Universidade
Católica de Brasília
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
STRICTO SENSU EM CIÊNCIAS GENÔMICAS E
BIOTECNOLOGIA
Mestrado
DESENVOLVIMENTO DE PAINÉIS MULTIPLEX DE MARCADORES MICROSSATÉLITES PARA PROGRAMAS DE MELHORAMENTO ASSISTIDO PARA QUALIDADE DE GRÃOS EM ARROZ (ORYZA
SATIVA L.)
AUTOR: Thaísa Sant´Anna Lacerda
Orientador: Dr. Márcio Elias Ferreira
BRASÍLIA
THAÍSA SANT´ANNA LACERDA
DESENVOLVIMENTO DE PAINÉIS MULTIPLEX DE MARCADORES MICROSSATÉLITES PARA PROGRAMAS DE MELHORAMENTO
ASSISTIDO PARA QUALIDADE DE GRÃOS EM ARROZ (ORYZA SATIVA L.)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia.
Orientador: Dr. Márcio Elias Ferreira
Dissertação de autoria de Thaísa Sant´Anna Lacerda, intitulada “Desenvolvimento
de painéis multiplex de marcadores microssatélites para programas de melhoramento assistido para qualidade de grãos em arroz (Oryza sativa L.)”, apresentada como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, em 18 de agosto de 2009, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
______________________________________________ Prof. Dr. Márcio Elias Ferreira
Orientador
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
______________________________________________ Prof. Dr. Georgios Joannis Pappas Jr.
Mestrado em Ciências Genômicas e Biotecnologia – UCB Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
______________________________________________ Dr. Paulo Hideo Nakano Rangel
Embrapa Arroz e Feijão
Dedico
A minha mãe, meu orientador Márcio Elias, à toda equipe do LGV e a todos que possam usufruir deste trabalho em prol da ciência,
Agradecimentos
Em Primeiro lugar devo meus agradecimentos a DEUS, que foi e sempre será minha força e minha motivação. Minha eterna gratidão por ter me capacitado e por me dar força e Fé nos momentos de grandes medos e incertezas.
Ao Meu orientador Dr. Márcio Elias Ferreira pela orientação, incetivo, compreensão, amizade, reconhecimento pela competência e pelos ensinamentos que me proporcionou
Ao Dr. Paulo Hideo Nakano Rangel, pelos ensinamentos, disponibilidade e auxílio neste trabalho.
Aos Pesquisadores Dr. Giorgio Pappas, Dr. Roberto Togawa e Marcos Mota pelo grande auxilio e ensinamentos na parte de Bioinformática .
À EMBRAPA CENARGEN por toda infraestrutura, apoio, suporte financeiro e oportunidade no desenvolvimento deste trabalho.
À Universidade Católica de Brasília e aos meus Mestres pela opotunidade de compreensão e realização do curso.
A todos do Laboratório de Genética Vegetal. Aos meus colegas que fiz no laboratório e sempre serão lembrados, Adriana Custódio, Andréa Schimit,César Petroli, Ediene Golveia, Káren Vilarinho, Leandro Nogueira, Marco Aurélio Pessoa, Marco Antônio Ferreira, Marilia Pappas, Márcio Moretzon, Natália Lhamas, Túlio Lins, Regisley Durão, e Rodrigo Furtado pela grande parceria, amizade, momentos de descontração e boas risadas, e por toda ajuda que me foi dada. Em especial às minhas amigas Bruna Jaqueline, Carolina Sansaloni e Danielle Paiva pela maravilhosa amizade, grande carinho e palavras que me deram nas horas mais dolorosas. Obrigada pelo grande incentivo, apoio, ensino e ajuda. Amo Vocês .
Aos meus amigos: Carolina Evangelista, Ana Carolina Auler, Denise Lacerda, Fabíola Pessoa, Gabriela Toscano, Gláucia Pimentel, Gisele Gontijo, Kalina Maurer, Kelen Oliveira, Larissa Dias, Laura Prado, Lucas Marques, Mayra Braga, Marília Pimentel, Tiara Fialho, Sophia Gontijo, Sumaia Sampaio e Rachel Costa pela força, torcida e compreensão por minha ausência, ansiedade e impaciência durante o desenvolvimento e finalização deste trabalho.
compreensão me engradeceu a cada momento que passamos juntos. Obrigado por sua força, torcida, palavras, e encorajamento. Seu amor foi essencial por todas as dificuldades que passei até a conclusão deste mestrado. Te Amo muito.
Agradeço a minha família: meus irmãos, minha vó, meu pai, e especialmente minha mãe, a qual pude ter todo apoio em minha decisão, desde o auxílio financeiro, às
maravilhosas palavras e gestos de amor. Obrigada por sua compreensão e seu amor incondicional. Sem você nada disso seria concluído, meu eterno amor e agradecimentos.
LACERDA, Thaísa Sant´Anna. Desenvolvimento de painéis multiplex de marcadores microssatélites para seleção assistida para qualidade de grãos de arroz (Oryza sativa L.”, 230 páginas. Dissertação de Mestrado
em Ciências Genômicas e Biotecnologia – Universidade Católica de Brasília, Brasília-DF, 2009.
O sucesso de uma variedade de arroz depende cada vez mais da qualidade dos seus grãos. A culinária brasileira exige, em geral, variedades com grãos longos, finos e alta qualidade de características físico-químicas, resultando em grãos mais soltos após a cocção. Qualidade de grãos é uma característica complexa, controlada por vários genes. O amido representa 90% do peso seco do grão beneficiado de arroz. A estrutura do amido é composta por dois tipos de polissacarídeos: amilose e amilopectina. Portanto, a composição de amilose e amilopectina no endosperma influencia diretamente a qualidade do grão de arroz. As enzimas da via metabólica de amido são codificadas por genes distribuídos em vários cromossomos, como os genes da ADP-glucose pirofosforilase, da sintase de amido, e das enzimas de ramificação e de desramificação de amido. Variação alélica nestes genes ou na região destes genes, em desequilíbrio de ligação com as sequências codantes que afetam a produção de amido pode, em tese, ser usada para selecionar indiretamente para o aumento da qualidade de grãos de arroz. Isto é importante porque a avaliação de qualidade de grãos em etapas iniciais do programa de melhoramento é, na prática, difícil de ser realizada. Os procedimentos de análise de qualidade de grãos (teor de amilose aparente, temperatura de gelatinização; coesividade, textura, etc.) demandam razoável quantidade de sementes, em geral não disponíveis nas primeiras gerações do programa de melhoramento. E mesmo na etapa final, quando a quantidade de sementes é suficiente, a fenotipagem para qualidade de grãos é complexa e intensiva em mão-de-obra. Portanto, a seleção indireta baseada em marcadores moleculares pode ter efeito significativo no melhoramento para qualidade de grãos se genótipos superiores puderem ser selecionadas nas etapas iniciais do programa. Este trabalho teve por objetivo desenvolver painéis de marcadores microssatélites situados na região de genes da via metabólica de amido para uso em seleção assistida para qualidade de grãos. O objetivo foi desenvolver painéis de marcadores microssatélites com as seguintes características: (1) capacidade de amplificação simultânea de alelos em quatro ou mais locos microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido; (2) qualidade e repetibilidade dos produtos de PCR em análise de polimorfismo em seqüenciadores de DNA; (3) alto conteúdo informativo (PIC) e diversidade gênica esperada dos marcadores selecionados; (4) análise combinada de pelo menos uma dezena de locos da via metabólica de amido, ou seja, o conjunto de painéis multiplex deve possibilitar a análise indireta de polimorfismo de DNA na região de vários genes selecionados. Para isto, foram identificadas milhares de sequências microssatélites na região de 11 genes da via metabólica de amido. Nestas regiões genômicas foram selecionados dois microssatélites acima e dois abaixo de cada gene, a uma distância máxima 200 kpb da sequência codificante. Quarenta-e-quatro microssatélites, sendo quatro na região de cada um dos 11 genes, distribuídos em seis cromossomos, foram selecionados para análise. Iniciadores (primers) de PCR foram
com os demais (SBE-IIa.H4), permitindo o controle de genotipagem entre painéis e minimizando a possibilidade de erro humano durante os ensaios. O PIC médio estimado dos locos selecionados foi 0,609, variando de 0,128 a 0,891, e a Probablilidade de Exclusão combinada dos painéis multiplexes selecionados foi de 0,9965-Painel J; 0,993-Painel K; 0,999 0,993-Painel L e 0,9992 0,993-Painel M. Os painéis multiplexes foram validados para seleção para qualidade de grãos de arroz através de mapeamento de QTLs de componentes de qualidade de grãos e através de testes independência entre fenótipo e genótipo em amostras de acessos do Banco de Germoplasma de Arroz tomadas ao acaso. O mapeamento de QTLs foi realizado em uma população de linhagens puras recombinantes (RIL) derivada do cruzamento entre as cultivares Chorinho e Amaroo. Cinco (AGPS2.C4, Waxy.F4,SBE-I.G3,SBE-IIb.I3, SSIIa.L2) dos 34 locos microssatélites desenvolvidos apresentaram segregação alélica nesta população. A população foi fenotipada para sete componentes de qualidade de grãos: Teor de Amilose (TA), Temperatura de Gelatinização (TG), Centro Branco (CB), Largura do Grão (LG), Comprimento do Grão (CG), Rendimento de Benefício (RB) e Rendimento de Grãos Inteiros (RI). Foram detectados QTLs de qualidade de grãos na região dos microssatélites Waxy.F4 (Teor de Amilose e Centro Branco) e SSIIa.L2 (Temperatura de Gelatinização) no cromossomo 6, e AGPS2.C4 (Largura do Grão) no cromossomo 8. Outros QTLs de componentes de qualidade de grãos foram detectados para Comprimento do Grão (cromossomo 7), Largura do Grão (cromossomos 2, 7 e 9) e Centro Branco (cromossomos 1 e 11). Uma amostra de 23 acessos do Banco de Germoplasma foi caracterizada para os sete componentes de qualidade de grãos já descritos e genotipada com os 34 marcadores microssatélites. Em testes de independência entre genótipo e fenótipo, os marcadores AGPS1.A1, AGPS1.A2, Dbe.Pul.E3, SBE-IIa.H2, SBE-IIa.H3 e SBE-IIb.I2 permitiram a identificação dos acessos do Banco de Germoplasma com mais do que 22% de Teor de Amilose com grande acurácia. Merece destaque o marcador SBE-IIb.I2, com uma eficiência de 82% na identificação de acessos com alto e baixo Teor de Amilose no Banco de Germoplasma. Todos os acessos com genótipo 154/154 no marcador AGPS1.A1 apresentaram Teor de Amilose menor do que 22%. Para Largura do Grão, grande parte dos acessos testados com o marcador Dbe.Pul.E3 possui um índice de Largura do Grão maior do que 5,0 (largo a extra-largo). Já o marcador AGPS2.C4 permitiu a identificação da maioria dos acessos de grãos finos e extra-finos, com índice Largura do Grão menor do que 5,0 (genótipo 184/184). Os dados de mapeamento de QTLs na população RIL Chorinho x Amaroo e de avaliação genética de amostras do Banco de Germoplasma de arroz permitem concluir que os marcadores microssatélites desenvolvidos na região dos genes AGPS1, AGPS2,DBE-Pullulanase, Waxy, SBE-IIa e SSIIa da via metabólica de amido são informativos para emprego em seleção assistida para qualidade de grãos de arroz.
Palavras-chave: microssatélite, qualidade de grãos, teor de amilose, seleção assistida, temperatura de gelatinização.
ABSTRACT
genotyping control, minimizing the possibility of human error during the PCR assays. The estimated average PIC value of the loci studied was 0.609, ranging from 0.128 to 0.891, and the combined Probability of Exclusion of the selected panels were 0.9965(Panel J); 0.993(Panel K), 0.999 (Panel L) and 0.9992 (Panel M). The multiplex panels have been validated for selection for grain quality of rice by QTL mapping of grain quality traits and through genotype and phenotype independence tests based on random accessions of the Rice Germplasm Bank. QTL mapping was performed in a population of recombinant inbred lines (RIL) derived from the cross between the cultivars Chorinho and Amaroo. Five (AGPS2.C4, Waxy.F4, SBE-I.G3, SBE-IIb.I3, SSIIa.L2) of 34 microsatellite loci selected showed allelic segregation in this population. The population was phenotyped for seven traits: Amylose Content (TA), Gelatinization Gemperature (TG), White Center (CB), Grain Width (LG), Grain Length (CG), Grain Milling (RB), Whole Grain Milling and Grain Yield (RI). QTLs were detected for grain quality in the region of the microsatellites Waxy.F4 (Amylose Content and White Center) and SSIIa.L2 (Gelatinization Gemperature) on chromosome 6, and AGPS2.C4 (Grain Width) on chromosome 8. QTLs for other traits were detected in other genome regions, such as Grain Length (chromosome 7), Grain Width (chromosomes 2, 7 and 9) and White Center (chromosomes 1 and 11). A sample of 23 accessions of of the Rice Germplasm Bank was analised for the seven traits described above and genotyped with the 34 microsatellite markers. Independence tests using the markers AGPS1.A1, AGPS1.A2, Dbe.Pul.E3, SBE-IIa.H2, SBE-SBE-IIa.H3 and IIb.I2 allowed the identification of accessions of the Germplasm Bank with more than 22% of Amylose Content with great accuracy. Also noteworthy is the marker SBE-IIb.I2, with an efficiency of 82% in the identification of accessions with high and low Amylose Content in the gene bank. On locus AGPS1.A1, all accessions with the 154/154 marker genotype presented less than 22% of amylose contente. Most of the accessions tested with the marker Dbe.Pul.E3 had a Grain Width index greater than 5.0 (large to extra large grain). Marker AGPS2.C4 allowed the identification of most narrow and extra-thin grain accessions, with an index lower than 5.0 (genotype 184/184). The QTL mapping data of the RIL population Chorinho x Amaroo and the genetic evaluation of samples of the Rice Germplasm Bank suggest that the microsatellite markers developed in the region of the starch pathway genes AGPS1, AGPS2, DBE-pullulanase, Waxy, SBE-IIa and SSIIa are informative for use in assisted selection for grain quality of rice.
. Keywords:
1. MICROSSATELITE, GRAIN QUALITY, AMYLOSE CONTENT , GELATINIZATION TEMPERATURE, MARKER ASSISTED SELECTION, STARCH
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. (a) Estrutura do grão de arroz em corte transversal; (b) O beneficiamento do arroz consiste em retirar a casca (20% do peso seco) e camadas superficiais de tecido (resultando em farelo), para obter o grão polido. O amido representa cerca de 90% do peso seco do grão polido. ... 21 Figura 2- (a) A amilose é um polímero com cadeia linear contendo ligações glicosil α-1,4; (b) A amilopectina é um polímero ramificado, que consiste em cadeias lineares de resíduos
de glicose, contendo ligações α-1,4 e α-1,6. O conteúdo de amido e amilose na composição do amido afeta a qualidade do grão de arroz. ... 25 Figura 3 – (a) grãos não-glutinosos, rico em amilose, com aspecto translúcido; (b) grãos glutinosos, ricos em amilopectina, com aspecto opaco. ... 26 Figura 4 - Via metabólica de síntese de amido. ... 28 Figura 5. O gene waxy codifica a enzima UDP-glucosil transferase do grão de amido
(granule-bound starch synthase - GBSS), que atua na síntese de amilose no endosperma (triplóide) e no grão de pólen (haplóide) de arroz. A região codificante do gene waxy é
interrompida por 13 íntrons. As barras verticais hachuradas representam regiões que apresentam mutações detectadas que afetam o conteúdo de amilose na estrutura do amido do endosperma de arroz. ... 33 Figura 6- Fluxograma das atividades que foram realizadas no presente trabalho. ... 48 Figura 7- Esquema de distribuição dos 11 genes selecionados no genoma de arroz. ... 81 Figura 8- Ensaios de PCR com 34 marcadores microssatélites situados na região de genes da via metabólica de amido. DNA extraído da cultivar Nipponbare, referência em estudos genômicos de arroz, foi utilizado em reações com cada um dos marcadores individualmente, confirmando o tamanho esperado do produto de PCR em cada loco. ... 83 Figura 8- continuação ... 84 Figura 8- continuação ... 85 Figura 9 - (A) – Painel pentaplex com reação de PCR baseada em soluções preparadas no
Figura 22 – QTLs identificados para Largura do grão, nas linhagens do cruzamento de Chorinho e Amaroo, nos grupos de ligação 2 (A),7 (B), 8 (C), e 9 (D), por mapeamento de Intervalo Composto (cof. 8). O valor de LOD crítico utilizado como ponto de corte foi de 2,8, e está representado pela linha horizontal. A linha horizontal delimita o LOD crítico. .... 115 Figura 22 – Continuação. ... 117 Figura 23 – QTL identificado no cromossomo 7 para Comprimento do grão, nas linhagens do cruzamento de Amaroo e Chorinho, por Mapeamento de Intervalo Composto (cof. 8). O valor de LOD crítico utilizado como ponto de corte foi 6,2, e está representado pela linha horizontal. ... 119 Figura 24 – QTL associado à característica Temperatura de Gelatinização no grupo de ligação 6 através de mapeamento de Intervalo Composto (cof. 10) utilizando a população RIL Chorinho x Amaroo. O valor de LOD crítico utilizado como ponto de corte foi de 6,6 e está representado pela linha horizontal. ... 122 Figura 25 – QTL identificado para Teor de amilose, nas linhagens do cruzamento de Chorinho e Amaroo, no grupo de ligação 6 por mapeamento de Intervalo Composto (cof. 8). O valor de LOD crítico utilizado como ponto de corte foi de 6,5, e está representado pela linha horizontal. ... 124 Figura 26– Representação da localização de QTLs nos cromossomos de arroz significativamente associados a componentes de qualidade de grãos de arroz. Os QTLs detectados por análise de intervalo composto incluem regiões associadas ao controle de Centro Branco (CB), Teor de Amilose (TA), Largura do Grão (LG) e Comprimento do Grão (CG). ... 127 Figura 27- Dendrograma resultante da análise baseada na distância genética calculada por
“Shared Allele Distance” de 28 acessos de arroz com 405 marcadores de arroz do estoque do laboratorio, agrupados por UPGMA . ... 134 Figura 28- Dendrograma resultante da análise baseada na distância genética calculada por
“Shared Allele Distance” de 28 acessos de arroz com os 34 marcadores de síntese amido
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Composição química e valores energéticos do grão de arroz classe longo finos (por 100 gramas). ... 23 Tabela 2- Enzimas das via metabólica de amido e respectivos locos gênicos no genoma de arroz utilizadas no desenvolvimento de marcadores microssatélites para seleção assistida para qualidade de grãos. As letras abaixo do código de cada enzima (A-L) identificam cada loco gênico e os respectivos microssatélites localizados na região destes genes. ... 49 Tabela 3-Acessos do Banco de Germoplasma de Arroz usados na avaliação dos marcadores microssatélites selecionados na região de genes da via metabólica de amido. ... 55 Tabela 4 – Descrição do gene “Oryza sativa soluble starch synthase II-2” e dos locos de
Tabela 13 – Locos microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido com evidência de associação à característica Centro Branco, com base em valores estimados de
χ2 (com correção de Yates) e de testes exatos de Fisher. ... 109
Tabela 14- Marcadores associados à característica Centro Branco na população RIL Chorinho x Amaroo por análise de marca simples. ... 110 Tabela 15 – Detecção de QTLs da característica Centro Branco na população RIL Chorinho e Amaroo, através de Mapeamento de Intervalo Composto... 111 Tabela 16 – Locos microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido testados para associação com Largura do Grão de arroz, com base em valores estimados de χ2 (com
correção de Yates), de testes exatos de Fisher e regressão linear simples. ... 113 Tabela 17- Marcadores associados à característica Largura do Grão na população RIL Chorinho x Amaroo por análise de marca simples ... 114 Tabela 18- Dados sobre QTL para as características da Largura do Grão em população RIL Chorinho e Amaroo, detectados por Mapeamento de Intervalo Simples. ... 114 Tabela 19- Dados sobre QTLs para as características de Largura do grão em linhagens do cruzamento entre Amaroo e Chorinho, detectados por Mapeamento de Intervalo Composto.114 Tabela 20- Marcadores associados à característica Comprimento do Grão na população RIL Chorinho x Amaroo por análise de marca simples ... 118 Tabela 21- Dados sobre QTL para as características de comprimento do grão em linhagens do cruzamento entre Amaroo e Chorinho, detectados por Mapeamento de Intervalo Composto. ... 119 Tabela 22 – Locos microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido testados para associação com temperatura de gelatinização, com base em valores estimados de χ2
(com correção de Yates), de testes exatos de Fisher e regressão linear simples. ... 120 Tabela 23- Marcadores associados à característica Temperatura de Gelatinização na população RIL Chorinho x Amaroo por análise de marca simples. ... 120 Tabela 24- Dados sobre QTL para as características de temperatura de gelatinização em linhagens do cruzamento entre Amaroo e Chorinho, detectados por Mapeamento de Intervalo Simples. ... 120 Tabela 25- Dados sobre QTL para as características de temperatura de gelatinização em linhagens do cruzamento entre Chorinho e Amaroo detectados por Mapeamento de Intervalo Composto. ... 121 Tabela 26 – Locos microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido testados para associação com Teor de amilose de arroz, com base em valores estimados de χ2 (com
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 20
1.1- Cultura do arroz ... 20
1.2 – Qualidade de grãos ... 20
1.2.1-O amido na qualidade de grão ... 23
1.2.3 Enzimas da via metabólica de amido ... 27
1.2.3.1 ADP-Glucose pirofosforilase ... 28
1.2.3.2 Sintases de Amido ... 30
1.2.3.3 Enzima de ramificação do amido ... 36
1.2.3.4 Enzima de Desramificação do amido ... 36
1.3. Fenotipagem: Técnicas usadas na avaliação de qualidade de grãos de arroz ... 37
1.3.1 Teor de amilose ... 37
1.3.2 Temperatura de Gelatinização ... 39
1.3.3- Centro Branco ... 40
1.3.4-Rendimento de Beneficiamento (RB) ... 42
1.3.5 Rendimento de grãos inteiros (RI) ... 42
1.3.6 Comprimento do Grão (CG) e Largura do Grão (LG) ... 43
1.4- Melhoramento para qualidade de grãos e seleção assistida por marcadores moleculares. ... 43
HIPÓTESES ... 46
OBJETIVO GERAL ... 47
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 47
2-MATERIAIS E MÉTODOS ... 48
2.1. Desenvolvimento de marcadores microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido ... 48
2.1.1 Busca de seqüências microssatélites na região de genes da via metabólica amido em bases de dados genômicas ... 48
2.1.2- Identificação e seleção de microssatélites nas regiões de genes que codificam enzimas da via metabólica de amido ... 50
2.1.3-Desenho de iniciadores de PCR de marcadores microssatélites identificados na região de genes da via metabólica de amido. ... 51
2.2.1 Detecção de fragmentos amplificados via PCR ... 52
2.3 Avaliação de polimorfismo em locos microssatélites situados na região de genes da via metabólica de amido ... 53
2.2.1 Germoplasma de arroz utilizado na genotipagem com marcadores microssatélites ... 54
2.2.4. Estatísticas descritivas de locos de marcadores microssatélites ... 58
2.3. Desenvolvimento e validação de painéis multiplex de locos microssatélites ... 58
2.3.1. Combinação de locos marcadores em painéis multiplex ... 58
2.3.2. Avaliação da qualidade dos painéis multiplex de marcadores microssatélites . 59 2.3.2 Validação genética de painéis multiplex para seleção para qualidade de grãos de arroz. ... 60
2.3.2.1 Mapeamento de QTLs de qualidade de grãos utilizando uma população de linhagens puras recombinantes (RIL) derivada do cruzamento entre Chorinho x Amaroo. ... 60
2.3.2.2. Fenotipagem de componentes de qualidade de grãos de arroz da população RIL Chorinho x Amaroo. ... 61
2.3.2.1. Testes de independência entre genótipo e fenótipo em acessos de arroz amostrados no Banco de Germoplasma... 66
3.-RESULTADOS E DISCUSSÃO. ... 68
3.1. Desenvolvimento de marcadores microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido. ... 68
3.1.1. Identificação e seleção de microssatélites nas regiões gênicas do genoma de arroz que codificam enzimas da via metabólica de amido. ... 68
3.1.2. Detecção de fragmentos amplificados via PCR nos 44 locos microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido ... 82
3.1.3. Avaliação de polimorfismo e estatísticas descritivas de locos de marcadores microssatélites situados na região de genes da via metabólica de amido. ... 86
3.1.4. Desenvolvimento de painéis multiplex de locos microssatélites... 89
3.1.5. Avaliação do conteúdo informativo dos painéis multiplex de marcadores microssatélites. ... 95
3.2. Validação genética de locos e painéis multiplex para seleção para qualidade de grãos de arroz. ... 96
3.2.1. Mapeamento genético de QTLs associados à qualidade de grãos na população de linhagens puras recombinantes (RILs) derivada do cruzamento entre Chorinho x Amaroo. ... 97
3.2.1.1. Fenotipagem de qualidade de grãos na população RIL Chorinho x Amaroo. ... 97
3.2.1.2. Genotipagem e mapa genético da população RIL Chorinho x Amaroo. .. 105
3.2.2- Teste de marcadores microssatélites situados na região de genes da via
metabólica de amido na identificação de componentes de qualidade de grãos em uma
amotra de acessos do Banco de Germoplasma de Arroz. ... 128
.4-.SÍNTESE E CONCLUSÕES ... 138
5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: ... 141
ANEXO 1 ... 161
ANEXO 2 ... 233
1. Introdução
1.1- Cultura do arroz
O arroz (Oryza spp.) é uma planta da família das gramíneas que serve como alimento
para dois terços da população humana. O gênero Oryza é constituído por aproximadamente 23
espécies distribuídas em todos os continentes (Vaughan et. al., 2003). Apenas duas espécies são cultivadas (O. sativa e O. glaberrima), embora introgressões de genes de importância
econômica venham sendo há muito realizadas, especialmente dos parentes silvestres para O. sativa. O arroz cultivado (Oryza sativa L.) é dividido em duas subespécies (indica e japonica), plantado em diferentes sistemas de cultivo. A área plantada com arroz no mundo
atinge cerca de 150 milhões de hectares a cada ano, produzindo 593 milhões de toneladas de grãos. Deste total, mais de75% é procedente do sistema de cultivo irrigado. O Brasil ocupa o décimo lugar em produção, com cerca de 12 milhões de toneladas e ocupa a nona maior área de plantio (IBGE, 2008). Os sistemas de cultivo mais disseminados no país são os sistemas irrigado, responsável por ~70% do arroz produzido, e de sequeiro (também conhecido como cultivo de terras altas), responsável por cerca de 30%.
O arroz junto com o feijão são alimentos com alto balanceamento nutricional, desempenhando um importante papel como componente da dieta básica em todas as classes sociais e faixas etárias no Brasil. É uma cultura que se adapta a diferentes condições de solo e clima, com grande demanda em todo o mundo e grande impacto econômico (FERREIRA et al., 2005). A lavoura de arroz tem um importante papel na economia do Brasil. No ano 2000, o valor da produção chegou a R$ 3,34 bilhões, representando 6,7% do valor bruto da produção agrícola nacional (R$ 49,75 bilhões) (Embrapa Clima Temperado, 2005).
1.2 – Qualidade de grãos
camada de aleurona) (Figura 1). A forma de grão de arroz mais consumida no mundo é o arroz branco ou beneficiado. O beneficiamento do arroz consiste em retirar a casca e camadas superficiais de tecido (farelo), para obter o grão polido (Figura 1). Aproximadamente 90% do peso seco do grão polido é amido. A composição e estrutura do amido no grão, portanto, tem forte impacto na qualidade do grão de arroz. O conhecimento da composição e estrutura, e do seu controle genético, tem, pois, grande importância no melhoramento para qualidade de grãos de arroz.
Figura 1. (a) Estrutura do grão de arroz em corte transversal; (b) O beneficiamento do arroz consiste em retirar a casca (20% do peso seco) e camadas superficiais de tecido (resultando em farelo), para obter o grão polido. O amido representa cerca de 90% do peso seco do grão polido. Fonte : www.colegiosaofrancisco.com.br/alfa/arroz/
pela estrutura final do amido no endosperma. A manipulação destas vias metabólicas pode resultar em melhorias significativas no valor nutritivo do grão (Mazur et al., 1999; Ye et al., 2000).
Outras características referentes à qualidade de grãos que constituem parâmetros significativos na determinação do valor de comercialização são: (1) rendimento de benefício (percentual de grãos inteiros e quebrados, resultante do beneficiamento do arroz em casca); (2) rendimento de grãos inteiros (percentual de grãos inteiros no produto comercial); (3) aspecto geral do grão e (4) dimensões do grão. As dimensões do grão consideradas para fins de classificação comercial incluem o comprimento, espessura e relação comprimento/largura. Estas medidas possibilitam a classificação do grão comercial de arroz em longo fino, longo, médio, curto e misturado (Ferreira et al., 2005). O longo fino é a classe de grãos preferida pelo consumidor brasileiro.
1.2.1-O amido na qualidade de grão
O grão de arroz é composto por água, proteínas, fibras, lipídios, carboidratos e sais minerais (Tabela 1). O amido representa a maior parte do carboidrato estocado no grão de arroz. O conhecimento do controle genético do conteúdo e composição estrutural de amido no grão tem, portanto, grande impacto na qualidade de grãos de arroz.
Tabela 1- Composição química e valores energéticos do grão de arroz classe longo finos (por 100 gramas).
Composição INTEGRAL POLIDO PARBOILIZADO
Crú Cozido Crú Cozido Crú Cozido Água (g) 10.37 73,09 11.62 68,44 9,7 70,36 Energia alimentar (kcal) 370 111 365 130 374 123
Proteínas (g) 7,94 2,58 7,13 2,69 8,11 2,91 Lipídios (g) 2,92 0,9 0,66 0,28 1,04 0,37 Carboidratos (g) 77,24 22,96 79,95 28,17 80,43 26,05
Fibras (g) 3,5 1,8 1,3 0,4 2,2 0,9
Açúcar total (g) 0,85 0,35 0,12 0,05 0,33 0,11
Fonte: USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 21 (2008)
O amido é fonte de energia em espécies de grande importância alimentícia como cereais (arroz, milho, trigo), mandioca ou batata. As reservas de amido da planta são compostas por dois tipos de polissacarídeos (homopolímeros): a amilopectina e a amilose. Tanto a amilose quanto a amilopectina são importantes para determinar a qualidade do grão de arroz (Asoaka et al., 1985; Reddy et al., 1993). A amilose, em menor concentração no amido (<30%), consiste em cadeias lineares de ligação α-1,4 (Figura 2).
testes simples de coloração com solução de iodo. As moléculas do iodo se ligam ordenadamente dentro da estrutura helicoidal formada pela amilose. Na presença da amilose, uma cor azul-escuro é observada em reação com o iodo.
A amilopectina é o polímero mais abundante do amido, caracterizado por cadeias lineares de monômeros de glucosil com ligação α-1,4 e por cadeias ramificadas com ligações
α-1,6 (Figura 2). A amilopectina possui um alto grau de organização estrutural, onde regiões sem ramificação alternam com regiões altamente ramificadas. O comprimento médio da cadeia ramificada é de aproximadamente 12 a 14 unidades de glicose. A amilopectina compõe aproximadamente 65% a 85% do amido de estocagem e esta estrutura é responsável pela organização cristalina do amido granular (Gallant e al., 1997). O conteúdo da amilopectina no amido é responsável pelas variações nas propriedades funcionais do amido entre espécies (arroz vs batata vs milho), tecidos (pericarpo vs endosperma) e background genéticos (arroz indica e japonica) (Nakamura et al., 2005). A amilopectina não apresenta estrutura helicoidal
e, devido à presença das ramificações, a interação com a solução de iodo é menor, resultando em coloração em tons de azul menos intensos.
As cadeias de amilopectina são geralmente classificadas em três tipos A, B e C. O tipo A é composto por uma cadeia não-redutora de glicoses unidas por ligações α-1,4 sem
ramificações, sendo unida a uma cadeia tipo B por meio de ligações α-1,6. As cadeias do tipo
B são compostas por glicoses ligadas em α-1,4 e α-1,6, contendo uma ou várias cadeias tipo A e podem conter cadeias tipo B unidas por meio de um grupo hidroxila primário. A cadeia C é única em uma molécula de amilopectina, sendo composta por ligações α-1,4 e α-1,6, com grupamento terminal redutor (Eliasson, 1996; Vandeputte & Delcour, 2004; Lajolo & Menezes, 2006).
cozimento, permanecem firmes e pegajosos, como convém à culinária do leste asiático, como a japonesa.
Figura 2- (a) A amilose é um polímero com cadeia linear contendo ligações glicosil α-1,4; (b) A amilopectina é um polímero ramificado, que consiste em cadeias lineares de resíduos de glicose, contendo ligações α-1,4 e α -1,6. O conteúdo de amido e amilose na composição do amido afeta a qualidade do grão de arroz.
ao translúcido, não-glutinoso, das cultivares de arroz com maior conteúdo de amilose no grão (Figura 3).
(a)
(b)
Figura 3 – (a) grãos não-glutinosos, rico em amilose, com aspecto translúcido; (b) grãos glutinosos, ricos em amilopectina, com aspecto opaco.
A fenotipagem vem sendo feita classicamente também com tratamento de iodeto de potássio no endosperma ou no grão de pólen para quantificar a presença de amido. Mais recentemente, o conteúdo de amilose, amilolopectina, açúcares livres e de amido no endosperma vem sendo mensurado por NIRS (near infrared reflectance spectroscopy, HPLC
e ensaios enzimáticos (Ebermann & Schwarz, 1975, Delwiche et al., 1995).
(Figura 4). A identificação das enzimas que participam da via metabólica de amido vem sendo feita ao longo da história da bioquímica de diferentes espécies de plantas. Recentes experimentos de expressão gênica com microarranjos de DNA confirmam um padrão de expressão específica de alguns genes da família do amido em tecido do endosperma de arroz (Zhu et al., 2003).
1.2.3 Enzimas da via metabólica de amido
A biossíntese do amido em plantas superiores é catalisada por enzimas presentes nos cloroplastos e amiloplastos, divididos em 4 classes: (1) ADP-Glucose pirofosforilase e isomerase (catálise de substrato -AGPase), (2) sintase do amido (elongamento da cadeia de glicose; SS –starch synthase), (3) enzima de ramificação do amido (ramificação da cadeia de
glicose –BE ou “branching enzyme”) e (4) enzima de desramificação do amido (linearização
da cadeia de glicose - DBE) (Smith et al., 1997; Myers et al., 2000; Nakamura, 2002). Essas enzimas são divididas em algumas isoformas e codificadas por diferentes genes em cromossomos distintos, como será visto a seguir.
Figura 4 - Via metabólica de síntese de amido.
1.2.3.1 ADP-Glucose pirofosforilase
Adenosina 5' difosfato glucose pirofosforilase (Adenosine 5' diphosphate glucose pyrophosphorylase ou AGPase, EC 2.7.7.27 ) catalisa uma etapa importante na biossíntese do
amido de plantas superiores. Esta enzima é responsável pela primeira reação que controla o fluxo do carbono na via do amido nas plantas (Slattery et. al., 2000; Ballicora et al., 2004; Kleczkowski et al., 2000) (Figura 4). É responsável pela síntese do precursor ADP-glucose (ADP-D-glucose ou ADP-Glc) que age como um doador glicosil nas reações catalisadas pelas
sintases de amido (EC 2.4.1.21).
planta superiores (Giroux et al., 1996; Stark et al., 1992). Além de catalisar a primeira etapa da via do amido, as AGPases também participam do controle do metabolismo do carbono. Em tecidos fotossintéticos como a folha, o controle da AGPase é um dos vários reguladores das etapas que regem a divisão do carbono entre a sacarose e o amido (Heldt et al.,1977). A maioria das AGPases são sujeitas a regulação alostérica pelo 3-fosfoglicerato (phosphoglycerate-3 ou 3-PGA, um ativador) e pelo fosfato inorgânico (Pi, um inibidor)
(Preiss & Sivak.,1996).
A AGPase possui função similar em tecidos fotossintéticos e não fotossintéticos, tais como sementes, tubérculos e frutas. Geralmente, em células de plantas superiores a ação da AGPase ocorre exclusivamente nos plastídios.Nos tubérculos da batata (Kim et al., 1989) e ervilha (Denyer & Smith,1988) a enzima é localizada no plastídeo. Em sementes de cevada e de milho, a atividade predominante de AGPase é localizada no citoplasma (Denyer et. al., 1996, Thorbjornsen et. al.,1996) ou na superfície do amiloplasto (Brangon et al., 1996). Análises de atividades enzimáticas indicaram que a maioria das AGPases no endosperma do arroz apresentaram propriedades de regulação alostérica semelhantes às observadas nos plastídeos das folhas, porém está localizada em um outro compartimento célular, o citoplasma (Sikka et al., 2001).
A forma heterotetrâmica da AGPase consiste em dois componentes: um par de subunidades grandes (LS- large subunit) e um par de subunidades pequenas (SS- small subunit) (Iglesias et al., 1993). Experimentos realizados com batata (Solanum tuberosum L.)
atribuíram funções distintas para as duas subunidades. O par de subunidades maior (LS) possui função reguladora enquanto o menor (SS) possui função catalítica. Entretanto, estudos recentes de mutagênesis sugerem que a SS-AGPase teria uma importância maior na regulação enquanto a principal função do LS-AGPase seria modular as propriedades regulatórias da subunidade menor (Ballicora et al., 1998; Frueauf et al., 2003). Aparentemente, portanto, ambas as subunidades apresentam propriedades regulatórias da enzima (Cross et al., 2004). Variação alélica nos genes AGPase-LS e AGPase-SS e o efeito deste polimorfismo no conteúdo de amido do endosperma ainda não foram descritos.
codificam uma ou as duas subunidades, e exibem diferentes padrões de expressão que são consideravéis entre espécies. Em batata foram identificados quatro transcritos diferentes, três que codificam a LS-AGPase (todos expressos no tubérculo e dois destes também com expressão nas folhas), e um que codifica SS-AGPase (La Cognata et al., 1995). A expressão de cada um destes genes é regulada diferentemente pela fase de desenvolvimento e por sinais metabólicos (Müller-Röber et al.,1990; Nakata et al., 1996). No feijão, um gene da LS-AGPase e dois genes de SS-LS-AGPase são expressos no embrião (Weber et al., 1995). Estes últimos mostram diferentes padrões de expressão temporal e espacial no desenvolvimento embrionário (Weber et al., 1995).
No milho há evidência de três genes que codificam SS-AGPase e dois que codificam LS-AGPase. Os transcritos de um gene SS-AGPase (BRITTLE2) foram detectados somente
no endosperma, porém os transcritos de um segundo gene (AGP1) foram localizados no
embrião e em baixos níveis nos plastídeos do endosperma (Denyer et al., 1996). A expressão de um terceiro gene foi detectada somente na folha (Giroux & Hannah, 1994; Prioul et al., 1994). Em cevada existem dois genes que codificam LS-AGPase (um expresso somente no endosperma e outro principalmente na folha) e apenas um que codifica SS-AGPase (Thorbjørnsen et al., 1996, Villand et al., 1992).
Em arroz, a família gênica de AGPase é composta por dois genes que codificam SS-AGPase: OsAGPS1 no cromossomo 9 (Sasaki et al., 2007), e OsAGPS2, no cromossomo 8 (Kikuchi et al., 2003) e quatro genes para LS-AGPase: OsAGPL1, no cromossomo 5, OsAGPL2 no cromossomo 1, OsAGPL3 no cromossomo 3 (Kavakli et al., 1996), e OsAGPL4 no cromossomo 7 (Sasaki et al., 2001; Akihiro et al., 2005; Hirose et al., 2006).
1.2.3.2 Sintases de Amido
As sintases do amido são encontradas associadas aos grãos de amido nos plastídeos (GBSS – granule bound starch synthase) ou no estroma dos plastídeos (SSS - soluble starch synthase), starch synthase). Dados recentes indicam que a GBSS atua diretamente na
existência de uma família gênica de sintase de amido onde vários genes codificam diferentes isoformas da enzima. As sintases do amido catalisam a etapa da reação de elongação da
cadeia α-1,4 na síntese do amido, transferindo uma unidade de glicose da ADP- glucose para terminação não- redutora da cadeia α-1,4 (Figura 4).
GBSS - A enzima sintase granular de amido (GBSS ou granule bound starch synthases) é a grande responsável pela síntese de amilose nas cultivares de arroz. O gene
GBSSI é mais conhecido como waxy (wx), ou “glutinoso”, localizado no cromossomo 6. O
gene waxy codifica a enzima UDP-glucosil transferase do grão de amido (granule-bound starch synthase - GBSS), que atua na síntese de amilose no endosperma (triplóide) e no grão
de pólen (haplóide) de arroz (Figura 4).
Evidência genética de controle de síntese de amido em arroz por um gene maior e vários genes modificadores foi claramente indicada há vários anos (Bollich & Webb, 1973). Posteriormente, com base na análise do conteúdo de proteína Wx em arroz, foi proposta a existência de dois alelos funcionais no gene waxy (Wxa e Wxb), responsáveis por alto e baixo
conteúdo de amilose, respectivamente, em arroz não glutinoso (Sano 1984). A análise genética de conteúdo de amilose em sementes F1, F2 e RC1 (retrocruzamento 1) em cruzamentos recíprocos de cultivares com baixo conteúdo de amilose (Kumar & Khush, 1988; Villareal & Juliano; 1989) confirmou que as cultivares de arroz possuem dois tipos alelos:
Wxa, correlacionado com alto conteúdo de proteína Wx e de amilose no endosperma,
comumente encontrado em cultivares da subespécie indica e Wxb, correlacionado com baixo
conteúdo de proteína Wx e de amilose no endosperma, encontrado com mais frequência em cultivares da subespécie japonica. Evidência indireta proveniente de estudos moleculares
comparando polimorfismo do gene waxy de milho e de arroz também corroboraram a
influência um gene maior na composição de amilose de endosperma de arroz. Em milho, a região do gene waxy possui estrutura altamente variável: inserções e deleções espontâneas
foram identificadas (Wessler & Veragona, 1985), especialmente na região flanqueadora 3’. O gene waxy em arroz é menos variável do ponto de vista estrutural do que em milho.
No germoplasma de arroz não glutinoso observa-se entre as cultivares uma grande variação de conteúdo do produto do gene waxy, a proteína Wx, bem como do conteúdo de
amilose. O alelo Wxa é tipicamente encontrado em cultivares da subespécie indica, que
geralmente encontrado em cultivares da subespécie japonica, que possuem um percentual de
amilose geralmente inferior a 18% do amido total.
O gene waxy foi clonado em diferentes cultivares da espécie (Wang et al., 1990; Wang
et al., 1994). A sequência codificante do gene waxy em arroz é interrompida por 13 introns
(Figura 5),sendo que o intron 1 é o maior deles (1,1 kpb) (Hirano & Sano, 1991; Wang et al., 1995). Análise molecular do loco waxy indicou que a diferença de expressão dos alelos Wxa e Wxb é causada por uma substituição de base única, ou SNP (single nucleotide polymorphism),
que ocorre no sítio doador de processamento (splice donor site) do primeiro íntron do gene.
O alelo Wxa possui a sequência 5’-AGGTATA na junção do sítio de processamento do íntron
1, enquanto o alelo Wxb possui a sequência5’-AGTTATA (Bligh et al., 1998; Cai et al., 1998;
Hirano et al., 1998; Isshiki et al., 1998). A substituição de uma base nitrogenada contribui para o decréscimo da eficiência de processamento do pré-mRNA e diminui a quantidade de amilose nas cultivares homozigotas Wxb (Cai et al., 1998; Hirano et al., 1998; Issiki et al.,
1998). A diminuição de amilose, portanto, afeta diretamente a qualidade do grão. Análise do germoplasma de arroz indica que a mutação G para T no íntron 1 de waxy explica 79,7% da
variação de conteúdo de amilose em arroz não glutinoso (Ayres et al., 1997). A expressão do alelo Wxb é ativada por baixas temperaturas durante o desenvolvimento do grão (Sano et al., 1985;), causando um maior conteúdo de amilose nas cultivares homozigotas para Wxb nestas
condições (Larkin & Park, 1999). Com base nestes estudos, os cultivares comerciais de arroz são classificados em três grupos, de acordo com o conteúdo de amilose no endosperma (Wang et al., 1995):
(a) Grupo 1 – arroz não glutinoso, caracterizado pela presença do alelo Wxa. Possui alto
conteúdo de amilose (>18%), observando-se processamento (excisão) completa do íntron 1 (~1,1 kb) do transcrito pré-mRNA (3,34kb), formando mRNA maduro (2,3 kb) do gene Wx. Detecta-se a presença de proteína Wx no endosperma do grão em desenvolvimento;
(b) Grupo 2 – arroz não glutinoso, caracterizado pela presença do alelo Wxb. Possui níveis
baixo a intermediário de amilose (2-18%) (Ayres et al., 1997), observando-se processamento parcial do íntron 1 e, portanto, detecção de transcritos mRNA maduro (2,3 kb) e pré-mRNA (3,4 kb) do gene waxy. Detecta-se a presença moderada de proteína Wx (~10 vezes menos que em cultivares do grupo 1). Estima-se que 74% dos
(c) Grupo 3 – arroz glutinoso, não produz amilose (endosperma glutinoso, 0% de amilose). Possui apenas transcrito mRNA maduro (3,4 kb) do gene Wx, com íntron 1 intacto no mRNA maduro. Não apresenta proteína Wx. Apesar do mRNA maduro ser
poliadelinado, a tradução não ocorre em cultivares de arroz deste grupo. Possui os dois tipos de alelos (Wxa e Wxb) classificados de acordo com o SNP na junção do sítio de
processamento do intron 1. Portanto, existem cultivares glutinosos com Wxb e também
com Wxa (em menor percentual) (Yamanaka, 2004). Isto indica que nas cultivares
glutinosas o endosperma waxy não é regulado pelo SNP observado no intron 1. Um
mutante nulo para glutinoso (wxCI 9972) apresenta, por exemplo, um transcrito gênico 200 pb menor (Okagaki & Wessler, 1988). Isto poderia indicar a presença de deleção no alelo glutinoso, afetando radicalmente a produção de amilose.
Portanto, os alelos Wxa e Wxb não explicam toda a variação de conteúdo de amilose no
arroz não glutinoso. Os dois alelos (Wxa e Wxb) também não são suficientes para classificação
dos cultivares nas subespécies indica (alelo Wxa) e japonica (alelo Wxb), visto que algumas
variedades indica possuem menor conteúdo de amilose do que variedades japonica. Além
disso, ao introduzir o alelo Wxb em uma cultivar indica, observa-se uma redução de conteúdo
de amilose a valores inferiores ao observado pelo mesmo alelo em background japonica, o
que indica a presença de modificadores na expressão gênica (Mikami et al., 2000). Já o controle genético do fenótipo glutinoso não é conhecido.
Figura 5. O gene waxy codifica a enzima UDP-glucosil transferase do grão de amido (granule-bound starch
synthase - GBSS), que atua na síntese de amilose no endosperma (triplóide) e no grão de pólen (haplóide) de arroz. A região codificante do gene waxy é interrompida por 13 íntrons. As barras verticais hachuradas
representam regiões que apresentam mutações detectadas que afetam o conteúdo de amilose na estrutura do amido do endosperma de arroz.
O intron 1 do gene waxy possui um microssatélite (RM190=(CT)n), localizado 55 pb
junção de processamento do íntron 1, que explica parte das variação de conteúdo de amilose no endosperma. Outro estudo confirma que a diversidade alélica no microssatélite RM190 explica cerca de 90% da variação de conteúdo de amilose em uma coleção de 198 cultivares e linhagens de arroz cultivadas em diferentes locais dos EUA (Bergman et al., 2001). Este microssatélite, portanto, pode ser usado como critério de seleção para desenvolver cultivares de arroz com maior ou menor conteúdo de amilose.
Contudo, é importante mencionar que o desequilíbrio de ligação é extenso em arroz, cobrindo regiões de até 200 kb (Mather et al., 2007). Portanto, é razoável supor que outras variações da região do gene waxy associadas com variação alélica no loco RM190, poderiam
contribuir também para variações no conteúdo de amilose. É possível, pois, que a identificação outros microssatélites na região do gene waxy, cobrindo extensões maiores,
possa facilitar o processo de seleção assistida nos programas de melhoramento.
Sintase de Amido - Estudos bioquímicos e genéticos indicam que são encontrados em plantas quatro tipos de SS –soluble synthase (ou SSS - soluble starch synthase), SS, isto é,
SSI, SSII, SSIII, e SSIV- alguns tipos têm múltiplas isoformas que variam entre espécies (Boyer &, Preiss ,1981; Martin & Smith, 1995). Em arroz, 10 isoenzimas de sintase de amido foram descritas (Hirose and Terao, 2004): SSI (cromossomo 6), SSII-1ou SSIIc (cromossomo 10), SSII-2 ou SSIIb (cromossomo 2), SSII-3 ou SSIIa (cromossomo 6), SSIII-1 ou SSIIIb (cromossomo 4), SSIII-2 ou SSIIIa (cromossomo 8), SSIV-1 ou SSIVa (cromossomo 1), SSIV-2 ou SSIVb (cromossomo 5), GBSSI /waxy (cromossomo 6) e GBSSII (cromossomo 7).
A expressão de genes de sintase de amido tem regulação espaço-temporal. Os genes SSIIb, SSIII-1 e GBSSII são expressos mais cedo no desenvolvimento do pericarpo do grão (cariopses). Por outro lado, os genes SSIIa; SSIIb e waxy, responsáveis pelo acúmulo de
amido no endosperma, são expressos mais tarde. Outros genes de sintase do amido são expressos durante todo o desenvolvimento (SSI, SSII-1, SSIV-1 e SSIV-2) (Hirose & Terao, 2004).
estruturais na amilopectina, levando ao aumento de temperatura de gelatinização do amido no endosperma. Tem sido sugerido, desta forma, que SSI está envolvida no controle da síntese de cadeia longa de amilopectina (Nishi et al., 2001).
SSII tem um papel específico na síntese de cadeia de comprimento intermediário a longo de amido (Fontaine et al., 1993; Craig et al., 1998; Edwards et al., 1999a; Morell et al., 2003). Experimentos com mutantes de milho e batata demonstraram que a supressão da atividade de SSII leva à redução da síntese da amilopectina e, conseqüentemente, à diminuição do desenvolvimento de cadeias longas de amido. A enzima está provavelmente envolvida na formação de cadeias mais longas de amilopectina (Gao et al., 1998; Edwards et al., 1999b). Resultado de análises de mapeamento gênico em arroz sugeriram o gene SSIIa (SSII) (localizados no loco alk no cromossomo 6), como responsável pelas diferenças na
estrutura da amilopectina entre duas variedades de arroz, Nipponbare (japonica) e Kasalath
(indica) (Umemoto et al., 2002). Foram encontrados alguns aminoácidos de SSII-a,
identificados pela análise de SNP, em diversas linhagens de arroz cultivado, como candidatos responsáveis pelos diferentes níveis da atividade de SSII, mas nenhuma evidência foi comprovada (Umemoto et al., 2004).
Estudos anteriores mostraram a existência de diferenças na sequência do gene da enzima SSIIa, que são responsáveis pela diferença na estrutura da amilopectina entre indica e japonica (Umemoto et al., 2002). A enzima é responsável pelo alongamento de cadeias curtas
da amilopectina. Diferentes alelos de SSIIa no arroz contribuem para a diferença na estrutura da amilopectina, levando a diferentes temperaturas gelatinização do amido (Umemoto et al., 2002). O gene OsSSIIa pode ser o responsável pelas diferenças entre as variedades Nipponbare (japonica), e Kasalath (indica), em termos de distribuição do comprimento de
cadeia da amilopectina e de propriedades físico-químicas do amido (Umemoto et al., 2002).
A isoforma SSIII compreende a atividade total solúvel das sintases de amido (ou SSS
-soluble starch synthase), e é responsável pela síntese de amilopectina atual na fração solúvel
1.2.3.3 Enzima de ramificação do amido
A enzima de ramificação de amido (Starch Branching Enzyme - SBE) gera ligações α
-1,6 na molécula de amido e possui funções essenciais na biossíntese da amilopectina (Smith et al., 1997). Duas classes de SBE são reconhecidas: SBEI, responsável por ramificações mais longas na cadeia de amido e SBEII, responsável por ramificações mais curtas. SBEII, por sua vez, possui duas isoformas (SBEIIa e SBEIIb), também relacionadas com a adição de ramificações relativamente mais curtas (SBEIIa) ou mais longas (SBEIIb) (Mizuno et al., 2001; Gao et al., 1998). A isoforma SBEI tem função de síntese de ramificações mais longas, teve seu gene mapeado no cromossomo 6 (Nakamura et al., 1994), porém posicionado distante do locos alk citado anteriormente (Umemoto et al., 2002).
Estudos recentes com marcadores microssatelites no intron 2 do gene SBE-I (Kawasaki et al., 1993) em acessos de indica e japonica resultaram em 3 alelos: SBE-A
(CTCTCGGGCGA...(CT)10); SBE-B (CTCTCGGGCGA...(CT)8); SBE-C ( (CT)8). Análise
do germoplasma de arroz na sequência do gene SBE-I sugere que o alelo SBE-A é exclusivo
do arroz indica, e os alelos SBE-B e SBE-C são exclusivos de japonica. Esta associação
alélica com as subespécies possibilita a diferenciação entre indica e japonica em linhagens
melhoradas (Bao et al., 2002).
O loco BEIIa (que codifica isoforma SBEIIa) de arroz (também designado como QEIIb por Yamanouchi & Nakamura, 1992, e SBE4 por Mizuno et al., 1992) foi localizado no cromossomo 4 (Umemoto et al., 2002). Já SBEIIb do arroz, designado também como QEIIa (por Yamanouchi & Nakamura, 1992) ou SBE3 (Mizuno et al., 1992), foi mapeado no cromossomo 2 (Harrington et al.,1997). SBEIIb é classicamente conhecido em arroz como ae
(amylose extender) devido ao alelo presente identificado neste loco que é responsável pelo
aumento da proporção de amilopectina no endosperma (Nishi et al., 2001). SBEII também afeta a expressão da enzima SSI.
1.2.3.4 Enzima de Desramificação do amido
também participam do metabolismo de amido. Há duas famílias de DBEs em plantas atuando na hidrólise de ligações α-1,6: isoamilases e pululanases. Mutações no loco DBE-isolamilase estão classicamente associadas ao loco sugary1 (ou su1), cujo fenótipo é caracterizado pelo
acúmulo de fitoglicogênio (polissacarídeo solúvel em água típico de milho doce) e redução de conteúdo de amido. Em arroz, o loco DBE-isoamilase tem possivelmente o papel na síntese de amilopectina, eliminando ramificações da cadeia de amido que são inadequadas (Nakamura et al., 2002).
Yano et al.(1984), mapeou o gene sugary1 no cromossomo 8 de arroz. Trabalhos
posteriores localizaram o gene que codifica as DBE-isomilase em plantas de arroz no cromossomo 8 (Fujita et al., 1999), enquanto o gene que codifica a DBE-pullulanase foi localizado no cromossomo 4 (Nakamura et al., 1996). Estudos recentes indicam que em arroz existe um único gene (OsPUL) que codifica a enzima DBE-Pullulanase (Nakamura et al.,
1996) e três genes (OsISA1, OsISA2 e OsISA3) que codificam três diferentes isoformas da
enzima DBE- isomilase (Kubo et al., 2005). Estes estudos também sugerem que os genes
OsISA1 e OsISA2 são altamente expressos no endosperma enquanto OsISA3 é expresso
principalmente na folha (Kubo et al.,2005). O perfil de expressão do gene OsPUL em
sementes foi altamente significativo em relação a folha em plantas de arroz. (Ohdan et al., 2005, Li et al., 2009), principalmente em estágios de preenchimento e maturação do grão (Duan & Sun, 2005).
1.3. Fenotipagem: Técnicas usadas na avaliação de qualidade de grãos de arroz 1.3.1 Teor de amilose
estava relacionado a presença de amilose, mas sim com as cadeias longas da amilopetina, produzida em conseqüência de uma alteração na enzima de ramificação BEIIb em mutantes
ae (amylose extender).Estudos recentes sugerem maior acurácia na mensuração do conteúdo
de amilose/amilopectina através de técnicas como NIRS (near infrared reflectance spectroscopy), HPLC e ensaios enzimáticos.
A concentração de amilose que compõe o amido no endosperma está relacionada com a viscosidade nos grãos de arroz, sendo este classificado como glutinoso (o amido do grão é composto basicamente de amilopectina, 0% de amilose), e o não glutinoso, com concentrações de amilose variando entre 8 a 37% do amido. As propriedades de textura do grão incluindo maciez, coesão, cor, brilho e volume de expansão também estão correlacionadas com o teor de amilose (Puri e Siddiq, 1980).
O arroz glutinoso apresenta um endosperma com aspecto opaco e, após cocção, brilhante e pegajoso. O não glutinoso possui aspecto vítreo e brilhante e, após o cozimento, apresenta comportamento variável em função de outras variáveis. Portanto, as mudanças que ocorrem durante a cocção podem determinar a qualidade culinária do grão. O consumidor brasileiro tem preferência pelo arroz com endosperma translúcido, apesar desta característica, por si só, não afetar o aspecto do grão após o cozimento.
A concentração de amilose no amido é o critério de classificação entre cultivares de arroz, apresentando um baixo teor (<21%), intermediário (21 a 25%) e alto teor (>25%); resultando em: a) grãos secos e soltos (alto teor de amilose), podendo endurecer após o resfriamento; b) grãos macios, aquosos e pegajosos no cozimento (baixo teor), mais apreciado pela culinária japonesa; e c) grãos secos e soltos após o cozimento, mantendo-se macios no reaquecimento (teor intermediário), preferido pelo consumidor brasileiro (Ferreira et al., 2005). As cultivares glutinosas são importantes para estudos genéticos e para uso agronômico. No entanto, grande parte do arroz consumido no mundo é não-glutinoso.
segue-se os procedimentos sugeridos pelo CIAT- Centro Internacional de Agricultura Tropical, que considera um ponto de corte a partir de 22% de teor de amilose, agrupando as cultivares da seguinte forma: Grupo 1: > 28%; Grupo 2: de 23 a 27% e Grupo 3: < 22%. Estas inconsistências na classificação e medição do teor de amilose trazem dificuldades em discussões e comunicação entre especialistas em qualidade de grãos provenientes de diferentes países.
1.3.2 Temperatura de Gelatinização
Na temperatura ambiente, a estrutura do amido nos grãos de arroz mantém-se inalterada. Porém, quando os grãos são hidratados e submetidos a temperaturas elevadas, a estrutura do amido é modificada. Com a ação da energia térmica, as ligações de hidrogênio entre as moléculas de amilose e de amilopectina são enfraquecidas. Este procedimento promove o relaxamento da estrutura granular, facilitando a entrada das moléculas de água no interior dos grânulos. O aquecimento e hidratação do grão de arroz, portanto, causam a modificação da estrutura dos glânulos de amido no endosperma e conferem um aspecto
“gelatinizado” ao grão polido de arroz. Parte da água permanece retida nos grânulos de amido, dificultando cada vez mais o movimento da água, levando a um aumento na viscosidade do grão. A Temperatura de Gelatinização (TG), também conhecida como “reação alcalina” ou “digestão”, é a temperatura em que se observa o efeito deste processo no grão de arroz. O conteúdo e estrutura do amido (relação amilose:amilopectina) no grão afeta a temperatura em que a gelatinização é observada.
Por definição, a TG é a temperatura alcançada por em média 90% dos grânulos de amido quando atingem um aspecto de gelatinizados na presença de água aquecida (Guimarães ,1989). A Temperatura de Gelatinização dos grãos das cultivares comerciais de arroz em geral varia entre 55º a 80º C. Considera-se a TG baixa se computada entre 63 a 68º C, enquanto uma TG intermediária varia entre 69 a 73º C. Isto significa que variedades de arroz com TGs baixos e intermediários necessitam de menos tempo/energia para o sua cocção (Kumar et al., 1994). Entretanto, cultivares com alta Temperatura de Gelatinização, 74 a 80º C, estão relacionadas com baixo teor de amilose, requerendo mais água e tempo para o cozimento. Neste caso, o centro do grão permanece semi-duro após a cocção (Ferreira et al., 2005).
Considerando que já é conhecida uma significativa correlação entre desintegração em alcalinos e a temperatura de gelatinização de arroz (Juliano et al., 1964), a temperatura de gelatinização pode ser também medida pela reação do grão de arroz com uma solução alcalina. Desta forma, as propriedades físico-químicas dos grãos de amido podem ser avaliados por solução de 1,3% de KOH em temperatura ambiente ou em solução de uréia 4M a 30°C, medindo o grau de dispersão do grão de arroz em mm e correlacionando este valor com a temperatura de gelatinização. Neste caso, uma escala de notas variando de 1 (grão não a afetado) a 9 (grão totalmente disperso, gelatinizado) é utilizada para mensurar a Temperatura de Gelatinização.
O gene (gel(t)) que distingue o fenótipo de gelatinização do grão de amido entre as
subespécies japonica e indica foi mapeado recentemente (Umemoto et al., 2002). O gene gel(t) foi localizado na mesma posição do gene alk no cromossomo 6 em todas as linhagens
de arroz analisadas (Umemoto et al., 2002). Outros trabalhos realizados com SNPs no gene
alk, mostraram dois polimorfismos no éxon 8, sendo alk3 (A/G) e alk4 (GC/TT) associados
com temperatura de gelatinização (Umemoto, 2005; Waters et al., 2006). Trabalhos recentes usando esses SNPs resultaram em variedades com genótipos com combinação de alk3 (G) e alk4 (GC) com temperatura de gelatinização alta e baixa desintegração alcalina, enquanto
variedades com genotipos alk3 (A) ou alk4 (TT) apresentaram temperatura de gelatinização
baixa (Masouleh et al., 2009).
1.3.3- Centro Branco
translúcidos são preferidos pelos consumidores, e isso faz com que haja uma redução nos preços de variedades de arroz com grãos gessados. O gessamento é caracterizado pela opacidade do grão, em parte ou em sua totalidade. As áreas opacas são chamadas de centro branco, barriga branca ou mancha branca
O cozimento de grãos com áreas opacas é diferente de grãos com áreas translúcidas, já que os grãos gessados desenvolvem fissuras rapidamente reduzindo a palatabilidade do produto após cocção (Nagato & Ebata 1959; Cheng et al., 2005). A indústria arrozeira também tem maior preferência por grãos tranlúcidos, pois os grãos gessados podem causar maior percentual de grãos quebrados, desvalorizando o produto para comercialização. Essas regiões tornam-se frágeis e estão sujeitas a rompimento, após beneficiamento (Del Rosario et al., 1968). Por outro lado, as cultivares de arroz com grãos gessados ou opacos são de grande interesse para a indústria japonesa para a produção de alimentos ou bebidas especiais, como o saquê.
As medidas usadas atualmente para avaliar a opacidade do endosperma e as áreas opacas do endosperma do arroz são: porcentagens de grãos gessados, a área do endosperma gessado (na região dorsal, centro branco e barriga branca) e grau de opacidade do endosperma. O IRRI segue uma avaliação de notas entre 0 a 9 para classificar por análise visual a porcentagem dos grãos que apresentam presença de barriga branca, centro branco, opacidade na região dorsal e o seu grau de translucidez. Assim, as amostras com nota zero de Centro Branco não apresentam nenhum grão com qualquer tipo de opacidade; amostras com nota 1 apresentam menos de 10% de grãos gessados; com nota 5 apresentam entre 10 a 20% de grãos gessados e nota 9 mais de 20% de grãos com qualquer área atingida por opacidade do grão (IRRI, 2002).
A translucidez do endosperma está relacionada com o grau de cristalinidade do amido. Esta característica pode ser influenciada por fatores ambientais como colheita dos grãos ainda imaturos, assim como por altas temperaturas noturnas durante a fase de maturação do arroz (Juliano & Gonzales, 1989). O grão translúcido é mais duro por apresentar maior densidade de grânulos de amido comparados com os grãos gessados. Os grãos translúcidos apresentam uma menor propensão à quebra durante o beneficiamento (Del Rosario et al.,1968).
Guimarães, 1989). A opacidade nestas áreas do grão ocorre devido ao arranjo entre os grânulos de amido (má formação dos grânulos com espaços de ar entre si) e proteína nas células (Singh et al., 2006). A existência desses espaços de ar entre os grânulos gera significativas alterações físico-químicas, morfológicas, na temperatura de gelatinização, na cocção e nas propriedades estruturais comparado àqueles de grãos translúcidos (Singh et al., 2003; Cheng et al., 2005). Grãos gessados podem apresentar aspecto de cor amarelada, isto pode estar relacionado com grãos envelhecidos ou ao maior conteúdo protéico. O alto conteúdo protéico também muda as propriedades de cozimento do arroz.
1.3.4-Rendimento de Beneficiamento (RB)
Contabilização do percentual de grãos inteiros mais o percentual de grãos quebrados existente após beneficiamento do arroz em moinho. A quebra dos grãos durante o processamento é conseqüência das propriedades físicas do grão, afetadas pela relação amilose:amilopectina no endosperma.
1.3.5 Rendimento de grãos inteiros (RI)
Contabilização do percentual de grãos inteiros existente após beneficiamento do arroz
em moinho. Os grãos descascados e polidos para serem considerados “inteiros” devem
apresentar comprimento igual ou superior a três quartas partes do comprimento mínimo da classe a que pertence. A presença de grãos quebrados em um lote de arroz é uma característica indesejável, diminuindo a qualidade e o valor comercial do produto, além da diminuição da quantidade total de grãos descascados, já que alguns grãos podem ser eliminados junto com as cascas (Crusciol et al., 1999). Linhagens com Rendimento de Grãos Inteiros inferior a 50% não são de interesse dos programas de melhoramento.
