1
UNI V E R S I D A D E F E D E R A L D O C E A R Á
C E NT R O D E C I ÊNC I A S
D E PA R T A M E NT O D E Q UÍM I C A A NA L ÍT I C A E F ÍS I C O -Q UÍM I C A
PR O G R A M A D E PÓS -G R A D UA Ç Ã O E M Q UÍM I C A
C L ÊR T O N L I NH A R E S G O M E S
C L A S S I F I C A Ç Ã O M UL T I V A R I A D A D E PE R F UM E S E A NÁ L I S E D E F R A G R ÂNC I A S A L É G E R NA S
O R I E NT A D O R : PR O F . D R . R O NA L D O F E R R E I R A D O NA S C I M E NT O
F O R T A L E Z A
“Seja modesto, queira o impossível”
E rnesto “C he” Guevara
“E u sou eu e minhas circunstâ ncias”
5
A G R A D E C I M E NT O S
A D E US , pelo dom da vida e por ter me inserido no seio de uma família excessivamente amável.
À minha esposa, E veline Perote, pela paciê ncia sem tamanho, pela ajuda inestimável na correçã o gramatical desse trabalho, e aos meus queridos J oã o Pedro (filho) e Iago (enteado), pelo carinho, cumplicidade, amor e respeito dedicados a mim nestes últimos anos.
À minha mã e, V aldê nia Maria L inhares, e ao meu padrasto, E uriberto C ésar, que sempre me apoiaram e incentivaram em minhas escolhas.
A os meus irmã os, S abrina e D aniel, sempre ao meu lado, e com quem sei que futuramente poderei contar.
E m memória de meu pai-avô, C ristovã o F iúza Gomes, que sempre fez tudo para educar seus netos sem medir esforços. S empre lembrarei dos seus ensinamentos.
À minha avó paterna, A urelina, e ao meu pai, C lê rton C unha Gomes, que sempre torceram pelo meu crescimento.
À minha avó materna, Y ayá, que enfrentou várias adversidades na vida, sendo um exemplo de pessoa batalhadora e vitoriosa para seus filhos e netos.
A o meu orientador, Prof. D r R onaldo F erreira do Nascimento, pela atençã o dispensada, pela amizade, dedicaçã o e por todas as críticas e sugestões que contribuíram para o meu crescimento e realizaçã o desse trabalho.
A todos os professores do curso de pós-graduaçã o em Química.
A gradecimento especial ao colega e amigo A ri C lésius, pelas excelentes contribuições a este trabalho; ao A bel pelo tratamento estatístico; à perita da PE F OC E Manuela C ândido, por ceder as amostras; e ao Prof. D r A donay L oiola, pela sua contribuiçã o na elaboraçã o dos artigos.
Itana, V itor, Natan, L ucas, R enata, C risiane, W agner, E dmilson, T hiago, Mayza, R aquel e E liezer, todos que contribuíram direta ou indiretamente com a realizaçã o desse trabalho.
A os funcionários do D epartamento: Ivanildo e V anda, pelo café de todo dia, principalmente aos sábados.
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R E S UM O
Perfumes sã o produtos constituídos essencialmente por álcool etílico, água e fragrâncias. E stas fragrâncias sã o responsáveis por caracterizar o odor agradável e ímpar de cada perfume. O comércio deste produto é muito lucrativo por ser algo utilizado por todos. Paralelo ao comércio legal de perfumes, sua falsificaçã o vem aumentando nos últimos anos. D entre as fragrâncias, destacou-se um grupo (limoneno, álcool benzílico, linalol, octanoato de metila, citral, citronelol, hidroxicitronelol, geraniol, eugenol, isoeugenol, álcool anis, álcool amil cinâmico, amil cinamal, álcool cinâmico, cumarina, cinamaldeido, alfa-isometil-ioneno, liral, lilial, farnesol, hexilcinamaldeido benzoato de benzila, cinamato de benzila, salicilato de benzila) que pode ocasionar alergia por contato, levando a uma dermatite. A legislaçã o brasileira (R D C 3/2012 da A NV IS A ) e a européia (C E 1223/2009) determinam que quando estas concentrações excederem o limite de 0,01% (100 ppm) para produtos com enxágue e 0,001% (10 ppm) para produtos sem enxágue, o fabricante fica obrigado a discriminar no rótulo sua presença. A primeira parte deste trabalho é a análise multivariada de perfumes, partindo do estudo comparativo entre 25 perfumes originais e 25 falsos, através das análises dos compostos orgânicos por infravermelho ( IV ), C G-D IC e espectroscopia na regiã o do ultravioleta (UV ); e inorgânicos por cromatografia de íons e fotometria de chama. Os dados gerados foram processados por um software estatístico, R Project, originando o PC A , S IMC A e L D A , com intuito de diferenciar o perfume original do falso. O estudo de espectroscopia UV mostrou que os produtos originais apresentam maior quantidade e intensidade de bandas quando comparado ao produto falso, o que pode ser um indicativo de maior teor de fragrância. O tratamento por quimiometria permitiu a separaçã o eficiente em dois grupos. A análise de íons e etanol permitiu observar que os produtos falsos apresentam elevados teores de cloreto (38 mg L
-1
) e baixos de etanol (45 % m/v). Por outro lado, os produtos originais apresentaram em média baixo teor de cloreto (15 mg L
-1
) e elevado teor de etanol (83%). O estudo multivariado permitiu a distinçã o de produtos falsos e originais. A segunda parte do trabalho trata da validaçã o de análise de fragrâncias alérgenas em perfumes, extraídas por microextraçã o em fase sólida (ME F S ) combinada com cromatógrafia gasosa - espectrometria de massas (C G-E M) do tipo quadripolo operando no modo S IM. E ste método demonstrou bons resultados de linearidade, limite de detecçã o (0,05-271 µ g.L
-1
), limite de quantificaçã o (0,017-0,900 µ g.L
-1
), precisã o intermédiária ( 3,0-19,3%), repetibilidade (8,9-19,7%) e recuperaçã o (59-115%) para a matriz estudada. A análise de perfumes autê nticos mostrou que esses produtos apresentam concentraçã o de fragrâncias alérgenas elevadas ( L D -190 mg.L
-1
) e que necessitam ser descriminadas em seus rótulos. A análise de perfumes falsos demonstrou que estes produtos apresentam baixo teor de fragrâncias alérgenas ( L D -56 mg.L
-1
) e que nã o possuem fragrâncias com massa molar mais elevada, como cinamaldeido e salicilato de benzila; isto pode ser um dos motivos que faz o produto contrafeito possuir baixa fixaçã o de odor.
A B S T R A C T
Perfumes are mainl y made of ethilic alcohol, water and fragrances. T hese fragrances are responsible for caracterizarrem nice and unique odor of each perfume. T he trade of this product perfumes is very lucrative for being product used by all. Parallel to the legal trade in perfumes, forgery see these products increasing in recent years. A mong the fragrances, the highlight was a group of fragrances (limonene, benzyl alcohol, linalool, methyl octanoate, citral, citroneol, hidroxicitroleol, geraniol, eugenol, isoeugenol, anise alcohol, amyl cinnamic alcohol, amyl cinamal, cinnamic alcohol, coumarin, cinnamaldehyde, alpha-isometil ionene liral, lilial, farnesol hexilcinamaldeido benzyl benzoate, benzyl cinnamate, benzyl salicylate) that may cause allergy by contact, leading to dermatitis. B razilian law (DR C 3/2012 A NV IS A ) and E uropean (E C 1223/2009) state that when these concentrations exceed the limit of 0.01% (100 ppm) for products rinse and 0.001% (10 ppm) for products with rinse, the manufacturer is obliged to discriminate underin its label their presence. T he first part of this work is the multivariate anal ysis of perfumes, based on the comparative study of 25 original perfumes ecom 25 false through oxidase analysis dose organic compounds by IR , GC -F ID and espectroóscopia in the UV region (UV ) : and inorganic by ion chromatography and flame photometry. T he data generated were processed by a estatistic software, the R Project, giving the PC A , S IMC A and L D A , aiming to differentiate the original edo fake perfume. UV spectroscopy study showed that the original product had major quantity and intensity of bands compared to the fake product, which may be indicative of higher fragrance content. T he chemometric treatment allowed the efficient separation into two groups. T he anal ysis of ions and ethanol allowed to observe the fake product has high chloride content (38 ppm) and low ethanol (45%); since the original product had a low content of ions (15 ppm) and high ethanol content (83%). T he multivariate study allowed the distinction of counterfeit and original products. T he second part comes D ae analysis validation of allergenic fragrances in perfumes, extraídaso by solid phase microextraction and analyse by gas chromatography coupled to mass espectrometric the quadrupole type operating in S IM mode, with small sample size (10 μg.L
-1
). T his method has shown good results of linearity, limit of detection (0,05 to 271 μg.L -1), limit of quantitation (0,017 to 0,900 μg.L -1), intermediate precision (3,0 to 19.3%) , repeatability (8,9 to 19,7%) and recovery (59-115%) for the studied matrix. T he authentic perfumes anal ysis showed that these products have a high allergenic fragrance concentration ( L D -190 mg.L -1) and need to be discriminated on their labels. T he fake perfume anal ysis showed that these products have low allergenic fragrances have ( L D -56 mg L
-1
) and who have no fragrances with higher molecular weight, as cinnamaldehyde and benzyl salicylate; this may be one of the reasons It makes the counterfeit product having a low fixing odor.
9
S UM Á R I O
1 I NT R O D UÇ Ã O ... 15
2 O B J E T I V OS ... 17
2.1 O bj etivos G er ais ... 17
2.2 O bj etivos específicos ... 17
3.R E V I S Ã O D A L I T E R A T UR A ... 18
3.1 Per fumes ... 18
3.2 F r agr â ncias alér genas ... 19
3.3 A nálise de fr agr â ncias alér genas ... 22
3.4 V alidaçã o de métodos cr omatogr áficos ... 27
3.4.1 S eletividade ... 28
3.4.2 L inear idade ... 28
3.4.3 L imite de detecçã o (L D ) ... 30
3.4.4 L imite de quantificaçã o (L Q ) ... 31
3.4.5 Pr ecisã o ... 32
3.4.6 R epetitividade ... 33
3.4.7 Pr ecisã o inter mediár ia ... 33
3.4.8 R epr odutibilidade ... 34
3.4.9 E xatidã o ... 34
3.4.10 R ecuperaçã o (R ) ... 34
3.5.Q uimiometr ia ... 35
3.5.1 Pr é tr atamento dos dados ... 35
3.5.1.1 F iltr o de S avistsk y- G olay ... 36
3.5.1.2. Nor malizaçã o ... 36
3.5.1.3. D ados centr ados na média ... 36
3.5.1.4 A plicaçã o de der ivada ... 36
3.5.2. M étodos multivar iados ... 37
3.5.2.2 S I M C A ... 37
3.5.2.3 L D A ... 37
3.5.3. A plicaçã o de A nálise multivar iada ... 38
3.5.3.1 A nálise multivar iada em per fumes ... 38
4 PA R T E E X PE R I M E NT A L ... 41
4. 1 R eagentes e acessór ios ... 41
4.2 A mostr as ... 43
4.3 I nstr umentaçã o e softwar e ... 43
4.4 A nálise de compostos inor gâ nicos ... 44
4.4.1 A nálise de clor eto (C r omatogr afia de íons) ... 44
4.4.2 A nálises de sódio e potássio ... 44
4.5 A nálise de compostos or gâ nicos ... 44
4.5.1 A nálise de infr aver melho ... 44
4.5.2 A nálise do teor de álcool etílico por C G -D I C ... 45
4.5.3 A nálise de UV -V is ... 45
4.6 A nálise multivar iada ... 46
4.6.1A nálise multivar iada par a estudo de íons e etanol ... 46
4.6.2 A nálise multivar iada par a análise UV ... 47
4.6.3 A nálise de fr agr â ncias alérgenas em per fume por H S -M E F S -C G -E M ... 48
4.6.4 C ondições cromatogr áficas (C G -E M ) par a análise de fr agr â ncias alér genas em per fumes ... 49
5 R E S UL T A DO S E D I S C US S Õ E S ... 52
5.1 V alidaçã o do método de análise par a fr agr â ncias alér genas em per fume ... 52
5.1.1 S eletividade ... 52
5.1.2. L inear idade ... 53
5.1.3 T este de significâ ncia de par â metr os das cur vas de calibr açã o ... 55
11
5.1.5 L imite de detecçã o (L D ) e limite de quantificaçã o (L Q ) ... 59
5.1.6 R ecuperaçã o ... 61
5.1.7 A nálise dos per fumes ... 62
5.2 A nálise multivar ada de per fumes ... 66
5.2.1A nálise infr aver melho ... 67
5.2.2 A nálise M ultivar iada de per fumes por espectr oscópia UV ... 72
5.2.3. A nálise de íons, etanol e estudo qumiométr ico ... 82
6. C O NC L US Õ E S ... 90
R E F E R ÊNC I A S ... 91
F I G UR A S
F igur a 1: Pir â mide de constituintes dos per fumes. ... 18
F igur a 2. S istema de extraçã o H S -M E F S . ... 49
F igur a 3: C r omatógr afo gasoso acoplado a detector de massa do tipo quadr ipolo. ... 50
F igur a 4: C romatogr ama da análise das 21 fr agr â ncias alér genas pelo modo S C A N: 1-L inalol, 2-octanoato de 2-metila, 3- citr onelol, 4- citral (a e b) , 5-ger aniol, 6-cinamaldeído, 7-hidr oxicitronelol, 8- álcool anis, 9- álcool cinâ mico, 10- eugenol, 11-isoeugenol, 12-cumar ina, 13- alfa-isometil ioneno, 14-lilial® , 15-amilcinamal, 16-lir al, 17- álcool amil cinâ mico, 18-far nesol (a e b), 19- hexilcinamaldeído, 20-salicilato de benzila e 21 cinamato de benzila. ... 53
F igur a 5: E spectros de I V dos per fumes or iginal e falso1. ... 68
F igur a 6: E spectros de I V dos per fumes or iginal e falso2. ... 68
F igur a 7: E spectros de I V dos per fumes or iginal e falso 3. ... 69
F igur a 8: PC A dos dados de infr avermelho dos per fumes.. ... 70
F igur a 9: H C A dos dados de infr avermelho dos per fumes. ... 70
F igur a 10: G r áfico E scor es dos dados de infr aver melho dos per fumes. ... 71
F igur a 11: Os espectr os de UV dos per fumes or iginais. ... 72
F igur a 12: E spectros UV do limoneno, linalol e citr al. ... 73
F igur a 13: E spectros UV do eugenol, isoeugenol e cumar ina... 74
F igur a 14: E spectros UV dos der ivados cinâ micos... 74
F igur a 15: E spectros UV dos der ivados cinâ micos... 75
F igur a 16: E spectr os UV de amostras or iginal (O 4), falso ( F 4), diluído falso (F 4) e etanol. ... 76
F igur a 17: Poder discr iminate S I M C A . ... 78
F igur a 18: (a) D istâ ncia entr e classes. (b) R esíduos O r iginais. (c) R esíduos falso. ... 79
F igur a 19: PC A com os r esultados de análises de íons e etanol em per fumes, pr é -pr ocessamento por autoscalonamento. ... 85
F igur a 20: G r áfico de L oadings par a os dados de íons e etanol. ... 85
F igur a 21: T empo de r etençã o do linalol (F r agmentos 41,43 e 71). ... 101
F igur a 22: T empo de r etençã o do C itr onelol ( F r agmentos 41,67,69) ... 101
13
F igur a 25: T empo de r etençã o do G er aniol (F r agmentos 41e 69). ... 102
F igur a 26: T empo de r etençã o do C inamaldeido (F r agmentos 131). ... 102
F igur a 27: T empo de r etençã o do H idr oxicitronelol (F r agmento 59). ... 103
F igur a 28: T empo de r etençã o do álcool anis (F r agmentos 131). ... 103
F igur a 29: T empo de r etençã o do álcool cinâ mico (F r agmentos 91). ... 103
F igur a 30: T empo de r etençã o do isoeugenol (F r agmentos 164)... 104
F igur a 31: T empo de r etençã o do eugenol (F r agmentos 103). ... 104
F igur a 32: T empo de r etençã o do cumar ina ( F r agmentos 89, 118 2 146) . ... 104
F igur a 33: T empo de r etençã o ionone (F ragmentos 135,107 e 150). ... 105
F igur a 34: T empo de r etençã o do lilial (F r agmentos 131 e 189). ... 105
F igur a 35: T empo de r etençã o do amilcinamal ( F r agmentos 91,115 e 117). ... 105
F igur a 36: T empo de r etençã o do lir al (F r agmentos 79) ... 106
F igur a 37: T empo de r etençã o do álcool amilcinâ mico ( F r agmento 133). ... 106
F igur a 38: T empo de r etençã o do far nesol (F r agmento 69). ... 106
F igur a 39: T empo de r etençã o do hexilcinamaldeido (F r agmento 129). ... 107
F igur a 40: T empo de r etençã o do salicilato de benzila (F r agmento 91)... 107
F igur a 41: T empo de r etençã o do cinamato de benzila (F r agmento 77, 91 e 131). ... 107
T A B E L A S
T abela 1: F r agr â ncias alér genas, N
o
C A S , PM , L ogK ow, solubilidadae, P.E . e E strututa.
... 19
T abela 2: E studo sobr e fr agr â ncias alér genas na literatur a ... 23
T abela 3: E studos de como diferenciar per fumes outr as matr izes. ... 49
T abela 4: Pur eza dos padr ões de fr agr â ncias alér genas segundo for necedor A custandar t ... 51
T abela 5: T ipo de per fumes, mar ca e or igem ... 52
T abela 6: D ivisã o das amostr as par a tr einamento e validaçã o de modelo S I M C A . ... 56
T abela 7: C ondições C r omatogr áficas. ... 59
T abela 8: M odo S I M : tempo e fr agmentos. ... 59
T abela 9: T empo de r etençã o e fr agmentos dos analitos. ... 60
T abela 10: C ur vas de calibr açã o (equaçã o da r eta), coeficiente de cor relaçã o (R ) dos compostos estudados em uma faixa de concentr açã o de 1 a 50 µ g.L -1 ... 66
T abela 11: R esultados do teste de significâ ncia estatística dos par â metr os das cur vas de calibr açã o. Sa = desvio padr ã o do declive; Sb = desvio-padr ã o da intercepçã o; tcalc, A = valor t calculado par a o declive; tcalc, B = valor t calculado par a a interceptaçã o. ... 68
T abela 12: Pr ecisã o inter mediár ia e r epetibilidades. ... 71
T abela 13: L imite de detecçã o e limite de quantificaçã o. ... 72
T abela 14: R ecuper açã o. ... 74
T abela 15: A nálise dos pefumes. ... 76
T abela 16: R esultados do modelo S I M C A . ... 89
T abela 17: F unçã o discr iminante e coeficientes da funçã o de classificaçã o. ... 91
T abela 18: O s r esultados da análise de íons e etanol e seu desvio padr ã o (DP) em Per fumes ( F ) falso e (O ) or iginais. ... 93
T abela 19: T este de igualdade da media dos gr upos. ... 97
15
1 I NT R O D UÇ Ã O
O perfume é um produto de grande importância econômica na indústria de cosméticos, sendo constituído principalmente de fragrâncias naturais e/ou sintéticas. S ua fabricaçã o requer uma combinaçã o de diversos constituintes (HA D A D et al., 2008).
D evido à lucratividade deste setor, vem aumentando em diversos países um comércio paralelo de produtos falsificados (MA R QUE S et al., 2006). E ste comércio é danoso à economia dos países produtores, pois diminui a arrecadaçã o tributária e influencia de modo negativo o mercado de trabalho da indústria de dermocosméticos.
A lém de prejudicar a economia dos países, os produtos falsificados sã o um risco à saúde pública (C A NO et al., 2011), pois na fabricaçã o dos mesmos sã o usadas maté rias-primas de baixa qualidade e em concentrações inadequadas, o que pode provocar problemas como alergia (D A V IE S et al., 2008; C A D BY et al., 2011).
D iversos estudos clínicos vê m demonstrando que a presença de alguns compostos em produtos dermocosméticos ocasionam uma reaçã o alérgica de contato, principalmente na pele, provocando assim uma dermatite (DA V IE S et al., 2008).
Pesquisas recentes investigam como diferenciar perfumes originais de falsos. A lguns desses trabalhos como os de Poprawski et al. (2006) e de C ano et al. (2011)utilizaram um nariz eletrônico e ferramenta quimiométrica PC A para realizar a diferenciaçã o supracitada. Os pesquisadores Hadad et al. (2008), C hingin et al. ( 2008) e Marques et al. (2006)foram alguns dos pioneiros no estudo com espectrometria de massas no modo ionizaçã o por eletrospray e PC A para distinguir falsificaçã o de perfumes. E ntretanto, os trabalhos citados na literatura usando o nariz eletrônico e espectrômetro de massa com ionizaçã o por eletrospray sã o técnicas bastante complexas e onerosas.
ppm, m/v) nos produtos sem enxágue e 0,01% (100 ppm, m/v) nos produtos com enxágue, é obrigatória a presença dessa informaçã o no rótulo desses produtos.
D evido ao fato da literatura apresentar poucos trabalhos sobre a distinçã o de perfumes originais dos falsos, nasceu a ideia de estudar, como parte desta tese, um método eficaz para promover a diferenciaçã o de perfumes. Para isso, técnicas analíticas e ferramentas estatísticas foram combinadas para gerar um método de fácil interpretaçã o. Outra parte da tese tratou de desenvolver uma metodologia analítica para identificar e quantificar fragrâncias alérgenas em perfumes, utilizando microextraçã o em fase sólida e cromatografia gasosa acoplada a detector de massas (C G-E M) com pequena quantidade de amostra (10µ g.L
-1
17
2 O B J E T I V O
2.1 O bj etivos G er ais
C lassificar perfumes em originais ou falsos utilizando técnicas analíticas e ferramentas quimiométricas. V alidar uma metodologia analítica para análise de fragrâncias alérgenas em perfumes por microextraçã o em fase sólida (ME F S ) e cromatografia gasosa acoplada a um detector de massa (C G-E M).
2.2 O bj etivos específicos
A nalisar compostos orgânicos dos perfumes por espectroscopia na regiã o do infravermelho, regiã o do UV -V is, por cromatografia gasosa acoplada a detector de ionizaçã o de chama (C G -D IC ) e cromatografia gasosa acoplada a um detector de massa (C G-E M).
A nalisar compostos inorgânicos dos perfumes por cromatografia de íons e fotometria de chama.
D iscriminar perfumes originais e falsos por ferramentas quimiométricas (PC A , S IMC A e L D A ).
3.R E V I S Ã O D A L I T E R A T UR A
3.1 Per fumes
A palavra perfume é originada do latim “per fumm” que significa através da fumaça. E ste produto originalmente era utilizado pelas elites: reis, sacerdotes, monarcas, imperadores, entre outros. No século X X , com a revoluçã o industrial, os perfumes foram disseminados por todas as sociedades em diversas partes do mundo, e hoje em dia é um produto praticamente indispensável ao ser humano (PY B US et al., 1999).
O perfume geralmente é constituído de 78 % de álcool etílico (m/m) anidro. A legislaçã o exige este tipo de álcool para evitar o seu uso em alimentos, bebidas e produtos farmacê uticos. Outros constituintes sã o: 12 % (m/m) de fragrâncias, 8,5 % (m/m) de água destilada e 0,5 % (m/m) de benzofenonas (usadas para prevenir a degradaçã o do produto) e 1% PPG (polipropilenoglicol) , também utilizado como fixador das fragrâncias (PY B US et al., 1999; MA R QUE S , 2006).
Um perfume apresenta-se dividido em trê s partes. A parte superior, mais volátil, é chamada de nota de saída, geralmente formada por fragrâncias cítricas; a segunda é a nota de corpo, onde se encontram fragrâncias florais; e a última é conhecida por nota de fundo, constituída por fragrâncias amadeiradas. E stas, por apresentarem massas molares mais elevadas, possuem funçã o de fixador (MA R QUE S , 2006; MA T A et al, 2005).
19 F onte: (M aques, 2006)
S egundo a A B IHPE C (A ssociaçã o B rasileira da Indústria de Higiene Pessoal, Perfumaria e C osméticos), a indústria brasileira de dermocosméticos apresentou um crescimento médio deflacionado composto próximo a 10% aa nos últimos 18 anos, tendo passado de um faturamento "E x-F actory", líquido de imposto sobre vendas, de R $ 4,9 bilhões em 1996 para R $ 38 bilhões em 2013 (A B IHPE C -2015).
3.2 F r agr â ncias alér genas
A s fragrâncias sã o compostos orgânicos voláteis ou semi-voláteis que apresentam características odoríferas geralmente agradáveis. Por esse motivo sã o usadas em perfumes ou produtos perfumados dos mais diversos fins (MA R QUE S , 2006). A lgumas dessas fragrâncias podem manifestar reaçã o alérgica quando entram em contato direto com a pele (D A V IE S et al., 2008). E studos clínicos sobre essa reaçã o alérgica fizeram a Uniã o E uropéia e o B rasil adotarem uma legislaçã o mais rigorosa quanto a esses tipos de compostos, em 30 de novembro de 2009 e em 20 de janeiro de 2012, respectivamente (UE -2009; A NV IS A -2012; L A MA S et al., 2010).
A R D C (R esoluçã o da D iretoria do C olegiado) 3/2012- A NV IS A determina que quando o produto dermocosmético apresentar concentraçã o de fragrâncias alérgenas superior a 0,001% (10 ppm) nos produtos sem enxágue, como perfumes, e 0,01% (100 ppm) em produtos com enxágue, como sabonete e shampoo, fica obrigatório o fabricante discriminar a presença desses componentes no rótulo do produto (A NV IS A -2012). E sta resoluçã o determinou que a partir de 1
o
T abela 1.F ragrâncias alérgenas, No C A S , PM, L ogK owc, solubilidadae, P.E . e E strututa. C omposto
a
No C A S
b
PM
c
L ogKow d
Solubilidade ( mg. L
-1
)
P.E
d
(
o
C )
E strutura L imoneno 5989-27-5 136 4,57 13,8 176
Á lcool benzílico 100-51-6 108 1,05 40000 205
L inalol 78-70-6 154 3,28 1589 198
Octonoato de 2- metila
111-12-6 154 2,6 - 219
C itral 5392-40-5 152 3,17 590 229
Geraniol 106-24-1 154 3,28 531 229
C itronelol 111-12-6 156 3,38 322 225 C inamaldeido 104-55-2 132 2,22 1420 229
Hidroxicitronelal 107-75-5 172 1,54 23800 241
Á lcool A nis 105-13-5 138 1,10 2070 259
Á lcool C inâmico 104-54-1 134 1,93 1800 250
E ugenol 97-53-0 164 2,20 <1000 256
21
C umarina 91064-5 146 1,39 2500 298
A lfa-isometil ioneno
127-51-5 206 4,41 16 266
L ilial® 80-54-6 204 4,07 33 279
A mil cinamal 122-40-7 202 4,80 8,5 289
L iral® 3196-04-4 210 2,53 185 319
Á lcool amil cinâmico
101-85-9 204 4,37 26 >200
F arnesol 4602-84-0 222 5,31 267 283
Hexilcinamaldeido 101-86-0 216 4,82 2,8 308
B enzoato de benzila 120-51-4 212 3,97 19,8 324
Salicilato de benzila 118-58-1 228 4,31 <1000 320
C inamato de benzila
103-41-3 238 3,65 9 371
F onte: T abela das F ragrâncias A lérgenas (L A MA S et al., 2011)
a
Nomenclatura usual.
b
Número de identificaçã o universal para cada composto químico adotado pela sociedade americana de química.
c
Peso molar do composto químico
d
3.3 A nálise de fr agr â ncias alér genas
O primeiro relato na literatura sobre análise de fragrâncias alérgenas foi o de R agosti (1995), que trabalhou com a análise de 11 compostos em cosméticos. Nesse trabalho o autor identificou os componentes das fragrâncias por C G-E M. A quantificaçã o foi realizada por sistema C G -D IC . E ntretanto, eventuais problemas de possível co-eluiçã o entre os compostos nã o foram resolvidos usando o sistema C G-D IC , uma vez que o mesmo nã o exibe qualquer especificidade para avaliar a percentagem de um determinado composto em mistura complexa.
E llendt et al.(2001) publicaram um trabalho sobre análise de fragrâncias alérgenas em desodorantes. Nesse estudo foram 24 compostos analisados utilizando C G -E M no modo S IM (monitoramento seletivo de íons) com dois fragmentos específicos para cada composto e utilizando como padrã o interno citronelal. E sse trabalho permitiu a separaçã o dos analitos, mas o tempo de corrida era bastante longo (80-120 min), e o citronelol é instável para ser usado como um padrã o interno.
C haintreau et al. (2003) analisaram 24 fragrâncias alérgenas e mais 4 outras (fenil acetaldeído, estrangole, metileugenol e metil 2-nonenoato) em perfumes. Os autores trabalharam com C G-E M com vaporizador térmico programável e auto-amostrador. F oram utilizadas 4 colunas capilares diferentes apolares D B 1 e D B 5, de polaridade intermediária D B 17 (J & W - A gilent T echnologies) e polar D elta 3 (Mach- E R E Y –Nagel, D üren, A lemanha). Nesse trabalho foi utilizado C G-E M operando no modo S IM com trê s fragmentos para cada composto e os padrões internos foram 1,4 dibromo benzeno e 4,4 dibromobifenil. D entre as colunas estudadas nã o ocorreu co-eluiçã o usando as colunas D B 5 (tempo de corrida 45 min) e D B 17 (tempo de corrida 55 min).
23
D ebonneville & C haintreau (2004) continuaram o trabalho de S hellie et al. (2003), utilizando cromatografia gasosa bidiomencional acoplada com detector de massa (C C G-E M) com uma coluna D B 1 (A gilent) conectada a uma coluna polar S PW A X -10 (S upelco, B ellefonte, PA , US A ), ou a uma D B 225 (A gilent). Os autores usaram modo S IM investigando um fragmento para cada composto, sendo utilizados como padrões internos 1,4 dibromo benzeno e 4,4 dibromobifenil. E sse trabalho conseguiu resolver o problema da coeluiçã o, muito comum em cromatografia gasosa quando se trabalha com o sistema GC GC -MS , mostrando que o sistema C G-E M no modo S IM é muito importante para a análise de fragrâncias alérgenas.
L eijis et al. (2005) trabalharam com C G -E M no modo S IM com divisã o de fluxo para duas colunas, apolar V arian C PS il 5 C B e polar V arian C PW A X 52 C B , para óleos perfumados. E les utilizaram como pardã o interno 1,4 dibromo benzeno e 4,4 dibromobifenil. Para todos os compostos foram analisados trê s (3) fragmentos. E sse trabalho resolveu o problema da co-eluiçã o, devido ao modo S IM, quando se utilizam mais de 2 fragmentos, permitir a quantificaçã o dos compostos.
Nieder et al.(2006) analisaram as fragrâncias alérgenas em creme com tratamento da amostra por cromatografia de exclusã o molecular e C G-E M no modo S IM. Utilizou
2
H8
naptaleno e o hexaclobenzeno como padrões internos. E sse trabalho permitiu a quantificaçã o da maioria dos compostos, sendo promissor para a análise de cremes pela indústria dermocosmética.
L amas et al.(2009) publicaram o primeiro trabalho sobre microextraçã o em fase sólida em modo head-space com C G -E M - íon trap no modo S IM para analisar 15 fragrâncias alérgenas em águas de banho para bebê s. E sse trabalho abrangeu um estudo seletivo para cinco tipos de fibras (PD MS , PD MS /D V B , C A R /PD MS , PA e D V B /C A R /PD MS ) para a análise destes compostos, adotando uma coluna polar D B-W A X (A gilen). A fibra selecionada foi a PD MS /D V B (polidimetilsiloxano-divinilbenzeno) e a extraçã o envolveu uma amostra de 10 mL em frasco (vial) de 22 mL em presença de 20 % de NaC l para melhorar a recuperaçã o. C om esses resultados L amas et al. (2009) conseguiram medir fragrâncias de concentrações em nível de µ g.L
-1
.
bons resultados trabalhando com a fibra PD MS /D V B empregando uma coluna apolar HP5 (A gilent).
S anchez et al. (2010) trabalharam com 24 fragrâncias em dermocosméticos com um amostrador automático do tipo headspace, em combinaçã o com um cromatógrafo gasoso equipado com um vaporizador de temperatura programável e espectrometria de massas com detector do tipo quadripolo no modo S IM equipado com uma coluna apolar D B -V R X (A gilent). F oram utilizadas duas técnicas de injeçã o diferentes: por vaporizaçã o do solvente e injeçã o de hot-split. E sse trabalho obteve bons resultados, porém há a necessidade de grande quantidade de amostra e os resultados sã o quantificados em mg L
-1
. A tabela 2 mostra os trabalhos da literatura sobre fragrâncias alérgenas.
T abela 2. E studo sobre fragrâncias alérgenas na literatura
Número de C omposto
M atriz E xtr açã o T écnica analítica
Nivel de concentr açã o
R efer ê ncia
11 C osméticos
(shampoo e creme)
E xtraçã o com solvente
C G-E M modo S C A N
C G-D IC
100-3000 mg L
-1
R asgoti et al (1995)
24
D esodorante E xtraçã o com solvente
C G-E M Modo S IM
100-500 mg L
-1
E llendt et al. (2001),
28 Perfumes Injeçã o
direta
C G-E M
Modo S C A N
2-100 mg L
-1
C haintreau et al. (2003)
24 Perfumes Injeçã o
direta
C GxC G-D IC
20-1000 mg L
-1
25
Número de C omposto
M atriz E xtr açã o T écnica
analítica
Nivel de concentr açã o
R efer ê ncia
24 F ragrâncias Injeçã o
direta
C GxC G-MS
2-100 mg L
-1
D ebonnevill e & C haintreau (2004)
24 Óleos
Perfumados
Injeçã o direta
GC -MS modo S IM
2-60 mg L
-1
L eijis et al. (2005),
24 C remes E xcluçã o
Molecular
GC -MS modo S IM
0,6-10 mg L
-1
Nieder et al.(2006)
26 Óleos
essenciais
E xtraçã o com solvente
HPL C 1-500 mg L
-1
V illa et al (2007)
20 B rinquedos
perfumado
HS -ME F S C G -E M modo S IM
10-100 mg L
-1
Maasuck, et al (2010)
12 C reme E xtraçã o
em fase
sólida
C G-E M modo S IM
10-150 mg L
-1
S gorbini et al .,(2010)
26 C reme D isperçã o
em fase
sólida pressurizada por extraçã o por liquido
C G-E M modo S IM
0,2-10 mg L
-1
L amas et al, (2010)
24 In door air
Headspace-micro
extraçã o em fase sólida
C G-E M modo S IM
0,08-40 ng.mg
-1
L amas et al, (2010)
24 In door air E xtaçã o por
ultrassom
C G-E M modo S IM
00,25-20 mg L
-1
Número de C omposto
M atriz E xtr açã o T écnica
analítica
Nivel de concentr açã o
R efer ê ncia
14 Á guas de
banho para bebê s.
Head space- mcricro extraçã o em fase sólida
C G-E M modo S IM
0,01-0,3 µ g L
-1
L amas et al. (2010)
26 Á gua de piscina e
água de esgoto
Microextra-çã o-
emulsã o assistida por ultrassom
C G-E M modo S IM
0,02-10 mg L
-1
B ecerril et al. (2010)
24. Perfume,
desodorante
e creme
Head space com
amostrado automático
C G-E M modo S IM
0,060-640 mg L
-1
S anchez et al. (2010),
26
.
Á gua de piscina e água de esgoto
Headspace-micro extraçã o em fase sólida
C G-E M modo S IM
0,01-0,3 µ g L
-1
B ecerril et al. (2010)
24 shampoos, leite
corporal, leite hidratante, creme dental, cremes, sabonetes líquidos
D ispersã o-micro extraçã o em fase sólida
C G-E M-E M
1-1000 µ g L
-1
C eleiro, et al (2014)
24 L enços umedecidos
e papel higiê nico molhado
E xtraçã o líquido pres-surized
C G-E M modo S IM
2-2000 µ g L
-1
C eleiro et al., (2015)
13 Á gua da estaçã o
de tratamento de esgoto
Headspace-micro extraçã o em fase sólida
C G-E M modo S IM
0,1-160 µ g L
-1
27
Neste trabalho utilizou-se a fibra PD MS /D V B , tal como L amas et al. (2009), que empregou a técnica de micro extraçã o em fase sólida usando C G -E M -quadripolo no modo S IM, utilizando quantidades mínimas de perfume (10 µ L ) para fazer análises das fragrâncias alérgenas em concentrações na unidade de µ g.L
-1
. E ssa concentraçã o foi escolhida neste estudo devido a alguns perfumes apresentarem valores elevados de fragrâncias e para tentar preservar a integridade do equipamento.
3.4 V alidaçã o de métodos cr omatogr áficos
S egundo L A NÇ A S (2009), validaçã o é o ato ou efeito de validar, dar validade, tornar válido, tornar legítimo ou legal. V isa atenuar os fatores que levam a imprecisã o ou inexatidã o de um dado gerado. D esse modo, a fim de garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis sobre a amostra, faz-se necessário uma avaliaçã o denominada validaçã o (R IB A NI et al., 2004; L A NÇ A S , 2009).
A validaçã o de um procedimento analítico tem a finalidade de comprovar que o mesmo é adequado aos objetivos propostos, ou seja, que os parâmetros de validaçã o avaliados atendem aos critérios de aceitaçã o preconizados. V isa ainda garantir a qualidade metrológica dos resultados analíticos, conferindo-lhes rastreabilidade, comparabilidade e confiabilidade para a tomada de decisões. (MA PA , 2011).
A validaçã o metodológica deve ser conduzida de maneira a evidenciar e garantir que o método é adequado ao objetivo desejado. A validaçã o metodológica é um requisito dos órgã os de acreditaçã o, e deve ser subsidiada e melhorada através de processos de verificaçã o do desempenho de método. Um processo de validaçã o definido e documentado oferece à s agê ncias reguladoras evidê ncias objetivas de que os métodos e os sistemas sã o adequados para o uso desejado (R IB A NI et al., 2004; A NV IS A , 2003; E UR OPE A N C OMMIS S ION, 2010). V alidar um método é um procedimento demorado, que requer um grande número de experimentos analíticos e cálculos estatísticos, o que aumenta o custo das análises (R IB E IR O et al., 2008).
2004; L A NÇ A S , 2009; E UR OPE A N C OMMIS S ION, 2010; MA PA , 2011; INME T R O, 2011).
3.4.1 S eletividade
Normalmente, a seletividade é o primeiro parâmetro de validaçã o estudado, constituindo-se como um dos principais parâmetros que caracterizam e descrevem um método de análise principalmente em análise de traços, dado que se a mesma nã o for assegurada, a linearidade, a exatidã o e a precisã o estarã o seriamente comprometidas. (R IB A NI et al., 2004; INME T R O, 2011).
A seletividade de um método instrumental de separaçã o é a capacidade de avaliar, de forma inequívoca, as substâncias em análise na presença de componentes que possam interferir na sua determinaçã o em uma amostra complexa. Nos métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções necessárias para garantir a pureza dos picos cromatográficos. S endo assim, a utilizaçã o de testes de pureza de pico (por exemplo, com auxílio de detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas) sã o interessantes para demonstrar que o pico cromatográfico é atribuído a uma só substância (A NV IS A , 2003; R IB A NI et al., 2004; MA PA , 2011).
3.4.2 L inear idade
A linearidade corresponde à capacidade de o procedimento produzir sinais analíticos diretamente proporcionais à concentraçã o do analito na amostra, dentro de uma determinada faixa de aplicaçã o ( A NV IS A , 2003; R IB A NI et al., 2004; R IB E IR O et al., 2008; MA PA , 2011).
29
(1)
Onde:
= sinal analítico (absorbância, altura ou área do pico, etc.);
= concentraçã o do analito;
= coeficiente angular;
= coeficiente linear;
A estimativa dos coeficientes de uma curva analítica pode ser alcançada usando o método matemático conhecido como regressã o linear. A lém dos coeficientes de regressã o a e b, também é possível calcular, a partir dos pontos experimentais, o coeficiente de correlaçã o linear (R). E ste parâmetro permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1,0, menor a dispersã o do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressã o estimados. V isando avaliar se o modelo linear é adequado, podem ser executados testes estatísticos a fim de verificar a significância estatística da regressã o linear e dos parâmetros a e b (R IB A NI et al., 2004).
T este de significâ ncia dos par â metr os da cur va de calibr açã o
Idealmente, as curvas de calibraçã o deveriam passar pela origem, onde a curva de calibraçã o obtida seria ideal com intercepto passando pelos pontos (0,0) dos eixos cartesianos, desse modo o coeficiente angular (a) seria numericamente igual a 1 e o coeficiente linear (b) igual a zero.
A significância dos parâmetros (coeficientes angular e linear) pode ser avaliada usando um teste de hipótese aplicando o parâmetro t de S tudent para comparar os valores estimados para a inclinaçã o (a’) e intercepto (b’) com os valores de referê ncia a e b, levando em consideraçã o as duas equações que seguem ( D A NZ E R ; C UR R IE R , 1998; L IG IE R O et. al., 2009).
(2)
a calc,a
s a a
t
'
onde:
sa = desvio padrã o da inclinaçã o
sb = desvio padrã o do intercepto
Paralelamente, obtê m-se os desvios da inclinaçã o (sa) e do intercepto (sb) e faz-se o
comparativo dos valores de tcalc com os valores de tʋ, 95% tabelado, considerando o número de
graus de liberdade (ν = p - 2) para um modelo linear, onde p é o número de níveis de concentraçã o da calibraçã o. O teste pode ser avaliado para 95% de confiança. D e modo que deve ser interpretado como mostrado abaixo:
S e o tcalc < tcrit,α ,ν o valor do parâmetro de calibraçã o nã o é significativamente diferente
do valor teórico esperado, podendo ser eliminado;
S e o tcalc > tcrit,α ,ν o valor do parâmetro de calibraçã o é significativamente diferente do
valor teórico esperado, nã o podendo ser descartado.
3.4.3 L imite de detecçã o (L D )
O limite de detecçã o ( L D ) é a menor concentraçã o do analito que pode ser detectada, porém nã o necessariamente quantificada ( A NV IS A , 2003; R IB A NI et al., 2004; INME T R O, 2011). Quando sã o reali zadas medidas em amostras com baixos níveis de concentraçã o do analito, como por exemplo, análise de traços, é importante saber qual o menor valor de concentraçã o do analito que pode ser detectado pelo método. ( INME T R O, 2011).
O limite de detecçã o é estimado por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectável. D entre os meios mais usuais de se estimar o L D tem-se: o método visual, o método relaçã o sinal-ruído e o método
(3)
b calc,b
s b b
t
31
baseado nos parâmetros da curva analítica ( A NV IS A , 2003; R IB A NI et al., 2004; R IBE IR O et al., 2008).
Nos métodos instrumentais, tais como os métodos cromatográficos, o L D pode ser estimado como a concentraçã o do analito que produz um sinal igual ou superior a trê s vezes a razã o sinal / ruído do equipamento. Outra maneira de estimar o L D para os métodos que empregam curva de cali braçã o é por meio do método que se baseia nos parâmetros da curva analítica, onde L D é estimado por intermédio da E quaçã o 4 (A NV IS A , 2003; A B NT , 2005; MA PA , 2011).
(4)
Onde:
= desvio padrã o do coeficiente linear da curva analítica;
= coeficiente angular da curva analítica;
3.4.4 L imite de quantificaçã o (L Q )
O limite de quantificaçã o ( L Q) ou limite de determinaçã o é definido como o menor nível de concentraçã o que pode ser quantificado com precisã o e exatidã o aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas (A NV IS A , 2003; R IB A NI et al., 2004; MA PA , 2011).
Os mesmos critérios adotados para a estimativa do L D sã o empregados para estimar o L Q, utilizando a relaçã o à relaçã o sinal / ruído igual ou superior a dez, dessa maneira o L Q é estimado através da E quaçã o 5(A NV IS A , 2003; R IB A NI et al., 2004).
(5)
Onde:
= desvio padrã o do coeficiente linear da curva analítica;
3.4.5 Pr ecisã o
A precisã o de um método analítico representa o grau de concordância entre resultados de testes individuais de análises repetidas de uma amostra. E la está associada com erros aleatórios e é uma estimativa de dispersã o de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas, ou seja, tal parâmetro representa a proximidade dos resultados obtidos em torno de um valor médio. (A NV IS A , 2003; R IB E IR O et al., 2008).
A maneira mais comum de se expressar numericamente a precisã o é por meio do coeficiente de variaçã o ( C V ), entretanto, também é possível expressar tal parâmetro por meio do desvio padrã o (s) e pelo intervalo de confiança da média. S endo determinados respectivamente pelas E quações 6 e 7 (A NV IS A , 2003; R IB A NI et al., 2004).
(6)
Onde:
= estimativa do desvio padrã o das medidas;
= concentraçã o média;
(7)
Onde:
= valor de cada uma das medidas individuais;
= valor médio das medidas individuais;
33
A precisã o pode ser considerada e determinada por meio de trê s maneiras diferentes: repetitividade, precisã o intermediária e da reprodutibilidade (A NV IS A , 2003; MA PA , 2011; INME T R O, 2011).
3.4.6 R epetitividade
A repetitividade também designada de repetibilidade, precisã o intra-ensaio ou precisã o intracorrida refere-se à capacidade do método de gerar os mesmos resultados ao longo de um curto intervalo de tempo, em condições idê nticas denominadas condições de repetitividade: mesmo procedimento de mediçã o, mesmo observador, mesmo instrumento utilizado sob as mesmas condições, mesmo local e repetições no menor espaço de tempo possível (R IB A NI et al., 2004; INME T R O, 2011).
S egundo a A NV IS A , a repetitividade do método deve ser examinada por, no mínimo, 9 determinações, contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 concentrações, baixa, média e alta, com 3 replicatas de cada ou 6 replicadas a um nível de concentraçã o (A NV IS A , 2003). O INME T R O sugere que sejam realizadas 7 ou mais determinações para o cálculo da estimativa do desvio padrã o ( INME T R O, 2011).
3.4.7 Pr ecisã o inter mediár ia
A precisã o intermediária (precisã o intercorridas) avalia à concordância entre os resultados intralaboratorial, avaliando assim as variações devido a eventos aleatórios que normalmente ocorrem durante o uso de um método, tais como diferentes dias, diferentes analistas, diferentes equipamentos ou uma combinaçã o destes fatores. A A NV IS A recomenda um mínimo de dois dias diferentes e com analistas diferentes para a determinaçã o da precisã o intermediária. A validaçã o deste parâmetro visa verificar se no mesmo laboratório o método fornecerá os mesmos resultados (A NV IS A , 2003; R IB A NI et al., 2004)
3.4.8 R epr odutibilidade
O termo reprodutibilidade (precisã o interlaboratorial) define a precisã o dos resultados obtidos para uma determinada análise realizada por diferentes analistas em diferentes laboratórios, todavia seguindo a mesma metodologia (R IB E IR O et al., 2008).
A reprodutibilidade refere-se aos resultados dos estudos colaborativos entre laboratórios distintos, deve ser considerada em situações como a padronizaçã o de procedimentos analíticos a serem incluídos, por exemplo, em farmacopeias (A NV IS A , 2003; R IB A NI et al., 2004).
3.4.9 E xatidã o
A exatidã o à s vezes designada de veracidade é um parâmetro de validaçã o que representa o grau de proximidade entre o valor medido e um valor de referê ncia considerado como verdadeiro. É importante salientar que um valor exato ou verdadeiro é um valor obtido por uma mediçã o perfeita e este valor é indeterminado por natureza (R IBA NI et al., 2004; R IB E IR O et al., 2008).
Os procedimentos normalmente utilizados para avaliar a exatidã o de um método sã o: uso de materiais de referê ncia certificados (MR C ) , comparaçã o de métodos, ensaios de recuperaçã o e adiçã o de padrã o. A avaliaçã o da exatidã o por intermédio da recuperaçã o é o método mais empregado.T al fato é decorrente da dificuldade de obtençã o de materiais de referê ncia certificados ( MR C ) . A lém disso, um segundo método analítico nem sempre está disponível, impossibilitando assim a comparaçã o de métodos (R IB A NI et al., 2004; INME T R O, 2011; HA R R IS , 2012).
3.4.10 R ecuperaçã o (R )
A recuperaçã o ( fator de recuperaçã o) é definida como a proporçã o da quantidade do analito de interesse, presente ou adicionada na porçã o analítica do material teste, que é extraída e passível de quantificaçã o (R IB A NI et al., 2004). A recuperaçã o mede a tendê ncia total do procedimento analítico e, portanto, é uma expressã o de sua exatidã o (MA PA , 2011).
35
menos trê s diferentes concentrações: baixa, média e alta, da faixa de uso do método. Quando a recuperaçã o é obtida por meio de fortificações de matriz branca, a porcentagem de recuperaçã o é calculada através da E quaçã o 8 ( A NV IS A , 2003; A B NT , 2005; INME T R O, 2011; MA PA , 2011).
(8)
Onde:
= concentraçã o do analito medida na amostra fortificada;
= concentraçã o do analito medida na amostra nã o fortificada (branco da amostra);
= concentraçã o do analito adicionado ao branco da amostra ( concentraçã o teórica);
3.5.A nálise Q uimiometr ia
A quimiometria é uma ferramenta que busca a interaçã o entre a química, a matemática e a estatística, facilitando a interpretaçã o e o aperfeiçoamento de resultados. Uma das partes da quimiometria é a análise exploratória de dados que se aproximam num espaço multidimensional. Para obter a análise exploratória dos dados, os mesmos sã o organizados em planilhas, ou seja: uma matriz do tipo n x m (GOND INHO, 2009).
3.5.1 Pr é tr atamento dos dados
C om a finalidade de aumentar a correlaçã o entre a resposta instrumental em relaçã o ao analito, busca-se um pré-tratamento dos dados, com o intuito de diminuir as distorções ocorridas pelas análises químicas. (POPPI, 1989)
3.5.1.1 F iltr o de S avistsk y- G olay
B asicamente, o filtro de S avistsky- Golay ajusta um polinômio a certa janela com um número fixo de pontos do espectro. O valor dado pelo polinômio no ponto de interesse corresponde ao valor filtrado. E m seguida, há um deslocamento de um ponto nesta janela, ajustando a outro polinômio (da mesma ordem), e assim sucessivamente ocorre deslocamento até o final do espectro. Os filtros exponenciais e de média deslizante consideram aproximações lineares ao sinal. C ontudo, alguns sinais podem ser melhor modelados com aproximações quadráticas ou cúbicas (POPPI, 1989).
3.5.1.2. Nor malizaçã o
A normalizaçã o dos dados consiste em dividir cada variável pelo seu valor médio. D essa forma, para cada linha da matriz de dados é obtido seu respectivo valor médio, através da soma de todas as variáveis e divisã o pelo número total das mesmas, e a seguir, divide-se cada variável desta mesma linha pelo valor médio encontrado. Para as demais linhas da matriz é feito o mesmo procedimento (B E E B E et al.,1998).
3.5.1.3. D ados centr ados na média
B aseia-se em fazer com que para cada variável, seus valores tenham média zero. Para centrar os dados na média, obtê m-se para cada coluna o valor médio e, em seguida, subtrai-se esse valor de cada variável dessa mesma coluna. D essa forma ocorre a mudança do sistema de coordenadas para o centro dos dados (T HOMA S , 1994).
3.5.1.4 A plicaçã o de der ivada
A aplicaçã o de derivada de primeira ou segunda ordem sobre os dados espectrais brutos é um procedimento que pode destacar ombros espectrais, bem como minimizar o efeito de inclinações provocadas na linha de base dos espectros (MA R T E NS et al., 1994).
37
3.5.2. M étodos multivar iados
E xistem diversos tipos de técnicas estatísticas multivariadas, com as mais diversas aplicações. D entre estas se destacam dois métodos principais: os métodos exploratórios e os métodos de calibraçã o multivariados. A utilizaçã o de um método ou outro depende da natureza do analito e da finalidade (MA L INOW S K I, 1991). A ssim, serã o destacados os métodos estudados neste trabalho, tais como: as técnicas exploratórias PC A (A nálise Principal de C omponentes), e as técnicas de calibraçã o multivariada S IMC A (software independente de modelagem de classes por analogia) e L D A (A nálise linear discriminante).
3.5.2.1 PC A
A PC A resulta na construçã o de um conjunto de vetores, ortogonais entre si, chamados de componentes principais. E stes novos componentes sã o combinações lineares das variáveis originais, construídas em ordem decrescente de variância, resultando no agrupamento de variáveis altamente correlacionadas. A ssim, as análises por componentes principais reduzem a dimensionalidades do conjunto de dados original de forma que as informações mais relevantes ficam concentradas nas primeiras componentes. D essa forma as primeiras componentes principais sã o suficientes para descrever as informações do sistema (B E R E T ON, 2002).
3.5.2.2 S I M C A
Nesse método, sã o desenvolvidos modelos baseados na análise PC A para cada classe. E le é um método de classificaçã o que considera informações da distribuiçã o da populaçã o, estimando o grau de confiança da classificaçã o e podendo prever novas amostras como pertencentes ou nã o a uma classe. Na construçã o do modelo de classificaçã o S IMC A , calcula-se para cada clascalcula-se, em calcula-separado, o desvio padrã o dos resíduos. Para o espaço descrito pelas componentes principais, sã o calculadas as variâncias das amostras em cada eixo. E sses dois parâmetros sã o usados na classificaçã o de novas amostras (S HA R A F et al., 1986; MA S S A R T et al., 1998).
3.5.2.3 L D A
classes e minimizaçã o da distância intra-classes. E sse método procura uma melhor separaçã o dos dados, de modo que quando os dados sã o projetados em plano de classes sejam separados (B E R E T ON, 2002).
A L D A pode ser considerada, assim como a PC A , um método de reduçã o de dimensões. C ontudo, enquanto a PC A seleciona um menor número de variáveis que representam e retê m a máxima variância dos dados, utilizando um número reduzido de variáveis representativas do total do sistema, a L D A seleciona aquelas variáveis que representam a separaçã o máxima entre classes avaliadas. (BE R E T ON, 2002).
3.5.3. A plicaçã o de análise multivar iada
A análise multivariada pode ser aplicada para distinguir amostras de acordo com suas características. Utilizando uma ou mais análises químicas, pode-se gerar uma série de informações que podem ser processadas por análise multivariada; com isso pode-se identificar a classe em que a amostra se enquandra de acordo com suas características químicas.
3.6.3.1 A nálise multivar iada em per fumes
Perfume é um produto de grande importância econômica para a indústria de cosméticos. S eus principais constituintes sã o fragrâncias naturais e/ou sintéticas. D evido a rentabilidade desse setor, um comércio paralelo de produtos falsificados surgiu em muitos países.
Nesse contexto, os estudos recentes tê m investigado perfumes falsos utilizando várias técnicas analíticas. Poprawski et al. (2006) e C ano et al. (2011) usaram um "nariz eletrônico" para diferenciar as amostras verdadeiras das falsas. Hadad et al.(2008), C hingin et al.(2008) e Marques et al. (2006) uti lizaram espectrometria de massas com ionizaçã o por eletrospray para distinguir produtos originais de falsificados. E mbora eficazes, essas técnicas sã o muito complexas e dispendiosas.
39
utilizada com eficiê ncia para classificar, identificar e distinguir produtos originais de cópias falsas. O tratamento tradicional de dados nã o conduz a uma resposta satisfatória, mas quando processado por meio de técnicas quimiométricas, é possível obter algumas conclusões importantes (V E R A S et al., 2012; F E R NA ND E S et al., 2012).
A literatura relata estudos sobre espectrofotometri a UV -V is e técnicas quimiométricas para classificaçã o de biodiesel (V E R A S et al., 2012), vinhos (NA S C IME NT O et al., 2010; UR B A NO et al., 2012), aguardentes (S IL V A et al., 2012), tequila (BA R B OS A -GA R C IA et al., 2007), café (SOUT O et al, 2007) e tabaco (G IOK A S et al., 2011), bem como para a investigaçã o de adulteraçã o e falsificaçã o de tequila (C ONT R E R A S et al., 2012), adulteraçã o de suco ( B OGG IA et al, 2013) e adulteraçã o de biodiesel (F E R NA ND E S et al., 2014).
Outra alternativa para identificar a falsificaçã o de produtos pode ser a análise de íons utilizando análises quimiométricas. O método multivariado aplicado à s técnicas de análise química é uma ferramenta importante, e tem por finalidade reconhecer padrões de classificaçã o de grupos distintos, no presente caso, produtos originais de falsos.
T abela 3. E studos de como diferenciar perfumes e outras matrizes.
C omposto M atriz T écnica
analítica
Q uimiometr ia R efer ê ncia
Orgânico
Perfume Nariz
eletrônico
PC A POPR A W SK I et al.
,2006
Perfume Nariz
eletrônico
PC A C A NO et al., 2011
Perfume E spectrometria de massas com ionizaçã o por eletrospray
PC A HA D A D et al.,2008
Perfume E spectrometria de massas com ionizaçã o por eletrospray
PC A C HING IN et al.,2008
Perfume E spectrometria de massas com ionizaçã o por eletrospray
PC A MA R QUE S et al.,
2006
B iodiesel E spectroscópia UV -V is
PC A , HC A e S IMC A
V E R A S et al., 2012
B iodiesel E spectroscópia UV -V is
S IMC A , K NN, PL S -D A e S PA -L D A
F E R NA ND E S et al, 2014
V inho E spectroscópia UV -V is
PC A , HC A e S IMC A
NA S C IME NT O et al., 2010;
V inho E spectroscópia UV -V is
PC A e S IMC A UR B A NO et al., 2012
A guardentes E spectroscópia UV -V is
PC A , HC A e L D A
S IL V A et al., 2012
T equila E spectroscópia UV -V is
PC A e PL S -D A B A R B OS A -GA R C IA et al., 2007
T equila E spectroscópia UV -V is
PC A e L D A C ONT R E R A S et al., 2012
C afé E spectroscópia
UV -V is
PC A , S IMC A , L D A , S PA -L D A
S OUT O et al, 2007
S uco E spectroscópia UV -V is
PC A B OGG IA et al, 2013
T abaco E spectroscópia UV -V is
PC A e L D A G IOK A S et al, 2011
Inorgânico pimentas e
ervas
IC P-MS IC P-OE S
41 analítica Plantas medicinais brasileiras E spectrômetro de absorçã o atômica com chama.
PC A e HC A D INIZ et al., 2001
C há IC P-MS
IC P-OE S
PC A , S IMC A e L D A
MOR E D A -PINE R O, et al., 2003
C há IC P-OE S PC A e L D A F E R NA D E Z - C A R C E R E et al., 2001
Inorgânico Plantas
medicinais chinesas
E spectrômetro de absorçã o atômica com chama.
PC A e HC A K OL A S A NI et al., 2011
C afé IC P-MS R ede neural B A R B OS A et al., 2014
Heroína IC P-MS PC A L IU et al., 2014
Heroína IC P-MS PC A C HA N et al., 2014
E cstasy IC P-OE S PC A e HC A . W A D E L L et al., 20O4
V inho IC P-OE S PC A e HC A GONZ A L V E Z et al., 2009
Mel IC P-OE S PC A Y UC E L et al., 2013
Mel IC P-MS PC A C HUD Z INS K A et al.,
2010 Óleo do
motor
IC P-OE S L D A K IM et al., 2009
D rogas vegetais
IC P-OE S PC A e HC A A R UMUGA M et al., 2012
4 PA R T E E X PE R I M E NT A L
Os seguintes reagentes foram utilizados: água Milli-Q, NaC l (V etec) e E tanol,
n-butanol e álcool isoamílico (Merck, grau analítico). Utilizaram-se padrões de 1 mL de
fragrâncias alérgenas de concentraçã o 1000 µ g.L
-1
( A cunstandart), tabela 4, como também
fibra de filme polidimetilsiloxiano - divinilbenzeno PD MS -D V B (65µ m, 60µ m), holder e vial
de 40 mL (S ulpeco), padrões de cloreto (Ultra S cientific), padrões de sódio e potássio (20 mg
L
-1
, D igimed).
T abela 4: Pureza dos padrões de fragrâncias alérgenas segundo fornecedor A cstandart .
C omposto Pureza (%, m/m)
L imoneno 100
Á lcool benzílico 99,9
L inalol 97,2
Octanoato de 2 metila 100
C itral 95,4
Geraniol 95,0
C itronelol 96,6
C inamaldeido 98,4
Hidroxicitronelal 99,8
Á lcool A nis 99,8
Á lcool cinâmico 94,8
E ugenol 99,6
Isoeugenol 100
C umarina 100
A lfa-isometil-ioneno 100
L ilial® 100
A mil cinamal 98,3
L yral® 100
Á lcool A mil cinâmico 42
F arnesol 98
Hexil cinamaldeido 100
43
S alicilato de benzila 100
C inamato de benzila 100
4.2 A mostr as
F oram adquiridas 25 amostras de perfumes originais diferentes, sendo 10 unidades da marca A (O B oticário, loja North S hopping, em F ortaleza-C E ) e 15 unidades da marca B (Natura, em um revendedor autorizado no C entro da cidade de F ortaleza-C E ), ao passo que os seus pares falsificados foram adquiridos por duas fontes: parte no comércio informal do C entro de F ortaleza-C E e outra parte cedida pela PE F OC E (Perícia F orense do E stado do C eará) em fevereiro de 2012, conforme a tabela 5.
T abela 5: T ipo de perfumes, marca e origem
T ipo de perfume* Marca Origem
F 1-F 10 A C omércio informal
F 11-F 25 B PE F OC E
O1-O10 A R evendedor autorizado
O11-O25 B R evendedor autorizado
*Perfumes ( F ) F also e ( O) Original.
4.3 I nstr umentaçã o e sofwar e
4.4 A nálise de compostos inor gâ nicos
4.4.1 A nálise de clor eto (C r omatogr afia de íons)
A s análises de cloreto foram realizadas em cromatógrafo de íons equipado com uma coluna A S 18 (250 mm x 4 milímetros D I), com detector de condutividade e um supressor de ionizaçã o A S R S II (4 mm) . O volume de injeçã o foi de 25 uL e o gradiente de eluiçã o, a uma taxa de 1 mL .min
-1
, foi de K OH 22 mM (7 min) a 40 mM (5 min). A curva analítica foi elaborada usando padrã o externo em concentrações de 0,1; 0,4; 1,2; 10,0 e 20,0 mg L
-1
, com uma equaçã o y = 0,3416 x + 0.0432 e R
2
= 0,9997. A s amostras foram diluídas em uma proporçã o de 1:10 em água milli-Q. Uma análise do branco foi feita antes de cada amostra . T odas as análises foram realizadas duplicata.
4.3.2 A nálises de sódio e potássio
A s análises de cátions sódio e de potássio foram realizadas em cromatógrafo de íons equipado com um coluna C S 12A (250 mm x 2 milímetros .D .I), com detector de condutividade e um supressor de ionizaçã o A S I ( 4 mm). O volume de injecçã o foi de 2,5 mL e o gradiente de eluiçã o com uma taxa de 0,25 mL / min. O gradiente de eluiçã o foi de H2S O4
9 mM (10 min).
A s curvas analíticas foram obtidas usando o método do padrã o externo em concentrações variando de 0,3, 0,4, 0,7, 2,0, 4,0, 7,0 e 20 mg / L (de sódio) e 0,7, 1,0, 1,7, 5,0, 10,0, 17,0 e 50 mg / L (de potássio ). E quaçã o e figuras de mérito obtidos foram por y de sódio = 1.1493x + 0,0386, coeficiente de correlaçã o (R
2
= 0,9994), L D ( 0,003 mg / L ) e L Q (0,03 mg / L ) e de potássio, y = 0.735x - 0,0945. O coeficiente de correlaçã o (R
2
= 0,9998), L D (0,004 mg / L ) e L Q (0,04 mg / L ). A s amostras foram diluídas numa razã o de 1:10 em água ultra-pura, com uma análise em branco anterior.T odas as análises foram realizadas duplicata.
4.5 A nálise de compostos or gâ nicos
45
A s análises das amostras de perfumes foram reali zadas diretamente sem diluiçã o com uma alíquota de 10 mL em um espectrofotômetro A B B B omem, modelo F T L A 2000-102, com janela espectral de 400 a4000 cm
-1
, localizado no laboratório de B ioinorgânica do
D epartamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade F ederal do C eará.
4.5.2 A nálise de UV -V is
A s amostras de perfumes foram diluídas em uma proporçã o de 5 µ L para 10 mL de etanol (1:2000 , v/v). Uma soluçã o (10 mg L
-1
) foi preparada (em etanol) a partir das soluções padrã o de fragrâncias (1000 mg L
- 1
). E tanol grau analítico foi utilizado como branco.
A s análises espectrofotométricas foram realizadas utilizando uma célula óptica de quartzo (1 cm) para uma faixa de varredura de 190-800 nm. T rê s leituras para a mesma amostra foram realizadas e um espectro médio foi obtido. A pós isso, a faixa de 200-380 nm (ultravioleta) foi selecionada para o estudo quimiométrico. Os dados de espectrofotometria (A BS x nm) geraram uma matriz 50x181 que foi processada por análise multivariada.
4.5.3 A nálise do teor de álcool etílico por C G -D I C
A s análises de álcool etílico foram realizadas utilizando um cromatógrafo gasoso
equipado com uma coluna cromatográfica D B -5 ( 30 m x 0,25 mm D .I x filme com espessura
0,25 μm com fase estacionária de 5% fenil e 95% dimetilsiloxano). A programaçã o de
temperatura para o forno foi iniciada de 40 º C por 3 min e elevada em 5º C .min
-1
até 65 º C e
com um aumento de 50 º C .min
-1
até 200 º C . A s temperaturas do injetor e do detector foram de
200º C e 300º C , respectivamente. A injeçã o direta das amostras foi realizada no modo split
com razã o 1:30, injetando-se 1μL de amostra. A pressã o do gás de arraste (hidrogê nio 4.5
F ID , W hite-Martins) na cabeça da coluna foi de 60 kPa. Os fluxos dos gases para alimentaçã o
do detector foram: 30 mL .min
-1
para o hidrogê nio, 300 mL .min
-1
para o ar sintético e 1,0 mL
min
-1
para o gás de arraste. A análise foi baseada no médoto desenvolvido por PE R E IR A et al.
