UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
Marcos Rodrigo Jerônimo da Costa
Efeito do Estresse Térmico no Relógio Biológico de
Danio rerio: um Elo entre Temperatura, Luz, Canais
TermoTRPs e Genes de Relógio
Thermal Stress Effects on Danio rerio Biological Clock: a
Link between Temperature, Light, Thermo-TRP Channels
and Clock Genes
São Paulo
2016
Marcos Rodrigo Jerônimo da Costa
Efeito do Estresse Térmico no Relógio Biológico de
Danio rerio: um Elo entre Temperatura, Luz, Canais
TermoTRPs e Genes de Relógio
Thermal Stress Effects on Danio rerio Biological Clock: a
Link between Temperature, Light, Thermo-TRP Channels
and Clock Genes
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Mestre em Ciências, na Área de Fisiologia Geral.
Orientador (a): Profa. Dra. Ana Maria de Lauro Castrucci
São Paulo
2016
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS / USP
Costa, Marcos Rodrigo Jerômino da
Efeito do estresse térmico no relógio biológico de Danio rerio: um elo entre temperatura, luz, canais termoTRPs e genes de relógio / Marcos Rodrigo Jerônimo da Costa; orientador Ana Maria de Lauro Castrucci. --. São Paulo, 2016.
92 f.
Dissertação (Mestrado) -- Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Fisiologia Geral.
1. Danio rerio. 2. Células ZEM-2S. 3. Genes de relógio. 4. Termo TRPs. 5. Proteínas de choque térmico. 6. HSP90.
7. Temperatura. I. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Fisiologia Geral. II. Título.
Nome: Costa, Marcos Rodrigo Jerônimo da
Título: Efeito do Estresse Térmico no Relógio Biológico de Danio rerio: um Elo entre Temperatura, Luz, Canais TermoTRPs e Genes de Relógio
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo para a obtenção de título de Mestre em Ciências, na Área de Fisiologia Geral.
Aprovado em: _____/_____/_______ Banca Examinadora: Prof. Dr. (a): ____________________________________________ Instituição: ____________________________________________ Julgamento: ____________________________________________ Assinatura: ____________________________________________ Prof. Dr. (a): ____________________________________________ Instituição: ____________________________________________ Julgamento: ____________________________________________ Assinatura: ____________________________________________ Prof. Dr. (a): ____________________________________________ Instituição: ____________________________________________ Julgamento: ____________________________________________ Assinatura: ____________________________________________ _______________________________________________ Profa. Dra. Ana Maria de Lauro Castrucci
Agradecimentos
A meus pais José Jerônimo e Maria Costa pela luta, dedicação e exemplo de vida. Vocês são meu orgulho!
A minha esposa Eliedna que, quando ninguém mais acreditou, depositou toda a sua confiança em mim e mergulhou junto comigo nessa aventura, dando a segurança necessária para que eu pudesse enfrentar todos os desafios. Amor, sem você nada disso seria possível!
A meu irmão Rubens e sua esposa Valcíria que me acolheram mais uma vez em seu humilde lar, mostrando o verdadeiro sentido de família.
A minha irmã Catarina e seu esposo Evandro que, mesmo longe, nunca deixaram de me apoiar e reconhecer o meu esforço.
A minha irmãzinha Sabrina, minhas sobrinhas Tiffany e Maria Alice, por sempre renovarem a minhas energias através de um simples sorriso, me fazendo acreditar em um mundo melhor.
À professora Doutora Ana Maria de Lauro Castrucci pela oportunidade de realizar esse trabalho em seu laboratório e por me proporcionar ensinamentos muito além do âmbito científico: ensinamentos de vida.
A todos os colegas e amigos de laboratório Maria Nathália, Leonardo Assis, Bruno, Jennifer, Nathana, Thainá e Márcio. À Maria Nathália deixo aqui o meu mais sincero agradecimento pela paciência e dedicação: Nath, nunca vou esquecer o dia em que “tocou meu ombro” e tornou esse sonho possível!
A meu mestre de graduação Professor Sebastião Pacheco Duque Neto por me fazer acreditar que seria capaz.
Resumo
COSTA, M. R. J. Efeito do Estresse Térmico no Relógio Biológico de Danio rerio: um Elo entre Temperatura, Luz, Canais TermoTRPs e Genes de Relógio. 2016. 92 f. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016.
A adaptação temporal é fundamental para a sobrevivência de espécies que precisam coordenar sua fisiologia e comportamentos ajustando-se a sinais externos. Ritmos biológicos não são simplesmente uma resposta às mudanças de 24 horas no ambiente físico impostas pela rotação da Terra sobre o seu próprio eixo, ao contrário, surgem a partir de um sistema de cronometragem endógeno. No teleósteo Danio rerio, ainda não foi identificada a presença de uma região que atue como relógio central; alguns estudos têm evidenciado a existência de células e tecidos que contêm relógios circadianos autônomos, fotossensíveis, comprovando um outro tipo de regulação dos ritmos circadianos onde a percepção do ambiente e o ajuste do período circadiano são efetivados diretamente em nível celular.
As consequências deletérias do aumento da temperatura são impedidas, em certa medida, por uma resposta adaptativa que assegura a sobrevivência celular na presença de calor. Esta via de sobrevivência ativada por calor, conhecida como resposta ao choque térmico, é composta por uma cascata de eventos que conduzem à indução de proteínas de choque térmico (HSPs) que minimizam a lesão celular aguda.
Acredita-se que os sistemas de percepção dos ciclos diários de temperatura e luminosidade sofreram as mesmas pressões seletivas em sua co-evolução, resultando em sua associação. As bases da sensação térmica estão em um grupo de canais altamente conservados, presente em todos os metazoários estudados até o momento e envolvidos
em uma série de modalidades sensoriais, os canais de potencial receptor transiente (TRP); os que respondem a estímulos térmicos foram agrupados em uma subfamília e denominados termoTRPs,
O objetivo deste trabalho foi investigar a influência do pulso de temperatura (33 ºC) na expressão de genes de relógio e de proteínas de choque térmico, bem como o papel do canal TRPV1, em células embrionárias de blástula de Danio rerio, denominadas ZEM-2S, submetidas a escuro constante (DD) ou ciclos claro-escuro (LD 12:12).
Através de PCR em tempo real (quantitativo) demonstrou-se que as células ZEM-2S expressam os genes dos seguintes canais TRP: trpA1a, trpA1b, trpV1/2, trpV4,
trpC6, trpM2, trpM4a, trpM4b/c e trpM5. Após um pulso de temperatura, observou-se
um aumento no transcrito de hsp90 aa1 em células mantidas tanto em DD como em LD, sendo a expressão de hsp90 aa1 em LD, no ponto uma hora, duas vezes menor quando comparada a sua expressão no mesmo ponto temporal em DD. O pulso de temperatura não promoveu efeito em nenhum dos genes do relógio estudados (bmal1a, bmal1,
bmal2, cry1a, cry1b, per1, per2) quando as células foram mantidas em DD. Porém, o
transcrito de per2 aumentou em resposta ao pulso de temperatura quando as células foram sincronizadas pelos ciclos claro-escuro.
A inibição do canal TRPV1 não alterou o efeito induzido pelo pulso de temperatura na expressão do gene hsp90 aa1 em células ZEM-2S mantidas em DD. Por outro lado, nossos dados permitem afirmar que o mesmo participa parcialmente na indução do aumento da expressão do gene per2 pelo estímulo térmico em células mantidas em LD, tendo em vista um decaimento significativo na resposta deste gene.
Os dados obtidos neste trabalho abrem uma nova perspectiva sobre a investigação da relação temperatura e genes de relógio, colocando um novo “ator” na regulação deste fenômeno: o canal TRPV1.
Palavras-chave: Danio rerio; Células ZEM-2S; Genes de relógio; TermoTRPs; Proteínas de choque térmico; HSP90; Temperatura.
Abstract
COSTA, M. R. J. Thermal Stress Effects on Danio rerio Biological Clock: a Link between Temperature, Light, Thermo-TRP Channels and Clock Genes. 2016. 92 f. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016.
Temporal adaptation is essential for the survival of species which need to coordinately adjust their physiology and behavior to external signals. Biological rhythms are not just a response to the 24 hour changes in the physical environment imposed by the rotation of the Earth around its own axis, but they arise from an endogenous timing system. In the teleost Danio rerio, there has not been identified so far a region in the nervous system that could act as a central clock; some studies have reported the existence of cells and tissues which contain photosensitive, autonomous circadian clocks, demonstrating the existence of another type of circadian rhythm regulation in which environment perception and entrainment of the circadian period are directly effected at cell level.
The deleterious consequences of temperature increase are prevented by an adaptive respose which assures cell survival in the presence of heat. This survival pathway activated by heat, known as response to temperature shock, is signaled by a cascade of events leading to the induction of thermal shock proteins (HSPs) which attenuate the acute cell lesion.
It is believed that the systems perceiving temperature and light daily cycles were subject to the same selective pressures during their co-evolution, resulting in their association. The base of thermal sensation is a family of highly conserved channels, present in all metazoans studied to date, and involved in a variety of sensorial
modalities, the transient receptor potential channels (TRP); those responding to thermal stimuli were grouped in a sub-family named thermo-TRPs.
The aim of this work was to investigate the influence of a temperature pulse (33 ºC) on the expression of clock and heat shock protein genes, as well as the role of TRPV1 channel, in blastula embryonic cells of Danio rerio, named ZEM-2S, subject to constant dark (DD) or light-dark cycles (LD).
Using quantitative PCR, we demonstrated that ZEM-2S cells express genes for the following TRP channels: trpA1a, trpA1b, trpV1/2, trpV4, trpC6, trpM2, trpM4a,
trpM4b/c and trpM5. After the pulse of temperature, we observed an increase of hsp90 aa1 transcripts in DD as well as in LD; hsp90 aa1 expression 1 hour after the stimulus
was two-fold lower in LD than in DD. Temperature pulse did not affect the expression of any of the studied clock genes (bmal1a, bmal1, bmal2, cry1a, cry1b, per1, per2), when the cells were kept in DD. However, per2 transcript increased in response to the temperature pulse when the cells were synchronized by light-dark cycles.
Inhibition of TRPV1 channel did not change the effect induced by the temperature pulse on hsp90 aa1 in ZEM-2S cells kept in DD. On the other hand, our data suggest that this channel participates, at least partially, in the temperature-induced increase of per2 in cells maintained in LD, as indicated by the significant decay observed in the gene response in the presence of the inhibitor.
Our results open new investigative perspective about the relationship between temperature and clock genes, placing a new “actor” in the regulation of the phenomenon: the TRPV1 channel.
Key words: Danio rerio; ZEM-2S cells; Clock Genes; Thermo-TRPs; Heat Shock Proteins; HSP90; Temperature.
Lista de Figuras
Figura 1. Representação do relógio molecular de mamíferos ... 23 Figura 2. Modelo atual do mecanismo molecular do relógio circadiano de Danio rerio
... ...25 Figura 3. Estrutura esquemática de um canal TRP ... 30 Figura 4. Gama de temperaturas de ativação dos canais termoTRPs em diferentes organismos ... 32 Figura 5. Esquema do protocolo experimental do pulso de temperatura de 33 °C (duração de uma hora) em células mantidas em DD ... 41 Figura 6. Esquema do protocolo experimental do pulso de temperatura de 33 °C (duração de 1 hora) em células mantidas em LD ... 42 Figura 7. Esquema do protocolo experimental do pulso de temperatura de 33 °C (duração de 1 hora) em células mantidas em DD, na presença de BCTC ... 43 Figura 8. Esquema do protocolo experimental do pulso de temperatura de 33 °C (duração de 1 hora), em células mantidas em LD, na presença de BCTC ... 44 Figura 9. PCR quantitativo dos genes hsp90 aa1 (A) e hsp90 ab1 (B) em células
ZEM-2S de Danio rerio submetidas a pulso de temperatura em DD ... 54 Figura 10. PCR quantitativo dos genes de relógio bmal1a (A), bmal1b (B) e bmal2 (C) em células ZEM-2S de Danio rerio submetidas a pulso de temperatura em DD ... .55 Figura 11. PCR quantitativo dos genes de relógio cry1a (A) e cry1b (B) em células ZEM-2S de Danio rerio submetidas a pulso de temperatura em DD ... 55 Figura 12. PCR quantitativo dos genes de relógio per1 (A) e per2 (B) em células
ZEM-2S de Danio rerio submetidas a pulso de temperatura em DD ... 56 Figura 13. PCR quantitativo de hsp90 aa1 (A) e hsp90 ab1 (B) em células ZEM-2S de
Danio rerio ... 57
Figura 14. PCR quantitativo dos genes de relógio bmal1a (A), bmal1b (B) e bmal2 (C) em células ZEM-2S de Danio rerio submetidas a pulso de temperatura em LD. ... 58 Figura 15. PCR quantitativo dos genes de relógio cry1a (A) e cry1b (B) em células ZEM-2S de Danio rerio submetidas a pulso de temperatura em LD ... 59 Figura 16. PCR quantitativo dos genes de relógio per1 (A) e per2 (B) em células
Figura 17. PCR quantitativo do gene hsp90 aa1 em células ZEM-2S de Danio rerio após tratamento com inibidor do canal TRPV1 ... 60 Figura 18. PCR quantitativo do gene de relógio per2 em células ZEM-2S de Danio
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 16
1.1. Ritmos Biológicos ... 16
1.2. Percepção de Luz e Temperatura ... 17
1.3. Funcionamento da Maquinaria Molecular do Relógio Biológico ... 20
1.4. Temperatura e a Maquinaria do Relógio – Relação entre Proteínas de Choque Térmico (HSP, Heat Shock Proteins) e Genes do Relógio ... 25
1.5. Canais TRP e Percepção de Temperatura – TermoTRPs ... 29
1.6. Relógios Periféricos: Células ZEM-2S como Modelo de Estudo ... 33
2. OBJETIVOS ... 38
2.1. Objetivo Geral ... 38
2.2. Objetivos Específicos ... 38
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 40
3.1. Manutenção de Células Embrionárias ZEM-2S de Danio rerio ... 40
3.2. Protocolos Experimentais ... 41
3.3. Extração de RNA Total ... 44
3.4. Reação de Transcriptase Reversa - RT-PCR ... 45
3.5. PCR Quantitativo ... 46
3.6. Análise Estatística ... 50
4. RESULTADOS ... 52
4.1. Identificação de Canais TRP em Células Embrionárias ZEM-2S ... 52
4.2. Expressão de hsps e de Genes do Relógio em Células ZEM-2S Mantidas em Escuro Constante e Submetidas a um Pulso de 33 ºC ... 53
4.3. Expressão de hsps e de Genes do Relógio em Células ZEM-2S Mantidas em Ciclos Claro-escuro e Submetidas a um Pulso de 33 ºC ... 56
4.4. Expressão Gênica de hsp90 aa1 e per2 após Bloqueio do Canal TRPV1 por BCTC ... 60
5. DISCUSSÃO ... 63
Introdução
“Até você tornar consciente, o inconsciente irá dirigir a sua vida, e você vai chamá-lo de destino”.
Carl Jung.
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Ritmos Biológicos
Ritmos biológicos podem ser entendidos como manifestações claras da organização temporal, que permitem aos organismos ocupar seu nicho no momento adequado. Está claro que os ritmos biológicos representam uma adaptação do organismo com relação ao ambiente em que vivem, sendo o tempo uma dimensão fundamental nesse processo, o qual possui caráter determinante na organização interna das espécies, permitindo a estas sincronizar eventos internos com os ciclos físicos do ambiente (Pittendrigh, 1993). Portanto, quase todas as espécies exibem variações periódicas em seu comportamento e/ou processos fisiológicos. Com exceção de cavernas, grandes profundidades marinhas ou certas nascentes de água quente, as características rítmicas de todos os ambientes na Terra são evidentes. Neste sentido, a adaptação temporal é fundamental para a sobrevivência de espécies que precisam coordenar sua fisiologia e comportamentos ajustando-se a sinais externos.
Ritmos biológicos não são simplesmente uma resposta às mudanças de 24 horas no ambiente físico impostas pela rotação da Terra sobre o seu próprio eixo, ao contrário, surgem a partir de um sistema de cronometragem endógeno. Este sistema de temporização próprio dos organismos baseia-se em mecanismos moleculares que determinam um período de oscilação. Entretanto, ciclos ambientais como o ciclo claro-escuro, de temperatura, de marés e outros, fornecem pistas que são interpretadas pelo organismo, permitindo que o mesmo se antecipe aos desafios impostos para sua sobrevivência através do ajuste dos programas temporais inatos a essas variáveis (Pittendrigh, 1993). Estas pistas ambientais denominam-se zeitgebers (doador do tempo em alemão), termo cunhado por Aschoff em 1960, referindo-se a quaisquer fatores
17 bióticos e abióticos cíclicos que podem promover a sincronização do organismo com o ambiente que ele ocupa, o que é denominado de arrastamento.
A presença de um temporizador em organismos eucariotos, como também em procariotos, garante um ritmo mesmo na completa ausência de pistas ambientais, situação em que o animal se encontra em livre curso, assegurando que as funções internas não percam seu perfil temporal (Aschoff, 1965). Relógios diferentes possuem períodos distintos, e aqueles que se aproximam de 24 horas de oscilação são denominados de relógios circadianos (circa = aproximadamente; dien = um dia). Ritmos com períodos mais curtos ou mais longos são chamados ultradianos ou infradianos, respectivamente.
1.2. Percepção de Luz e Temperatura
Dada a importância do ciclo claro-escuro como principal zeitgeber ambiental, muitos estudos constataram que células fotorreceptoras ou estruturas responsáveis pela captura da informação luminosa ambiental são encontradas desde organismos procariontes (Spudich et al., 2000; Spudich, 2006). Opsinas compõem um grande grupo de proteínas estrutural e funcionalmente semelhantes, que são capazes de responder à luz em função da presença de um cromóforo associado à porção protéica (Findlay e Pappin, 1986). Atualmente existem seis importantes famílias de proteínas fotorreceptoras reconhecidas na literatura: as rodopsinas, os fitocromos, as xantopsinas, os criptocromos, as fototropinas e as BLUF-proteins (blue-light using FAD proteins) (Van Der Horst e Hellingwerf, 2004), sendo essa classificação baseada na estrutura química do componente responsável pela absorção da luz, o cromóforo.
O fotopigmento melanopsina pertence à família das rodopsinas, sendo uma proteína com sete domínios transmembrânicos, acoplada a proteína G, que se liga
18 covalentemente ao cromóforo 11-cis-retinal pela base de Schiff. A melanopsina foi inicialmente identificada nos melanóforos, retina e cérebro do anfíbio Xenopus laevis (Provencio et al., 1998), sendo que nos melanóforos a presença deste fotopigmento os torna capazes de responder a luz com dispersão pigmentar (Isoldi et al., 2005). Posteriormente, sua expressão foi verificada na retina de mamíferos (Provencio et al., 2002), sendo hoje reconhecida como responsável pela sincronização do relógio central, o núcleo supra-quiasmático (NSQ) (Panda et al., 2002; 2003). Nesta classe de vertebrados, a melanopsina está localizada em uma subpopulação de células ganglionares da retina (ipRGCs) sendo ativada pelo comprimento de onda do azul (480 nm). Ativação da melanopsina por luz recruta a participação de uma proteína Gq, seguida da ativação de uma fosfolipase C (PLC) e posterior abertura de canais de potencial receptor transitório C6 (TRPC6) e C7 (TRPC7), resultando na despolarização da membrana (Qiu et al., 2005; Kumbalasiri et al. 2007; Hankins et al., 2008; para revisão ver Hughes et al., 2012). Das ipRGCs partem axônios que formam o Trato Retino-Hipotalâmico (TRH) que comunica a retina com o NSQ através do sinal de glutamato (Johnson et al., 1988), promovendo a sincronização dos eventos internos com o ambiente (Reppert e Weaver, 2002).
Peixes, anfíbios, répteis e aves possuem células fotorreceptoras especializadas distribuídas em várias regiões do encéfalo, e a luz que incide sobre o corpo destes animais penetra pela pele e crânio e atinge essas células fotossensíveis, que veiculam a informação para uma região homóloga do NSQ (Menaker, 1972). No teleósteo Danio
rerio ainda não foi identificada a presença de uma região que atue como relógio central,
pelo contrário, alguns estudos têm evidenciado a existência de células e tecidos que contêm relógios circadianos autônomos, fotossensíveis, comprovando um outro tipo de regulação dos ritmos circadianos onde o funcionamento e a adaptação do período
19 circadiano são efetivados diretamente em nível celular (Whitmore et al., 1998; Tamai et
al., 2005; Moore e Whitmore, 2014; Heussen e Whitmore, 2015). Porém essa
responsividade celular à luz encontra-se prejudicada em estados patológicos, como em melanoma de Danio rerio, nos quais os genes induzíveis por luz e que exercem um papel crítico na regulação do relógio perdem essa capacidade (Hamilton et al., 2015).
Acredita-se que os sistemas de percepção dos ciclos diários de temperatura e luminosidade sofreram as mesmas pressões seletivas em sua co-evolução, resultando em sua associação. O que suporta a hipótese evolutiva de “fuga da luz”, onde altas temperaturas encontradas na fase clara do dia seriam nocivas para a estabilidade de processos fisiológicos, bem como a radiação ultravioleta representaria uma ameaça à estrutura de ácidos nucleicos dos seres vivos. De acordo com Pittendrigh (1993), é provável que esta fuga da luz tenha exercido uma função significativa, de fato principal, na evolução da organização circadiana.
Uma recente descoberta que fortalece a interação de ciclos de luz e temperatura é descrita por Shen e colaboradores, que demonstraram que a detecção de temperatura mediada por canais TRP em Drosophila é dependente de rodopsina. Animais mutantes sem rodopsina perdem essa capacidade, sendo que a termossensibilidade é restaurada pela transfecção do fotopigmento melanopsina. É importante destacar que o papel da rodopsina/melanopsina é independente de luz, uma vez que os ensaios de termo-descriminação foram realizados em condição de escuro constante (Shen et al., 2011). Desta forma, os achados de Shen e colaboradores se destacam como uma importante contribuição para o entendimento da geração dos ritmos circadianos, uma vez que a melanopsina, um fotopigmento essencial para o arrastamento dos ritmos circadianos em vertebrados, é capaz de interagir com o TRP de Drosophila e reestabelecer a termossensibilidade nesses animais.
20 A convergência dos componentes das vias de sinalização de opsinas e de canais TRP pode ter resultado de um processo adaptativo considerável, uma vez que essa cascata enzimática confere ao sistema de detecção termossensorial uma capacidade de amplificação de sinal mesmo em pequenas diferenças de temperatura dentro de um intervalo confortável (Minke e Peters, 2011; Fowler e Montell, 2013). A co-evolução dos sistemas de fotorrecepção/termorrecepção pode ser considerada para explicar a interação dos canais TRP e rodopsina, ampliando a lista atual de proteínas sensíveis à temperatura conhecidas, incluindo proteínas classicamente sensíveis à luz como rodopsina e melanopsina.Trabalhos recentes vêm demonstrando esta interação opsina e canais TRP em outros processos, como a resposta de melanócitos humanos à radiação UVA com produção de melanina, atribuindo esse fenômeno à ação conjunta de rodopsina e o canal TRPA1 (Wicks et al., 2011; Bellono et al., 2013).
1.3. Funcionamento da Maquinaria Molecular do Relógio Biológico
A grande maioria do conhecimento a respeito do funcionamento da maquinaria molecular do relógio é originária de estudos realizados em mamíferos nos quais os sinais luminosos captados pela retina são convertidos em impulsos nervosos. O trato retino-hipotalâmico libera o neurotransmissor excitatório glutamato nas células do NSQ e provocando o arrastamento do relógio central, sincronizando a fase do relógio central com a fase dos ciclos claro-escuro ambientais (Ohi et al., 1991; Takeuchi et al., 1991).
O funcionamento do NSQ envolve mecanismos de retroalimentação positiva e negativa (Figura 1). As proteínas dos genes Clock (Circadian Locomotor Output Cycle
Kaput) e Bmal1 (Brain and Muscle Arnt-like protein 1) formam o heterodímero
CLOCK:BMAL1, que atua como fator de transcrição para a expressão dos genes Per1,
21 proteínas PER e CRY formam oligômeros com uma caseína quinase, são fosforilados e transportados do citoplasma para o núcleo, onde bloqueiam a sua própria transcrição ao interagirem com o heterodímero CLOCK/BMAL1 inibindo sua ação como fator de transcrição (Young et al., 2001). O dímero CLOCK:BMAL1 também ativa uma segunda alça de retroalimentação composta pelos genes Rev-erb α/β e Ror α/β. As proteínas ROR α/β e REV-ERB α/β atuam sobre a mesma região, Retinoic acid-related
Orphan receptor Response Element (RORE), do promotor de Bmal1, de forma
competitiva, na qual a primeira inicia a transcrição de Bmal1, e a segunda a inibe (Buhr e Takahashi, 2013). A proteína REV-ERB /β aumenta com a indução da transcrição de CLOCK:BMAL1 e vai para o núcleo, ligando-se ao promotor de Bmal1 e reprimindo sua transcrição (Preitner et al., 2002). Uma alta expressão de REV-ERB α/β é capaz de inibir a ação de ROR α/β (Guillaumond et al., 2005); dessa maneira, quando a proteína REV-ERB está ausente, o gene Bmal1 é novamente transcrito com o auxílio de ROR α/β, podendo formar novamente o fator de transcrição CLOCK:BMAL1, reiniciando um novo ciclo circadiano. Se Clock for removido do sistema, o funcionamento do NSQ permanece rítmico (DeBruyne et al., 2006), pois o gene Npas2 é capaz de assumir a função de Clock (DeBruyne et al., 2007a). Já a remoção de Bmal1 resulta na desregulação da maquinaria do relógio (Bunger et al., 2000; Mieda e Sakurai, 2011).
Assim como os genes Rev-erb α/β e Ror α/β, a enzima caseína quinase 1ε (CK1ε) é um elemento essencial na regulação dos genes de relógio (Figura 1). Ela é responsável pela fosforilação e consequente estabilidade das proteínas PER no citoplasma e sua migração para o núcleo celular, enquanto CRY é fosforilado pela ativação das proteínas quinases AMPK1 e DYRK1A (Dibner et al., 2010; Mohawk et
al., 2012; Brown e Azzi, 2013; Buhr e Takahashi, 2013; Partch et al., 2014). A
22 insuficientes para inibir o heterodímero CLOCK/BMAL1, reiniciando um novo ciclo. Todos esses ciclos anteriormente descritos levam em torno de 24 horas para se completarem, sendo a variação das concentrações dessas diferentes proteínas ao longo do dia a base molecular do relógio biológico.
Após a identificação de genes de relógio em fibroblastos de ratos ficou claro que tecidos periféricos funcionam como osciladores (Balsalobre et al., 1998). Posteriormente, vários estudos comprovaram a presença desses genes em células de tecidos periféricos, o que permite sua sincronização a fatores locais independentemente do relógio central (Zylka et al., 1998; Balsalobre et al., 2000; Yamazaki et al., 2000; Stokkan et al., 2001; Storch et al., 2002).
O heterodímero CLOCK1-BMAL1 atua ainda controlando a transcrição de outros genes, que não aqueles do relógio, mas que também possuem o elemento E-box na sua região promotora, o que torna a sua transcrição dependente dos componentes do relógio biológico. Estes genes são conhecidos como genes controlados pelo relógio
clock-controlled genes (CCGs) e apresentam uma variação rítmica circadiana de seus
transcritos. Dada essa característica, são considerados um dos possíveis mecanismos de eferência do relógio circadiano, pois controlam a produção e/ou liberação de substâncias como hormônios, neurotransmissores, neuropeptídios, moléculas de sinalização intracelular, entre outros, sincronizando todo o organismo ao funcionamento da maquinaria do relógio central (Zanquetta et al., 2010; Mohawk et al., 2012; Hamilton et
23
Figura 1. Representação do relógio molecular de mamíferos. O heterodímero
CLOCK/BMAL1 é um fator de transcrição para genes que possuem uma sequência E-box, como Per e Cry. As proteínas PER e CRY formam oligômeros, que são fosforilados pela caseína quinase 1 (ε e δ) e são transportadas para o interior do núcleo onde bloqueiam a ação de CLOCK/BMAL1. As proteínas PER e CRY são hiperfosforiladas para que sejam degradadas nos proteassomos, iniciando um novo ciclo (Burh e Takahashi, 2013).
Em Danio rerio foram identificados 4 genes period (per1a, per1b, per2 e per3), 6 genes cryptochrome (cry1a, cry1b, cry2a, cry2b, cry3 e cry4), 3 genes clock (clock1a,
clock1b e clock2) e 3 genes bmal (bmal1a, bmal1b, bmal2) (Kobayashi et al., 2000;
Cahill, 2002; Wang, 2008; Vatine et al., 2011). Entretanto, apesar dessa grande diversidade gênica, o funcionamento da maquinaria do relógio encontrada em mamíferos é filogeneticamente antiga, sendo a descrição das alças de retroalimentação
24 descritas para mamíferos válidas para a descrição do funcionamento do relógio molecular em Danio rerio.
De acordo com o modelo proposto por Vatine e colaboradores (Figura 2), o sinal luminoso é captado por um fotopigmento circadiano inserido na membrana (muito provavelmente a melanopsina). A partir disso se inicia a transcrição de TEF (Thyrotroph Embryonic Factor), que se ligará ao elemento D-box de per2 e cry1a, ativando a expressão destes. PER2 e CRY1a iniciam o funcionamento da alça de retroalimentação central, a qual é composta por múltiplas cópias dos genes clock, bmal,
per e cry, resultando em regulação do sistema. Do lado positivo da alça, há a expressão
gênica de clock e bmal e produção de um heterodímero das proteínas resultantes desses respectivos genes. O complexo CLOCK:BMAL liga-se aos elementos E-box dos genes
per e cry controlando a expressão rítmica destes. O heterodímero PER:CRY, quando em
grandes concentrações no citoplasma, retorna ao núcleo e reprime sua própria transcrição através da interação com CLOCK:BMAL, caracterizando a porção negativa da alça. Além das alças positiva e negativa, há ainda a presença de uma alça central estabilizadora que regula a expressão de bmal, agindo através da indução ou repressão dos genes Ror e Rev-erb. Todo esse processo demora cerca de 24 horas, o que caracteriza um ciclo com padrão rítmico circadiano (Vatine et al., 2011).
25
Figura 2. Modelo atual do mecanismo molecular do relógio circadiano de Danio rerio
(Vatine et al., 2011).
1.4. Temperatura e a Maquinaria do Relógio – Relação entre Proteínas de Choque Térmico (HSP, Heat Shock Proteins) e Genes do Relógio
Temperaturas elevadas podem provocar desnaturação, degradação e agregação de proteínas intracelulares que participam de processos críticos, ativando vias que levam à morte celular (Bivik et al., 2007; Chinnathambi et al., 2008). As consequências deletérias do aumento da temperatura são impedidas, em certa medida, por uma resposta adaptativa que assegura a sobrevivência celular na presença de calor (Soti et al., 2005). Esta via de sobrevivência ativada por calor, conhecida como resposta ao choque térmico, é composta por uma cascata de eventos que conduzem à indução de proteínas de choque térmico (HSPs) que minimizam a lesão celular aguda. As HSPs pertencem a
26 uma família multigênica e podem apresentar um peso molecular que varia de 10 a 150 kDa. Outra função atribuída às HSPs é que as mesmas estão diretamente relacionadas com a resistência a apoptose celular encontrada no câncer (Samali e Cotter, 1996; Takayama et al., 2003; Wrzal et al., 2008).
A classificação das subfamílias está de acordo com o peso molecular que cada grupo apresenta: HSP de 100-110 kDa, 90 kDa, 70 kDa, 60 kDa, 40 kDa e a subfamília que apresenta peso molecular de 18-30 kDa (Richter e Buchner, 2001; Sreedhar et. al., 2004). Estas proteínas são encontradas tanto em organismos procariontes como eucariontes e apresentam uma alta homologia em suas sequências nucleotídicas e de aminoácidos. Localizam-se principalmente no citoplasma, tendo como principal função a manutenção da homeostasia celular frente a um desafio por altas temperaturas.
Uma das sub-famílias mais abundantes é a das proteínas de choque térmico de 90 kDa, ou HSP90. Estas proteínas compõem 1 a 2% das proteínas citosólicas totais e sua expressão pode aumentar em até 10% durante eventos de estresse celular (Nollen e Morimoto, 2002). Duas isoformas, HSP90α (HSP90aa) e β (HSP90ab), encontram-se no citosol, com frações muito pequenas no núcleo, diferenciando-se das outras isoformas que geralmente estão associadas a organelas (Sawarkar e Paro, 2013). Estas duas proteínas compreendem cerca de 80% desta subfamília, sendo as mais estudadas pelo fato de modularem a maioria das ações exercidas pelas HSP90 (Lindquist e Craig, 1988; Welch, 1991).
A função mais estudada e conhecida das proteínas HSP90 diz respeito a sua atuação como moduladoras alostéricas de várias proteínas denominadas “clientes de HSP90”, conferindo às HSP90 a função de chaperonas moleculares, proteínas que auxiliam o enovelamento de proteínas e previnem a sua agregação, entre outras importantes funções intracelulares, inclusive o crescimento de células eucariontes. Elas
27 são capazes de interagir com proteínas não-enoveladas, conservando-as em um estado re-enovelável, e mantêm a conformação, estabilidade e função de vasto número de proteínas (Khurana e Bhattacharyya, 2015).Fatores de transcrição (Zou et al.,1998; Xu
et al., 2004), proteínas quinases (Buchner, 1999; Caplan, 1999; Mayer e Bukau, 1999) e
outras proteínas que participam na regulação da transcrição e tradução de sinais, tais como o receptor de hormônios esteroides (Cadepond et al., 1991; Pratt e Toft, 2003) e as sintases de óxido nítrico (Garcia-Cardena et al., 1998; Bender, et al., 1999; Balligand, 2002; Yoshida e Xia, 2003), são reconhecidos como proteínas clientes das HSP90. Outra função das HSP90 é prolongar a vida média de suas proteínas clientes, através da estabilização e prevenção da degradação proteassomal das proteínas às quais elas se unem (Lu et al., 2007).
Resumidamente, em condições de estresse térmico, a indução das HSP90 se inicia com a liberação do fator de resposta a estresse térmico (HSF1), que normalmente se encontra inibido pela associação a HSP90 no citosol. Uma vez liberado, o HSF1 transloca-se para o núcleo onde se une a elementos de resposta a estresse térmico (HSE – Heat Shock Elements), iniciando a ativação da transcrição e o subsequente aumento da expressão das HSP90 (Leach et al., 2012b). Por sua vez, as HSP90 são reguladas por proteínas quinases e/ou fosfatases (Richter e Buchner, 2001; Sud et al., 2007).
Este sistema de resposta ao calor, através do HSF1, pode estar envolvido na regulação do oscilador circadiano central. Camundongos alterados geneticamente que não possuem o HSF1 apresentam um período mais longo em livre curso do que os camundongos do tipo selvagem (Reinke et al., 2008). A inibição farmacológica das vias de sinalização das HSP aumenta o período de neurônios do NSQ e interfere no arrastamento da fase em relógios periféricos de camundongos (Buhr et al., 2010).
28 Em culturas de neurônios da pineal de pintos ou do NSQ de mamíferos, as variações de temperatura do meio alteram a fase do relógio biológico (Barrett e Takahashi, 1997; Ruby et al., 1999). Osciladores periféricos, incluindo fibroblastos, fígado, rim e intestino também são sensíveis às mudanças de temperatura (Abraham et
al., 2010; Buhr et al., 2010).Lahiri e seus colegas descreveram que células da linhagem PAC-2, originárias do teleósteo Danio rerio, quando submetidas a ciclos de 27,5 ºC e 23,5 ºC (12:12) durante 6 dias em DD, apresentaram expressão diminuída dos genes
per4 (também designado de per1b) e cry3, na temperatura mais elevada, enquanto que
em temperatura mais baixa estes genes exibiam um aumento em seus transcritos (Lahiri
et al., 2005).
Uma das possíveis explicações da influência da temperatura no funcionamento da maquinaria do relógio pode residir na relação entre as proteínas BMAL1 e HSP90. Como já mencionado, a proteína BMAL1 possui participação chave no funcionamento da maquinaria molecular do relógio circadiano, onde o seu heterodímero com CLOCK atua como fator de transcrição para a expressão de vários genes do relógio. Em seu trabalho, Schneider e colegas demonstraram que, em fibroblastos de ratos, a inibição da HSP90 reduz significativamente os níveis celulares de BMAL1, tendo consequência direta na maquinaria do relógio, diminuindo a expressão do gene Per2(Schneider et al., 2014).
29 1.5. Canais TRP e Percepção de Temperatura – TermoTRPs
Para entender como a temperatura pode modificar os ritmos biológicos em nível molecular, é fundamental que conheçamos como os organismos podem detectar as variações térmicas no ambiente externo e interno. A capacidade de perceber variações de temperatura é um dos processos sensoriais mais antigos, do ponto de vista evolutivo. Todos os organismos, de bactérias até plantas e animais, possuem mecanismos capazes de detectar as variações térmicas que ocorrem no ambiente e gerar respostas que são cruciais para sua sobrevivência (Vriens et al., 2014). As bases dessa sensação térmica estãoem um grupo de canais altamente conservados – presente em todos os metazoários estudados até o momento e envolvidos em uma série de modalidades sensoriais – os já mencionados canais de potencial receptor transiente (TRP).
No ano de 1969, Cosens e Manning publicaram um trabalho no qual descreviam uma disfunção na cascata de fototransdução em Drosophila (Cosens e Manning, 1969), iniciando a grande jornada de descoberta e caracterização dos canais TRP. Após duas décadas, Montell e Rubin (1989) identificaram os verdadeiros responsáveis por essa disfunção, caracterizando a descoberta do primeiro canal TRP. Até o presente foram identificados mais de 50 canais TRP, que respondem aos mais variados estímulos e que estão presentes em uma ampla variedade de organismos.
Nos mamíferos, foram identificadas seis subfamílias que compõem o grande grupo dos canais TRP: TRPC (TRPC1-7), TRPV (TRPV1-6), TRPM (TRPM1-8), TRPP (TRPP2, TRPP3, TRPP5), TRPML (TRPML1-3) e TRPA (TRPA1).
Sabe-se que a família de canais TRP é distinta de outros grupos de canais iônicos por apresentar uma diversidade de seletividade iônica, modos de ativação e funções. No entanto, todos os seus componentes são compostos por quatro subunidades idênticas, onde cada uma delas consiste de seis domínios transmembrânicos com a
30 formação de um poro para a passagem de cátions presente entre os segmentos 5 e 6 da subunidade (Poletini et al., 2015) (Figura 3).
Figura 3. Estrutura esquemática de um canal TRP (Poletini et al., 2015).
Entre os membros da grande família dos canais TRP, os que respondem a estímulos térmicos foram agrupados em uma subfamília e denominados termoTRPs, os quais apresentam duas características comuns: 1)sua ativação provoca um influxo não seletivo de íons, podendo gerar uma alteração no potencial de repouso da membrana plasmática; 2) embora cada canal termoTRP seja ativado dentro de um intervalo de temperatura relativamente estreito, a gama que todos eles cobrem conjuntamente é muito ampla, partindo do frio nocivo até temperaturas altas que também podem ser nocivas à integridade do organismo (Romanovsky, 2007).
Em mamíferos, a ativação dos termoTRPs é seguida por um influxo de íons que pode gerar um potencial de ação em neurônios sensoriais, caracterizando o início do processo de transdução da termossensação (Dhaka et al., 2006). Além de responder a estímulos térmicos, os termoTRPs também podem ser ativados por estímulos químicos
31 ou físicos, o que os caracteriza como receptores multimodais. Outra característica dessas proteínas é que a sua expressão não está restrita a neurônios sensoriais, podendo estar presente em vários tipos de tecidos (Patapoutian et al., 2003). Os dez termoTRPs identificados em mamíferos são membros de diferentes subfamílias: TRPV (TRPV1-TRPV4), TRPM (TRPM2, TRPM4, TRPM5 e TRPM8), TRPA1 e TRPC5, sendo cada um ativado por diferentes faixas de temperatura (Saito e Tominaga, 2015).
Ao longo dos últimos anos, vários estudos vêm demonstrando que, apesar dos termoTRPs apresentarem estruturas semelhantes em diferentes organismos, eles são espécie-específicos, sendo ativados por diferentes faixas de temperaturas (Figura 4), comprovando que durante o processo evolutivo houve uma diferenciação funcional de um mesmo termoTRP (Gau et al., 2013; Saito et al., 2011; Caterina et al., 1997; Gracheva e Bagriantsev, 2015).
32
Figura 4. Gama de temperaturas de ativação dos canais termoTRPs em diferentes organismos. Apesar de apresentarem a mesma estrutura, muitos canais termoTRPs respondem a
diferentes temperaturas de acordo com a classe de vertebrados à qual pertencem (Poletini et al., 2015).
Análises filogenéticas demonstraram que o teleósteo Danio rerio possui nove termoTRPs codificados em seu DNA, porém alguns deles diferem daqueles presentes nos mamíferos (Saito e Shingai, 2006), fato atribuído a algumas mudanças ocorridas no genoma deste teleósteo. Os termoTRPs presentes em Danio rerio são: TRPV1/2, TRPV4, TRPM2, TRPM4a, TRPM4b, TRPM4c, TRPM5, TRPA1a e o TRPA1b.
33 1.6. Relógios Periféricos: Células ZEM-2S como Modelo de Estudo
Hoje já está bem estabelecido que, em adição ao marcapasso circadiano localizado no sistema nervoso central, há osciladores em tecidos periféricos (Abe et al., 2002). Plautz e Kay (1997) realizaram um estudo muito interessante em Drosophila no qual demonstraram que mesmo fragmentos separados do corpo são capazes de se sincronizar a ciclos claro-escuro. Resultado semelhante foi encontrado no peixe teleósteo Danio rerio, no qual tecidos e órgãos podem ser sincronizados por luz (Whitmore et al., 2000). Experimentos com cultura celular também têm contribuído para o entendimento dos relógios periféricos, os quais nesses modelos podem ser sincronizados por diversos fatores como luz (Whitmore et al., 2000; Pando et al., 2002; Farhat et al., 2009), temperatura (Buhr et al., 2010) e choque de soro (Balsalobre et al., 1998).
Yamazaki e colaboradores (2000) demonstraram que explantes de NSQ apresentavam ritmo constante de expressão de Per1, enquanto explantes derivados do pulmão e fígado rapidamente perdiam suas oscilações, indicando que a via de comunicação do relógio central com os relógios periféricos poderia ser importante para a manutenção dos ritmos periféricos. Dessa forma ficava claro que relógios periféricos distinguiam-se do relógio central em mamíferos, uma vez que a expressão rítmica dos genes do relógio em órgão ou células em cultura persistia somente por poucos dias (Yamasaki et al., 2000).
A perda gradual da oscilação dos relógios periféricos em mamíferos, na ausência de sinais do NSQ, sugeria que o ajuste de fase dos osciladores periféricos fosse diariamente controlado pelo marcapasso central. A partir desses achados acreditava-se que este conceito de controle rítmico do oscilador central sobre os periféricos era baseado em uma relação de subordinação, onde o relógio central possuiria dominância
34 sobre os periféricos (Ripperger e Schibler, 2001; Carr e Whitmore, 2005). No entanto, vários laboratórios demonstraram a independência do oscilador em muitos tecidos (Yamazaki et al., 2000; Abe et al., 2002; Bartell et al., 2004; Yoo et al., 2004; Costa et
al., 2005; Davidson et al., 2005) e hoje esse conceito foi reestruturado levando-se em
consideração uma maior integração dos sistemas periféricos e central para a geração de uma resposta rítmica homeostática.
Experimentos mais recentes, não mais baseados em lesão do NSQ, mas em deleção gênica específica no NSQ, demonstraram que camundongos nocaute para
Bmal1 no marcapasso central apresentaram uma falta de sincronia nos tecidos
periféricos em condições de escuro constante, sendo essa sincronia restabelecida quando esses animais foram submetidos a ciclos claro-escuro, comprovando que tecidos periféricos podem ser arrastados por luz de forma independente da maquinaria do relógio central (Izumo et al., 2014; Husse et al., 2015). Abriu-se, assim, espaço para um novo conceito de organização do sistema circadiano: o modelo federado. Tal modelo contesta a ideia clássica da organização hierarquizada, onde a luz promoveria o ajuste do NSQ e este realizaria o alinhamento temporal nos tecidos periféricos, pois demonstra que o SCN é necessário para sustentar os ritmos em condições de livre curso, mas é dispensável para sustentar ritmos quando o organismo é submetido a ciclos claro-escuro (Husse et al., 2015).
O modelo de estudo escolhido para o nosso trabalho é representado por células embrionárias de blástula de Danio rerio (zebrafish), uma linhagem comercialmente disponível denominada ZEM-2S. Pertencente à família dos Cyprinidae, Danio rerio é um teleósteo, caracterizado principalmente por seu pequeno tamanho medindo, quando adulto, cerca de 4 a 5 cm, e que habita água doce. Apresenta um corpo cilíndrico e um padrão de coloração corporal no qual são facilmente identificáveis listras horizontais
35 que alternam cores escuras e claras (Spence et al., 2008). O zebrafish é um animal euritérmico, capaz de suportar grandes variações térmicas. Em um estudo onde foram coletados exemplares da espécie na natureza, os locais apresentaram uma grande heterogeneidade quanto à temperatura média apresentada, no intervalo entre 16,5 ºC e 38,5 ºC (López-Olmeda e Sánchez-Vázquez, 2011).
A razão para o aumento da atenção para o sistema circadiano de Danio rerio é o seu potencial como modelo de sistema para análise genética dos mecanismos de relógio (Allada et al., 2001; Loros e Dunlap, 2001; Yong e Kay, 2001; Okamura et al., 2002; Stanewsky, 2002), já que linhagens celulares derivadas de embriões deste animal expressam genes do relógio sincronizados por luz (Whitmore et al., 2000; Pando et al., 2001; Farhat et al., 2009). Além disso, suas semelhanças, no que diz respeito à composição e funcionamento da maquinaria molecular dos relógios biológicos, ao de mamíferos, permitiram que fosse adotado como modelo alternativo aos roedores nas investigações acerca da genética dos ritmos biológicos de vertebrados (Cahill, 2002; Vatine et al., 2011).
A capacidade de percepção luminosa dessa linhagem celular foi comprovada por estudo realizado por nosso grupo onde ficou claro que, quando submetidas a ciclos claro-escuro com diferentes durações da fase de luz, as células ZEM-2S exibem diferentes perfis de proliferação, além de uma expressão rítmica de genes de relógio –
clock, per1 e cry1b – quando expostas a ciclo claro-escuro (12:12), comprovando a
capacidade de sincronização desse modelo celular por luz (Farhat et al., 2009).
Em um estudo dedicado à identificação de fotopigmentos em Danio rerio, Davies e colaboradores (2011) caracterizaram cinco genes de melanopsinas (Opn4m-1,
Opn4m-2, Opn4m-3, Opn4x-1 e Opn4x-2). No modelo ZEM-2S, Ramos e colaboradores
36 expressas. Ainda nesse mesmo estudo, os autores demonstraram que, quando mantidas em DD e submetidas a um pulso de luz azul com duração de dez minutos, as células ZEM-2S apresentavam um aumento expressivo na expressão do gene de relógio per2 duas horas após o final do pulso (Ramos et al., 2014).
Gau e colaboradores verificaram que larvas de Danio rerio apresentavam uma resposta locomotora maior quando expostas a temperaturas acima de 32 ºC, preferindo ambientes com temperaturas mais amenas. Quando o gene ortólogo de TRPV1 nesses organismos foi deletado, as larvas perderam a capacidade de termotaxia, levando a crer que o canal TRPV1 é o principal responsável pela detecção da temperatura nessa fase de desenvolvimento (Gau et al., 2013).
Baseando-se nos dados de literatura descritos neste capítulo, propusemo-nos a investigar a influência do pulso de temperatura (33 ºC) na expressão de genes de relógio e de proteínas de choque térmico, bem como o papel do canal TRPV1, em células ZEM-2S submetidas a escuro constante e ciclos claro-escuro (12:12) tendo em vista a relação intrincada destes dois fatores ambientais na sincronização dos relógios circadianos em outros modelos (Lee e Montel, 2013). Portanto, levantamos a seguinte hipótese: as células ZEM-2S percebem calor o que leva ao aumento da expressão de genes do relógio, possivelmente através da ativação de HSP90 e de canais TRPV1.
Objetivos
“Não se deve ir atrás de objetivos fáceis, é preciso buscar o que só pode ser alcançado por meio dos maiores
esforços.”
Albert Einstein
38
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Caracterizar a influência do pulso de temperatura nas células ZEM-2S do teleósteo Danio rerio, em livre curso (DD) ou sincronizadas por ciclo claro-escuro (LD 12:12).
2.2. Objetivos Específicos
- Investigar a presença de genes hsp90 aa1, hsp90 ab1 e de canais termo-TRPs em células ZEM-2S de Danio rerio;
- Avaliar a expressão gênica de hsp90 aa1, hsp90 ab1, per1, per2, cry1a, cry1b,
bmal1a, bmal1b, bmal2 em resposta a pulso de temperatura de 33 °C, em células
ZEM-2S de Danio rerio mantidas em escuro constante (DD) ou ciclo claro-escuro (LD);
- Avaliar o efeito do inibidor de canais TRPV1 na expressão de hsp90 e de genes de relógio alterados no protocolo anterior, em experimentos de pulso de temperatura de 33 °C, em células ZEM-2S de Danio rerio mantidas em DD ou LD.
Material e Métodos
“O método científico é comprovado e verdadeiro. Não é perfeito, é apenas o melhor que temos.
Abandoná-lo, junto com seus protocolos céticos, é o caminho para uma idade das trevas.”
40
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Manutenção de Células Embrionárias ZEM-2S de Danio rerio
Células embrionárias ZEM-2S de Danio rerio (gentilmente cedidas pelo Prof. Mark Rollag, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, MD, EUA e adquiridas originalmente da ATCC, CRL-2147, Manassas, VA, EUA) foram mantidas em frascos de 75 cm2 com meio composto de 50% de L15, 35% de D-MEM, 15% de F12 (Vitrocell, Campinas, SP, Brasil) e 15 mM de HEPES (ThermoFisher, Waltham, MA, EUA), complementado com 10% de soro fetal bovino (SFB, Vitrocell, Campinas, SP, Brasil) e 1% de antibiótico/antimicótico (10.000 U/mL penicilina; 10.000 µg/mL estreptomicina; 25 µg/mL anfotericina B, ThermoFisher, Waltham, MA, EUA), em estufa a 28 °C, em escuro constante.O meio de cultura foi trocado duas vezes por semana e as células foram subcultivadas (1:3) quando atingiam a semi-confluência nos frascos. Para tanto foram removidas com solução de Tyrode/EDTA (NaCl 8,0 g/L; KCl 0,2 g/L; NaHCO3 1,0 g/L; NaH2PO4 0,05 g/L; MgCl2 1,0 g/L; EDTA 1,86 g/L) e
transferidas para novos frascos.
Para que a densidade celular fosse constante em todos os experimentos descritos abaixo, as células ZEM-2S foram destacadas dos frascos de cultura, centrifugadas a 500 x g por 5 min, ressuspendidas em meio de cultura e contadas em câmara de Neubauer. Para calcular o volume necessário de suspensão de células para obtenção da densidade final de 2x106 células por frasco de 25 cm2, empregou-se a fórmula: N x 5 x 103, onde N igual ao número de células contadas, 5 referente ao fator de diluição da alíquota de 200 µL e 103 equivalente a suspensão final de 1 mL preparada para a contagem. Adicionado
41 o volume calculado da suspensão de células em cada frasco de 25 cm2, acrescentou-se meio de cultura para completar o volume final para 4 mL.
3.2. Protocolos Experimentais
I – Pulso de temperatura de 33 °C em escuro constante (DD)
Células ZEM-2S foram semeadas (2x106 células/25 cm2) e mantidas por 6 dias em estufa a 28 °C, em DD, em meio como descrito acima, mas contendo retinaldeído 10-7 M e com SFB reduzido para 2%, sem nenhum tipo de manipulação ou troca de meio. No início do 7° dia, foi aplicado um pulso de temperatura de 33 °C, durante 1 hora, com extração temporal de RNA total 1, 2 e 4 horas após o final do estímulo (Figura 5).
Figura 5. Esquema do protocolo experimental do pulso de temperatura de 33 °C (duração de uma hora) em células mantidas em DD.
II – Pulso de temperatura de 33 °C em ciclo claro-escuro (LD)
Células ZEM-2S foram semeadas (2x106 células/25 cm2) e mantidas em 12:12 LD (fotofase com luz branca, com espectro de emissão de 420 a 750 nm, intensidade de 95,18 mW/cm2 , 650 lux) em estufa a 28 °C, em meio idêntico ao do protocolo I por 6 dias, sem nenhum tipo de manipulação ou troca de meio. No início do 7° dia, fase clara,
42 foi aplicado um pulso de temperatura de 33 °C durante 1 hora, com extração temporal de RNA total 1, 2 e 4 horas após o final do estímulo (Figura 6).
Figura 6. Esquema do protocolo experimental do pulso de temperatura de 33 °C (duração de 1 hora) em células mantidas em LD.
III – Pulso de temperatura de 33 °C em DD, com adição do inibidor seletivo de canais
TRPV1
Para experimentos com o inibidor N-(4-tertiarybutylphenyl)-4-(3-chloropyridin-2-yl) tetrahydropyrazine-1(2H)-carbox-amide (BCTC) (Abcam Biochemicals®, Cambridge, MA, EUA), a solução estoque foi preparada em DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), e as diluições intermediárias em H2O livre de
RNAse/DNAse estéril. O BCTC é um potente inibidor do canal TRPV1, sendo que a concentração deste fármaco utilizada nos experimentos, 4 x 10-8 M, foi baseada no valor de IC50 recomendado pelo fabricante para mamíferos, com posterior verificação
da sobrevivência celular em diferentes concentrações, através de testes realizados por nós em período nunca inferior a 24 horas. Devido ao fato que a dissolução deste fármaco requer DMSO, expusemos as células controle à mesma concentração final de DMSO presente no meio das células tratadas com inibidor.
Células ZEM-2S foram semeadas (2x106 células/25 cm2) e mantidas em estufa a 28 °C, em DD, em meio como descrito nos protocolos anteriores por 6 dias, sem
43 nenhum tipo de manipulação ou troca de meio. No início do 7° dia, foi aplicado um pulso de temperatura de 33 °C durante 1 hora, sendo o BCTC aplicado 30 min antes do início do pulso em concentração final de 4 x 10-8 M, permanecendo no meio durante toda a duração do experimento. Extração de RNA total foi feita 1 hora após o final do estímulo (Figura 7), ponto onde foi encontrada a maior resposta de expressão de genes do relógio e de hsp90 em DD.
Figura 7. Esquema do protocolo experimental do pulso de temperatura de 33 °C (duração de 1 hora) em células mantidas em DD, na presença de BCTC.
IV – Pulso de temperatura de 33 °C em LD, com adição do inibidor seletivo de canais
TRPV1 (BCTC)
Células ZEM-2S foram semeadas (2x106 células/25 cm2) e mantidas em 12:12 LD (fotofase com luz branca, com espectro de emissão de 420 a 750 nm, intensidade de 95,18 mW/cm2, 650 lux ) em estufa a 28 °C, em meio idêntico ao utilizado nos protocolos anteriores por 6 dias, sem nenhum tipo de manipulação ou troca de meio. No início do 7° dia, fase clara, foi aplicado um pulso de temperatura de 33 °C durante 1 hora, sendo o BCTC aplicado 30 min antes do início do pulso, na concentração final de 4 x 10-8 M, permanecendo no meio até o final do experimento. A extração de RNA total
44 foi 2 horas após o final do estímulo (Figura 8), ponto no qual foi encontrada a maior respostas de expressão de per2 em LD.
Figura 8. Esquema do protocolo experimental do pulso de temperatura de 33 °C (duração de 1 hora), em células mantidas em LD, na presença de BCTC.
3.3. Extração de RNA Total
Após o descarte do meio, foi adicionado 1 mL de Tri-Reagent-LS (Ambion, Foster City, CA, EUA) diretamente sobre as células. O lisado celular foi coletado e incubado por 5 min à temperatura ambiente, para permitir a completa dissociação das proteínas nucleares. Adicionaram-se 200 µL de bromo-cloro-propano (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e, em seguida, as amostras foram agitadas vigorosamente por 15 seg. Após incubação por 10 min à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 12.000 x g por 15 min a 4 °C, separando-se em seguida a fase superior aquosa, que contém RNA. O RNA foi precipitado com a adição de 650 µL de isopropanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) por 10 min à temperatura ambiente, seguido de centrifugação a 12.000 x g por 35 min a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o RNA lavado com 1,3 mL de etanol 75%. O RNA foi recuperado por centrifugação a 12.000 x g por 15 min a 4 °C, e a lavagem com etanol repetida, sendo as amostras
45 colocadas a -80 °C por, no mínimo, 1 h. Após nova centrifugação, o etanol foi descartado e o precipitado de RNA evaporado à temperatura ambiente, ressuspendido em 20 µL de H2O/DEPC (Ambion, Foster City, CA, EUA) e tratado com DNase I
conforme instruções do fabricante (turbo-DNA-freeTM, Ambion, Foster City, CA, EUA). Resumidamente, adicionou-se a cada amostra, 10% do volume de 10x Turbo DNase
Buffer, 1 µL de Turbo DNAse, seguindo-se incubação de 30 min, a 37 °C. Logo após,
foram acrescentados 3 µL ou 10% do volume do reagente de inativação de DNase, seguindo-se incubação de 2 min em temperatura ambiente, período durante o qual as amostras foram agitadas 2 a 3 vezes. Após centrifugação a 10.000 x g por 2 min, o sobrenadante contendo o RNA (20 µL) foi transferido para um novo eppendorf.
3.4. Reação de Transcriptase Reversa - RT-PCR
A concentração de RNA foi determinada por leitura da absorbância a 260 nm em espectrofotômetro (Nanodrop, Wilmington, DE, EUA) e o RT-PCR realizado com 1 µg de RNA total, utilizando 1 µL de oligonucleotídeos randômicos (50 µg/uL) e 1 µL de dNTPs 10 mM (ThermoFisher, Waltham, CA, EUA), em reação com volume final de 13 µL ajustado com H2O/DEPC. As amostras foram aquecidas por 5 min a 65 °C e, a
seguir, transferidas para cuba com gelo, adicionando-se 4 µL de tampão para PCR (5x), 1 µL de DTT (0,1 M), 1 µL de inibidor de ribonuclease (40 U/µL) e 1 µL da enzima
Superscript III (200 U/µL, ThermoFisher, Waltham, CA, EUA), para um volume final
de 20 µL. A mistura foi homogeneizada e, após breve centrifugação, incubada por 5 min a 25 oC, e em seguida por 50 min a 50 oC. A reação foi interrompida por incubação a 70
o
C por 15 min. O cDNA sintetizado foi utilizado nas reações subsequentes de PCR quantitativo.
46 3.5. PCR Quantitativo
Para os ensaios multiplex de PCR quantitativo simultâneo para até 4 genes (Taqman), foram preparadas soluções contendo os primers e sondas para per1b, cry1b e RNA ribossômico 18S (RNA 18S) ou para per2, cry1a e RNA 18S (Tabela 1), Supermix 2X (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA ou ThermoFisher, Waltham, CA, EUA) suplementado para 400 µM de dNTPS, 6 mM de MgCl2 e 0,1 U/µL de Platinum Taq
DNA polimerase (ThermoFisher, Waltham, CA, EUA). Esta solução foi aliquotada (87 µL, sendo cada alíquota suficiente para 3 poços) em tubos, e o cDNA de cada amostra adicionado (3 uL/alíquota). As soluções já com cDNA foram então distribuídas nos poços da placa de experimento (28 µL/poço). Controles negativos sem cDNA foram incluídos rotineiramente. As concentrações finais dos primers foram de 300 nM para os genes de interesse e 200 nM para RNA 18S; para os probes, utilizou-se 200 nM para os genes de interesse e 50 nM para RNA 18S.
Para as reações de PCR quantitativo pela tecnologia SYBR® GreenER™ para os
genes hsp90 aa1, hsp90 ab1, bmal1a, bmal1b, bmal2, trpA1a, trpA1b, trpV1/2, trpV4,
trpM2, trpM4a, trpMb/c, trpM5, trpC6 e RNA 18S, foram preparadas soluções
contendo os primers (Tabela 1), Kapa SYBR® Fast qPCR Master Mix 2X (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, EUA) e H2O DNaseRNase-free (ThermoFisher,
Waltham, CA, EUA), obtendo-se uma concentração final de 300 nM para os primers de genes de interesse e 50 nM para os primers do RNA 18S em soluções independentes. Cada solução foi aliquotada (44 μL, sendo cada alíquota suficiente para 2 poços) em tubos e o cDNA de cada amostra adicionado (2 µL/alíquota). As soluções já com cDNA foram então distribuídas nos poços da placa experimental (20 µL/poço).
Todos os ensaios, tanto com a metodologia SYBR® GreenER™ como com a
47 CA, EUA) nas seguintes condições: SYBR® GreenER™ - 10 min a 95 oC, seguido por 45 ciclos de 15 seg a 95 oC, 1 min a 60 oC e 80 ciclos de 10 seg a 55 oC, com aumento gradual de 0,5 oC; TaqMan® – 7 min a 95 oC, seguido por 45 ciclos de 30 seg a 95 oC e 30 seg a 55 oC.
O par de primers e a sonda específicos para cada gene (Tabela 1) foram desenhados usando o programa Primer Express (ThermoFisher, Waltham, CA,EUA) ou
Primer Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome), baseados nas sequências obtidas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank), e sintetizados por IDT (Coralville, IO, EUA ou ThermoFisher, Waltham, CA, EUA). Os primers cruzaram íntrons sempre que estes estivessem presentes no gene. Foi utilizado como normalizador (house-keeping gene) dos experimentos RNA ribossômico 18S conforme amplamente utilizado na literatura (Goidin et al., 2001; Schmid et al., 2003; Aerts et al., 2004; Zhu et al., 2005; Mccurley e Callard, 2008).
Tabela 1. Sequências e concentrações de primers e sondas para os ensaios de PCR quantitativo
Templates Sequências Seletividade Concentração Final RNA 18S (X03205.1) For: 5˗ CGGCTACCACATCCAAGGAA ˗ 3′ Todos os vertebrados 50 nM Rev: 5′˗ GCTGGAATTACCGCGGCT ˗ 3′ 50 nM Probe:5′˗ /5TexRd/TGCTGGCACCAGACTTG CCCTC/3BHQ_2/˗3′ 50 nM per1 (AY597250 ou M_212439.2) For: 5′˗ AGCTCAAACTCTCACAGCCCTT ˗ 3′ Danio rerio 300 nM Rev: 5′˗ TCAGAGCTGGCACTCAACAGA ˗3′ 300 nM Probe:5′˗ /5Cy5/TCCACCCAGCAGTTCTCTG GCATACA/3BHQ_2/˗3′ 200 nM
48 cry1b (NM_131790.4) For: 5′˗ CGTCTCTGGAGGAGCTCGG ˗ 3′ Danio rerio 300 nM Rev: 5′˗ TCTCCCCCGGGCCAC ˗ 3′ 300 nM Probe:5′˗ /5HEX/TTTGAAACAGAGGGACTG TCCACTGCTG/3BHQ_1/˗3′ 200 nM per2 (ENSDARG000000 34503) For: 5′˗ GTGGAGAAAGCGGGCAGC ˗ 3′ Danio rerio 300 nM Rev: 5′˗ GCTCTTGTTGCTGCTTTCAGTTCT ˗ 3′ 300 nM Probe:5' /6FAM/ATGGGTTCAGGATCAAAC CGCTGT/3BHQ_1/3' 200 nM cry1a (ENSDAR00000045 768) For: 5′˗ CTACAGGAAGGTCAAAAAGAAC AGC ˗ 3′ Danio rerio 300 nM Rev: 5′˗ CTCCTCGAACACCTTCATGCC ˗ 3′ 300 nM Probe:5′˗ /5HEX/AAAGCGTGGGTTGTTTGT AGCAGC/3BHQ_1/˗3′ 200 nM hsp90 aa1 (NM_131328.1) For: 5'- CTCTTCACCGAACTGGCAGA - 3' Danio rerio 300 nM Rev: 5'- CCTCCAGACCAGCTTTACGG - 3' 300 nM hsp90 ab1 (NM_131310.3) For: 5'- ATCGTGACCAGCACTTACGG - 3' Danio rerio 300 nM Rev: 5'- GGGGGAATGTCTTCAGGAGC - 3' 300 nM bmal1a (NM_131577.1) For: 5'- GGATCTGGCCACAGGTGAAA – 3‟ Danio rerio 300 nM Rev: 5‟ – TTTTATCCGGCCCTGCTGTT – 3‟ 300 nM bmal1b (BC134895.1) For: 5'- CGTGTCAGAAAGCCTCAGGA - 3' Danio rerio 300 nM Rev: 5'- CTGTGTGAGCTGTGAGCTTG - 3' 300 nM bmal2 (BC128806.1) For: 5'- AAGCAGCTATGGCGGTCATT – 3 Danio rerio 300 nM Rev: 5'- ATGCCAACGGGGTAGAAGTG - 3' 300 nM trpA1a (AY677196.1) For: 5'- GAGTGTACGAGAGCTGCTTAAT - 3' Danio rerio 300 nM
