Bioaffinity sorbent based on immobilized protein A Staphylococcus aureus: development and application

UDC 579.69 +577.112

Би

о

аф

фин

ный

сор

бент

на

осно

ве

им

мо

би

ли

зо

ва

нно

го

бел

ка

А

Staphylococcus

aureus:

со

зда

ние

и

ис

поль

зо

ва

ние

О. Б. Гор

ба

тюк, М. В. Ца

пен

ко

_{, М. В. Пав}

_ло

_ва

_{, О. В. Оку}

_нев

_{, В. А. Кор}

_дюм

КиевскийнациональныйуниверситетимениТарасаШевченко Ул. Владимирская, 64, Киев, Украина, 01033

1_{ИнститутмолекулярнойбиологииигенетикиНАНУкраины}

Ул. АкадемикаЗаболотного, 150, Киев, Украина, 03680

2_{ИнститутгенетическойирегенеративноймедициныНАМНУкраины}

Ул. Красноармейская, 57/3, Киев, Украина, 03150 [email protected]

Цель. СозданиебиоаффинногосорбентанаосновеориентированноиммобилизованногобелкаА Sta-phylococcus aureus (SPA) черездвацеллюлозосвязывающихдомена (СBD) Clostridium thermocellum иего

применениедляочисткиантител. Методы. СиспользованиемпоследовательностейДНК, кодирующих

SPA идваСBD, сконструировангенслитногобелка SPA-CBD2иобеспеченоегополучениевраствори

-мойформеэкспрессиейвклетках Escherichia coli. Целевойбелокиммобилизовалиметодомбиоаффин

-ного связывния намикрокристаллическойцеллюлозе. Результаты. Установлены такие характери

-стикибиоаффинногосорбента, какемкость (1 мг SPA-CBD2 /1 млцеллюлози), динамическаяемкость (3

мгиммуноглобулиновмыши/1 млсорбента) ипродуктивность, атакжепоказанаегостабильностьпри

долгосрочномхранении. Спомощьюбиоаффинногосорбентавыделеныфракциииммуноглобулиновс

чистотойболее 95 %. Определено, чтоочищенныетакимспособомантителасвысокойчувствитель

-ностьювыявляютсоответствующиеантигены. Выводы. Предложенныйбиоаффинныйсорбентпо

-зволяетполучатьочищенныефункциональноактивныеполи- имоноклональныеантитела, атакже

проводитьфракционированиенаподклассыиммуноглобулинов G мыши.

Ключевыеслова: антитела, белокА, целлюлозосвязывающийдомен, иммобилизациябелка, аффинная

хроматография.

Введение. Внастоящеевремяантителаширокопри-

меняютвбиомедицинскойпрактикеивфундамен

-тальныхисследованиях. Дляполучениязначитель

-ныхколичествантителсвысокойстепеньючисто

-ты, как правило, используют комбинации отдель

-ныхметодов, вчастности, преципитациюэтанолом иразличныевидыхроматографии: ионообменную,

гидрофобных взаимодействий, металл-аффинную

[1]. Однако эти методы неспецифические, к тому же применение некоторых из них приводит к ча

-стичнойпотерефункциональнойактивностианти

-тел. Высокопродуктивнымспособомполученияан

-тителявляетсяаффиннаяхроматографиясисполь

-зованиемсорбентовна основе иммобилизованных иммуноглобулинсвязывающих белков, в частнос

-ти, рекомбинантногобелка A Staphylococcus aureus (SPA). Этотметодширокоприменяютдляполуче

-ния фракций очищенных антител из культураль

-ных и асцитных жидкостей, сывороток крови, а такжедляиммуносорбцииаутоантителициркули

-рующих иммунных комплексов из плазмы крови больных [2–4].

Особенностьюстроения SPA, обеспечивающей специфическоесвязываниес IgG разныхвидовжи

вотныхичеловека, являетсяналичие вегосоставе пятидоменов (E, D, A, B, C), каждый из которых способен специфически взаимодействовать с

Fc-фрагментами антител [5]. Однамолекула SPA мо

-жетсвязыватьнеменеедвухмолекул IgG. Несмот

-ряна то, чтодля очисткиантителприменяюталь

-тернативные низкомолекулярные синтетические лиганды, обладающиенекоторойселективностьюк

IgG, степеньихочисткизначительнониже, чемпри использовании SPА. Ниодин изизвестных низко

-молекулярныхлигандовнеобеспечиваеттакойуни

-версальностиприочисткеантител, как SPA [6].

Преимуществами SPA какбиолигандавбиотех

-нологииявляютсяегоконформационнаястойкость кдействиюфизико-химическихфакторовипроте

-аз, сохранение функциональных свойств в широ

-комдиапазонерН (2,0–11,0), возможностьренату

-рациипослеобработкиденатурирующимираство

-рамимочевиныилигуанидингидрохлорида, а так

-жеотсутствиевегосоставеостатковцистеина, что значительно упрощает выделение и очистку SPA [7]. Крометого, высокоесродствок Fc-фрагментам антителистабильностьвсравнениисдругимиим

-муноглобулинсвязывающими белками, используе

-мымивбиотехнологии (белок G рода Streptococcus

и белок L Peptostreptococcus magnus), позволяют позиционировать SPA какэффективныйлиганддля очистки антител вусловиях лаборатории ив про

-мышленныхмасштабах [3, 8].

Присозданииаффинныхсорбентовприменяют разныестратегиииммобилизациибелковыхлиган

-дов, вчастности SPA, нахроматографическихмат

-рицах. Классическим методом является непрямая иммобилизациянахимическиактивированныхмат

-рицах (активация бромцианом, карбонилдиимида

-золом, N-гидроксисукцинимидом). Однакоисполь

-зованиетакихматрицврядеслучаевприводиткне

-специфической иммобилизациилигандаичастич

-ной потере его функциональной активности [9].

Крометого, спроснасорбентыподобноготипаог

-раничиваетсяихвысокойсебестоимостью.

Альтернативой иммобилизации на химически активированныхматрицахявляетсягенно-инженер

-ноевведениевсоставпоследовательности SPA вка

-чествебелка-партнерацеллюлозосвязывающегодо

-мена CBD (CBD – Cellulose Binding Domain) изцел

-люлозолитическогокомплекса Clostridium thermo-cellum, способного специфически взаимодейство

-ватьсуглеводнымостовомцеллюлозы. Этообеспе

-чиваеториентированнуюиммобилизациюбелка на матрицеиэкспонированиеактивныхцентровсвязы

-ванияв положение, оптимальное длявзаимодейст

-виясиммуноглобулинами [10, 11]. Врезультатеуда

-етсяобойтитрудности, возникающиеприиспользо

-ваниихимическиактивированныхматриц.

Вработеописанополучениебиоаффинногосор

-бентанаосновеориентированноиммобилизованно

-го SPA припомощидвухцеллюлозосвязывающих доменовиегоиспользованиедляочисткиантител.

Материалыиметоды. Использовалиштаммы

Escherichia coli XL1-bluе, BL21 (DE3) и плазмид

-ныевекторы pJET1.2 («Fermentas», Литва), pGEM-11Zf («Promega», США), рET-24 («Novagen», США).

Последовательностиолигонуклеотидовдляамп

-лификацииДНК SPA и CBD (Gene Bank Acession N X68233) рассчитывалиспомощьюпрограммы «Vec-tor NTI» («Invitrogen», США) по гомологии с из

-вестной нуклеотидной последовательностью, пред

-ставленнойвбазеданных GenBank BLAST Нацио

-нального центра биотехнологической информации

(NCBI). Олигонуклеотидысинтезированыфирмой

«Синтол» (РФ).

Конструирование вектора экспрессии р

ET-24-SPA-СBD2. Дляполучениягенно-инженерноготан

-дема «CBD-CBD» использовали плазмиду pCBD,

любезно предоставленную для исследованийпро

-фессором Я. Шохамом (Израиль). ПЦР-амплифи

-кацию последовательности «CBD-CBD» проводи

-лисприменениемдвухпарспецифическихпрайме

-ров: 1) sn1: 5'-CATGCGGCCGCAGGCGGTGTCCG AAGGCGGTGGCAGCGAAGGTGGCGGCGCAAA TACACCGGTATCAGG-3', asn2: 5'-GTGGGATCC GGGTTCTTTACCCCATACAAGAACAC-3'; 2) sn3: 5'-CATGGATCCGGCGGTGGCTCCGAAGGCGGT GGCAGCGAAGGTGGCGGCGCAAATACACCGG TATCAGG-3', asn4: 5'-GTGCTCGAGGGGTTCTTT ACCCCATACAAGAACAC-3'.

С помощью первой парыпраймеров в состав ДНКодного CBD вводилипоследовательностьлин

-кера «-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-Glu-Gly3-» исайтыре

-стрикции BamHI на 5'-концеи XhoI – на 3'- конце:

другого CBD встраивалитужепоследовательность линкера, атакжесайтыузнаванияэндонуклеазрест

-рикции NotI на 5'-конце и BamHI – на 3'-конце:

ПЦР-продукт 2. ПЦР-продукты 1 и 2 (534 п. н. каж

-дый) гидролизовали соответствующими рестрик

-тазамииклонироваливплазмидныйвектор pGEM-11Zf с получением плазмиды pGEM-11Zf (CBD2), гидролизуемойвдальнейшемрестриктазами NotI и

XhoI дляполученияфрагмента CBD-CBD. Послед

-нийлигировалисплазмиднымвекторомдляэкспрес

-сии рET24 и конструирования плазмиды

pET-24-СBD2.

ДНК-последовательность SPA амплифицирова

-лиизхромосомнойДНК S. aureus.

Для проведения ПЦРиспользовали парупрай

-меров: Sn-SPА: 5'-ATCATATGGCGCAACACGAT GAAGCTCAAC-3' и Asn-SPА: 5'-ATGCGGCCGC TTCCTCTTTTGGTGC-3', спомощьюкоторыхвсо

-ставпоследовательности SPA вводилисайтырест-

рикции NdeI и NotI.

Очищенныйпродуктамплификации SPA (~880 п.

н.) субклонировали в плазмидныйвектор р

ET-24-СBD2, которым трансформировали клетки E. coli

штамма BL21 (DE3).

Синтез SPA-CBD2. Рекомбинантный SPA-CBD2 экспрессироваливклетках E. coli согласномодифи

-цированномупротоколу аутоиндукции [12]. Лока

-лизацию SPA-CBD2определялиразделениемраст -воримойинерастворимойфракцийбелковклеткив

12 %-мДСН-ПААГ [13].

Анализсвязывания SPA-CBD2сразличнымити

-пами полисахаридных матриц. Для связывания с

фибриллярными целлюлозами (СFI, СFII), микро

-кристаллическойгранулярнойцеллюлозой (СС31) («Whatman», Великобритания) и хитином («New England BioLabs», Великобритания) аликвоты SPA-CBD2 (100 мкг) инкубироваливтечение 1 чсвы

-шеуказаннымиматрицами (20 мкл), осаждалицент

-рифугированием, промывалидистиллированнойво-

дойианализировалив 12 %-мДСН-ПААГ.

Для получения биоаффинного сорбента SPA-CBD2 иммобилизовали на микрокристаллической целлюлозеСС31. Затемсорбентотмывалиотнеспе

-цифическисвязавшихся белков буфером (500 мМ

NaCl, 1 мМЭДТА, 20 мМтрис-HCl, рН 8,0) ихрани

-липритемпературе 4 °Св 20 %-мраствореэтанола.

Очистка поликлональных антител с использо

-ванием биоафинногосорбента. Нахроматографи

-ческуюколонку, содержащую 1 млбиоаффинного сорбента, уравновешенного буфером PBS (50 мМ

Na2HPO4, 150 мМ NaCl, рН 8,0), наносилиразбав -ленныетемжебуферомсывороткикровииммуни

-зированныхмышей. Скоростьпотокабуфераравна

0,5 мл/мин. Сорбентпромывалибуфером PBS, свя

-занныеантителаэлюировали 0,1 М Na-цитратным буфером, рН 3,8. Чистоту элюированных антител анализировали электрофорезом в 12 %-м ДСН

-ПААГ.

ELISA. Антиген rhIFN-a_{2b (рекомбинантный}

интерферончеловекаa_{2b), предоставленныйНПК}

«ФармБиотек» (Украина) иммобилизоваливлунках полистиролового планшета (10 мкг/мл) («Nunc»,

Дания). Послеблокированияместнеспецифическо

-госвязываниявлункивносилипредварительноочи-

щенные на биоаффинном сорбенте поликлональ

-ные антитела к rhIFN-a_{2b и инкубировалив тече}

-ние 1 чпритемпературе 37 °С. Иммунныекомплек

-сы детектировали спомощьювторичных антимы

-шиных антител («ИМТЕК», РФ), конъюгирован

-ныхспероксидазойхрена. Вкачествехромогенно

-госубстрата использовали раствор ТМВ («Sigma»,

США). Статистическуюобработкурезультатовпро

-водилисприменениемпакетапрограмм «Origin»7.0.

Применениебиоаффинногосорбентадляфрак

-ционирования IgG мыши. Хроматографическую колонку, содержащую 1 млбиоаффинногосорбента,

присоединяликавтоматизированнойсистеме FPLC («Pharmacia», США). Уравновешивали буфером длянанесения (1,5 M глицин, 3 M NaCl, pH 8,9) ина

-носилисывороткикровимышей, разбавленныетем же буфером. Скорость потока буфера составляет

0,5 мл/мин. Сорбентпромывалибуферомдлянане

-сениядовыходаперасамописцанаизолинию. Свя

-занныеантителаэлюировалисиспользованиембу

-ферныхрастворов: 0,1 M Na-фосфат, pH 6,0; 0,1 M Na-цитрат, pH 4,5 и 0,1 M Na-цитрат, pH 3,5. Чис

-тоту и концентрацию полученных в результате элюци и антител анализировалиэлектрофорезом в

12 %- мДСН-ПААГ.

Результатыиобсуждение. Известно, чтокри

-терием, определяющимемкостьсорбента, является плотность посадкилиганда на матрице. Приэтом динамическаяемкостьсорбентаобусловленаориен-

тациейлигандаидоступностьюегоактивногоцен

-тра. Поэтому наиболее целесообразно проводить прямую иммобилизацию лиганда. Основной спо

-собосуществлениятакойиммобилизации – этовве

-дениенагенномуровневсоставбелка-лигандадо

-бавочнойтиогрупы или адаптерной молекулы [14, 15].

В данной работе для иммобилизации SPA ис

-пользован адаптерный белок CBD, выделеный из целлюлозолитическогокомплекса C. thermocellum,

обеспечивающий аффинное связывание белка на полисахариднойматрице [10]. Дляполученияген

-но-инженернымметодомслитногобелка SPA-CBD2 проведен интерактивныйдизайн в соответствии с особенностями структурыбелков-партнерови то

-пологиейихактивныхцентров [16, 17]. Определе

-но, что оптимальным является дизайн химерного белка, вкотором на N-конце находится SPA, а на С-конце – два CBD, соединенныхмеждусобойгиб

-кими линкерными последовательностями: «-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-Glu-Gly3-». Такое взаимораспо

-ложение обеспечиваетпространственнуюдоступ

-ность иммуноглобулинсвязывающих центров SPA

длявзаимодействияс Fc-доменамиантител. Введе

-ние в состав рекомбинантного белка не одного, а двухпоследовательностей CBD обусловленонеоб

-ходимостью усиления аффинности связывания ре

-комбинантногобелка SPA-CBD2сцеллюлозой [18]. Для проведенияхроматографическойочистки

SPA-CBD2вегосоставвведенаС-концеваяпоследователь -ностьолигогистидиновойметки 6His-tag (рис. 1, а).

Длясозданиярекомбинантногобелка SPA-CBD2 ДНК-последовательность, кодирующую SPA, амп

-лифицировалис хромосомной ДНК S. aureus. Раз

-мерамплифицированногофрагмента ДНК состав

-ляет 880 п. н., чтоотвечаетаминокислотнойпосле

-довательности пятидоменного SPA. Секвенирова

-ние выявило его полное соответствие последова

-тельности SPA, представленнойвбазеданных Gen- Bank (Accession N EU695225.1) NCBI. Полученную последовательность ДНК, кодирующую SPA, суб

-клонировали в плазмидный вектор рET-24-CBD2, которым трансформировали E. coli штамма BL21 (DE3). Важноотметить, чтополученныйнамипро

-дуцент рекомбинантного белка SPA-CBD2 (E. coli штамма BL21 (DE3)) былдостаточно стабильным придлительномхранении (неменееодногогода).

Белок SPA-CBD2 получен бактериальной экс -прессиейпомодифицированномупротоколуауто

-индукции. Установлено, что SPA-СBD2накаплива -етсявцитоплазмеврастворимом виде (рис. 1, б).

Уровеньегоэкспрессии составляет ~ 0,5 г/л (рис. 1,

б) культуры E. coli, чтопочтив 80 развыше, чемв работеШосееваидр. [19]. Порезультатамсвязыва

-нияСBD сцеллюлозойи SPA симмуноглобулина

-ми показано функциональную активность обоих белков-партнеров SPA-CBD2.

Следующим этапомнашей работыстал выбор хроматографическойматрицыдлясозданиябиоаф

-финногосорбента. ПосколькуСBD обладаетаффин-

ностью к целлюлозе, для анализа связывания ис

-пользовалиразныетипыцеллюлоз (микрокристал

-SPA-CBD2®

1 2 3 4

¬₇₀

¬₅₅

¬₄₀

¬35

кДа

T7 prom ATG

RBS

SPA CBD CBD

T7 term Xho I

Линкер Линкер

NdeI NotI BamHI 6 His-tag

Рис. 1. Схематическоеизображенниекас

-сеты для экспрессии рекомбинантного слитногобелка SPA-CBD2 (а) иэлектро

-фореграммализатовклетокE. coli, вкото

-рыхиндуцировали синтез SPA-CBD2 (б:

1 – суммарныйлизатбелковклетокпроду

лическую и фибриллярную), а также хитин. Про

-веденные эксперименты по связыванию показали,

что емкость SPA-СBD2для этих сорбентов колеб -летсявдиапазонеот 0,4 (для CFI) до 1,2–1,5 мг/мл

(для CC31 ихитина) (рис. 2). Исходяизэтогодля получениябиоаффинногосорбента SPA-СBD2им -мобилизовалинацеллюлозе CC31 ихитине.

Из литературы известно, что в результате аф

-финноговзаимодействия CBD сцеллюлозоюфор

-мируется стабильный комплекс. Это происходит вследствие гидрофобных взаимодействий некото

-рыхаминокислотныхостатковдоменасуглеводо

-роднымостовомцеллюлознойматрицы [17]. Ранее показано, чтооднимизнедостатковбиоаффинного методаиммобилизациигибридногобелкананоси

-телеявляется частичнаядиссоциациякомплексав кислыхусловиях (рН 3,0) иееусилениепридаль

-нейшемпонижениирНдо 2,0. Последнееприводит кснижениючистотыконечногопродуктаисужает диапазонвозможныхусловийэлюции [11]. Дляре

-шения этой проблемыв состав гибридного белка

SPA-CBD2ввелигенно-инженерный тандем CBD-CBD, чтопозволилоусилитьегосвязывниенамат

-рице [18].

Далеенужнобылоопределитьусловияэлюции,

обеспечивающиеселективнуюдиссоциациюанти

-теливместестемневызывающиестеканиялиган

-да. При этом использовали следующие растворы дляэлюции: 0,1 Мглицин, рН 3,0; 0,1 М Na-цит

-ратныйбуфер, рН 3,8 и 2 Маргинин, рН 4,3 [20].

Послеэлектрофоретическогоразделения получен

-ныхэлюатовустановлено, чтотолько 2 Маргинин вызывает значительное стекание иммобилизован

-ного SPA-CBD2вэлюат. Прииспользованииглици -нового и цитратного буферов конечный продукт полностьюэлюируетсясвысокойстепеньючисто

-ты. Исходяизэтого последующиеочисткипрово

-дилиспомощьюцитратногобуфера, рН 3,8 (рис. 3).

Полученныйбиоафинныйсорбент использова

-ли при очисткеантителиз сыворотоккрови иас

-цитныхжидкостеймышей (данныенеприведены).

Дляэтогованалитическуюколонкуобъемом 1 мл вносили 3 мл 30 %-й суспензии СС31-SPA-СBD2. Послеуравновешивания сорбентафосфатно-соле

-вымбуферомнаносилиразведенныесывороткиим

-мунизованных рекомбинантным IFN-a_{2b мышей,}

отмывали отнеспецифически связавшихсябелков иэлюировалиантитела Na-цитратнымбуфером, рН

3,8. Врезультаеполучены IgG свысокойстепенью чистоты (более 95 %) (рис. 4). Динамическуюем

-кость биоаффиннойколонкипосвязыванию анти

-тел находили, определяя концентрацию очищен

-ныхантител. Установлено, чтоонасоставляет 3 мг мышиныхантителна 1 млосажденногобиоаффин

-ногосорбента. Такжепоказананеизменностьфунк

-циональныххарактеристикбиоаффинногосорбента прихраненииегонапротяжениинеменееодногого

-дапри температуре 4 °Сивозможность повторного

¬SPA-CBD2

1 2 3 4 5

70®

кДа

55®

40®

35®

Рис. 2. Электрофореграмма SPA-CBD2 послесвязываниясраз

-личнымитипамиполисахаридныхматриц: 1 – белки – маркеры молекулярноймассы; 2, 3 – фибриллярнаяцеллюлоза CFI и CFII

соответственно; 4 – микрокристаллическаяцеллюлозаСС31; 5 –

хитин. Надорожкинанесенопо 3 мклсорбента

1 2 3 4

70®

кДа

55®

35®

25®

¬Тяжелые цепи иммуноглобулинов

¬Легкие цепи иммуноглобулинов

Рис. 3. Электорофореграммафракцийантител, очищенныхнабио

-аффинномсорбенте, полученныхприэлюциибуфернымираство

-рамисразнымизначениямирН: 1 – белки – маркерымолекуляр

использованиядлянесколькихцикловочисткианти

-телбезснижениядинамическойемкости.

Изучение формирования комплекса белка А с иммуноглобулинамипоказало, чтоглавнуюрольв связывании SPA с IgG играют гидрофобные взаи

-модействиямеждуa_{-спиральюІ SPA и Fc-домена}

-ми IgG (более 80% свободнойэнергиисвязывания),

в то время как селективность SPA к разнымпод

-классам IgG определяютэлектростатическиевзаи

-модействиямеждуa_{-спиральюІІ SPA и Fc-домена}

-ми IgG (20 %) [21]. Поэтомуприменениебуферных растворов с высокой концентрацией соли для по

-2,0 8,0

6,0

4,0 10,0

0,5 1 1,5

2

А280, mAU pH

1 2 3 4

Тяжелые цепи иммуноглобулинов®

Легкие цепи иммуноглобулинов®

¬₇₀

кДа

¬₅₅

¬₃₅

¬₂₅

б а

0

1 2

3

5 10 15 20 25 V,мл

12,0 14,0

Рис. 4. Очисткаполиклональныхантителпротив IFN-a_{2b человекаизсыворотоккровииммунизованныхмышейнабиоаффинномсор}

-бенте: а – хроматограмма (1 – нанесениебелковсыворотоккровииммунизированныхмышей; 2 – белки, удаляемыеприпромываниисо

-рбента; 3 – элюциясвязанныхантител); б – электрофореграммафракцийбелков (1 – нанесениебелковсыворотоккровииммунизован

-ныхмышей; 2 – белки, удаляемыеприпромываниисорбента; 3 – хроматографическиочищеннаяфракцияполиклональныхантителпро

-тив IFN-a_{2b человека; 4 – маркерымолекулярноймассы)}

2,0 8,0

6,0

4,0

А280, mAU pH

1 2 3 4 5

¬70

кДа

¬₅₅

¬₃₅

¬₂₅

б а

12,0

0

5 10 15 20 25 V,мл

5 2

3

10,0

0,5 1 1,5 2,5

2

4

1

Рис. 5. Фракционированиеподклассов IgG мышинабиоаффинномсорбенте: а – хроматограмма (1 – нанесениебелковсыворотоккро

-ви; 2 – белки, удаляемыеприпромываниисорбентабуфером; 3–5 – элюциясвязанныхантителбуфернымирастворами, содержащими

0,1 M Na-фосфат, pH 6,0 (3); 0,1 M Na-цитрат, pH 4,5 (4) и 0,1 M Na-цитрат, pH 3,5 (5)); б – электрофореграммафракцийбелков (1 – нане

садки IgG на колонку способствует ихболее пол

-номусвязыванию с SPA. Следует отметить, чтос сорбентовнаоснове SPA IgG элюируютсявболее мягких условиях, нежелипри использовании дру

-гихаффинныхсорбентов (например, сорбентысим-

мобилизованнымбелком G). Этообеспечиваетпо

-лучениечистыхфракцийиммуноглобулиновбезсу-

щественнойпотериихфункциональнойактивности.

Исходяизтого, что SPA имеетразнуюаффинностьк определенным изотипам мышиных IgG, последние фракционировалинаподклассыврезультатепооче

-редногоснижения величинырН элюирующего бу

-фера: IgG1 элюировалипри pH 6,0; IgG-2a – pH 4,5; IgG-2b – pH 3,5 (рис. 5). Наличиевэлюатахпреиму

-щественно определенных подклассов IgG мыши подтверждали, используя IsoQuick Kit for Mouse Monoconal Isotyping. Также известно, что челове

-ческие IgG1, IgG2, IgG4 взаимодействуютс SPA с константойаффинностиКА = 10

8 М–1

, втовремякак

IgG3 демонстрируютслабоесвязываниес SPA. Это позволяетвыделить IgG3 средиостальныхподклас

-совиммуноглобулинов G человека.

Выводы. Полученные результаты свидетель

-ствуют о перспективности использования сконст

-руированного нами биоаффинного сорбента для высокоэффективнойочисткиифракционирования поли- имоноклональныхантителизсложныхбио

-логических смесей в условиях лаборатории. Очи

-щенные набиоаффинномсорбентеантителаоказа

-лись стабильнымиприхраненииидостаточночув

-ствительными при детекции соответствующих ан

-тигеновметодом ELISA (рис. 6). Крометого, целлю

-лоза – недорогойидоступный материал, нетребу

-ющий дополнительных химических модификаций,

чтослужитещеоднимподтверждениемправильно

-стивыбранногонаправленияисследований.

O. B. Gorbatiuk, M. V. Tsapenko1, M. V. Pavlova1, 2, O. V. Okunev1, 2, V. A. Kordium1, 2

Bioaffinity sorbent based on immobilized protein A Staphylococcus aureus: development and application

Taras Shevchenko National University of Kyiv 64, Volodymyrska Str., Kyiv, Ukraine, 01033

1

Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine 150, Akademika Zabolotnoho Str., Kyiv, Ukraine, 03680

2_{State Institute of Genetic and Regenerative Medicine, NAMS of Ukraine} 57/3, Chervonoarmiyska Str., Kyiv, Ukraine, 03150

Sammary

Aim. The obtaining of bioaffinity sorbent based on the immobilized pro-tein A of S. aureus (SPA) using two cellulose-binding domains (CBD), and its application for purification of antibodies. Methods. The DNA sequences encoding SPA and two CBD were genetically fused, expres-sed in the high-productive Escherichia coli system and the protein SPA-CBD2 was obtained in a soluble form. The SPA-CBD2 fusion

pro-tein was affinity immobilized on the microcrystalline cellulose. Re-sults. Capacity of bioaffinity sorbent (1 mg SPA-CBD2/1 ml

CC31-cel-lulose), dynamic capacity (3 mg mouse IgG/1 ml bioaffinity sorbent), efficiency and stability during prolonged storage were determined. The bioffinity sorbent was used for purification of antibodies. The pu-rity of antibodies in eluted fractions was more than 95 %. The purified antibodies detected target antigens with a high sensitivity. Conclu-sions. The designed bioaffinity sorbent provides obtaining pure poly-and monoclonal antibodies in functionally active form poly-and can be use-ful for the fractionation of mouse immunoglobulin G.

Keywords: antibodies, protein A, cellulose-binding domain, pro-tein immobilization, affinity chromatography.

О. Б. Горбатюк, М. В. Цапенко, М. В. Павлова, О. В. Окунєв,

В. А. Кордюм

Біоаффіннийсорбентнаоснові іммобілізованогобілка АStaphylococcus aureus: створенняівикористання

Резюме

Мета. Створеннябіоафінногосорбентанаосновіорієнтовано

іммобілізованогобілкаА Staphylococcus aureus (SPA) черездваце

-люлозозв’язувальнихдомени (СBD) Clostridium thermocellum та

йогозастосуваннядляочищення антитіл. Методи. Звикорис

-таннямпослідовностейДНК, кодуючих SPA ідваСBD, сконстру

-йованогензлитогобілка SPA-CBD2тазабезпеченойогоотри

-манняврозчиннійформіекспресієюуклітинах Escherichia coli.

Цільовийбілокіммобілізованометодомбіоафінногозв’язування

намікрокристалічнійцелюлозі. Результати. Встановленотакі

характеристики біоафінного сорбента, якємність (1 мг

SPA-CBD2/1 млцелюлози), динамічнаємність (3 мгімуноглобулінівми

-0,00 0,01 0,04 0,16 0,64 2,56 10,24

IgG,мкг/мл A₄₅₀

0 0,5 1 1,5 2,0

Рис. 6. Криваясвязыванияочищенныхнабиоаффинномсорбенте поликлональныхантителс rhIFN-a_{2b антигеномприиспользова}

ші/1 мл сорбента) і продуктивність, а також показано його

стабільністьпритриваломузберіганні. Задопомогоюбіоафінного

сорбентавиділенофракціїімуноглобулінівзчистотоюпонад 95 %.

Визначено, щоочищеніутакийспосібантитілазвисокоючут

-ливістювиявляютьвідповідніантигени. Висновки. Запропонова

-ний біоафінний сорбент дозволяє отримувати очищені функ

-ціональноактивніполі- імоноклональніанттіла, атакожпрово

-дитифракціонуваннянапідкласиімуноглобулінів G миші.

Ключовіслова: антитіла, білокА, целюлозозв’язувальнийдо

-мен, іммобілізаціябілка, афіннахроматографія.

REFERENCES

1. Denizli A. Purification of antibodies by affinity chromatography // Hacettepe J. Biol. Chem.–2011.–39, N 1.–P. 1–18.

2. Boi C., Dimartino S., Sarti G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies // Bio-technol. Prog.–2008.–24, N 3.–P. 640–647.

3. Hober S., Nord K., Linhult M. Protein A chromatography for an-tibody purification // J. Chromatogr. B. Analyt Technol. Bio-med. Life Sci.–2007.–848, N 1.–P. 40–47.

4. Hickstein H., Korten G., Bast R., Barz D., Templin R., Schneide- wind J. M., Kittner C., Nizze H., Schmidt R. Protein A immuno-adsorption (i. a.) in renal transplantation patients with vascular rejection // Transfus. Sci.–1998.–19.–P. 53–57.

5. Moks T., Abrahmsen L., Nilsson B., Hellman U., Sjoquist J., Uh- len M. Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains // Eur. J. Biochem.–1986.–156, N 3.–P. 637–643. 6. Ghose S., Hubbard B., Cramer S. M. Evaluation and comparison

of alternatives to Protein A chromatography mimetic and hydro- phobic charge induction chromatographic stationary phases // J. Chromatogr. A.–2006.–1122, N 1–2.–P. 144–152.

7. Gottschalk U. Process scale purification of antibodies.–Hobo-ken: Wiley & Sons, 2009.–430 p.

8. Housden N. G , Harrison S., Roberts S. E., Beckingham J. A., Graille M., Stura E., Gore M. G. Immunoglobulin-binding do-mains: Protein L from Peptostreptococcus magnus // Biochem. Soc. Trans.–2003.–31, Pt 3.–P. 716–718.

9. Affinity chromatography: methods and protocols / Eds P. Bailon et al.–New York: Humana press, 2000.–Vol. 147.–230 p. 10. Morag E., Lapidot A., Govorko D., Lamed R., Wilchek M.,

Ba-yer E. A., Shoham Y. Expression, purification, and characteri-zation of the cellulose-binding domain of the scaffoldin subunit

from the cellulosome of Clostridium thermocellum // Appl. En-viron. Microbiol.–1995.–61, N 5.–P. 1980–1986.

11. Gilchuk P. V., Volkov G. L. Immobilization of mouse single-chain antibodies for affinity chromatography using the cellu-lose-binding protein // Ukr. Biokhim. Zhur.–2006.–78, N 4.– P. 160–163.

12. Studier F. W. Protein production by auto-induction in high den-sity shaking cultures // Protein Expr. Purif.–2005.–41, N 1.– P. 207–234.

13. Westermeir R. Electrophoresis in practice: a guide to methods and application of DNA and protein separations.–Weinheim: VCH, 1997.–331 p.

14. Ljungquist C., Jansson B., Moks T., Uhleen M. Thiol-directed immobilization of recombinant IgG-binding receptors // Eur. J. Biochem.–1989.–186, N 3.–P. 557–561.

15. Linhult M., Gulich S., Graslund T., Nygren P. A., Hober S. Eva-luation of different linker regions for multimerization and coup-ling chemistry for immobilization of a proteinaceous affinity ligand // Protein Eng.–2003.–16, N 12.–P. 1147–1152. 16. Atkins K. L., Burman J. D., Chamberlain E. S., Cooper J. E.,

Poutrel B., Bagby S., Jenkins A. T., Feil E. J., van den Elsen J. M. S. aureus IgG-binding proteins SpA and Sbi: host specificity and mechanisms of immune complex formation // Mol. Immu-nol.–2008.–45, N 6.–P. 1600–1611.

17. Tormo J., Lamed R., Chirino A. J., Morag E., Bayer E. A., Sho-ham Y., Steitz T. A. Crystal structure of a bacterial family-III cel- lulose-binding domain: a general mechanism for attachment to cellulose // EMBO J.–1996.–15, N 21.–P. 5739–5751. 18. Lidner M., Salovuori I., Ruohonen L., Teeri T. T.

Characteriza-tion of a double cellulose-binding domain: synergistic high-affi- nity binding to crystalline cellulose // J. Biol. Chem.–1996.–

271, N 35.–P. 21268–21272.

19. Pat. USA N 5837814. 1998. Сellulose binding domain proteins / O. Shoseyov, K. Yosef, I. Shpiegl, M. Goldstein, R. Doi. 20. Arakawa T., Philo J. S., Tsumoto K., Yumioka R., Ejimac D. Elu-

tion of antibodies from a Protein-A column by aqueous arginine solutions // Protein Expr. Purif.–2004.–36, N 2.–P. 244–248. 21. Huang B., Liu F. F., Dong X. Y., Sun Y. Molecular mechanism of

the affinity interactions between protein A and human immunoglobulin G1 revealed by molecular aimulations // J. Phys. Chem. B.–2011.–115, N 14.–P. 4168–4176.