Fenotipagem de componentes de qualidade de grãos de arroz da população

A avaliação fenotípica para qualidade de grãos foi realizada pelo Laboratório de

Tecnologia de Alimentos da Embrapa Arroz e Feijão. As características físico-químicas foram analisadas na população de Linhagens Puras Recombinantes derivadas dos cruzamentos entre Chorinho e Amaroo. As seguintes características físico-químicas foram analisadas, conforme os protocolos descritos a seguir:

Teor de Amilose (TA) – Foram triturados e pesados 100 mg de farelo de arroz a partir de 5g

de grão de arroz. Em um balão de 100 ml foram adicionados ao farelo de arroz 1 ml de EtOH 95%, 9 ml de 1-N NaOH e incubados por 15 a 24h em temperatura ambiente. Em seguida foi retirada uma alíquota de 5 ml da amostra (amido) e adicionadas 50 ml de ddH20 e 1 ml de 1- N ácido acético e agitados. Depois foi adicionado 2 ml de solução de iodo (0.2% I2 em 2 % KI), e completou-se para 100 ml com ddH20. Foram agitados por 20 minutos e logo depois uma alíquota foi observada em espectrofotômetro a 620 Nm, e o controle foi representado por 5 ml de 0,09 N NaOH. Para e teste foram usados duas repetições, dois blocos e para avaliação foi usada a média das duas repetições. Em seguida foram avaliadas pela porcentagem de teor de amilose existente no grão (Juliano,1985), seguindo as seguintes avaliação :

TA % de Teor de Amilose

BAIXO 11 a 22%

INTERMEDIARIO 23 a 27%

ALTO 28 a 32%

Escala CIAT (1989)

Centro Branco (CB) - Amostras de 100 grãos de arroz beneficiado foram contados os grãos

com CB por análise visual. Foram selecionadas e examinadas em uma placa de vidro com a focalização de luz de lâmpada a quantidade de grãos opacos ou com variações de opacidade existente em cada acesso. A avaliação para Centro branco foi de acordo com as notas classicamente utilizadas para este fenótipo, sendo: (1) Excelente, (2) Bom, (3) Regular, (4) Ruim (5) Péssimo.

Temperatura de gelatinização (TG) - A temperatura de gelatinização foi avaliada pelo valor

de dispersão do grão tratado com solução alcalina. A desintegração e gelatinização dos grânulos de amido foram detectadas pelos testes realizados nos grãos pela adição de solução alcalina. Para cada amostra, 10 ml de 1.7% w/v solução de KOH foram adicionados a seis grãos de arroz beneficiado. Os grãos foram então incubados em temperatura ambiente por aproximadamente 23hs. Em seguida foi feita a avaliação da transparência da pasta dissolvida fora dos grãos, utilizando uma escala de 7 pontos, conforme descrito por Little et al. (1958) e Sowbhagya & Bhattacharya (1979). Para este teste foram usadas duas repetições, dois blocos e para avaliação foi usada a média das duas repetições. As notas seguiram a escala descrita abaixo:

TG Temperatura Classificação dos grãos _{Notas (1 a 7)} BAIXO (< 70 °C)

(6) partes do grão separadas e dispersas, misturando-se ao gargalo;

(7) grãos totalmente dispersos e misturados.

INTERMEDIARIA (70-74 °C) (4) grão entumescido, gargalo completo e largo; _{(5) grão partido ou segmentado, gargalo} completo e largo;

ALTA (74.5 a 80 °C)

(1) grão não afetado; (2) grão entumescido

(3) grão entumescido, gargalo incompleto e estreito;

Rendimento de Beneficiamento (RB) - Em amostras de 100 gramas de grão de arroz

beneficiado foram quantificados o percentual de grãos inteiros e quebrados.

Rendimento de grãos inteiros (RI) – Em amostras de 100 gramas de grãos de arroz

beneficiado foram quantificados apenas o percentual de grãos inteiros.

Classificação Visual de Comprimento (CG) e Largura do Grão (LG) - Em amostras de 100

grãos de arroz beneficiado de cada linhagem e acesso foram dadas notas visual para comprimento e largura dos grãos de acordo com as escalas de notas desenvolvidas pelo CNPAF, considerando-se os padrões definidos pelo Diário da República, 19 Abril 2000 (núm. 93), do Ministério da Agricultura.

Notas para Comprimento

Avaliação Nota Mm

Extra longo 1 >7,5 mm

Longo a Extra longo 3 7,0-7,5 mm

Longo 5 6,61- 7,0 mm

Médio 7 5,51-6,60

Curto 9 <5,5

Notas para Largura

Avaliação Nota Mm

Extra fino 1 <2,50

Fino 3 2,51-3,00

Largo 5 3,00-3,51

Extra largo 7 >3,50

Análises de variância dos valores absolutos de Teor de Amilose (TA) e Temperatura de Gelatinização (TG) foram realizadas com o programa GENES (Cruz, 2006), tratando-se os dados como um modelo de Blocos ao Acaso sem parcelas perdidas (101 linhagens de Amaroo x Chorinho, 2 repetições). Estimou-se os componentes de variância e covariância (fenotípico e ambiental), herdabilidade, coeficientes de variação (genético e experimental) e correlações (fenotípica, genotípica e de ambiente) entre todos os pares de caracteres estudados.

Também foram estimadas a diferença mínima significativa de médias segundo o teste de Tukey. Cada característica foi tratada de forma independente na análise de variância.

Foram realizadas estimativas descritivas (GENES- Cruz, 2006) nos valores médios das sete características, com a finalidade de estimar as médias, variâncias, desvios-padrão, coeficientes de variação, máximo e mínimo da linhagem de cada característica analisada. Também foram obtidas as estimativas de coeficiente de correlações simples de Pearson. A normalidade das distribuições fenotípicas foram testadas pelo Teste de Normalidade de Lilliefors, medidas de curtose e teste de Qui-Quadrado (2), com base nos valores médios das setes características.

Mapeamento de QTLs de componentes de qualidade de grãos – Nas análises visando a

detecção de QTLs associados aos componentes de qualidade de grãos com base na população RIL Chorinho x Amaroo, os dados categóricos das características baseadas em escala de índices (Centro Branco, Comprimento do Grão, Largura do Grão, Temperatura de Gelatinização), foram submetidos a testes de independência genótipo/fenótipo empregando tabelas de contingência 2x2. Os valores de significância foram estimados com base em testes qui-quadrado (corrigidos para continuidade pela fórmula de Yates) e testes exatos de Fisher. Os pontos de corte para definição das duas classes fenotípicas para as características analisadas com escala de índices foram os seguintes:

(a) Centro Branco (≤ 2,5 = bom a excelente; > 2,5 = regular a péssimo); (b) Comprimento do Grão (≤ 5,0 = longo a extra longo; > 5,0= médio a curto); (c) Largura do Grão (≤4,0 = fino; > 4,0 = largo a extra largo);

(d) Temperatura de Gelatinização (≤ 3,0 = bom a excelente; > 3,0 = intermediária a baixa);

(e) Teor de Amilose (≤ 18,0 = baixo; > 18,0 = intermediária a alto).

O teste de qui-quadrado com a correção de continuidade de Yates (Overall, 1990) é adequado quando uma ou mais classes em uma tabela de contingência 2x2 possui um número pequeno de amostras. Nesta situação, o experimento fere a premissa de que a probabilidade das freqüências observadas dos dados discretos tem uma distribuição qui-quadrado, que é contínua. O qui-quadrado (Yates) ajusta a continuidade da distribuição com a seguinte equação:

Onde,

N = número de eventos

Oi=freqüência observada de eventos Ei=freqüência esperada de eventos

O teste exato de Fisher, indicado para análise de dados categóricos quando o tamanho das amostras em diferentes classes é pequeno, também foi utilizado na análise de associação entre marcadores microssatélites e componentes de qualidade de grãos. O teste é exato e não- paramétrico. A equação é a seguinte:

Onde a, b, c e d representam os valores distribuídos em cada um dos quadrantes da tabela de contingência 2x2. Estas análises foram realizadas com os marcadores microssatélites cujos alelos segregam na população RIL do cruzamento Chorinho x Amaroo, com o objetivo de avaliar diretamente a associação destes locos com a qualidade de grãos de arroz nas condições experimentais descritas, utilizando o software Excel.

Após a análise de testes de independência de dados categóricos, todas as sete características analisadas (Centro Branco, Comprimento do Grão, Largura do Grão, Rendimento de Engenho, Rendimento de Grãos Inteiros, Teor de Amilose e Temperatura de Gelatinização) foram consideradas para a detecção de associação com marcadores moleculares através da análise de marca simples pelo método de regressão linear simples, utilizando o programa WinQTLCartographer (Wang et al., 2005). Em seguida, análises de Mapeamento de Intervalo (Lander & Botstein, 1989) e Mapeamento de Intervalo Composto (Jansen, 1993; Zeng, 1993), também foram realizadas com o programa WinQTLCartographer. Para determinar a significância estatística na detecção de QTLs foi estimado o valor de LOD mínimo de cada característica analisada através de testes de permutação (1.000 permutações;

nível de significância de 0,05) (Churchill & Doerge, 1994; Doerge & Churchill, 1996). Os parâmetros de análise de Mapeamento de Intervalo Composto foram os referentes ao Modelo 6 no programa (forward regression method, três, cinco, oito e dez marcadores controle, janela de 10 cM).

2.3.2.1. Testes de independência entre genótipo e fenótipo em acessos de arroz amostrados no