1. INTRODUÇÃO
2.3 Avaliação de polimorfismo em locos microssatélites situados na região de genes da
Para a seleção dos marcadores microssatélites usados no estudo, foram sintetizados 44 pares de iniciadores, conforme citado anteriormente. A avaliação da qualidade e do polimorfismo dos 44 marcadores foi inicialmente realizada através da genotipagem de três cultivares de arroz da subespécie japonica: Nipponbare, Curinga e Primavera. Nipponbare é a cultivar referência de arroz, que teve o genoma completamente seqüenciado (Goff et al., 2002; IRSC, 2004), e que serviu de base para a seleção de microssatélites e síntese de iniciadores deste trabalho. Curinga é uma cultivar de arroz com dupla aptidão, produtiva em sistema de produção de várzea úmida e sistema sequeiro. Primavera é uma cultivar de arroz de sequeiro (terras altas), referência para qualidade de grãos neste sistema de produção.
Os dados de amplificação, qualidade de análise e polimorfismo inicial baseados nas três cultivares de arroz (Nipponbare, Curinga e Primavera) possibilitaram a seleção dos marcadores microssatélites com maior qualidade de produtos de PCR, mais robustos e
potencialmente mais informativos. Este marcadores foram então avaliados em detalhe com um conjunto de acessos do Banco de Germoplasma de Arroz e os dados compilados para a obtenção de estatísticas descritivas de cada marcador.
2.2.1 Germoplasma de arroz utilizado na genotipagem com marcadores microssatélites
Para a avaliação dos marcadores microssatélites selecionados entre os 44 inicialmente testados, uma amostra ao acaso de 28 acessos do Banco de Germoplasma de Arroz, apresentando alta variabilidade para qualidade de grãos, foi selecionada (Tabela 3).
Os tamanhos dos alelos de cada acesso de arroz nos locos microssatélites testados foram classificados em classes discretas representativas da variação alélica de cada loco usando o algorítimo de minimização de quadrados mínimos descrito por Idury & Cardon (1997), e implementado no software Allelobin (Indury & Cardon, 1997).
Tabela 3-Acessos do Banco de Germoplasma de Arroz usados na avaliação dos marcadores microssatélites selecionados na região de genes da via metabólica de amido.
Acessos Característica de interesse
BRS Formoso Cultivar de arroz irrigado, suscetível à brusone e moderadamente suscetível a mancha de grãos, recomendada para plantio em sistema irrigado por inundação controlada ou em várzea úmida.
BRS Diamante Cultivar de arroz irrigado oriunda de cruzamento triplo realizado no CIAT, Colômbia, e introduzida no Brasil por pesquisadores da Embrapa Arroz e Feijão. A linhagem é moderadamente resistente à brusone e resistente a mancha de grãos; recomendada especialmente para plantio em sistema irrigado por inundação controlada ou várzea úmida. CNA8502 Linhagem de arroz irrigado, parental recorrente de programa de piramidização de genes de resistência à brusone do
arroz.
BRS Primavera Cultivar de arroz de sequeiro, derivada do cruzamento entre as cultivares IRAT 10 e LS 85-158, lançada em 1987; suscetível à brusone, apresenta resistência moderada à escaldadura foliar e à mancha-de-grãos; Apresenta produtividade média e é exigente quanto ao ponto de colheita; a cultivar Primavera destaca-se como uma variedade com alta qualidade de grãos.
CNAi9930
Linhagem de arroz irrigado desenvolvida por retrocruzamento avançado de QTLs (Advanced Backcross QTL
Analysis) a partir do cruzamento entre Oryza sativa (BG90-2) e Oryza glumaepatula (RS-16) (Brondani et al.,
2002); a linhagem apresenta alta produtividade e alta capacidade de perfilhamento; apresenta potencial de colheita deduas safras, a segunda a partir de irrigação da soca da primeira colheita; suscetível a mancha de grãos e resistente a brusone.
CNAi9022 Linhagem de arroz irrigado, fonte de resistência à brusone do arroz. CNAi9029 Linhagem de arroz irrigado, fonte de resistência à brusone do arroz.
Oryzica Llanos4 Cultivar de arroz irrigado, originária da Colômbia, desenvolvida pelo Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT); resistente à brusone e à mancha de grãos
Oryzica Llanos5 Cultivar de arroz irrigado, originária da Colômbia, desenvolvida pelo Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT); resistência durável à brusone;
Oryzica 1 Cultivar de arroz irrigado, originária da Colômbia, desenvolvida pelo Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT); apresenta resistência à brusone e é moderadamente resistente a mancha de grãos;
5287 Linhagem de arroz irrigado, fonte de resistência à brusone.
(CIAT);
CNA 8212 Linhagem de arroz de sequeiro; linhagem quase-isogenica (NIL) obtida do cruzamento entre IAC-25 e C46-15, pela Embrapa arroz e Feijão, visando a introgressão de genes de cultivares exóticas provenientes de arroz indica, apresentando moderado a alto grau de resistência à brusone;
CNA 8198 Linhagem de arroz de sequeiro; linhagem quase- Isogênica (Nils) obtida pelo cruzamento entre IAC-25 e Carreon, pela Embrapa arroz e Feijão, visando a introgressão de genes de resistência à brusone. Essas linhagens apresentaram moderado a alto grau de resistência à brusone;
C101-A51 Linhagem de arroz de sequeiro; linhagem quase-isogênica de arroz de sequeiro (NIL) (Mackill & Bonman 1992), desenvolvida pelo Internacional Rice Research Institute (IRRI), com genes dominantes de resistência à brusone Rantulasi Cultivar de arroz irrigado (CNA0010681); originária das Filipinas, resistente a brusone e a mancha de grãos; RS-16 Acesso da espécie silvestre Oryza glumaepatula, originária da região Amazônica.
BG 90-2 Linhagem de arroz irrigado (CNA00005860) - alta produtividade, suscetível à brusone e moderadamente resistente a mancha de grãos;
Chorinho Variedade tradicional de arroz de sequeiro; sub-espécie japonica tropical; cultivada em condição de várzea úmida no sul do estado de Minas Gerais; tolerância moderada à seca.
Puteca Variedade tradicional de arroz de sequeiro (CA780217); sub-espécie japonica tropical; variedade cultivada em sistemas de terras altas, coletada no Estado de Goiás.
Bico Ganga Variedade tradicional de arroz de sequeiro; coletada em Ouro Preto do Oeste-RO; resistente a brusone e a mancha de grãos;
Zenith Cultivar de arroz sequeiro e várzea úmida (japonica temperado); moderadamente resistente a brusone e moderadamente suscetível à mancha de grãos
.
Farroupilha Variedade tradicional de arroz irrigado (CA940007) (japonica temperado); variedade tradicional originária no Rio Grande do Sul, moderadamente resistente a brusone e a mancha de grãos;
Amaroo Cultivar comercial de arroz irrigado (japonica temperado), muito cultivada na Austrália (CNA13218); apresenta tolerância moderada a baixas temperaturas
BRS Curinga
Cultivar de arroz de sequeiro e várzea úmida. Foi originada inicialmente de uma família selecionada na geração F3, pelo Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), na Colômbia, depois melhorada pela Embrapa Arroz e Feijão. Linhagem com dupla aptidão de plantio, indicada para cultivo em condições de terras altas (sequeiro) e várzeas. A primeira cultivar agulhinha de alta qualidade de grãos recomendada para as condições de várzea úmida ou drenada de Minas Gerais. Apresenta arquitetura com folhas eretas, semelhantes à de arroz irrigado por submersão, com boa resistência à seca e a alumínio tóxico, moderadamente resistente a brusone e suscetível a mancha de grãos, e alto potencial de produção, mesmo no cultivo de terras altas.
IRGA417 Cultivar de arroz irrigado. Originaria do cruzamento a F1 de New Rex/IR19743-25-2-2 com BR-IRGA 409, realizada pelo IRGA-EEA. Possui grão agulhinha com alto teor de amilose, baixa temperatura de gelatinização e rendimento industrial de 62% de grãos inteiros quando polidos. Possui sensibilidade média à toxicidade por ferro, bem como ao frio na fase reprodutiva das plantas. Possui resistência moderada à brusone e à mancha dos grãos. CNA10928 Linhagem de arroz irrigado, com arquitetura modificada de panícula (multiespigueta) e capacidade fotossintética
durante a maturação dos grãos (stay-green).
Nipponbare Cultivar de arroz irrigado (japonica temperado); originária do Japão; cultivar padrão utilizada no seqüenciamento do genoma estrutural do arroz (Goff et al., 2002; IRGSC, 2003).
2.2.4. Estatísticas descritivas de locos de marcadores microssatélites
As estatítiscas descritivas de cada marcador foram estimadas pelo programa PowerMarker (v.3.25) (LIU, K.; MUSE, 2005). Dois acessos foram excluídos das análises: BG90-2, por ser quase-isogênico a CNAi9930), e RS-16, por ser um acesso de O. Glumaepatula. Para cada marcador microssatélite testado foram estimados, com base nos 26 dos 28 acessos de arroz selecionados (Tabela 3), os seguintes parâmetros: número de alelos observados em cada loco (No); a heterozigosidade observada (Ho); a diversidade gênica (DG), segundo a fórmula [GDe]=(1-Σipi2)(2n)/(2n-1), onde pi é a freqüência do iésimo alelo para cada loco e n o
número de amostras analisadas (Nei,1987); o conteúdo informativo de polimorfismo (PIC), que estima como o grau de polimorfismo em um loco marcador influencia a probabilidade de detecção de ligação com um loco referência, ou a probabilidade de uma progênie de uma linhagem parental que possui um alelo raro permitir a dedução do genótipo da linhagem parental no loco marcador (Botstein et al., 1980).
Para testar o poder dos painéis em relação à capacidade de discriminação genética, a Probabilidade de Identidade (PI), definida como PI= Σ pi4 + Σ (2pipj)2 (Sefc et al., 1999), foi estimada nos marcadores selecionados. Este parâmetro define a probabilidade de dois indivíduos ao acaso de uma mesma população apresentarem genótipos idênticos com os mesmos marcadores testados. Foi ainda calculado o Poder de Exclusão (PE) combinado de um painel multiplex, que estima a probabilidade de excluir um indivíduo selecionado casualmente numa população de ser um dos parentais de um indivíduo analisado, segundo a fórmula PE= Σ pi (1-pi)2 -1/2 Σ pi2pj2 (Weir 1996).
2.3. Desenvolvimento e validação de painéis multiplex de locos microssatélites