1. INTRODUÇÃO
1.2.3 Enzimas da via metabólica de amido
1.2.3.2 Sintases de Amido
As sintases do amido são encontradas associadas aos grãos de amido nos plastídeos (GBSS – granule bound starch synthase) ou no estroma dos plastídeos (SSS - soluble starch synthase), starch synthase). Dados recentes indicam que a GBSS atua diretamente na
polimerização de amilose (alongamento), enquanto a SSS atua na formação de amilopectina (Smith et al., 1997; Nakamura, 2002; Umemoto et al., 2002). Em arroz (Hirose & Terao, 2004), milho e trigo (Harn et al., 1998; Vriten & Nakamura, 2000) há clara evidência da
existência de uma família gênica de sintase de amido onde vários genes codificam diferentes isoformas da enzima. As sintases do amido catalisam a etapa da reação de elongação da cadeia α-1,4 na síntese do amido, transferindo uma unidade de glicose da ADP- glucose para terminação não- redutora da cadeia α-1,4 (Figura 4).
GBSS - A enzima sintase granular de amido (GBSS ou granule bound starch
synthases) é a grande responsável pela síntese de amilose nas cultivares de arroz. O gene
GBSSI é mais conhecido como waxy (wx), ou “glutinoso”, localizado no cromossomo 6. O gene waxy codifica a enzima UDP-glucosil transferase do grão de amido (granule-bound
starch synthase - GBSS), que atua na síntese de amilose no endosperma (triplóide) e no grão
de pólen (haplóide) de arroz (Figura 4).
Evidência genética de controle de síntese de amido em arroz por um gene maior e vários genes modificadores foi claramente indicada há vários anos (Bollich & Webb, 1973). Posteriormente, com base na análise do conteúdo de proteína Wx em arroz, foi proposta a existência de dois alelos funcionais no gene waxy (Wxa e Wxb), responsáveis por alto e baixo
conteúdo de amilose, respectivamente, em arroz não glutinoso (Sano 1984). A análise genética de conteúdo de amilose em sementes F1, F2 e RC1 (retrocruzamento 1) em cruzamentos recíprocos de cultivares com baixo conteúdo de amilose (Kumar & Khush, 1988; Villareal & Juliano; 1989) confirmou que as cultivares de arroz possuem dois tipos alelos:
Wxa, correlacionado com alto conteúdo de proteína Wx e de amilose no endosperma,
comumente encontrado em cultivares da subespécie indica e Wxb, correlacionado com baixo
conteúdo de proteína Wx e de amilose no endosperma, encontrado com mais frequência em cultivares da subespécie japonica. Evidência indireta proveniente de estudos moleculares comparando polimorfismo do gene waxy de milho e de arroz também corroboraram a influência um gene maior na composição de amilose de endosperma de arroz. Em milho, a região do gene waxy possui estrutura altamente variável: inserções e deleções espontâneas foram identificadas (Wessler & Veragona, 1985), especialmente na região flanqueadora 3’. O gene waxy em arroz é menos variável do ponto de vista estrutural do que em milho.
No germoplasma de arroz não glutinoso observa-se entre as cultivares uma grande variação de conteúdo do produto do gene waxy, a proteína Wx, bem como do conteúdo de amilose. O alelo Wxa é tipicamente encontrado em cultivares da subespécie indica, que
geralmente encontrado em cultivares da subespécie japonica, que possuem um percentual de amilose geralmente inferior a 18% do amido total.
O gene waxy foi clonado em diferentes cultivares da espécie (Wang et al., 1990; Wang et al., 1994). A sequência codificante do gene waxy em arroz é interrompida por 13 introns (Figura 5), sendo que o intron 1 é o maior deles (1,1 kpb) (Hirano & Sano, 1991; Wang et al., 1995). Análise molecular do loco waxy indicou que a diferença de expressão dos alelos Wxa e
Wxb é causada por uma substituição de base única, ou SNP (single nucleotide polymorphism),
que ocorre no sítio doador de processamento (splice donor site) do primeiro íntron do gene.
O alelo Wxa possui a sequência 5’-AGGTATA na junção do sítio de processamento do íntron
1, enquanto o alelo Wxb possui a sequência5’-AGTTATA (Bligh et al., 1998; Cai et al., 1998;
Hirano et al., 1998; Isshiki et al., 1998). A substituição de uma base nitrogenada contribui para o decréscimo da eficiência de processamento do pré-mRNA e diminui a quantidade de amilose nas cultivares homozigotas Wxb (Cai et al., 1998; Hirano et al., 1998; Issiki et al.,
1998). A diminuição de amilose, portanto, afeta diretamente a qualidade do grão. Análise do germoplasma de arroz indica que a mutação G para T no íntron 1 de waxy explica 79,7% da variação de conteúdo de amilose em arroz não glutinoso (Ayres et al., 1997). A expressão do alelo Wxb é ativada por baixas temperaturas durante o desenvolvimento do grão (Sano et al., 1985;), causando um maior conteúdo de amilose nas cultivares homozigotas para Wxb nestas
condições (Larkin & Park, 1999). Com base nestes estudos, os cultivares comerciais de arroz são classificados em três grupos, de acordo com o conteúdo de amilose no endosperma (Wang et al., 1995):
(a) Grupo 1 – arroz não glutinoso, caracterizado pela presença do alelo Wxa. Possui alto
conteúdo de amilose (>18%), observando-se processamento (excisão) completa do íntron 1 (~1,1 kb) do transcrito pré-mRNA (3,34kb), formando mRNA maduro (2,3 kb) do gene Wx. Detecta-se a presença de proteína Wx no endosperma do grão em desenvolvimento; (b) Grupo 2 – arroz não glutinoso, caracterizado pela presença do alelo Wxb. Possui níveis
baixo a intermediário de amilose (2-18%) (Ayres et al., 1997), observando-se processamento parcial do íntron 1 e, portanto, detecção de transcritos mRNA maduro (2,3 kb) e pré-mRNA (3,4 kb) do gene waxy. Detecta-se a presença moderada de
proteína Wx (~10 vezes menos que em cultivares do grupo 1). Estima-se que 74% dos
(c) Grupo 3 – arroz glutinoso, não produz amilose (endosperma glutinoso, 0% de amilose). Possui apenas transcrito mRNA maduro (3,4 kb) do gene Wx, com íntron 1 intacto no mRNA maduro. Não apresenta proteína Wx. Apesar do mRNA maduro ser poliadelinado, a tradução não ocorre em cultivares de arroz deste grupo. Possui os dois tipos de alelos (Wxa e Wxb) classificados de acordo com o SNP na junção do sítio de
processamento do intron 1. Portanto, existem cultivares glutinosos com Wxb e também
com Wxa (em menor percentual) (Yamanaka, 2004). Isto indica que nas cultivares
glutinosas o endosperma waxy não é regulado pelo SNP observado no intron 1. Um mutante nulo para glutinoso (wxCI 9972) apresenta, por exemplo, um transcrito gênico 200 pb menor (Okagaki & Wessler, 1988). Isto poderia indicar a presença de deleção no alelo glutinoso, afetando radicalmente a produção de amilose.
Portanto, os alelos Wxa e Wxb não explicam toda a variação de conteúdo de amilose no
arroz não glutinoso. Os dois alelos (Wxa e Wxb) também não são suficientes para classificação
dos cultivares nas subespécies indica (alelo Wxa) e japonica (alelo Wxb), visto que algumas
variedades indica possuem menor conteúdo de amilose do que variedades japonica. Além disso, ao introduzir o alelo Wxb em uma cultivar indica, observa-se uma redução de conteúdo
de amilose a valores inferiores ao observado pelo mesmo alelo em background japonica, o que indica a presença de modificadores na expressão gênica (Mikami et al., 2000). Já o controle genético do fenótipo glutinoso não é conhecido.
Figura 5. O gene waxy codifica a enzima UDP-glucosil transferase do grão de amido (granule-bound starch synthase - GBSS), que atua na síntese de amilose no endosperma (triplóide) e no grão de pólen (haplóide) de arroz. A região codificante do gene waxy é interrompida por 13 íntrons. As barras verticais hachuradas representam regiões que apresentam mutações detectadas que afetam o conteúdo de amilose na estrutura do amido do endosperma de arroz.
O intron 1 do gene waxy possui um microssatélite (RM190=(CT)n), localizado 55 pb acima do SNP observado na junção de processamento (Bligh et al., 1995). Variação alélica neste microssatélite, em desequilíbrio de ligação com o SNP, explica cerca de 88% da variação do conteúdo de amilose em arroz não glutinoso (Ayres et al., 1997 e Shu et al., 1999). A variação alélica no loco RM190, portanto, está fortemente associada ao SNP da
junção de processamento do íntron 1, que explica parte das variação de conteúdo de amilose no endosperma. Outro estudo confirma que a diversidade alélica no microssatélite RM190 explica cerca de 90% da variação de conteúdo de amilose em uma coleção de 198 cultivares e linhagens de arroz cultivadas em diferentes locais dos EUA (Bergman et al., 2001). Este microssatélite, portanto, pode ser usado como critério de seleção para desenvolver cultivares de arroz com maior ou menor conteúdo de amilose.
Contudo, é importante mencionar que o desequilíbrio de ligação é extenso em arroz, cobrindo regiões de até 200 kb (Mather et al., 2007). Portanto, é razoável supor que outras variações da região do gene waxy associadas com variação alélica no loco RM190, poderiam contribuir também para variações no conteúdo de amilose. É possível, pois, que a identificação outros microssatélites na região do gene waxy, cobrindo extensões maiores, possa facilitar o processo de seleção assistida nos programas de melhoramento.
Sintase de Amido - Estudos bioquímicos e genéticos indicam que são encontrados em plantas quatro tipos de SS –soluble synthase (ou SSS - soluble starch synthase), SS, isto é, SSI, SSII, SSIII, e SSIV- alguns tipos têm múltiplas isoformas que variam entre espécies (Boyer &, Preiss ,1981; Martin & Smith, 1995). Em arroz, 10 isoenzimas de sintase de amido foram descritas (Hirose and Terao, 2004): SSI (cromossomo 6), SSII-1ou SSIIc (cromossomo 10), SSII-2 ou SSIIb (cromossomo 2), SSII-3 ou SSIIa (cromossomo 6), SSIII-1 ou SSIIIb (cromossomo 4), SSIII-2 ou SSIIIa (cromossomo 8), SSIV-1 ou SSIVa (cromossomo 1), SSIV-2 ou SSIVb (cromossomo 5), GBSSI /waxy (cromossomo 6) e GBSSII (cromossomo 7).
A expressão de genes de sintase de amido tem regulação espaço-temporal. Os genes SSIIb, SSIII-1 e GBSSII são expressos mais cedo no desenvolvimento do pericarpo do grão (cariopses). Por outro lado, os genes SSIIa; SSIIb e waxy, responsáveis pelo acúmulo de amido no endosperma, são expressos mais tarde. Outros genes de sintase do amido são expressos durante todo o desenvolvimento (SSI, SSII-1, SSIV-1 e SSIV-2) (Hirose & Terao, 2004).
O papel de algumas destas enzimas na síntese de amido é conhecido. Trabalhos recentes com mutantes afetando a atividade da enzima SSI resultaram em mudanças
estruturais na amilopectina, levando ao aumento de temperatura de gelatinização do amido no endosperma. Tem sido sugerido, desta forma, que SSI está envolvida no controle da síntese de cadeia longa de amilopectina (Nishi et al., 2001).
SSII tem um papel específico na síntese de cadeia de comprimento intermediário a longo de amido (Fontaine et al., 1993; Craig et al., 1998; Edwards et al., 1999a; Morell et al., 2003). Experimentos com mutantes de milho e batata demonstraram que a supressão da atividade de SSII leva à redução da síntese da amilopectina e, conseqüentemente, à diminuição do desenvolvimento de cadeias longas de amido. A enzima está provavelmente envolvida na formação de cadeias mais longas de amilopectina (Gao et al., 1998; Edwards et al., 1999b). Resultado de análises de mapeamento gênico em arroz sugeriram o gene SSIIa (SSII) (localizados no loco alk no cromossomo 6), como responsável pelas diferenças na estrutura da amilopectina entre duas variedades de arroz, Nipponbare (japonica) e Kasalath (indica) (Umemoto et al., 2002). Foram encontrados alguns aminoácidos de SSII-a, identificados pela análise de SNP, em diversas linhagens de arroz cultivado, como candidatos responsáveis pelos diferentes níveis da atividade de SSII, mas nenhuma evidência foi comprovada (Umemoto et al., 2004).
Estudos anteriores mostraram a existência de diferenças na sequência do gene da enzima SSIIa, que são responsáveis pela diferença na estrutura da amilopectina entre indica e
japonica (Umemoto et al., 2002). A enzima é responsável pelo alongamento de cadeias curtas
da amilopectina. Diferentes alelos de SSIIa no arroz contribuem para a diferença na estrutura da amilopectina, levando a diferentes temperaturas gelatinização do amido (Umemoto et al., 2002). O gene OsSSIIa pode ser o responsável pelas diferenças entre as variedades Nipponbare (japonica), e Kasalath (indica), em termos de distribuição do comprimento de cadeia da amilopectina e de propriedades físico-químicas do amido (Umemoto et al., 2002).
A isoforma SSIII compreende a atividade total solúvel das sintases de amido (ou SSS -
soluble starch synthase), e é responsável pela síntese de amilopectina atual na fração solúvel
da síntese do amido. A redução na atividade de SSIII parece não afetar o conteúdo amido ou amilose em relação à amilopectina e sim a forma granular do amido (Li et al., 2003).