Universidade Federal do Tocantins Campus de Gurupi
Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal
ALTHIÉRIS DE SOUZA SARAIVA
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE TIAMETOXAM, CIPROCONAZOL E PARAQUAT EM INVERTEBRADOS AQUÁTICOS
GURUPI- TO 2016
Universidade Federal do Tocantins Campus de Gurupi
Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal
ALTHIÉRIS DE SOUZA SARAIVA
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE TIAMETOXAM, CIPROCONAZOL E PARAQUAT EM INVERTEBRADOS AQUÁTICOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Produção Vegetal. Orientador: Prof. Dr. Renato de Almeida Sarmento
Co-orientador: Prof. Dr. Amadeu Mortágua Velho da Maia Soares
GURUPI- TO 2016
DEDICATÓRIA
A minha amada família: minha mãe Irene Saraiva, meu pai Aroldo José, minhas irmãs Thamiris Saraiva e Suhéllen Saraiva, e minha esposa Diana Cléssia, pelo amor incondicional e motivação constante.
Em memória de Francisca Ana de Souza (Avó paterna), Ranulfo Carlos Saraiva (Avô materno) e Petrina Francisca Saraiva (Avó materna), pelo que hoje sou.
A Escola Municipal Teodomiro Corrêa situada na cidade de São João das Missões – MG, pela contribuição de cada professor em minha formação inicial, e pelo empenho em formar pessoas de bem. Em particular, a minha primeira e eterna professora, Irene Saraiva, pelo esforço sem medidas para que a minha formação profissional fosse possível.
DEDICO.
“Eu posso ir muito além de onde estou, vou nas asas do Senhor, pois o Seu amor é o que me conduz. ”
AGRADECIMENTOS
A Deus sou muito grato pelas conquistas concedidas a mim.
Aos meus amados pais Aroldo José e Irene Saraiva pelos ensinamentos, suporte, amor, carinho e incentivo. Obrigado pela educação base e apoio constante na minha formação profissional. No dia 01 de Janeiro de 2003, com apenas 13 anos de idade os deixei, e fui em busca da qualificação profissional. Já ultrapassam os 13 anos e agora completam-se 5 formações profissionais (Técnico em Agricultura – 2004/1, Técnico em Sistemas de Informação – 2005/2, Engenheiro Agrônomo – 2010/2, Mestre em Produção Vegetal – 2012/2, e Doutor em Produção Vegetal 2016/2). Sei que onde eu estiver, vocês intercedem por mim. Sou muito grato pelo que hoje sou. Amo vocês!
À minhas amadas irmãs Thamiris Saraiva e Suhéllen Saraiva pelo amor, carinho e incentivo. Nossa convivência tem sido pouca, pois quando sai de casa vocês estavam prestes a completarem 5 e 3 anos, respectivamente, e durante esses últimos 13 anos temos nos visto apenas em momentos de férias. Vocês cresceram e assim como eu, com o apoio dos nossos pais, também estão vencendo. Amo vocês!
À minha amada esposa Diana Cléssia pelo amor, carinho, incentivo e companheirismo. Àquela que em momentos tristes me motiva e que em momentos felizes sorri comigo. Já são 6 anos de muito amor e carinho. Obrigado por compartilhar comigo a felicidade de mais uma conquista. Que possamos, com as bênçãos de Deus, vivenciar muitos momentos de vitórias. Te amo pelo que és e por me fazer tão feliz.
Aos meus amados tios e tias pelo apoio e palavras de incentivo. De maneira especial agradeço a tio Dimas Santana e madrinha “Loide” pelo muito que têm feito por minha família.
Aos meus primos e primas pelas palavras de apoio. Em especial agradeço ao Dr. Gilson Dourado pelo apoio e incentivo em minhas primeiras formações profissionais pelo CEFET URUTAÍ – GO, atual IFGoiano.
Aos meus sogros (André Luís e Maria Divina) e cunhado (a) (Anderson Peixoto e Amanda Peixoto) pela convivência, carinho e incentivo.
À madrinha Edna e família pelo apoio, convivência e incentivo, serei eternamente grato. Aos meus amigos (as), obrigado pelas palavras de apoio.
Aos colegas do grupo de oração Kairós (Gurupi) pela experiência de vivenciar sempre a palavra de Deus.
Ao grupo de pesquisa em Ecologia Funcional e Aplicada – UFT pela partilha de conhecimento e oportunidade de aprendizagem. De maneira especial agradeço a amiga Ana Maria Córdova Lopez pela convivência e aprendizado mútuo e ao Prof. Dr. Renato Sarmento pelo apoio, ensinamentos, convivência e oportunidade de internacionalização.
Ao Grupo de Pesquisa ApplEE (Applied Ecology and Ecotoxicology R&D group) – Universidade de Aveiro, pela oportunidade de aprendizagem e crescimento profissional. Em especial agradeço a Andréia Rodrigues, Diana Campos e Fátima Simão pelo apoio constante. Agradeço ainda ao Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro, nas pessoas do Prof. Dr. Amadeu Soares e Dr. João Pestana. Meus sinceros agradecimentos pelos ensinamentos e orientação.
Ao Dr. Eduardo Erasmo pela amizade, conselhos, apoio e incentivo inicial no desenvolvimento do perfil científico e acadêmico.
Ao Amigo Dr. José Iran (In memorian) pelas conversas simples. A sua simplicidade muito me motivou e tenho sua memória como exemplo de humildade.
À Universidade Federal do Tocantins e seu corpo docente por terem contribuído na minha formação de Engenheiro Agrônomo (2010/2), Mestre em Produção Vegetal (2012/2) e Doutorado em Produção Vegetal (2016/2).
A Dona Tereza, uma pessoa especial, que em conversas simples muito me motivou.
Ao Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins, em nome do Professor Dr. Rodrigo Fidelis (coordenador) e Erika Borba (Secretária).
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa concedida.
RESUMO GERAL
O Estado do Tocantins está se tornando um dos principais polos de cultivo agrícola do Brasil e a disponibilidade de recursos hídricos têm fortalecido a produção agrícola no Estado. As áreas de monocultura estendem-se principalmente ao longo da bacia hidrográfica Araguaia e Tocantins, sendo estes os dois principais sistemas de drenagem. Para obtenção de elevadas produtividades, os cultivos agrícolas são altamente dependentes do uso de pesticidas. Adicionalmente, os pesticidas agrícolas podem chegar aos ecossistemas aquáticos através da lixiviação e deriva após a aplicação e também através da adsorção a materiais biológicos e às partículas de argila do solo que são carregados para sistemas aquáticos pelos processos de erosão. Consequentemente, o ecossistema aquático pode ser afetado, devido ao efeito tóxico destes pesticidas para espécies aquáticas de diferentes níveis tróficos. Como resultado de uma pesquisa de campo em várias áreas de cultivo no Estado do Tocantins, verificou-se que o inseticida tiametoxam (TMX), o fungicida ciproconazol (CPZ) e o herbicida Paraquat (PQ) estão entre os principais pesticidas utilizados em diversas culturas e em diferentes áreas de cultivo. O objetivo deste estudo foi avaliar a toxicidade de TMX, CPZ e PQ para invertebrados de água doce, de modo a contribuir para análise de risco ecológico de pesticidas agrícolas no ecossistema da bacia hidrográfica Araguaia-Tocantins. Como a informação sobre a toxicidade letal e sub-letal de diferentes compostos, particularmente para espécies aquáticas ecologicamente relevantes, é crucial para a avaliação dos riscos de pesticidas em ecossistemas aquáticos, foram realizados ensaios ecotoxicológicos, utilizando ensaios laboratoriais com dois invertebrados de água doce, o díptero Chironomus riparius e a planária Dugesia tigrina. Estudos preliminares revelaram que TMX não é tóxico para D. tigrina em concentrações ambientalmente relevantes, logo a toxicidade deste pesticida foi avaliada apenas sobre C.
riparius (sobrevivência, crescimento, emergência e avaliação de respostas bioquímicas). Na
avaliação da toxicidade de CPZ, os parâmetros avaliados em C. riparius incluem sobrevivência, crescimento e emergência, enquanto que em D. tigrina foram avaliados sobrevivência, regeneração e respostas comportamentais (locomoção e alimentação). Para avaliação da toxicidade de PQ, ensaios crônicos foram conduzidos com C. riparius (avaliação de crescimento, emergência e peso de mosquitos adultos) e D. tigrina (avaliação de regeneração, locomoção e alimentação). Os resultados evidenciaram que TMX é altamente tóxico para C. riparius, uma vez que concentrações ambientalmente relevantes afetam não só o desenvolvimento do organismo, mas também a sobrevivência. O fungicida CPZ é moderadamente tóxico para C. riparius (atraso no tempo à emergência) e D. tigrina (decréscimo da atividade locomotora, atividade alimentar e capacidade de regeneração). O herbicida PQ também provocou atraso no tempo à emergência, além de diminuição do tamanho dos adultos de C. riparius, bem como redução na atividade locomotora, atividade alimentar e capacidade de regeneração de D. tigrina. Este estudo acrescenta dados ecotoxicológicos sobre os efeitos de TMX, CPZ e PQ sobre invertebrados de água doce e sugere que, em longo prazo, estes pesticidas podem potencialmente perturbar cadeias alimentares e estrutura da comunidade nos ecossistemas de água doce. A aplicação destes pesticidas em particular na bacia hidrográfica Araguaia-Tocantins deve ser cuidadosamente monitorada nas áreas agrícolas de modo evitar impactos sobre os ecossistemas aquáticos.
GENERAL ABSTRACT
Toxicity assessment of thiamethoxam, cyproconazole and paraquat in aquatic invertebrates The State of Tocantins is becoming one of the main agricultural centers in Brazil, and the availability of water resources have strengthened agricultural production in the state. Monoculture areas extend mainly along the Araguaia and Tocantins watersheds, which are the two main drainage systems. To achieve high productivity, agricultural crops are highly dependent of pesticide use. As such, agricultural pesticides may reach the aquatic ecosystems through leaching and drift after application, also through the adsorption to biological materials and soil clay particles that are carried to aquatic system by erosion. Consequently, the aquatic ecosystem may be affected due to the toxic effect of these pesticides to aquatic species of different trophic levels. As a result of a field survey of several areas of cultivation in the State of Tocantins, it was found that the insecticide thiamethoxam (TMX), the fungicide cyproconazole (CPZ) and the herbicide paraquat (PQ) are the main pesticides used in many crops, in different areas of cultivation. The aim of this study was to evaluate the toxicity of TMX, CPZ and PQ for freshwater invertebrates, in order to contribute to ecological risk assessment of agricultural pesticides in the ecosystem of the Araguaia-Tocantins watershed. Since information on the lethal and sub-lethal toxicity of the different compounds, particularly for ecologically relevant aquatic species, is crucial for risk assessment of pesticide in aquatic ecosystems, ecotoxicological tests were carried using laboratory tests with two freshwater invertebrates, the dipteran Chironomus riparius and the planarian Dugesia tigrina. Preliminary studies revealed that environmentally relevant concentrations of TMX is did not induced toxicity to D. tigrina and thus, effects of this insecticide were evaluated only using C.
riparius (survival, growth, emergence and evaluation of biochemical responses). In the
evaluation of CPZ toxicity, the endpoints evaluated in C. riparius included survival, growth and emergence, while in D. tigrina effects were evaluated in terms of survival, regeneration and behavioral responses (locomotion and feeding). For the assessment of PQ toxicity, chronic tests were conducted with C. riparius (growth, emergence and adult weight) and D.
tigrina (regeneration, locomotion, and feeding). Our results showed that TMX is highly toxic
to C. riparius, since environmentally relevant concentrations affects not only the development rates, but also survival. The CPZ fungicide is moderately toxic to C. riparius (delayed emergence time) and D. tigrina (decreased locomotor activity, feeding activity and delayed regeneration). The herbicide PQ also caused a delay in emergence time and decrease in body weight of C. riparius imagos, as well as reduction in locomotor activity, feeding activity and regeneration of D. tigrina. This study adds ecotoxicological data on the effects of TMX, CPZ and PQ to freshwater invertebrates and suggests that in the long term, these pesticides can potentially disrupt food chains and community structure in freshwater ecosystems. The application of these pesticides namely in the Araguaia-Tocantins watershed should thus be closely monitored in agricultural areas in order to avoid impacts on aquatic ecosystems.
ÍNDICE CAPÍTULO I
1 INTRODUÇÃO GERAL ... 15
1.1 Uma Agricultura Dependente de Pesticidas ... 15
1.2 Efeitos de Pesticidas Agrícolas Sobre Ecossistemas de Água Doce ... 16
1.3 O Estado do Tocantins Como Componente da Nova Fronteira Agrícola Brasileira ... 17
1.3.1 Principais pesticidas agrícolas utilizados nas lavouras tocantinenses ... 18
1.3.1.1 tiametoxam ... 20 1.3.1.2 ciproconazol... 21 1.3.1.3 paraquat ... 21 1.4 Organismos Teste ... 22 1.5 Objetivo do Estudo...23 CAPÍTULO II Assessment of thiamethoxam toxicity on Chironomus riparius ... 25
1 Introduction ... 26
2 Material and Methods ... 27
2.1. Thiamethoxam ... 27
2.2. Chironomus riparius culture conditions ... 27
2.2.1. Survival test ... 27
2.2.2. Partial life-cycle test ... 28
2.3 Short exposure for biochemical responses assessment... 28
2.3.1 Acetylcholinesterase activity ... 29
2.3.2 Catalase activity ... 29
2.3.3 Glutathione-S-transferase activity ... 29
2.3.4 Lipid peroxidation ... 29
2.3.5 Electron transport system activity ... 30
2.3.6 Protein quantification ... 30 2.4 Chemical Analysis ... 30 2.5 Statistical Analysis ... 31 3 Results ... 31 3.1 TMX concentrations in water ... 31 3.2 Acute test ... 32 3.3 Chronic assay ... 32 3.4 Biochemical responses ... 34
4 Discussion ... 34
5 References ... 37
CAPÍTULO III Lethal and sub-lethal effects of cyproconazole on Chironomus riparius and Dugesia tigrina ... 43
1 Introduction ... 44
2 Material and Methods ... 45
2.1 Test Organisms ... 45 2.1.1 Chironomids ... 45 2.1.2 Planarians ... 45 2.2 Chemical compound ... 45 2.2.1 Chemical analysis ... 46 2.3 Bioassays ... 46
2.3.1 C. riparius lethal effect assessment ... 46
2.3.2 C. riparius sub-lethal effects assessment ... 47
2.3.3 D. tigrina lethal effect assessment ... 47
2.3.4 D. tigrina sub-lethal effect assessment ... 47
2.3.4.1 locomotion ... 47
2.3.4.2 head regeneration ... 48
2.3.4.3 feeding activity ... 48
2.4 Statistical Analysis ... 48
3 Results ... 49
3.1 Lethal effects of CPZ to chironomids and planarians ... 49
3.2 Sub-lethal effect of CPZ to C. riparius ... 49
3.3 Sub-lethal effects of CPZ to D. tigrina ... 50
4 Discussion ... 52
5 References ... 54
CAPÍTULO IV Effects of paraquat on freshwater invertebrates: a study with Chironomus riparius and Dugesia tigrina ... 59
1 Introduction ... 60
2 Material and Methods ... 61
2.1 Maintenance of test organisms ... 61
2.3 Sub-lethal assessment ... 62 2.3.1 Chironomids ... 62 2.3.2 Planarians ... 62 2.4 Statistical analysis ... 63 3 Results ... 63 3.1 Chironomids ... 63 3.2 Planarians ... 65 4 Discussion ... 66 5 References ... 69 CAPÍTULO V CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 72 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 77 ANEXOS ... 85
LISTA DE TABELAS Capítulo I
Tabela 1: Propriedades fisico-químicas de TMX, CPZ e PQ...18
Capítulo II
Table 1. TMX concentrations measured in overlying water (µg/L) after ten days in chronic exposure and after 48 h in short exposure for biochemical analyses (mean ± SD)…………..31 Table 2. Effects of short-term (48 h) exposure to sub-lethal concentrations of TMX on the biochemical endpoints in C. riparius (4th instar larvae). All values are presented as mean ±
SD………..33
Capítulo III
Table 1. EmT50 C. riparius midge after exposure to PQ treatments...64
Tabelas em Anexo
Anexo 2: Principais pesticidas agrícolas aplicados nas culturas de arroz, soja, feijão, melancia, milho e cana de açúcar no estado do Tocantins...86 Anexo 3: Toxicidade aguda e crônica de neonicotinóides em Chironomus riparius...90
LISTA DE FIGURAS
Capítulo I
Figura 1: Sistema hidrográfico do estado do Tocantins...17
Capítulo II
Fig. 1 TMX exposure on growth rate of C. riparius (mm/day; mean ± SE); endpoint assessed after 10 days of exposure. *denote significant differences compared to the control treatment (p < 0.01, Dunnett's test)……….……..32 Fig. 2 Effects of 28-days TMX exposure on cumulative emergence of C. riparius. *denote significant differences compared to the control treatment (p < 0.01, Dunnett's test)…….…..32
Capítulo III
Fig. 1 Effects of CPZ exposure on C. riparius. a) Growth rate of C. riparius larvae (mm/day; mean ± SE); b) Cumulative emergence of C. riparius. Percentage emergence was derived by dividing the number of adult midges by the number of introduced larvae, endpoint assessed after 28 days of exposure; c) Mean emergence time of C. riparius (EmT50 in days, upper and
lower limits). *EmT50 value significantly different from control value (p < 0.05, Sprague and
Fogels)………...49 Fig. 2 a) Locomotor velocity (cm/min) by D. tigrina after 8 days exposure to sub-lethal CPZ concentrations. Data are presented as mean ± SEM, n = 20. *Denotes a significant difference compared to the control treatment (p < 0.05, Dunnett’s test). b) Total distance covered (cm) of
D. tigrina in the light and dark phase after 8 days exposure to sub-lethal CPZ
concentrations……….…..50 Fig. 3 a) Effects of sub-lethal CPZ concentrations on regeneration of D. tigrina, measured as days until photoreceptor formation to sub-lethal CPZ concentrations (16 days total exposure). Data are presented as mean ± SEM, n = 20. *Denotes a significant difference compared to the control treatment (p < 0.001, Kruskal-Wallis test); b) Feeding activity of D. tigrina, as number of chironomid larvae ingested over 3h, after 8 days exposure to sub-lethal CPZ concentrations. Data are presented as mean ± SEM, n = 10. *Denotes a significant difference
compared to the control treatment (p < 0.05, Dunnett’s test)………...………50
Capítulo IV
Fig. 1 Sub-lethal effects of PQ exposure on C. riparius. a) Growth rate of C. riparius larvae (mm; mean ± SE). Endpoint assessed after 10 days of exposure; b) Cumulative percentage of
C. riparius emergence. Percentage emergence was derived by dividing the number of adult
midges by the number of introduced larvae; c) Adult body weight for males and females (mg; mean ± SE).Endpoints c) and d)wereassessed after 28 days of exposure *denote significant differences (p < 0.01) compared to the control treatment (Dunnett's test)………...63 Fig. 2 Chronic effects of PQ on D. tigrina. a) Total distance covered (cm) in the light and dark phase after 8 days exposure; b) Locomotor velocity (cm/min) after 8 days exposure. c) Regeneration, measured as days until photoreceptor (16 days total exposure); d) Feeding activity, as number of chironomid larvae ingested over 3h, after 8 days exposure. Data are presented as mean ± SEM, n = 12. *Denotes a significant difference compared to the control treatment (Dunnett’s test, p < 0.01 or Kruskal-Wallis test, p < 0.001 for regeneration)……..65
_______________________________________________________________CAPÍTULO I
1 INTRODUÇÃO GERAL
A agricultura é considerada um dos principais setores que contribuem para a manutenção da economia mundial. O Brasil ocupa posição de destaque no ranking da produção e exportação de produtos agroalimentares (PEREIRA et al., 2012). As extensas áreas propícias ao cultivo agrícola, abastecimento de água doce em abundância, além dos sistemas de pesquisa e inovação tecnológica, fatores que contribuem com o amplo desenvolvimento da agricultura no país (EMBRAPA, 2014).
O setor agrícola brasileiro cresceu significativamente nas últimas duas décadas, ao mesmo tempo em que, em nível mundial, a demanda por produtos agrícolas tem aumentado devido ao crescimento populacional, urbanização da população e aumento da renda per capita (OECD-FAO, 2015). Além do abastecimento interno, a produção agrícola brasileira abastece diversos países, sendo a soja o principal produto agrícola de exportação atualmente (CONAB, 2016).
Segundo a Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura – FAO, a produção agrícola necessária para satisfazer a demanda mundial de alimentos, poderá não seguir os princípios da sustentabilidade. Cada vez mais as técnicas de produção agrícola têm impactado os recursos naturais, principalmente no que diz respeito ao aumento do uso de fertilizantes e outros insumos químicos, a exemplo dos pesticidas agrícolas (FAO, 2002).
É conhecido que as modernas tecnologias de produção, incluindo o uso de pesticidas, contribuíram com a evolução do setor agrícola, possibilitando maiores produtividades e redução das perdas envolvidas no processo produtivo. Contudo, o uso abusivo de pesticidas nas lavouras, resultou num sistema agrícola altamente dependente do uso de pesticidas, e que consequentemente tem afetado os ecossistemas naturais.
1.1 Uma Agricultura Dependente de Pesticidas
Os pesticidas agrícolas são vistos pelo setor agrícola como uma importante ferramenta para aumentar a produção das culturas, com vistas principalmente, a atender as demandas alimentares de uma população em crescimento (WATERFIELD & ZILBERMAN, 2012) e a produção de energia renovável (BUNZEL et al., 2015). Diante o cenário de expansão da agricultura, os agricultores dos países em desenvolvimento tendem a usar mais pesticidas agrícolas comparado aos dos países desenvolvidos, e para além disso, utilizam compostos com maior toxicidade e aplicam os mesmos com maior frequência (ECOBICHON, 2001). No Brasil, por exemplo, ao mesmo tempo em que a produção agrícola cresce exponencialmente,
o país tem ocupado o primeiro lugar no ranking mundial do uso de pesticidas agrícolas (ANVISA, 2012).
O uso abusivo de pesticidas nos países em desenvolvimento, como o Brasil, comparado aos países desenvolvidos pode estar relacionado, entre outros fatores, ao fato das técnicas de manejo integrado de pragas serem menos adotadas e incentivadas (PARSA et al., 2014). Para além disso, a legislação referente à regulamentação do uso de pesticidas no Brasil é sistematicamente diferente do que é adotado em países desenvolvidos, a exemplo de países da União Europeia. Recentemente, um estudo comparativo sobre o uso sustentável de pesticidas na União Europeia e no Brasil revelou que ingredientes ativos banidos na União Europeia, têm o uso normalmente autorizado no Brasil. Além disso, foi constatado que os limites máximos de resíduos de pesticidas legalmente autorizados pela União Europeia são muito inferiores aos valores legalmente aceites no Brasil (Gonçalves, 2016).
Esse modelo de agricultura baseado no uso intensivo de pesticidas pode ocasionar uma variedade de problemas nos componentes bióticos dos agroecossistemas tais como: surtos de pragas secundárias, ressurgimento de populações-alvo de pragas, além do desenvolvimento de resistência das pragas aos pesticidas (SMITH, 1970). Consequentemente, para manter a sanidade dos sistemas de cultivo agrícola têm sido necessário a aplicação de doses cada vez mais elevadas de pesticidas, bem como a adoção de compostos cada vez mais tóxicos (ARCIERI, 2016).
Além dos impactos sobre os agroecossistemas, toda a biodiversidade acaba por ser afetada, uma vez que os efeitos são evidenciados principalmente pelos impactos diretos sobre organismos não-alvos (terrestres e aquáticos) e seres humanos, e também pelos impactos indiretos através da contaminação de alimentos, solo, ar e água (AKTAR et al., 2009). No que diz respeito ao impacto de pesticidas sobre sistemas aquáticos, os ecossistemas de água doce têm sido consideravelmente afetados (FAO, 2012; BARBOSA et al., 2015), principalmente aqueles próximos à áreas agrícolas (MORRISSEY et al., 2015; PAPADAKIS et al., 2015).
1.2 Efeitos de Pesticidas Agrícolas Sobre Ecossistemas de Água Doce
O uso de pesticidas na agricultura envolve riscos ambientais, tais como a contaminação das águas superficiais e subterrâneas (MARÍN-BENITO et al., 2014). As principais vias de contaminação de pesticidas em sistema aquáticos são através de escoamento superficial, erosão, deriva, lixiviação, e deposição atmosférica (REICHENBERGER et al., 2007).
Uma vez no ambiente aquático, os pesticidas podem ter efeitos não somente em organismos individuais e suas populações (BATTAGLIN et al., 2016; INOSTROZA et al., 2016), mas podem ainda afetar o desempenho de suas funções e interações no ecossistema (IEROMINA et al., 2016). A acumulação de pesticidas no ecossistema, para além de ocasionar perdas da biodiversidade é uma ameaça potencial para a saúde humana (MALAJ et al., 2014). Adicionalmente, os contaminantes químicos, a exemplo dos pesticidas agrícolas, podem acumular-se nos tecidos e órgãos dos organismos aquáticos em concentrações mais elevadas do que é encontrado na água (BORRELL et al., 2016).
O Brasil é o país que possui o maior reservatório de água doce, com aproximadamente 12% do que está disponível em todo o planeta Terra (TUNDISI et al., 2014). Visto que o Brasil é atualmente o líder mundial do uso de pesticidas agrícolas, não existem, contudo, estudos científicos suficientes que permitam concluir que os diversos reservatórios de agua doce brasileiros estejam contaminados ou em processo de contaminação (GOMES E BARIZON, 2014). Com essa lacuna, torna-se necessário a realização de estudos prospectivos que contribuam para a avaliação de risco ecológico de pesticidas agrícolas nos ecossistemas de água doce brasileiro, com vistas à proteção da biodiversidade.
1.3 O Estado do Tocantins Como Componente da Nova Fronteira Agrícola Brasileira
Uma nova fronteira agrícola está em crescente avanço no Brasil, sendo denominada de MATOPIBA, um acrônimo criado com as iniciais dos estados do Maranhão, Tocantins, Piauí e Bahia. Dentre os estados que compõe a nova fronteira de exploração agrícola brasileira, o Tocantins é o de maior representatividade com 27.772.052 ha, o equivalente a 38% do território do MATOPIBA (MIRANDA et al., 2014). A agricultura tocantinense tem sido fortalecida com a produção de arroz, soja, feijão, melancia, milho, cana de açúcar, entre outras culturas de importância econômica, contribuindo de maneira significativa para o abastecimento nacional e para a exportação (CONAB, 2016).
Os ecossistemas de água doce brasileiros possuem distribuição e disponibilidade irregular devido a influência de fatores climatológicos (Tundisi et al., 2014). Deste modo, o estado do Tocantins torna-se um polo de cultivo estratégico, visto que o acesso aos recursos hídricos e à irrigação são fatores determinantes no potencial da produção agrícola no Estado. O estado do Tocantins possui sistemas hidrográficos cujos eixos de drenagem são os rios Araguaia e Tocantins (Figura 1) (EMBRAPA, 1999). Contudo, para o controle fitossanitário nos cultivos agrícolas, grandes quantidades de pesticidas são aplicados, principalmente em
monoculturas, as quais se estendem ao longo destes sistemas hidrográficos, tornando-os passíveis de contaminação.
Figura 1: Sistema hidrográfico do estado do Tocantins. Fonte: Miranda e Bignola, 1999 (Embrapa Monitoramento por Satélite).
1.3.1 Principais pesticidas agrícolas utilizados nas lavouras tocantinenses
A priori foi realizado um estudo de campo nos municípios de Formoso do Araguaia, Lagoa da Confusão e Pedro Afonso, regiões consideradas polos de cultivo agrícola do estado do Tocantins e que são banhadas pela bacia hidrográfica Araguaia-Tocantins. A pesquisa de campo consistiu em entrevistas, através de inquérito, a representantes comerciais de pesticidas agrícolas e consultoria agronômica, produtores agrícolas, e técnicos de campo (Anexo 1). De
posse das informações obtidas, foi gerado um banco de dados com informações dos principais pesticidas agrícolas (inseticidas, fungicidas e herbicidas) utilizados no controle fitossanitário das principais culturas de interesse comercial do Estado (soja, feijão, arroz, melancia, milho e cana de açúcar).
Foram constatados 56 ingredientes ativos utilizados nestas regiões de cultivo, sendo que dentre estes constavam 23 inseticidas, 16 fungicidas e 17 herbicidas (Anexo 2). Deste modo, para estudos da avaliação laboratorial da toxicidade sobre invertebrados aquáticos em, foram selecionados três pesticidas agrícolas, utilizados em diversas culturas e em diferentes áreas de cultivo do estado do Tocantins: o inseticida tiametoxam (TMX), o fungicida ciproconazol (CPZ) e o herbicida paraquat (PQ).
É conhecido que, dependendo de suas características físico-químicas, os pesticidas podem atingir os recursos hídricos e persistir na água e nos sedimentos, principalmente se as perdas por transformação e degradação ambiental forem continuamente substituídas por novas emissões do composto (INOSTROZA et al., 2016). Assim, devido suas características físico-químicas (Tabela 1), sugere-se que TMX, CPZ e PQ são passíveis de atingir recursos hídricos e impactar a biota aquática. Relativamente ao uso destes compostos nos cultivos agrícolas, dados recentes revelam que o fungicida CPZ e também o herbicida PQ estão entre os pesticidas agrícolas mais aplicados no Brasil, com um montante de aplicação acima de 1000 toneladas/ano (1090,87 e 5249,54 toneladas/ano, respectivamente) (BARBOSA et al., 2015). Tabela 1: Propriedades fisico-químicas de TMX, CPZ e PQ.
Pesticida Solubilidade em água mg/L Log Kow Koc mL/g T1/2Campo (dias) T1/2Água e Sedimento (dias) Potencial de Lixiviação* Concentrações ambientalmente relevante µg/L TMX 4100a -0,13a 56,2a 39a 40a 3,58 63,4b CPZ 93a 3,09a 309c 191a 300a 3,44 49,05d PQ 620000a -4,5a 1000000a 2800a ... -6,9 3,14e
Kow = Coeficiente de partição octanol/água; Koc = coeficiente de partição solo/água; T1/2 =
tempo de meia-vida; a Valores obtidos a partir da base de dados Pesticide Properties DataBase (PPDB - University of Hertfordshire); b Samson-Robert et al. (2014); c Bayer CropScience; d
EFSA (2010); e Ikpesu (2015); *Índice GUS (Groundwater Ubiquity Score) = log (T1/2Campo) x
(4-log(Koc)); Índice GUS ≥ 2,8 indica alta capacidade de lixiviação, ≤ 1,8 = Baixo potencial de lixiviação, e < 0 = Potencial de lixiviação muito baixo (GOSS, 1992).
Recentemente o Instituto brasileiro de meio ambiente (Ibama), com base em pesquisas científicas e em decisões adotadas por outros países, deu início formal ao processo de
reavaliação de TMX (além de imidacloprid, clotianidin e fipronil). Dado que a aplicação aérea destes pesticidas têm sido associado a morte de abelhas em diferentes regiões do Brasil, como medida preventiva, o Ibama proibiu provisoriamente a aplicação aérea de TMX (e os outros três compostos) em qualquer tipo de cultura (IBAMA, 2016).
Cabe ressaltar ainda que TMX foi reportado como responsável por causar o declínio de abelhas selvagens, e sua utilização no domínio agrícola da União Europeia foi restringido no ano de 2013 (LAYCOCK et al., 2014). Além da União Europeia, TMX está em reavaliação no Canadá pela Health Canada's Pest Management Regulatory Agency (PMRA) devido seu potencial para causar efeitos em organismos não-alvo, incluindo os organismos aquáticos, uma vez que a lixiviação para as águas superficiais é uma das principais preocupações (ANDERSON et al., 2015).
Relativo ao herbicida PQ, devido ao seu potencial tóxico para seres humanos, em 2007 a União Europeia anulou a Directiva 2003/112 que autorizava o seu uso. Contudo, PQ ainda está registrado para uso em mais de 100 países (BALTAZAR et al., 2013), a exemplo do Brasil. Diante do exposto, salienta-se que a escolha de TMX, CPZ e PQ como objeto de estudo foi fundamentada não somente na representatividade destes compostos nas diversas culturas e polos de cultivo agrícola tocantinense, mas também devido ao potencial de contaminação de ecossistemas aquáticos, quantidade de uso nas lavouras brasileiras (CPZ e PQ) e restrição de uso (TMX e PQ).
1.3.1.1 Tiametoxam
Os neonicotinóides constituem a classe de inseticidas mais utilizada em cultivos agrícolas nos últimos anos, sendo que compostos desta classe são tóxicos para organismos aquáticos não alvo (ANDERSON et al., 2015; SMIT et al., 2015). TMX faz parte da segunda geração dos neonicotinóides (MAIENFISCH et al., 2001) e é utilizado em uma ampla variedade de culturas agrícolas em todo o mundo (EFSA 2013; FAO 2014) para controle de insetos das ordens Hemiptera, Thysanoptera, Coleoptera, Lepidoptera e Diptera (UNEME, 2011). Assim como os demais neonicotinóides, TMX mimetiza a ação da acetilcolina e não é degradado pela acetilcolinesterase (NAUEN et al., 2003). A permanente ativação dos receptores colinérgicos causa impulsos nervosos contínuos no sistema nervoso central, causando uma contração muscular descontrolada, provocando a morte do inseto (RANCAN et al., 2006).
Nas áreas de cultivo de Formoso do Araguaia e Lagoa da Confusão, foi observado que TMX é utilizado principalmente nas culturas de arroz, melancia, feijão e soja (Anexo 2). Em
áreas agrícolas, devido a intensidade de aplicações, TMX pode ser facilmente lixiviado, com posterior contaminação do lençol freático (ANDERSON et al., 2015; MAIN et al., 2015), e contaminação de águas superficiais (SÁNCHEZ-BAYO et al., 2013). Devido as propriedades físico-químicas de TMX e detecção em águas superficiais (Tabela 1), este inseticida pode ser potencialmente tóxico para organismos aquáticos, principalmente para insetos de água doce.
1.3.1.2 Ciproconazol
O fungicida CPZ pertence ao grupo químico dos triazois e é um inibidor da desmetilação de esterol, uma vez que inibe a formação de citocromo P450 esterol 14 α-desmetilase, uma enzima necessária à biossíntese de ergosterol, componente essencial de membranas de fungos (ZHAN et al., 2006; ECDC, 2013). CPZ é utilizado em ampla variedade de culturas agrícolas, como cereais, frutas, sementes oleaginosas, café e vegetais folhosos e de raiz (FAO, 2010; EFSA, 2010). Nas áreas de cultivo de Formoso do Araguaia, Lagoa da Confusão e Pedro Afonso, foi observado que CPZ é utilizado principalmente nas culturas de arroz, feijão, soja e cana de açúcar (Anexo 2).
Os organismos não-alvo também podem ser afetados pela toxicidade de CPZ (OCHOA-ACUN et al., 2009), pois o esterol 14α-desmetilase é expresso não apenas em fungos, más é também encontrado em vários filos (de bactérias a mamíferos) (ZARN et al., 2003). Além disso, CPZ pode contaminar águas superficiais próximos à áreas agrícolas e ocasionar efeitos potenciais sobre os organismos aquáticos (DEB et al., 2010). Como consequência da inibição de enzimas P450, a toxicidade de fungicidas triazois sobre organismos não alvo é evidenciada principalmente pela desregulação hormonal, afetando o desenvolvimento e reprodução (FEYEREISEN, 1999; HAHN et al. 2001; ZARN et al. 2003; LEPESHEVA & WATERMAN, 2007; TAENZLER et al. 2007; HASSOLD & BACKHAUS, 2009; GUITTARD et al., 2011).
1.3.1.3 Paraquat
O herbicida PQ pertence ao grupo químico dos bipiridílio e é inibidor competitivo do transporte de elétrons na fotossíntese a nível do fotossistema I (VÁRADI et al., 2000). Nas células, PQ conduz à geração de radicais livres de oxigênio, cuja detoxificação pela enzima superóxido dismutase, resulta na formação de peróxido de hidrogênio (H2O2), que peroxida
lipídios e danifica membranas do cloroplasto e células (CHAGAS et al., 2008).
Este herbicida é utilizado em pré e pós emergência no controle de largo espectro de ervas daninhas e gramíneas de folha larga, numa vasta gama de cultivos agrícolas e áreas
urbanas (FAO, 2003). É utilizado também como dessecante de diversas culturas agrícolas, de modo a antecipar e/ou facilitar a colheita (USEPA, 1997). Nas áreas agrícolas de Formoso do Araguaia, Lagoa da Confusão e Pedro Afonso, PQ é amplamente utilizado nos cultivos de soja e feijão (Anexo 2).
Para além de lixiviação e deriva, devido suas propriedades físico-químicas (Tabela 1), PQ é capaz de adsorver-se à argila e pode ser carregado para sistemas aquáticos através de escoamento superficial das partículas do solo (DINIZ-OLIVEIRA et al., 2008). Deste modo, PQ é considerado um composto potencialmente tóxico a uma grande variedade de organismos aquáticos (DIAL & DIAL, 1995; FRANQUEIRA et al., 1999; PARVEZ & RAISUDDIN, 2006).
1.4 Organismos Teste
Quironomídeos são uma família ecologicamente diversificada de Dípteros e são considerados omnipresentes devido apresentarem tolerância fisiológica ao stress ambiental, tais como modificações da temperatura e salinidade ou redução dos níveis de oxigênio dissolvido (Anderson, 1977). Dípteros da família Chironomidae tem alta relevância ecológica devido abundância numérica e por serem presas de outros organismos aquáticos. Além disso, larvas de quironomídeos têm ampla distribuição geográfica, uma vez que habitam quase todas as águas doces (TAENZLER et al., 2007). Estes mosquitos também são abundantes em ecossistemas de água doce tropicais brasileiros, a exemplo da espécie Chironomus xanthus Rempel (Diptera: Chironomidae) (SUEITT et al., 2015).
Contudo, uma vez que os ensaios ecotoxicológicos foram conduzidos na Universidade de Aveiro – Portugal, foi utilizado como organismo teste a espécie Chironomus riparius Meigen (Diptera: Chironomidae). Este inseto aquático é considerado espécie modelo em ecotoxicologia e é amplamente estudado em testes ecotoxicológicos para avaliar os efeitos dos pesticidas em ecossistemas de água doce (PÉREZ et al., 2013; MORRISSEY et al., 2015).
O díptero C. riparius é amplamente distribuído no hemisfério norte em latitudes temperadas (PÉRY & GARRIC, 2006), e pode ser encontrado em ambientes lênticos e lóticos (PÉRY & GARRIC, 2006). Este inseto aquático tem um ciclo de vida curto (3 a 4 semanas a 20°C), vive em contato com sedimentos e pode ser facilmente criado em laboratório com baixo custo de manutenção (LEARNER, 1966; FARIA et al., 2007; MUÑOZ & SABATER, 2014).
Também planárias da espécie Dugesia tigrina Girard (Paludicola: Dugesiidae) estão presentes em ecossistemas de água doce brasileiro (SOUZA et al., 2005) e foram utilizadas como organismo teste. Planárias têm sido reportadas como invertebrados que apresentam respostas semelhantes àqueles observadas em mamíferos, a exemplo de estudos de teratogenese e carcinogenese (HALL ET AL., 1986; SCHAEFFER, 1993). Além disso, as propriedades regenerativas e simplicidade morfológica, tornam as planarias organismos ideais para o estudo de regeneração (NEWMARK & ALVARADO, 2002; REDDIEN & ALVARADO, 2004), a exemplo de estudos de mecanismos moleculares subjacentes à biologia de células-tronco e regeneração de órgãos (HENDERSON et al., 2015).
Em ecotoxicologia, planárias são reportadas como potenciais organismos bioindicadores de contaminação ambiental e sua capacidade regenerativa e comportamental (locomoção e alimentação) têm sido estudada (HORVAT et al., 2005; OFOEGBU et al. 2016; RODRIGUES et al., 2016). No que diz respeito à regeneração, quando planárias são expostas a compostos tóxicos, a formação de fotorreceptores e quimiorreceptores pode ser inibida, atrasada ou deformada (KNAKIEVICZ & BUNSELMEYER, 2008). Para além disso, parâmetros comportamentais podem ser afetados, o que sugere implicações ecológicas em longo prazo.
Dado que planárias são fototáticos negativos, o atraso na formação de fotorreceptores faz com que o organismo perca a capacidade de detectar a intensidade e a direção da luz, afetando assim a capacidade de locomoção, fuga de predadores e forrageamento (INOUE et al., 2004). Adicionalmente, a inibição, atraso ou deformação na formação de quimiorreceptores em planárias também sugere implicações ecológicas, dado que esta estrutura sensorial serve para localização de alimento (MACRAE, 1967).
Deste modo, o estudo da sensibilidade de planárias aos contaminantes ambientais torna-se importante, uma vez que são organismos predadores principalmente de insetos, larvas e outros invertebrados de água doce, para além de servirem de alimento para outros invertebrados e vertebrados predadores (WALLEY & HAWKES 1996; ALBA-TERCEDOR et al., 2002). Para além dos fatores fisiológicos e ecológicos, planárias são de fácil manutenção em laboratório, e essas características em conjunto, tornam as planárias bons candidatos a organismo-teste em ecotoxicologia (BUTTARELLI et al., 2008; RODRIGUES et al., 2016).
1.5 Objetivo do estudo
O estudo do potencial impacto de pesticidas tornou-se um campo de prioridade para a pesquisa ambiental. Deste modo, a informação sobre a toxicidade letal e sub-letal de diferentes compostos, particularmente para espécies aquáticas ecologicamente relevantes, é crucial para a avaliação dos riscos de pesticidas em ecossistemas aquáticos (ESPERANZA et al., 2015). Diante do exposto, o objetivo deste estudo foi avaliar a toxicidade de TMX, CPZ e PQ em invertebrados de água doce de modo a contribuir, por meio de ensaios ecotoxicológicos, para o biomonitoramento do ecossistema da bacia hidrográfica Araguaia-Tocantins. Estudos preliminares revelaram que TMX não é tóxico para D. tigrina em concentrações ambientalmente relevantes. Uma vez que a toxicidade de outros neonicotinóides têm sido amplamente estudados sobre insetos aquáticos, principalmente C.
riparius (Anexo 3), a toxicidade de TMX foi avaliada considerando apenas este inseto
______________________________________________________________CAPÍTULO II Assessment of thiamethoxam toxicity on Chironomus riparius
Althiéris S. Saraivaa,b, Renato A. Sarmentoa,b, Andreia C. M. Rodriguesb, Diana Camposb, Ganna Fedorovac, Vladimír Žlábekc, Carlos Gravatob, João L. T. Pestanaa,b,Amadeu M. V. M.
Soaresa,b
aDepartmento de Produção Vegetal, Universidade Federal do Tocantins, Campus
Universitário de Gurupi, Rua Badejós, Lote 7, Chácaras 69/72, Zona Rural. PO box 66, CEP: 77402-970, Gurupi, Tocantins, Brazil
bDepartamento de Biologia & CESAM, Universidade de Aveiro, Campus Universitário de
Santiago, 3810-193 Aveiro, Portugal
cUniversity of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of
Waters, South Bohemian Research Center of Aquaculture and Biodiversity of Hydrocenoses, Zatisi 728/II, 389 25 Vodnany, Czech Republic
Submitted to: Ecotoxicology and Environmental Safety
Abstract
The insecticide thiamethoxam (TMX) is a systemic neonicotinoid widely used for pest control in several agricultural crops. TMX mimics the action of acetylcholine causing uncontrolled muscular contraction eventually leading to insect death. TMX is being found in freshwater ecosystems at concentrations of up to 63.4 µg/L. Still, chronic toxicity data for freshwater invertebrates is limited. Therefore, the aim of this study was to evaluate the acute and chronic effects (at organismal and biochemical levels) of TMX on the freshwater insect Chironomus
riparius. C. riparius life history responses were significantly affected by TMX exposure, with
decrease in growth and delay in emergence. Concerning the biochemical responses, after a short exposure (48h) to TMX, our results showed that environmentally relevant concentrations of TMX significantly reduced CAT activity and LPO levels of C. riparius. No effects were observed to AChE, GST and ETS activities. Effects in terms of survival and development rates of C. riparius exposed to environmentally relevant concentrations of TMX observed in this study suggests potential deleterious effects of this neonicotinoid on aquatic insects inhabiting freshwaters environments near agricultural areas.
1 Introduction
Neonicotinoids represent one of the most widely used class of insecticides nowadays (Morrissey et al., 2015). The insecticide thiamethoxam (TMX), introduced in 1998 under the trademark Actara® (foliar application and irrigation, soil treatment) and Cruiser® (seed treatment), belongs to the 2nd generation of neonicotinoids, and are distinguished by the fact that the 1st generation have a group cloropiridinil, which was replaced by clorotiazolidil (Maienfisch et al., 2001).
The insecticide TMX is used in a wide variety of agricultural crops and forestry business (EFSA 2013; FAO 2014) to control insects of the orders Hemiptera, Thysanoptera, Coleoptera, Lepidoptera and Diptera (Uneme, 2011). As all neonicotinoids, TMX mimics the action of acetylcholine and is not degraded by acetylcholinesterases (Nauen et al., 2003). The permanent activation of acetylcholine receptors causes hyperexcitability of the central nervous system, inducing uncontrolled muscular contraction and eventually leading to death of insects (Rancan et al., 2006).
The use of TMX raises concerns since it is a highly leachable compound in certain types of soil, capable of reaching surface waters near agricultural areas (Anderson et al., 2015; Main et al., 2015) and can also contaminate ground waters (Sánchez-bayo et al., 2013). In areas of intensive monocultures, TMX is commonly detected in surface waters (Schaafsma et al., 2015) and environmental concentrations are reported to reach 63.4 µg/L in river waters (Samson-Robert et al., 2014). Thus, due to detection of TMX in the surface waters, this insecticide has potential risk for freshwater invertebrates, and is to be expected that insects in particular, are more affected (Uğurlu et al., 2015). Some deleterious effects of TMX on aquatic non-target organisms have been reported (Anderson et al. 2015; Smit et al., 2015).
Among freshwater organisms used as model species in aquatic toxicology,
Chironomus riparius Meigen (Diptera: Chironomidae) has been one of the species widely
used in standard laboratory tests to evaluate the effects of pesticides in freshwater ecosystems (Pérez et al., 2013; Morrissey et al., 2015; Campos et al., 2016). C. riparius has short life cycle, live in close contact with sediments and can be easily maintained in the laboratory (Learner and Edward, 1966; Faria et al., 2007; Muñoz & Sabater, 2014). In addition, this midge species is widely distributed in the northern hemisphere at temperate latitudes being found in lentic and lotic environments (Péry & Garric, 2006).
Thus, the aim of this study was to investigate the acute and chronic effects (at organismal and biochemical levels) of TMX on C. riparius. The effects of TMX exposure were evaluated at the organismal level by C. riparius larvae survival and life-history
responses (growth and emergence). Biochemical effects of TMX in C. riparius larvae were evaluated using biochemical biomarkers related to the neurotransmission using acetylcholinesterase activity (AChE), oxidative damage measured as lipid peroxidation (LPO) levels, antioxidant defences through catalase (CAT) activity and biotransformation enzymes through glutathione-S-transferase (GST) activity. Effects of TMX on cellular energy metabolism were assessed by measuring the electron transport system (ETS) activity.
2 Material and Methods 2.1. Thiamethoxam
Thiamethoxam (EZ)-3-(2-chloro-1,3-thiazol-5-ylmethyl)-5-methyl-1,3,5-oxadiazinan-4-ylidene (nitro) amine, (purity of 99.6%) was purchased from Sigma-Aldrich (UK). TMX is water-soluble (up to 4.1 g/L) with a log Kow (octanol/water partition coefficient) = -0.13
(FAO, 2014). Stock solution was prepared in ultrapure water, kept at 4 °C and protected from light to avoid degradation of TMX. The nominal concentrations of stock solutions for acute and chronic tests were 6 and 1 mg/L TMX, respectively.
2.2. Chironomus riparius culture conditions
Chironomid culture was maintained in ASTM medium (ASTM, 1980), with controlled aeration in plastic containers, containing 1-2 cm of inorganic sediment ( < 1mm), previously burnt at 500 °C for 5 hours.
C. riparius were kept at 20 ± 2 °C, with a photoperiod of 16:8 h light: dark. Cultures
were fed three times a week with macerated fish food (TetraMin®, Tetrawerke, Melle, Germany). These conditions allow C. riparius to complete their entire life cycle (from egg to adult) in 20-28 days (OCDE, 2004).
2.2.1. Survival test
The acute tests were performed in glass crystallizing dishes (Ø = 7.5 cm) containing 1.5 cm layer of inorganic sediment (previously burned sand at 500 °C; < 1 mm), and 100 mL of ASTM. Based on preliminary tests and data available in the literature for TMX and others neonicotinoids, we used a gradient of TMX concentrations (0, 32, 51.2, 81.92, 131.07, 209.71, and 335.54 µg/L), plus control treatment (ASTM hard water only) in the survival tests.
Six-days old C. riparius larvae (2nd instar) were exposed during 48 h. The tests were
organisms were performed at 20 ± 1 ºC and 16:8 h light:dark photoperiod. During exposure, organisms were deprived of food. At the end of the exposure, the sediment was sieved and mortality was assessed with any immobile larva considered dead.
2.2.2. Partial life-cycle test
The chronic exposure of C. riparius followed OECD 219 guideline (OECD, 2004) and the highest concentration used was based on about 20% of the LC50. Chironomids were
exposed to 4, 6.5, 10.5 and 18 µg/L TMX for a period of 28 days. These concentrations were prepared from a stock solution of 1 mg/L of TMX. 1st instar larvae (2-days old) were introduced into 200 ml glass vials containing a 1.5 cm layer of inorganic sediment (< 1mm), previously burnt at 500 °C for 5 hours, and 150 mL of experimental solutions.
For each treatment, sixteen replicates were used with five organisms each and with aeration. After 10 days, chironomid larvae were collected from eight replicates per treatment and stored in ethanol (70 %) for posterior measurement of body length and determination of growth rate (mm/day). Total body length was evaluated in stereoscopic microscope. The remaining replicates were left until the 28th day. C. riparius imagoes were collected daily for
the assessment of percentage of emergence (derived by dividing the number of adult midges by the number of introduced larvae) and female/male ratios.
Throughout the exposure period, food (TetraMin®) was provided every two days (0.5 mg/larvae/day) and physico-chemical parameters (pH, temperature, conductivity and dissolved oxygen) were monitored (OCDE, 2004).
2.3 Short exposure for biochemical responses assessment
C. riparius 12-days old larvae (4th instar larvae) according to Domingues et al. (2007) were exposed to three concentrations of TMX (4.5, 9 and 18 µg/L) plus control treatment (ASTM hard water only) during 48h. The exposure was performed in 500 ml crystallizing dishes containing 200 ml of experimental solutions. Fifteen larvae per replicate were used, with a total of seven replicates per treatment, without sediment or food. After TMX exposure,
C. riparius was quickly dried on filter paper, weighed, frozen in liquid nitrogen, and stored at
-80 ºC until further analysis.
Homogenization of the samples was performed on ice, 1600 µL of ultrapure water were added to the samples and them homogenized by sonication (Brason Sonifier 250). From each replicate, an aliquot of 300 μL was taken for ETS, 200 μL for determination of LPO, whereas the remaining homogenate (~500 μL) was diluted with 500 μL of 0.2 M
K-phosphate buffer, pH 7.4, centrifuged for 20 min at 10,000 g (4 °C) and the post-mitochondrial supernatant (PMS) divided into 3 microtubes. Those PMS samples were kept in -80 °C until further analyses of biomarkers.
2.3.1 Acetylcholinesterase activity
AChE activity was measured following the method described by Ellman et al. (1961), adapted to microplate by Guilhermino et al. (1996). AChE activity was measured on 50 µL of PMS that was mixed with 250 µL of reaction solution (30 µL of K-phosphate buffer (0.1 M; pH 7.2), 200 µL of 0.075 M acetylthiocholine iodide solution and 1 mL of 10 mM 5,5’-dithiobis (2-nitrobenbenzoic acid)). The absorbance was read at 414 nm. The molar extinction coefficient (ε) = 13.6 × 103 M-1 cm-1 was used to determine the enzymatic activity, expressed in nmol per min per mg of protein.
2.3.2 Catalase activity
CAT activity was determined in PMS by measuring the decomposition of the substrate hydrogen peroxide (H2O2) (Clairborne, 1985). The reaction included a mixture of
135 µL of K-phosphate (pH 7.0; 0.05 M), 150 µL of 30% H2O2 and 15 µL of PMS.
Absorbance was read at 240 nm during 2 min. The results were expressed as µmol per min per mg of protein using a ε = 40 M−1 cm−1.
2.3.3 Glutathione-S-transferase activity
GST activity was measured based on the method describe by Habig et al. (1974). Two hundred microliters of reaction solution containing 4950 µL of phosphate buffer (0.1 M; pH 6.5), 150 µL 10 mM 1-chloro-2,4- dinitrobenzene and 900 µL of 10 mM reduced L-glutathione were mixed with 100 µL of PMS. The absorbance was read at 340 nm, for 5 min and the enzymatic activity was expressed in nmol per min per mg of protein using a ε = 9.6 × 103M−1 cm−1.
2.3.4 Lipid peroxidation
LPO was determined on 150 µL of homogenate, treated with 4 µL 4% BHT, 500 µL of 12% (w/v) trichloroacetic acid sodium salt, 50 µL of 0.73% (w/v) 2- thiobarbituric acid and 400 µL of 60 mM Tris–HCl, with 0.1 mM diethylenetriaminepentaacetic acid (Bird and Draper, 1984; Ohkawa et al., 1979). After one hour incubation period (100 ºC), the mixture was centrifuged for 5 min at 11,500 rpm. The samples were maintained in dark and
absorbance was read at 535 nm using ε = 1.56 × 105M-1 cm-1. The results were expressed as nmol thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) per g of weight.
2.3.5 Electron transport system activity
ETS activity was measured following a protocol adapted from De Coen and Janssen (1997) with slight modifications (Rodrigues et al., 2015a). To homogenate samples of 300 μL, 150 μL of homogenization buffer (0.3 M Tris base; 0.45% (w/v) Poly Vinyl Pyrrolidone; 459 μM MgSO4; 0.6% (v/v) Triton X-100 at a pH of 8.5) were added and centrifuged (1000 g, 10 min, 4 °C). Fifty microliters of supernatant and 150 μL of buffered solution 0.13 M Tris base; 0.27% (v/v) Triton X-100; 1.7 mM NADH; 274 μM NADPH; and 100 μL of INT solution (p-iodonitrotetrazolium; 8 mM) were added to a microplate. The absorbance was measured kinetically over a 3 min period at 490 nm. The cellular oxygen consumption rate conversion was performed based on the stoichiometric relationship, whereby for every 2 mmol of formazan formed, 1 mmol of oxygen is consumed. The formula of Beer-Lambert was then applied to quantify the oxygen consumed: A= ε x l x c (A = absorbance; ε for INT-formazan = 15,900 M-1 cm-1; l = 0.9 cm; and c = oxygen consumed).
2.3.6 Protein quantification
The protein concentration was determined following the Bradford method (Bradford, 1976), adapted from BioRad's Bradford microassay setup in a 96 well plate, using bovine γ-globuline as a standard. For the reaction, 10 µL of PMS and 250 µL of BioRad solution were mixed and 15 min later the absorbance was read at 590 nm.
2.4 Chemical Analysis
TMX in water samples was analyzed by LC/MS/MS using a triple stage quadrupole TSQ Quantum Ultra Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) coupled to an Accela 1250 LC pump (Thermo Fisher Scientific) and an HTS XT-CTC autosampler (CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland). A Hypersil GOLD column (50 mm × 2.1 mm ID × 3 µm particles; Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) was used for the separation of target analytes. Heated electrospray (HESI-II) in positive ion mode was used for ionization of the target compound. The key parameters were set as follows: ionization voltage, 3.5 kV; sheath gas, 35 and auxiliary gas, 15 arbitrary units; vaporizer temperature, 200 °C; capillary temperature, 325 °C; collision gas, argon at 1.5 mL min-1. Both first and
third quadrupole were operated at a resolution of 0.7 FMWH. Two SRM transitions were monitored for each analyte according to the European Commission Decision 2002/657/EC of
17 August 2002 concerning the performance of analytical methods and interpretation of results.
Quantification of TMX was performed by internal standard method using labeled metolachlor. Good linearity and limits of quantification (LOQ) were observed: R-squared values was 0.999; LOQs was 1.5 ng/mL. Quality control was confirmed by analysis of blank samples to assure that target analytes were not introduced from sampling or laboratory procedures and sample handling.
2.5 Statistical Analysis
The 48 h LC50 of TMX in C. riparius was estimated by dose-response analysis
(survival curve), using a four parameter logistic curve: Y= Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogLC50-x)*HillSlope)). Normality of data was assessed using the
Kolmogorov-Smirnov test and homogeneity of variance was tested by the Bartlett's test. Biochemical endpoints, CAT and GST data were transformed into Log (x). Growth, emergence and biochemical data of C. riparius, were analysed by analysis of variance (ANOVA), followed by Dunnett's post-hoc tests. For all statistical tests the significance level was set at p < 0.05.
Non-parametric test (Kruskal-Wallis test) was conducted for emergence (%) in C.
riparius. Statistical analyses were performed using the software GraphPad Prism version 6.0
for Windows (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). The sex ratio of C. riparius was analysed in treatments using contingency tables and Chi-square test, using SigmaPlot version 13.0 statistical software (Systat Software, Inc., San Jose California, USA).
3 Results
3.1 TMX concentrations in water
The measured TMX concentration of the stock solution (7.4 mg/L) was higher than nominal concentration (6 mg/L). Consequently, TMX nominal concentration used for the acute test was adjusted. The values of nominal and measured concentrations for the chronic test (10 days) and short exposure (48 h) for biochemical analyses are presented in Table 1. Nominal and measured concentrations of chronic exposure and short exposure, did not differ more than 13.8 and 5.6%, respectively.
Table 1. TMX concentrations measured in overlying water (µg/L) after ten days in chronic exposure and after 48 h in short exposure for biochemical analyses (mean ± SD).
Nominal concentrations (µg/L) Measured concentrations (µg/L) Chronic exposure (10 days) 4 3.8 ± 0.56 6.5 5.9 ± 0.42 10.5 10.5 ± 0.70 18 18 ± 0 Short exposure (48 h)* 4.5 4.5 9 9.4 18 17
*In short exposure experiments only one composite sample per treatment was analysed.
3.2 Acute test
The estimated TMX 48-h LC50 (95% CI) was 86.41 µg/L (74.35 to 100.04 µg/L). At
the end of exposure 100% of living organisms were found in the control treatment and decreased in survival observed for the range of concentrations tested.
3.3 Chronic assay
After 10 days of exposure to TMX, C. riparius survival was above 80% in the control treatment, 4, 6.5, and 10.5 µg/L, but survival at 18 µg/L, reached only 35.5%. Significant decrease was observed in growth rate of C. riparius larvae after 10 days of exposure to 18 µg/L TMX (F4, 34 = 20.02, p < 0.001, Figure 1), when compared with the control treatment.
NOEC and LOEC values were established at 10.5 and 18 µg/L TMX, respectively. The growth rate observed in the study is similar to data reported by Domingues et al. (2007), where the average growth rate of C. riparius at 20 °C was 0.99 mm/day.
T M X c o n c e n t r a ti o n s ( µ g / L ) G r o w th r a te ( m m /d a y ) 0 4 6 .5 1 0 .5 1 8 0 .0 0 .7 0 .8 0 .9 1 .0 1 .1 1 .2 1 .3 *
Fig. 1 TMX exposure on growth rate of C. riparius (mm/day; mean ± SE); endpoint assessed after 10 days of exposure. *denote significant differences compared to the control treatment (p < 0.01, Dunnett's test).
At the end of the 28 days of exposure, the partial life cycle teste was considered valid with emergence rate above 77 % in the control treatment. Exposure to 10.5 and 18 µg/L TMX caused a significant reduction in C. riparius emergence (Kruskal-Wallis test, p < 0.001, Figure 2), when compared with the control treatment. NOEC and LOEC values were set at 6.5 and 10.5 µg/L, respectively. In the 10.5 µg/L TMX treatment, 45% of larvae reached the pupal state, but failed to emerge, so the emergence percentage did not exceed 12.5%. At the highest concentration tested no chironomids reached the adult stage during the 28 days of experiment (100% mortality). 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 0 4 µ g / L 6 .5 µ g / L 1 0 .5 µ g / L 1 8 µ g / L * * D a y s C u m u la ti v e E m e r g e n c e ( % )
Fig. 2 Effects of 28-days TMX exposure on cumulative emergence of C. riparius. *denote significant differences compared to the control treatment (p < 0.01, Dunnett's test).
A significant imbalance in the ratio of females to males (χ2 = 19.82, df = 3, p <0.001)
was observed. The female : male ratio varied from 0.8 in the control treatment to 1.2, and 0.4 in 4 and 6.5 µg/L TMX treatments, respectively. Only males emerged in the 10.5 µg/L TMX treatment, and the treatment with the highest concentration, 18 µg/L TMX, was not included in analysis, due to lethal effect of TMX after 10 days of exposure.
3.4 Biochemical responses
TMX exposure caused significant reduction in CAT activity (F3, 24 = 3.92, p < 0.01)
and LPO (F3, 23 = 6.66, p < 0.01), compared to the control treatment (Table 2), with LOEC of
18 μg/L TMX.
TMX exposure also caused significant effects on AChE activity (F3, 24 = 5.18, p <
0.01) and GST activity (F3, 24 = 8.37, p < 0.01), despite no significant differences found by
post hoc tests in comparison with the control treatment. In contrast, ETS activity in C. riparius larvae was not significantly altered by exposure to TMX (F3, 24 = 0.81 p = 0.5),
compared to the control treatment.
Table 2. Effects of short-term (48 h) exposure to sub-lethal concentrations of TMX on the biochemical endpoints in C. riparius (4th instar larvae). All values are presented as mean ± SD.
Biochemical endpoints TMX concentration (µg/L)
Control 4.5 9 18 AChE activity (nmol/min/mg protein) 11.9 ± 2.26 14.1 ± 3.21 9.4 ± 1.65 11.9 ± 1.51 CAT Activity (µmol/min/mg protein) 6.6 ± 2.51 6.2 ± 2.18 5.6 ± 1.44 3.5 ± 0.58* GST Activity (nmol/min/mg protein) 16.3 ± 2.25 18.9 ± 3.11 14.1 ± 0.9 14.3 ± 1.06 LPO
TBARS (nmol/g wet weight) 81.5 ± 3.49 84.5 ± 6.63 71.3 ± 8.92 66.6 ± 12.09* ETS Activity
(mJ/mg organism/h) 113.9 ± 11.72 116.6 ± 11.0 109.2 ± 8.20 109.3 ± 11.49 *Denotes a significant difference compared to the control treatment (p < 0.05, Dunnett's test).
4 Discussion
Knowledge on the potential ecotoxicological effects of TMX is still limited concerning freshwater insects (Directive 98/8/EC, 2008; FAO, 2014). Our study shows that TMX is highly toxic to C. riparius, since exposure to environmentally relevant concentrations of TMX caused significant decrease in their survival, growth and emergence rates.
The acute toxicity of TMX on C. riparius observed in this study (86.41 µg/L) is similar to the environmentally relevant concentrations reported in river water (63.4 µg/L) (Samson-Robert et al., 2014). This results suggest that C. riparius is more sensitive to TMX exposure than the caddisfly Sericostoma vittatum (estimated 48-h LC50 (95% CI) of 203.87
µg/L (169.12 to 254.14 µg/L – nominal concentrations, unpublished data) and freshwater
Dugesia tigrina (LC50 96h was > 60.000 µg/L) (Saraiva et al. 2016). Nevertheless, TMX is
slightly less toxic than imidacloprid to C. riparius (LC50 values of 12.9 to 19.9 µg/L)
(Azevedo-Pereira et al., 2011a, Pestana et al., 2009). TMX was also less toxic to Chironomus
dilutus compared to others neonicotinoids (14 days LC50 values of 1.52, 2.41 and 23.6 µg/L
for imidacloprid, clothianidin and TMX, respectively) (Cavallaro et al., 2016).
In preliminary studies it was also observed that C. riparius is more sensitive to TMX than other organisms such as the freshwater planarian D. tigrina (Saraiva et al., 2016). Since planarians are predators of dipteran larvae in freshwaters, these results suggest that TMX may cause trophic cascade effects in freshwater ecosystem (Walley and Hawkes, 1996; Alba-Tercedor et al., 2002), because the population dynamics of chironomids can still be affected by loss of ability to escape from predators (Pestana et al., 2009).
Also, Brock & Wijngaarden (2012) point out that for insecticides with very specific mode of action, like neonicotinoids, data on toxicity on Daphnia cannot always be used to protect sensitive invertebrates, such as freshwater insects (Beketov et al., 2008, Anderson et al., 2015). Our study shows that C. riparius NOEC values are several orders of magnitude lower that what is observed for Daphnia magna (NOEC is equal to 100 mg/L) (FAO, 2014). In addition, TMX is reported as non-toxic to Gammarus sp., Thamnocephalus platyurus, molluscs (Lymnea stagnalis and Radix peregra) and fish (Oncorhynchus mykiss and Lepomis
macrochirus). However, TMX is highly toxic to the crustacean Ostracoda (EC50 = 180 µg/L),
to the ephemeropteran Cloeon sp.(EC50 = 14 µg/L) (Directive 98/8/EC, 2008) and the dipteran
Chironomus dilutus (EC50 is equal to 4.13 µg/L) with similar sensitivity to C. riparius
(Cavallaro et al., 2016).
Furthermore, the present study also showed effects of TMX on the sex ratio of C.
riparius. The alterations in sex ratio in C. riparius is likely to have resulted from some sort of
endocrine disruption (Hahn et al., 2001). This indication of sex related developmental toxicity, with females being more sensitive than males, is in accordance with previous studies where higher toxicity of neonicotinoids towards female chironomids have been reported (Kunce et al., 2015). Similar effects have been also observed on chironomids exposed to other insecticides such as pyrethroids (Agra & Soares, 2009, Rodrigues et al., 2015). Differences in
