the statistical parameters used to evaluate the adequacy of the model for the linseed oil microencapsulated by PHA, PHF, and RPI. ... 96 Table 2. Moisture content, water activity (aw), and glass transition temperature (Tg) of
linseed oil microencapsulated with protein hydrolysates obtained by Alcalase (PHA) and Flavourzyme (PHF) and rice protein isolate (RPI). ... 99
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO GERAL ... 16
1.1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ... 17
CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS ... 20
2.1. OBJETIVO GERAL ... 21
2.1.1. Objetivos específicos ... 21
CAPÍTULO 3 – REVISÃO BIBILIOGRÁFICA ... 22
3.1. PRINCÍPIO ATIVO: ÓLEO DE LINHAÇA ... 23
3.2. OXIDAÇÃO LIPÍDICA EM ALIMENTOS ... 24
3.3. MICROENCAPSULAÇÃO ... 26
3.4. MATERIAIS DE PAREDE ... 28
3.4.1. Maltodextrina ... 29
3.4.2. Proteína de Arroz ... 30
3.5. EMULSÃO ... 32
3.6. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA PROTEÍNA DE ARROZ ... 35
3.6.1. Capacidade antioxidante ... 38
3.7. SECAGEM POR ATOMIZAÇÃO ... 42
REFERÊNCIAS ... 45
CAPÍTULO 4 – IMPROVEMENT OF THE FUNCTIONAL AND ANTIOXIDANT PROPERTIES OF RICE PROTEIN BY ENZYMATIC MODIFICATION FOR THE MICROENCAPSULATION OF LINSEED OIL ... 52
4.1. INTRODUCTION ... 54
4.2. MATERIAL AND METHODS ... 55
4.2.1. Material ... 55
4.2.2. Enzymatic hydrolysis of rice protein ... 56
4.2.2.1. Molecular weight distribution ... 56
4.2.2.2. Antioxidant capacity ... 57
4.2.3. Preparation of RPI– and PH–stabilized emulsions ... 57
4.2.3.1. Emulsion stability ... 57
4.2.3.2. Droplet size distribution and mean droplet size ... 58
4.2.3.3. Rheological behavior ... 58
4.2.3.4. ζ-potential ... 58
4.2.4. Microencapsulation of the linseed oil by spray drying... 59
4.2.4.1. Encapsulation efficiency ... 59
4.2.4.2. Particle size distribution ... 59
4.2.4.3. Oxidative stability measured by the Rancimat method ... 60
4.2.5. Statistical analysis ... 60
4.3. RESULTS AND DISCUSSION ... 60
4.3.1. Enzymatic hydrolysis of rice protein and molecular weight distribution . 60 4.3.2. The impact of the enzymatic hydrolysis of RPI on its antioxidant capacity 62 4.3.3. Influence of rice protein modification on the emulsion properties ... 63
4.3.3.1. Rheological behavior ... 64
4.3.3.2. Droplet size distribution ... 66
4.3.3.3. Emulsifying capacity ... 68
4.3.3.4. Emulsion stability and ζ-potential ... 69
4.3.4. Effect of protein modification on the microparticle properties ... 75
4.3.4.1. Encapsulation efficiency ... 75
4.3.4.2. Mean particle size and size distribution ... 77
4.3.5. Oxidative stability ... 79
4.4. CONCLUSIONS ... 79
ACKNOWLEDGMENTS ... 80
REFERENCES ... 81
CAPÍTULO 5 - INFLUENCE OF RICE PROTEIN HYDROLYSATE ON PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES AND LIPID OXIDATION STABILITY ON THE MICROPARTICLE OF LINSEED OIL OBTAINED BY SPRAY-DRYING ... 87
5.1. INTRODUCTION ... 89
5.2. MATERIAL AND METHODS ... 90
5.2.1. Material ... 90
5.2.2. Enzymatic Hydrolysis of Rice Protein ... 91
5.2.2.1. ABTS scavenging capacity of protein hydrolysates ... 91
5.2.3. Preparation of RPI– and PH–stabilized emulsions ... 91
5.2.4. Microencapsulation of linseed oil by spray drying ... 92
5.2.4.1. Microstructure ... 92
5.2.4.2. Moisture content and water activity (aw) ... 92
5.2.4.4. Glass Transition Temperature ... 93
5.2.4.5. Oxidative stability by Peroxide value ... 93
5.2.5. Statistical analysis ... 94
5.3. RESULTS AND DISCUSSION ... 94
5.3.1. Particle morphology ... 94
5.3.2. Sorption isotherms ... 95
5.3.3. Water content, water activity and glass transition temperature (Tg) ... 98
5.3.4. Peroxide value ... 100
5.4. CONCLUSION ... 103
ACKNOWLEDGMENTS ... 103
REFERENCES ... 104
CAPÍTULO 6 – DISCUSSÃO GERAL ... 108
CAPÍTULO 7 – CONCLUSÃO GERAL ... 111
REFERÊNCIAS... 113
1.1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
Nos últimos anos, a indústria de alimentos vem enfrentando uma crescente demanda por alimentos funcionais. Com isso, o desafio da indústria e da área acadêmica visa inovar nas pesquisas e desenvolvimento de tecnologias que permitam a prevenção de suas funções, funcionais e antioxidantes, e a melhora dos componentes dessa natureza.
O óleo de linhaça, considerado como alimento funcional, possui um alto valor nutricional e seu consumo pode ter efeitos benéficos na saúde, pois se trata de um alimento muito rico em ácidos graxos poliinsaturados, sendo sua composição majoritária 50% de ácido α-linolênico, 21,2% de ácido oleico monoinsaturado e 13,96% de ácido linoleico (BAKRY et al., 2016). No entanto, a susceptibilidade dos ácidos graxos poliinsaturados à oxidação representa um enorme desafio na sua aplicação, uma vez que a oxidação lipídica leva à formação de radicais livres e compostos voláteis resultando em sabores indesejáveis em produtos alimentares (CHANG; VARANKOVICH; NICKERSON, 2016).
Devido a essa instabilidade, há uma necessidade de proteger óleos ricos em ácidos graxos poliinsaturados, a fim de torná-los mais estáveis durante o manuseio, processamento e armazenamento. Através do uso de tecnologias de encapsulação, essas limitações podem ser minimizadas de modo que ofereça proteção oxidativa às severas condições ambientais expostas durante o processamento e armazenamento de alimentos (ABERKANE; ROUDAUT; SAUREL, 2014).
A microencapsulação consiste na incorporação de um núcleo sensível ou funcional, substâncias essas também chamadas de material ativo, cercadas por um agente encapsulante homogêneo ou heterogêneo, também conhecido como material de parede, que serve assim de proteção e facilita o manuseio (EDRIS et al., 2016). A escolha do agente encapsulante deve levar em considerações alguns critérios, baseando-se nas características físicas e químicas do composto bioativo a encapsular, pois cada substância possui características únicas com relação à propriedade de formação de filmes e poder emulsificante.
Para ser considerado ideal, o material de parede deve ter propriedades emulsificantes; ser bom formador de filme na interface; ter baixa viscosidade em altas concentrações de sólidos; liberar o material encapsulado quando desejável no produto final; exibir baixa higroscopicidade; ter baixo custo; apresentar alta disponibilidade e
oferecer boa proteção ao ativo. Como quase nenhum material de parede possui todas essas propriedades listadas, geralmente são utilizados em combinação (SHAHIDI; HAN, 1993).
Um material de parede muito utilizado na microencapsulação de ingredientes alimentícios é a maltodextrina. Trata-se de um amido hidrolisado que oferece vantagens como baixo custo relativo, baixa viscosidade em altas concentrações de sólidos, aroma e sabor neutro. Além disso, oferece boa proteção contra oxidação. Porém, o grande problema da utilização desse material de parede é sua baixa capacidade emulsificante (REINECCIUS, 1989).
O uso de proteínas vegetais como material de parede na microencapsulação reflete a tendência atual nas indústrias, pois elas apresentam propriedades funcionais e antioxidantes desejáveis no processo (NESTERENKO et al., 2013). Um dos pré-requisitos adotado para o uso das proteínas na microencapsulação de óleos é a habilidade que elas possuem em se adsorver na interface óleo/água e formarem emulsões estáveis, permitindo assim a máxima eficiência de encapsulamento e estabilidade oxidativa. As proteínas, independentemente da fonte, por serem moléculas anfifílicas diminuem a tensão interfacial das emulsões, permitindo a formação de pequenas gotículas de óleo e evitando a coalescência formando uma barreira física na interface óleo/água (KARACA; LOW; NICKERSON, 2015).
As proteínas de arroz podem ser um atrativo em diversos processos alimentícios devido a sua biodegradabilidade, biocompatibilidade e não toxicidade (PAREDES‐ LÓPEZ; ORDORICA‐FALOMIR; OLIVARES‐VÁZQUEZ, 1991). Mas, devido à estrutura molecular complexa que as proteínas têm, deve-se formular a hipótese que as propriedades emulsionantes das proteínas não são totalmente exploradas no estado nativo. A hidrólise enzimática limitada é uma técnica adequada que pode melhorar as propriedades funcionais e antioxidantes das proteínas globulares. Estudos mostram que dependendo da enzima e substrato utilizados, os hidrolisados proteicos possuem melhor capacidade emulsificante, formação de espuma e estabilidade quando comparadas com proteínas no estado nativo (GHRIBI et al., 2015; LACOU; LÉONIL; GAGNAIRE, 2016). Vale reforçar que as propriedades antioxidantes dos hidrolisados proteicos dependem de diversos fatores, tais como: tipo de proteína, enzima empregada, grau de hidrólise e pré-tratamento do substrato (TAMM et al., 2016b).
Diferentes métodos foram desenvolvidos para realizar um encapsulamento eficiente e a posterior entrega do material ativo encapsulado para produtos alimentares
no tempo e taxa desejados. Entre os diversos métodos propostos para a microencapsulação de alimentos e ingredientes, a secagem por atomização (spray-drying) é uma das técnicas mais empregadas, devido à grande disponibilidade de equipamentos, baixo custo do processo, boa retenção dos compostos voláteis e obtenção de produto final com alta estabilidade (CORSTENS et al., 2017; SARAO; ARORA, 2017).
O objetivo do presente estudo foi investigar a capacidade da proteína isolada de arroz e seus hidrolisados em microencapsular óleo de linhaça em uma matriz com maltodextrina via spray-drying, e verificar o papel dos hidrolisados proteicos como agentes emulsificantes e antioxidantes durante a produção e armazenamento de micropartículas, em comparação com a proteína não modificada enzimaticamente.
2.1. OBJETIVO GERAL
O objetivo principal do presente estudo foi investigar o impacto da hidrólise enzimática limitada sobre as propriedades físico-químicas na interface óleo/água, propriedades de encapsulação e efeitos antioxidantes das proteínas de arroz em micropartículas de óleo de linhaça obtidas via spray drying.
2.1.1. Objetivos específicos
• Obter hidrolisados proteicos de arroz com diferentes graus de hidrólise (GH) a partir de duas proteases com ações catalíticas distintas, a exopeptidase Flavourzyme e a endopeptidase Alcalase;
• Avaliar a distribuição do peso molecular de cada hidrolisado e da proteína de arroz intacta;
• Avaliar a capacidade antioxidante dos hidrolisados proteicos por DPPH e FRAP; • Avaliar as propriedades das emulsões formadas por óleo de linhaça, maltodextrina e proteína de arroz isolada ou hidrolisados proteicos com diferentes graus de hidrólise (estabilidade, capacidade emulsificante, viscosidade, tamanho das gotas e potencial Zeta);
• Avaliar e caracterizar os pós formados via spray drying em relação à eficiência de microencapsulação, umidade, distribuição de tamanho das partículas e microestrutura;
• Determinar isotermas de sorção e temperatura de transição vítrea das micropartículas produzidas com diferentes hidrolisados;
• Estudar a estabilidade oxidativa do óleo de linhaça puro (controle) e microencapsulado.
3.1. PRINCÍPIO ATIVO: ÓLEO DE LINHAÇA
A linhaça é uma das culturas mais antigas do mundo, cultivada desde o início da civilização, sendo geralmente encontrada como grão integral, moído, ou na forma de óleo (GOYAL, 2013). A semente de linhaça (Linum usitatissimum) é uma oleaginosa rica em gordura (41%), proteína (21%) e fibra dietética (28%) (SINGH et al., 2011) e hoje é considerada um alimento funcional, depois de séculos de uso na alimentação e na medicina natural. Os benefícios da linhaça são atribuídos ao seu óleo, rico em ácido α-linolênico, ao alto teor de lignanas e às fibras alimentares (GALLARDO et al., 2013; KAJLA; SHARMA; SOOD, 2014).
O óleo de linhaça é uma boa fonte de ômega-3 (ácido graxo poliinsaturado), sendo sua composição constituída por mais de 50% de ácido α-linolênico (ALA), 21,2% de ácido oleico monoinsaturado e 13,96% de ácido linoleico (LA). O α-linolênico é o principal ácido graxo da família do ω-3 e o ácido linoleico é o principal ácido graxo da família do ω -6 (BAKRY et al., 2016). Esses ácidos são chamados de ácidos graxos essenciais, uma vez que não podem ser sintetizados pelo organismo humano e são indispensáveis para o funcionamento e crescimento normal de todos os tecidos.
Estudos demonstram que a suplementação de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 apresenta benefícios para melhoria dos parâmetros cardíacos, na coagulação sanguínea e na concentração de triglicerídeos (SOUZA et al., 2014). Apesar dessas propriedades que o óleo de linhaça promove à saúde, o óleo, muitas vezes, permanece subutilizado pela indústria de alimentos por causa da sua suscetibilidade à oxidação. Segundo Brand-Willians et al. (1995), os radicais livres são os responsáveis pela oxidação de lipídeos em alimentos, no qual acarreta a deterioração do sabor, descoloração, destruição de nutrientes e formação de compostos tóxicos, comprometendo a qualidade do produto. A falta de miscibilidade em sistemas alimentares aquosos é também um dos grandes problemas enfrentados pelas indústrias (KARACA; NICKERSON; LOW, 2013).
Assim, há uma necessidade de proteger esses óleos para torná-los mais estáveis durante o manuseio, processamento e armazenamento, e a microencapsulação tem sido uma técnica amplamente usada que visa reduzir a susceptibilidade de diversos óleos a oxidação.
3.2. OXIDAÇÃO LIPÍDICA EM ALIMENTOS
A reação espontânea do oxigênio atmosférico com os lipídios, conhecida como autoxidação, é o processo mais comum que leva à deterioração oxidativa dos óleos em geral. O mecanismo preciso da oxidação em um determinado alimento depende da natureza das espécies reativas presentes e do seu ambiente físico-químico. Normalmente, os óleos mais susceptíveis a oxidação apresenta ácidos graxos poli-insaturados, estando presentes como ácidos graxos livres (triglicerídeos) ou fosfolipídeos, fontes potenciais mais significativas da oxidação em alimentos.
Como já mencionado anteriormente, alterações oxidativas geralmente acarretam o desenvolvimento de off flavors e off odors e perda de valores nutritivos. A degradação oxidativa pode ocorrer por várias vias: fotoxidação, oxidação enzimática e autoxidação. No entanto, a autoxidação é o principal mecanismo e pode ser convenientemente dividida em três estágios distintos: iniciação, propagação e terminação. As reações de iniciação podem ser promovidas por dois grupos de fatores, pelo impacto (irradiação, exposição à luz, aumento de temperatura) ou absorção de energia por reações redox catalisadas por metais de transição ou enzimas (RAMALHO; JORGE, 2006; FENNEMA; DAMODARAN; PARKIN, 2010). Nessa etapa, ocorre a formação de radicais livres do ácido graxo devido à retirada do carbono alílico (Figura 1). Uma vez iniciada, a reação segue em cadeia até esgotar as reservas de ácidos graxos insaturados e oxigênio (KIRK, 1984).
Figura 1. Esquema geral do mecanismo da oxidação lipídica.
A fase de propagação que ocorre em seguida é caracterizada por diversas reações que levam a formação de peróxidos. Nessa etapa, os compostos podem ser mensurados e servem como índice de oxidação lipídica em alimentos. Todavia, por se tratar de compostos instáveis, sua mensuração é limitada as fases iniciais da oxidação, já que as reações continuam a ocorrer até a fase de terminação (SEVANIAN; HOCHSTEIN, 1985). Na última etapa, dois radicais livres combinam-se, com a formação de produtos estáveis (produtos secundários de oxidação) obtidos por cisão e rearranjo dos peróxidos (epóxidos, compostos voláteis e não voláteis).
Ao comparar o processo oxidativo de óleos em emulsões, a oxidação ocorre mais rapidamente do que em óleo sem embalagem e transportado em grandes quantidades. Na emulsificação, essa oxidação é atribuída a várias causas. Primeiro, presume-se que a formação de área interfacial entre o óleo e a fase aquosa promova um contato mais rápido e eficiente entre os lipídios insaturados e os compostos pró-oxidantes, tais como íons metálicos. Além disso, uma maior área interfacial poderia favorecer a acessibilidade da fase oleosa ao oxigênio dissolvido na fase aquosa. Em segundo, o próprio processo de emulsificação poderia promover a incorporação do oxigênio e aquecimento do sistema devido ao cisalhamento (BERTON-CARABIN; ROPERS; GENOT, 2014).
A avaliação do grau de oxidação lipídica é importante para controlar e garantir a qualidade e a estabilidade do produto. Testes acelerados permitem estimar de forma mais rápida e precisa a estabilidade oxidativa, uma vez que os fenômenos naturais de oxidação são processos lentos e que podem demorar um longo período. Tais fatos tornam as análises de tempo real inviável em alguns casos, como o controle de qualidade em nível industrial.
O Rancimat, método utilizado ultimamente por indústrias e pesquisadores, permite medir o índice de oxidação em lipídios de forma acelerada. Através de um fluxo constante de ar e controle especifico da temperatura, a amostra é exposta até a possível oxidação. Os lipídios são oxidados e formam peróxidos, que são instáveis e são quebrados em produtos de oxidação secundária. Esses produtos são transportados pelo fluxo de ar a um reservatório de água deionizada, onde a volatilização e condensação desses compostos na água faz com que aumente a condutividade, que está associada ao grau de oxidação (BARROSO et al., 2014).
3.3. MICROENCAPSULAÇÃO
A utilização da microencapsulação em ingredientes alimentares nas últimas décadas tem sido de grande interesse para indústrias e pesquisadores. Os primeiros estudos dessa técnica em alimentos foram iniciados nos anos de 1960, nos Estados Unidos, pelo Instituto de Pesquisas Southwest, com o intuito de prevenir a oxidação, perda de substâncias voláteis e controlar a liberação de aromas em óleos essenciais (RÉ, 1998). Tal técnica consiste no revestimento de partículas ou gotículas dentro de um material de parede constituído por proteínas, polissacarídeos e/ou lipídeos (CHANANA et al., 2013; DAAKE; BALLWEG; STEPHAN, 2016). Este método ajuda a proteger diversos compostos, tais como enzimas, antioxidantes, polifenóis e micronutrientes, para consequente liberação controlada ao local alvo e protegê-los de um ambiente adverso (KWAK, 2014). A proteção contra a oxidação lipídica é um fator crítico para a qualidade dos alimentos, e a aplicação da microencapsulação de óleos tem sido amplamente adotada como uma técnica para resolver este problema e aumentar a vida de prateleira.
A micropartícula de modo geral, consiste de uma membrana semipermeável (parede), de estrutura esférica uniforme ou não, envolvendo em seu interior um composto de interesse. Esse material dentro da micropartícula é referido como núcleo, fase interna ou princípio ativo, enquanto a parede é chamada de fase externa, revestimento ou membrana (BANSODE et al., 2010). Vale salientar que, de acordo com seu tamanho, essas cápsulas podem ser classificadas como: nanopartículas, variando de 0,01 a 0,2 µm, micropartículas, 1 a 100 µm e macropartículas no qual variam acima de 100 µm (SUAVE et al., 2006).
Em termos de morfologia, as cápsulas podem ser distinguidas em microesferas ou micropartículas, sendo frequentemente usadas de forma sinônima. As micropartículas são aquelas no qual o núcleo é nitidamente concentrado na região central, circundado por um material de parede definido e contínuo, classificado como sistema tipo reservatório. Já as microesferas são aquelas em que o núcleo é uniformemente disperso em uma matriz, caracterizado como sistema matricial (PAULO; SANTOS, 2017). A grande diferença entre esses dois tipos está no fato de que, nas microesferas uma pequena fração do material “encapsulado” permanece exposta na superfície, o que é evitado pela verdadeira encapsulação.
Figura 2. Diferentes tipos de micropartículas.
(i) micropartícula (simples); (ii) microesfera (matriz); (iii) micropartícula – irregular; (iv) vários núcleos; (v) duas paredes; (vi) agrupamento de micropartículas; (vii) micropartícula por
spray-dryer.
Fonte: Adaptado de Bakry et al. (2016)
Conforme exposto (Figura 2), as diferentes morfologias são condicionadas ao material de parede escolhido e pela técnica utilizada para a obtenção das micropartículas. A literatura reporta centenas de diferentes técnicas, e é possível que esse número aumente à medida que forem surgindo novos materiais encapsulantes e
novos princípios ativos que necessitam de processamentos específicos. A diferença entre os métodos está no tipo de aprisionamento do material ativo pelo material de parede, sendo essa combinação física, química ou físico-química (AZEREDO, 2005; BAKRY et al., 2016). Os métodos físicos são: spray drying, spray cooling, pulverização em banho térmico, leito fluidizado, extrusão centrífuga com múltiplos orifícios, cocristalização e liofilização. Já os métodos químicos são: inclusão molecular e polimerização interfacial. E os métodos físico-químicos são: coacervação, emulsificação e envolvimento lipossômico (BANSODE et al., 2010).
A etapa que antecede a microencapsulação de óleos via spray drying é a formação da uma emulsão. Algumas variáveis importantes, como natureza e estabilidade do material a ser encapsulado e características do material de parede, devem ser consideradas no desenvolvimento de sistemas microencapsulados para que consigam formar emulsões estáveis, permitindo máxima eficiência de encapsulação e estabilidade oxidativa a ser alcançada.
Diversos materiais de paredes vêm sendo estudados a fim de obter cápsulas com alta eficiência de encapsulação, e conforme apresentado por Carneiro et al. (2013), pelo fato de um mesmo composto não englobar todas as propriedades, utilizam-se misturas de diferentes materiais. Estes materiais devem ser reconhecidos geralmente como seguros (GRAS), biodegradáveis, compatíveis com a substância ativa, economicamente viável e fornecer estabilidade máxima durante e após o processamento para o material encapsulado, juntamente com boas propriedades funcionais e reológicas (AZEREDO, 2005; NESTERENKO et al., 2013; SARAO; ARORA, 2017). Os carboidratos são os materiais mais utilizados conforme reporta a literatura, devido a sua capacidade de se ligar aos compostos de sabor “flavors”, sua diversidade e baixo custo, seguido das proteínas (DIAS; FERREIRA; BARREIRO, 2015).
3.4. MATERIAIS DE PAREDE
O desenvolvimento de sistemas de liberação de encapsulação, no qual protegem, transportam e entregam ingredientes alimentares funcionais em seu local de ação específico, é um dos desafios atuais na engenharia de alimentos. Quando é necessária uma entrega rápida ou controlada do material do núcleo, o mesmo pode ser liberado por desintegração, solubilização ou desorganização da parede das micropartículas ou gradualmente liberado através da parede (CASTRO-ROSAS et al., 2017). Tais
características são influenciadas pelo agente encapsulante utilizado na composição da micropartícula. Os agentes encapsulantes mais comumente estudados para a microencapsulação na indústria de alimentos são as proteínas de soro de leite, caseinato de sódio, proteína de soja, gelatina, maltodextrina, alginatos, amidos e goma arábica (CHANG; VARANKOVICH; NICKERSON, 2016).
A escolha do agente encapsulante deve levar em consideração alguns critérios, baseando-se nas características físicas e químicas do composto bioativo a encapsular, por exemplo, porosidade e solubilidade, assim como o método utilizado para obtenção das micropartículas (FAVARO-TRINDADE; PINHO, 2008). Cada substância possui características únicas com relação à propriedade de formação de filmes e poder emulsificante; portanto, a seleção correta do material de parede para a secagem por atomização é muito importante para um encapsulamento eficiente.
De acordo com diversos autores, existem algumas características importantes para que o agente encapsulante seja considerado ideal, tais como: não deve ser reativo com o composto a encapsular; ter propriedades desejadas de liberação do material a encapsular; ser econômico; proteger o material a encapsular de circunstancias adversas, tais como: luz, pH, oxigênio e ingredientes reativos; ter uma boa capacidade incorporar o material a encapsular impedindo a perda deste; baixa viscosidade em concentrações elevadas; ser fácil de manusear durante o processo de microencapsulação e não ter aromas (MENEZES et al., 2013; SIMEONI et al., 2014).
É interessante frisar que os polímeros naturais têm despertado o interesse dos pesquisadores devido algumas vantagens que apresentam, por exemplo: baixa toxicidade, maior biodisponibilidade, melhor biocompatibilidade e facilidade de obtenção. Dentre tantos polímeros naturais biodisponíveis, proteínas e polissacarídeos, que formam hidrogéis, têm recebido uma atenção maior por serem biodegradáveis e atóxicos (LAURENTI; GARCIA, 2013; NESTERENKO et al., 2013).
3.4.1. Maltodextrina
As maltodextrinas são comumente utilizadas na microencapsulação de ingrediente alimentares. Elas são produtos parcialmente hidrolisados do amido e formados de cadeias de D-glicose conectadas por ligações α-(1,4) (SHAHIDI; HAN, 1993). Esses carboidratos podem ser formados pela ação da hidrólise ácida, enzimática ou ainda pela combinação de ambos, e estão disponíveis em diferentes dextroses
equivalentes (DE). A DE indica uma medida do total de número α-D-glicose anidro e está ligada a seu grau de polimerização (DP). A DE pode ser relacionada ao grau de polimerização através da seguinte Equação 1.
𝐷𝐸 = (100
𝐷𝑃) (1)
Shahidi e Han (1993) afirmam que para serem chamados de maltodextrinas, os mesmos devem conter DE menor que 20, caso esse valor seja maior são considerados xarope de amido. Normalmente apresentam-se como um pó branco e oferecem vantagens como o custo relativamente baixo, aromas e sabores neutros, baixa viscosidade em altas concentrações de sólidos e boa proteção contra a oxidação. No entanto, o maior problema deste material de parede é não possuírem propriedades emulsificantes, sendo assim, é desejável a utilização da maltodextrina em combinação com outros biopolímeros, como por exemplo proteínas (CARNEIRO et al., 2013). Embora a maltodextrina promova a proteção devido à formação de um filme envolto de ingredientes encapsulados susceptíveis a oxidação, a mesma é incapaz de promover a retenção de compostos voláteis durante a secagem por atomização, reforçando assim a combinação com outro biopolímero (RÉ, 1998).
3.4.2. Proteína de Arroz
Proteínas vegetais têm sido extensivamente estudadas nos últimos anos, devido ao seu caráter renovável e biodegradável, além de apresentarem boas propriedades funcionais, tais como: capacidade emulsificante e propriedades de formação de filmes. Além disso, o mercado vegetariano está em constante crescente. Segundo os dados do Instituto Brasileiro de Opinião Pública e Estatística (IBOPE), em 2011 foi feita a primeira pesquisa sobre o número de vegetarianos mostrando que 9% da população brasileira se declarava vegetariana. Já em 2018, uma nova pesquisa mostrou que cerca de 14% dos brasileiros se declararam vegetariano, isto representa quase 30 milhões de brasileiros (SVB, 2018).
O uso de proteínas vegetais na formação de material de parede em microencapsulação reflete a tendência atual das indústrias farmacêutica, cosmética e alimentar em alternativa às proteínas de origem animal. Em aplicações alimentares, é
interessante reforçar que as proteínas vegetais são conhecidas por serem menos alergênicas em comparação com as proteínas de origem animal, entretanto esse fator não é generalizado para todas as pessoas, pois depende da reação de cada organismo (JENKINS; BREITENEDER; MILLS, 2007). Nos últimos anos, outras novas aplicações para produtos vegetais ricos em proteínas se tornaram uma área cada vez mais interessante para a pesquisa.
O arroz representa uma das principais culturas alimentares do mundo, com uma produção global de 480 milhões de toneladas. Já no Brasil, estima-se alcançar uma produção de 11,6 milhões de toneladas, se destacando como o maior produtor mundial fora do continente asiático (CONAB, 2018). O grão de arroz é formado basicamente de casca, farelo, endosperma e embrião, ou gérmen (Figura 3) e a composição de cada componente estão sujeitas a variações ambientais, de manejo, de processamento e de armazenamento.
Figura 3. Corte longitudinal de um grão de arroz.
Fonte: Adaptado de Encyclopedia Britannica (2018)
Reconhecido por suas características funcionais, o arroz é uma fonte rica em carboidratos, mas também é uma fonte importante de proteína que são classificadas de acordo com sua base de solubilidade descrita por Osborne (1924); albumina (solúvel em
água), globulina (solúvel em sal), glutelina (solúvel em solução alcalina) e prolamina (solúvel em álcool), sendo as quatro frações principais. No endosperma, a glutelina forma a principal fração, correspondendo a aproximadamente 80% das proteínas, com menor concentração de albumina e globulina (15%) e prolamina (5-8%). Já o farelo apresenta aproximadamente 60% de albumina, seguido por prolamina e glutelina (27%) e globulina (7%) (JULIANO, 1993). Portanto, a composição em proteínas do endosperma difere do farelo.
Dentre as frações de arroz, o farelo (resíduo compreendendo o pericarpo e a camada aleurona, proveniente do polimento do arroz integral) possui os maiores conteúdos de energia e proteína (JULIANO, 1993). Apesar de ser relativamente rico em proteínas, o farelo de arroz tem sido subutilizado como material alimentício, dado seu baixo teor de amido, e tem sido usado principalmente como ingrediente em ração animal ou mesmo como combustível de caldeira. No entanto, as propriedades nutricionais e tecnológicas da proteína de arroz são amplamente reconhecidas atualmente, e os isolados proteicos tornaram-se comercialmente disponíveis nos últimos anos (FABIAN; JU, 2011).
Entre as proteínas vegetais utilizadas como material de parede em microencapsulação, a literatura reporta principalmente os isolados proteicos de soja, ervilha e cereais (TANG; LI, 2013; CHANG; VARANKOVICH; NICKERSON, 2016; TAMM et al., 2016b). Mas devido às buscas por novas alternativas, as proteínas de arroz podem ser um atrativo em diversos processos alimentícios. Chandi e Sogi (2007) analisaram as propriedades funcionais do concentrado proteico de arroz (55% da fração proteica) e notaram a excelente estabilidade da formação de espuma com duração de vários dias, alta capacidade emulsificante e a boa estabilidade das emulsões dependendo do pH. Já Fabian et al. (2010) mostraram que as proteínas do arroz também se associam bem aos polissacarídeos (alginato e carragenina) para formar precipitados complexos com possíveis novas aplicações industriais. A partir destes resultados, as propriedades físico-químicas das proteínas do arroz podem fornecer características favoráveis para o material da parede na microencapsulação.
3.5. EMULSÃO
A emulsificação, etapa que antecede a formação da micropartícula por spray drying, é um fator importante que influenciará diretamente na eficiência de
encapsulação nas propriedades da micropartícula produzida. Uma emulsão consiste em um sistema contendo pelo menos dois líquidos imiscíveis, com um dos líquidos sendo dispersos como pequenas gotas esféricas no outro (MCCLEMENTS, 2010). As emulsões são encontradas em produtos como cosméticos, pinturas, produtos agrícolas, na indústria petrolífera, e tradicionalmente na indústria de alimentos, no caso de leite, cremes, molhos para saladas, maioneses e sopas que são mistura óleo/água (O/A), e mistura água/óleo (A/O) como margarinas e manteigas.
De modo geral, as emulsões podem ser classificadas conforme a natureza do emulsificante ou a estrutura do sistema. De acordo com a estrutura do sistema, as emulsões são classificadas relativas à localização das fases óleo e água no sistema (fase dispersa e fase contínua). Um sistema na qual as gotículas de óleo são dispersas numa fase aquosa é referido como uma emulsão óleo em água (O/A). Já um sistema com gotículas de água dispersas numa fase oleosa, tem-se uma emulsão de água em óleo (A/O). É possível criar ainda vários tipos de emulsões múltiplas, por exemplo, óleo-água-óleo (O/A/O), óleo-água-óleo-água (A/O/A), óleo-água-água (O/A/A) (KALE; DEORE, 2016). As emulsões também podem ser classificadas conforme o diâmetro das gotas, sendo que a faixa de tamanho das gotículas para cada emulsão é bastante específica e é definida em termos das propriedades físicas e termodinâmicas (MCCLEMENTS, 2007a)
Uma emulsão convencional, também conhecida como macroemulsão, tem tipicamente um diâmetro médio de gota entre 100 nm e 100 µm. As macroemulsões são a forma mais comum de emulsões usadas na indústria de alimentos sendo encontradas em uma variedade de produtos e são propensas à instabilidade física (ex.: separação gravitacional, floculação e coalescência). As nanoemulsões são dispersões de gotículas em nanoescala com diâmetro médio entre 20 e 100 nm e também são termodinamicamente instáveis porque as fases separadas de óleo e água têm uma energia livre mais baixa do que as fases de óleo e água emulsionadas (como nas emulsões convencionais). Já as microemulsões possuem gotículas na faixa de 2 a 50 nm e são as mais estáveis por apresentarem maior área interfacial e consequentemente menor tensão interfacial (ADHEEB USAID; PREMKUMAR; RANGANATHAN, 2014).
As emulsões apresentam uma tendência natural a se separar em suas fases constitutivas com o tempo, devido à energia livre positiva necessária para aumentar a área interfacial, uma vez que o óleo e a água possuem densidades diferentes
(MCCLEMENTS; DECKER, 2000; WONG; LIM; DOL, 2015). É sempre importante tentar identificar os mecanismos físico-químicos responsáveis pela instabilidade de uma determinada emulsão, e os possíveis mecanismos são mostrados na Figura 4.
Figura 4. Diagrama dos possíveis mecanismos de instabilidade em emulsões em alimentos.
Fonte: McClements (2007)
De forma bem resumida, a separação gravitacional (cremeação e sedimentação) é um processo pelo qual as gotículas de óleo se deslocam para parte superior ou inferior do sistema devido à diferença de densidade entre a fase dispersa e a fase continua. A floculação é o processo pelo qual duas ou mais gotículas “se juntam” para formar um agregado no qual cada uma das gotículas iniciais mantém sua integridade individual. Já a coalescência é o processo pelo qual duas ou mais gotículas se fundem para formar uma única gotícula maior. No amadurecimento de Ostwald, as gotículas maiores crescem às custas de gotículas menores devido ao transporte de massa da fase dispersa através da fase contínua. E a inversão de fase, como o próprio nome já diz, é um processo no qual a emulsão (O/A) muda para (A/O) e vice-versa (MCCLEMENTS, 2007b; ADHEEB USAID; PREMKUMAR; RANGANATHAN, 2014).
Há uma constante busca por parte das indústrias e pesquisadores por emulsões que sejam cineticamente estáveis por um período de tempo razoável (algumas semanas, meses ou anos), e a incorporação de substâncias químicas conhecidas como emulsificantes devem ser adicionadas antes da homogeneização. Um emulsificante é
uma substância de natureza anfifílica (apresentam grupos hidrofóbicos e hidrofílicos) que é capaz de adsorver à superfície das gotículas de emulsão para formar um revestimento protetor. Assim, impede que as gotículas se agreguem umas às outras, diminuindo a tensão interfacial entre dois líquidos.
Proteínas vegetais provaram ser emulsificantes eficazes para emulsões de óleo em água (O/A), ao reduzir as tensões interfaciais óleo/água e formar uma camada protetora pela adsorção na superfície de gotículas recém-formadas, fornecendo estabilidade às emulsões contra coalescência e floculação (PAPALAMPROU; DOXASTAKIS; KIOSSEOGLOU, 2010; JUN-XIA; HAI-YAN; JIAN, 2011; CHANG; VARANKOVICH; NICKERSON, 2016). Na adsorção, as proteínas passam por uma modificação estrutural (rearranjos da estrutura secundária e terciária) de tal forma que a interação máxima entre os segmentos hidrofóbicos e a fase hidrofóbica é assegurada (SHARIF et al., 2018). Na seção 3.6 será dado uma ênfase maior nas proteínas hidrolisadas como agente emulsificante.
3.6. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA PROTEÍNA DE ARROZ
A busca incessante por proteínas que apresentem diversas funções no processamento de alimentos, as indústrias e pesquisadores procuram desenvolver e aperfeiçoar técnicas de modificação que melhorem algumas propriedades das proteínas. A modificação através do método de hidrólise enzimática consiste em catalisar a clivagem das ligações peptídicas de proteínas sobre ligações amina e éster. A hidrólise altera as propriedades funcionais das proteínas e, consequentemente, melhora o uso das mesmas no processo de microencapsulação, tais como: solubilidade, propriedades emulsificantes, capacidade de retenção de óleo e água (NESTERENKO et al., 2014). Além disso, a hidrólise enzimática das proteínas é uma abordagem efetiva que pode ser usada para liberar peptídeos antioxidantes sem afetar o valor nutritivo, ajudando assim a proteger o composto bioativo presente na micropartícula (HE et al., 2013).
Diversos estudos mostraram que os hidrolisados proteicos são capazes de aumentar a capacidade emulsificante, formação de espuma e estabilidade quando comparadas com proteínas intactas, devido à exposição de grupos hidrofóbicos presentes no interior da molécula de proteína (ZHAO et al., 2012; MORALES-MEDINA et al., 2016; TAMM et al., 2016b; AI et al., 2019). As propriedades funcionais e antioxidantes desses peptídeos dependem em grande parte da
especificidade da enzima utilizada no processo, do grau de hidrólise, do substrato e da natureza dos peptídeos liberados, incluindo a composição de aminoácidos, o peso molecular e a hidrofobicidade (SARMADI; ISMAIL, 2010).
No processo de hidrólise enzimática, as enzimas são classificadas de acordo com o mecanismo catalítico, classificadas como endo e exopeptidases (Figura 5). As endopeptidases possuem a capacidade de hidrolisar ligações peptídicas de forma aleatória nas moléculas de proteína, gerando peptídeos relativamente grandes. Já as exoproteases, removem de forma sistêmica os aminoácidos dos grupos N-terminal ou no C-terminal ou hidrolisam peptídeos nas ligações terminais, resultando na liberação de aminoácidos livres e peptídeos relativamente pequenos (ANTONOV, 1993; BEYNON; BOND, 2001).
Figura 5. Classificação das proteases de acordo com o mecanismo de ação.
Fonte: o próprio autor
Diversos tipos de enzimas são utilizadas no processo de hidrólise, sendo destaque as enzimas microbianas Alcalase e a Flavourzyme como uma das mais utilizadas (HRČKOVÁ; RUSŇÁKOVÁ; ZEMANOVIČ, 1999; CUMBY et al., 2008; SCHMIDT; SALAS-MELLADO, 2009; YUST et al., 2010). A enzima Alcalase provém da fermentação submersa do micro-organismo Bacillus licheniformis, e é
classificada como uma subtilisina, uma endopeptidase do tipo serina que apresenta ampla especificidade de substrato e pode hidrolisar a maioria das ligações peptídicas dentro de uma molécula de proteína. Suas condições ótimas de ação estão na faixa de pH 7 a 9 e de temperatura de 30 a 65 °C. Já a Flavourzyme trata-se da mistura de proteases oriunda da fermentação submersa de uma linhagem especifica de Aspergillus oryzae, apresentando atividade especifica endo e exopeptidase. Seu pH e temperatura de máxima atividade é de 7,0 e 50 °C, respectivamente. É interessante frisar que a aplicação de endoproteinases é dominante em alimentos proteicos hidrolisados. Entretanto, quando se deseja a completa hidrólise de proteínas as endoproteinases são combinadas com exopeptidases (NILSANG et al., 2005).
A hidrólise enzimática é geralmente recomendada para melhorar a funcionalidade das proteínas. Em muitos casos, as proteínas intactas são moléculas grandes e possuem ligações intramoleculares que as limitam produzir emulsões, espumas e soluções estáveis. Um dos benefícios dos peptídeos gerados da hidrólise com relação às proteínas intactas está na capacidade de difundir-se mais rapidamente para a interface devido ao seu aumento de solubilidade, que por sua vez será adsorvido mais rapidamente na relação água/óleo ou óleo/água (SHARIF et al., 2018). Os hidrolisados com um baixo grau de hidrólise formam uma emulsão mais estável, em contraste com o hidrolisado com uma maior extensão de hidrólise, uma vez que os peptídeos são muito pequenos para reduzir a tensão interfacial de forma suficiente para assegurar capacidades emulsificantes ótimas (NESTERENKO et al., 2012; GHRIBI et al., 2015; LACOU; LÉONIL; GAGNAIRE, 2016).
A hidrólise extensiva geralmente melhora a solubilidade, mas por outro lado pode prejudicar outras propriedades funcionais, tais como propriedades espumantes e emulsificantes, e pode potencialmente resultar no desenvolvimento de sabor amargo, devido ao acúmulo de peptídeos hidrofóbicos de baixo peso molecular. A Figura 6 a seguir mostra a possível estabilização de emulsão O/A pelos hidrolisados.
Figura 6. Ilustração da estabilização da emulsão O/A através de produtos da hidrólise de proteína.
Fonte: Adaptado de Zhang et al. (2014)
Foram relatadas várias atividades biológicas dos hidrolisados das proteínas de arroz, incluindo atividade antioxidante, atividade antifúngica, atividade antigênica, capacidade de quelação de metais e propriedades funcionais como emulsificante, alta solubilidade, capacidade de formação de filmes e entre outros (ZHAO et al., 2012; CHEETANGDEE; BENJAKUL, 2015; XU et al., 2016). Alguns estudos já foram conduzidos para investigar propriedades funcionais e antioxidantes de hidrolisados proteicos como material de parede na elaboração de micropartículas por atomização, tais como proteína de soja, girassol e soja, soro de leite, ervilha, proteína de sardinha e soro de leite isolado (NESTERENKO et al., 2012, 2014, TAMM et al., 2015, 2016b, 2016a; MORALES-MEDINA et al., 2016; DRAPALA et al., 2017).
3.6.1. Capacidade antioxidante
Uma quantidade impressionante e crescente de trabalhos tem sido publicada sobre a estabilidade oxidativa em emulsões (ŠLIŽYTE et al., 2009; LOBO et al., 2010; CHEETANGDEE; BENJAKUL, 2015). Os compostos com capacidade antioxidante em alimentos são definidos como qualquer substância capaz de adiar, retardar ou impedir o
desenvolvimento de sabor rançoso e perdas nutricionais. Além disso, os antioxidantes impedem outras deteriorações aromáticas em alimentos, bloqueando os efeitos danosos dos radicais livres. Vale reforçar que esses compostos inibem não só a peroxidação lipídica, mas também a oxidação de outras moléculas como, DNA, RNA, entre outras.
Existe uma gama de compostos antioxidantes, sejam naturais ou sintéticos, que podem ser utilizados em alimentos, fármacos ou como suplementos nutricionais, uma vez que apresentem segurança para saúde humana. Os antioxidantes sintéticos mais utilizados na indústria de alimentos são butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), propilgalato (PG) e tercbutilhidroquinona (TBHQ). Por se tratar de compostos fenólicos, a doação de um próton a um radical livre é facilitada, e esses novos radicais fenólicos gerados podem se estabilizar sem promover ou propagar reações de oxidação (RAMALHO; JORGE, 2006).
Nas últimas décadas, cientistas e pesquisadores tem dado ênfase à procura de novas substâncias naturais com capacidade antioxidante, que possam atuar sozinhas ou sinergicamente com outros aditivos prevenindo a deterioração oxidativa em alimentos (CHENG; XIONG; CHEN, 2010; CENTENARO; MELLADO; PRENTICE-HERNÁNDEZ, 2011; MORALES-MEDINA et al., 2016). A Tabela 1 apresenta uma lista de estudos sobre as atividades antioxidantes de peptídeos, bem como o tipo de enzima utilizada.
Tabela 1. Estudos de capacidade antioxidante de peptídeos de diferentes fontes proteicas.
Fonte de peptídeos Enzima Atividade Referência
Amendoim Alcalase Inibição da autoxidação do ácido linoleico, atividade de eliminação de radicais livres, redução do poder e inibidor da oxidação lipídica do fígado.
Chen et al. (2007)
Batata Alcalase Atividade de eliminação de radicais ABTS, FRAP e atividade quelante do ferro e cobre Wang e Xiong (2005)
Canola Alcalase e
Flavourzyme
Atividade de eliminação de radicais DPPH e poder redutor. Cumby (2008)
Farelo de arroz Alcalase,
Flavourzyme, Neutrase, Protamex e
Tripsina.
Atividade de eliminação de radicais DPPH e poder redutor. Zhao et al. (2012)
Grão-de-bico Alcalase Atividade de eliminação de radicais DPPH, hidroxila e superóxido, poder redutor e inibição da autoxidação do ácido linoleico.
Li et al. (2008)
Okara Alcalase e
Flavourzyme
Atividade de eliminação de radicais ABTS e DPPH, e FRAP. Sbroggio et al. (2016)
Trigo Alcalase Atividade de eliminação de radicais ABTS, DPPH e superóxido. Elmalimadi et al.
(2017) Sardinha e
Carapau
Alcalase e tripsina Atividade de eliminação de radicais DPPH, poder redutor do ferro e atividade quelante do ferro
Morales-Medina et al. (2016)
Diante de inúmeras pesquisas elaboradas acerca de antioxidantes naturais, descobriu-se que vários peptídeos de diferentes fontes proteicas possuem capacidade antioxidante. Desde então, sua atividade biológica vem sendo amplamente estudada. Os peptídeos antioxidantes contêm de 5 a 16 resíduos de aminoácidos e são considerados compostos seguros e saudáveis com baixo peso molecular, baixo custo, alta atividade e fácil absorção (SARMADI; ISMAIL, 2010). Eles têm algumas vantagens em comparação com antioxidantes enzimáticos; isto é, com estrutura mais simples, eles têm mais estabilidade em situações diferentes e não apresentam nenhuma imunorreação perigosa. Além disso, apresentam melhores propriedades nutricionais e funcionais em comparação com a proteína intacta.
A fim de avaliar a capacidade antioxidantes desses diversos compostos, vários métodos foram desenvolvidos, cada um com seu alvo especifico dentro da matriz. Esses métodos auxiliam os pesquisadores a determinar a quantidade de compostos antioxidantes em diversas matrizes, avaliando sua capacidade de resistir à oxidação e a atividade antioxidante que pode estar presente no organismo após a ingestão. Com base nas reações químicas, os ensaios para medir a capacidade antioxidante são classificados em dois grupos: métodos baseados na transferência de átomos de hidrogênio e métodos baseados na transferência de elétrons. Não existe um método que possa fornecer resultados inequívocos e a melhor solução é usar vários métodos em vez de uma abordagem unidimensional. O poder redutor de íons férricos (FRAP) e a capacidade de eliminação de radicais 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) são exemplos de ensaios frequentemente utilizados para medir a capacidade antioxidante de peptídeos (SARMADI; ISMAIL, 2010; CAROCHO; FERREIRA, 2013).
De forma resumida, o método DPPH baseia-se na premissa de que um doador de hidrogênio é um antioxidante. Este ensaio colorimétrico usa o radical DPPH, que muda de púrpura para amarelo na presença de antioxidantes, e é amplamente usado como um estudo preliminar (MOON; SHIBAMOTO, 2009). Já o FRAP é um método baseado na transferência de elétrons, redução do Fe3+ para Fe2+, e mede a habilidade de um potencial antioxidante transferir um elétron a fim de reduzir radicais, metais ou carbonilas, o qual usa como indicativo a mudança de cor do oxidante (CAROCHO; FERREIRA, 2013).
3.7. SECAGEM POR ATOMIZAÇÃO
A secagem por atomização é uma das operações unitárias amplamente utilizadas na secagem de emulsões contendo óleos e aromas durante o processo de microencapsulação. Essa técnica frequentemente produz pós com alta qualidade, baixa atividade de água e uma elevada shelf-life. O processo de secagem por atomização ou pulverização para fazer micropartículas envolve três estágios principais: preparação, homogeneização e atomização da suspensão ou emulsão (CORSTENS et al., 2017). As etapas acima mencionadas são cruciais no processo de microencapsulação de compostos sensíveis, tais como óleos contendo altas quantidades de componentes nutricionalmente valiosos, incluindo antioxidantes, compostos fenólicos bioativos e ácidos graxos essenciais.
Muitos pesquisadores tem usado esse processo para encapsular óleos como os de linhaça (CARNEIRO et al., 2013), alecrim (FERNANDES et al., 2014), gengibre (FERNANDES et al., 2016), abacate (BAE; LEE, 2008), café (FRASCARELI et al., 2012), noz e amendoim (LUNA-GUEVARA et al., 2017), obtendo assim partículas em pó que são facilmente manipuladas e conservadas em relação aos óleos líquidos. Vale reforçar que nesse processo de secagem existem pelo menos quatro variáveis que devem ser consideradas para obter uma micropartícula eficiente: propriedades do material de parede, características dos materiais de núcleo, condições críticas da emulsão de alimentação e condições de secagem.
No processo de secagem por spray drying, o líquido, podendo ser uma solução, emulsão ou dispersão, é atomizado no interior de uma câmara de secagem para formar microgotas que entram em contato com ar quente, provocando rápida evaporação e posterior formação de micropartículas. É um processo contínuo que envolve diversas fases: atomização do fluido, mistura do fluido atomizado com ar quente, evaporação da água e separação do produto em pó do ar de secagem (CASTRO-ROSAS et al., 2017). A Figura 7 representa, de forma resumida, o esquema da microencapsulação por spray drying.
