Maria Cristina Arias
Flávio de Oliveira Francisco Daniela Silvestre
ABSTRACT. The present work briefly reports some of our data concerning the application of different mtDNA analysis in
population and evolutionary studies of stingless bees. The utility of the data obtained from this small genome is illustrated by the characterization of populations of Plebeia remota, by phylogenetic analysis among species belonging to the genera Plebeia, Melipona and Schwarziana, and by the characterization of Melipona bicolor mitochondrial genome showing tRNA genes translocation.
RESUMO. Esse trabalho relata, de maneira sucinta, os resultados obtidos em alguns estudos realizados pelo nosso
grupo de pesquisa. O objetivo é ressaltar a importância do genoma mitocondrial, e as diferentes análises a ele aplicadas, para resolver questões de caráter populacional e evolutivo em abelhas sem ferrão. Os exemplos apresentados abordam a análise populacional de Plebeia remota, análise filogenética entre espécies do gênero Plebeia, Melipona e Schwarziana, e caracterização do genoma mitocondrial de Melipona bicolor por seqüenciamento evidenciando translocações de genes para RNA transportador.
KEYWORDS. mtDNA; stingless bees; molecular markers.
INTRODUÇÃO
Desde as décadas de 70-80, do século passado, a molécula do DNA mitocondrial (mtDNA) passou a fazer parte de muitos, senão da maioria dos estudos envolvendo estrutura populacional, relações filogenéticas e o entendimento de vários aspectos biológicos e evolutivos de uma grande variedade de organismos (WILSON et al.
1985; AVISE et al. 1987; MORITZ et al. 1987; AVISE 1993). O
que atraiu e ainda tem atraído os pesquisadores em utilizar esse genoma em tais estudos, vem de suas caracte-rísticas genéticas e estruturais extremamente peculiares e únicas. Dentre essas características podemos citar: 1. É um genoma pequeno (com aproximadamente 16 kb
nos animais) e circular, com raras exceções.
2. Apresenta herança materna e ausência de recom-binação, embora exceções também sejam descritas. 3. Possui poucos genes, 37 no total (13 genes codificadores de proteínas, 22 para RNA transpor-tadores e 2 para as subunidades ribossômicas). Esse número de genes codifica para apenas 5% dos produtos necessários para o funcionamento da mitocôndria. 4. Possui uma região não codificadora, conhecida como
D-loop (em vertebrados e equinodermas) ou região rica em A+T (invertebrados), que parece exercer o controle da replicação e transcrição do mtDNA.
5. É considerado como um genoma compacto, pois
raramente possui seqüências espaçadoras, seqüências repetitivas, pseudogenes e introns. 6. O conteúdo gênico é bastante conservado, e a ordem
em que esses genes se encontram organizados no genoma costuma ser também conservada.
7. A taxa evolutiva, ou seja, de substituições de base é muito alta, quando comparada a do genoma nuclear. O emprego do mtDNA em estudos populacionais e evolutivos se vale principalmente do fato dele possuir uma alta taxa de substituições de base, apresentar alterações no tamanho total da molécula devido a inserções e deleções, principalmente na região rica em A+T, e mais recentemente, do fato de que translocações de genes codificadores de tRNA parecem ser mais freqüentes do que se imaginava, acarretando assim em alterações na ordem gênica entre organismos filogeneticamente relacionados.
Várias metodologias têm sido aplicadas com o intuito de se caracterizar esse genoma e/ou encontrar variabilidade genética entre populações ou espécies. Dentre os métodos de análise, os principais são: análise com enzimas de restrição (RFLP-“Restriction Fragment Length Polymorphism”); construção de mapa de restrição para todo o genoma; amplificação via PCR seguido de digestão com endonucleases; clonagem; e seqüencia-mento.
Dentre os Hymenoptera, somente o genoma
O DNA mitocondrial em estudos populacionais e
evolutivos de meliponíneos
mitocondrial de Apis mellifera está completamente seqüenciado (CROZIER & CROZIER 1993) e, em termos
moleculares esse genoma é rico em bases adenina e timina, como também observado em outros insetos. Estudos populacionais e evolutivos em abelhas têm utilizado RFLP e seqüenciamento desse genoma, os resultados têm sido muito efetivos na caracterização de populações, subespécies e espécies, no entanto, esses estudos se restringem quase que na totalidade às abelhas do gênero Apis (MORITZ et al. 1986; SMITH 1988; ARIAS et al. 1990; GARNERY et al. 1991; SHEPPARD et al. 1991;
GARNERY et al. 1992; OLDROYD et al. 1992; ARIAS &
SHEPPARD 1996; ARIAS et al. 1996; MEIXNER et al. 2000;
SMITH et al. 2000).
Em meliponíneos os estudos empregando o mtDNA como marcador molecular em estudos populacionais e evolutivos e em estudos de caracterização desse genoma ainda são recentes. Temos trabalhado um pouco nesse sentido, e a seguir descrevemos alguns exemplos de como esse genoma pode acrescentar novas informações e funcionar efetivamente como uma excelente ferramenta no entendimento da biologia e evolução desse grupo de abelhas.
CARACTERIZAÇÃO DE POPULAÇÕES
Freqüentemente, estudos populacionais utilizando o mtDNA como marcador envolvem a caracterização desse genoma por enzimas de restrição. A análise do número de sítios gerados por enzima e a posição relativa destes no mapa de restrição, são os parâmetros utilizados para a determinação do que chamamos de haplótipos mitocondriais. Em meliponíneos, foi realizado um estudo (FRANCISCO 2002) envolvendo quatro populações de Plebeia remota provenientes dos estados de São Paulo (Cunha),
Paraná (Curitiba e Prudentópolis) e Santa Catarina (Blumenau e vizinhança), totalizando 70 ninhos. Para cada um dos ninhos, haplótipos mitocondriais foram determinados utilizando-se 15 enzimas de restrição. A técnica de Southern Blot foi empregada para a detecção dos fragmentos de DNA clivados. Foram encontrados 15 haplótipos diferentes: 4 em São Paulo, 4 em Prudentópolis, 5 em Curitiba e 2 em Santa Catarina, podendo-se considerar esses haplótipos como local-específicos, dada à exclusividade dos mesmos por região. No entanto, dois haplótipos presentes em São Paulo também foram encontrados em Curitiba. Embora a amostragem dessa última localidade (5 ninhos) seja pequena, podemos inferir que esse resultado seja um reflexo de um isolamento recente entre essas duas populações, onde esses dois haplótipos compartilhados fossem os mais freqüentes ou ainda podemos interpretar esse resultado como decorrente da ação humana, através do transporte de ninhos entre essas regiões. Apesar do compartilhamento de dois haplótipos entre São Paulo e Curitiba, as análises estatísticas mostraram que as quatro populações
encontram-se isoladas, ou seja, estruturadas. As análises de distância genética mostraram que a população de Prudentópolis é a que mais se distancia das outras, principalmente da de São Paulo (Fig. 1). Os mesmos resultados, em termos de estruturação populacional e distância genética, também foram obtidos em análises com outro marcador molecular, agora de origem nuclear, os microssatélites. Em geral, as evidências populacionais e evolutivas obtidas nesse estudo vieram corroborar os dados de comportamento e estrutura de ninho, observados por pesquisadores do Laboratório de Abelhas do IB-USP, indicando diferenças marcantes entre ninhos coletados em Cunha e Prudentópolis (Imperatriz-Fonseca, comunicação pessoal). As evidências moleculares e comportamentais, sugerem que as abelhas P. remota provenientes de Prudentópolis e Cunha possam constituir duas unidades evolutivas independentes, e que possivelmente estejam passando por um processo de especiação.
O potencial informativo do RFLP do mtDNA para a verificação de estruturação populacional em abelhas da espécie P. remota abriu-nos a perspectiva de estudar outras espécies de abelhas. Atualmente estão sendo caracterizadas populações de Partamona mulata,
Partamona helleri e Melipona quadrifasciata.
CARACTERIZAÇÃO DE ESPÉCIES E FILOGENIA A construção de mapas de restrição nos fornece uma primeira caracterização do genoma mitocondrial, como por exemplo, o tamanho completo do genoma, número de sítios de restrição por enzima, posição relativa desses sítios, e em comparação com outras espécies, a determinação de regiões mais ou menos conservadas desse genoma. A posição de sítios de restrição nesse mapa serve como um marcador que pode auxiliar na definição de espécies e na determinação das relações filogenéticas entre espécies próximas.
Em meliponíneos temos trabalhado com 13 espécies, sendo 5 do gênero Plebeia, 7 de Melipona e Schwarziana
quadripunctata. Os mapas de restrição para todas essas
espécies foram determinados, utilizando-se 17 enzimas de restrição e a técnica de Southern Blot para a identificação dos fragmentos. Para um melhor posicionamento dos sítios de restrição, utilizamos também a técnica de PCR+RFLP, o que permitiu também localizar os sítios de restrição com relação aos genes presentes no fragmento amplificado. O conhecimento do conteúdo gênico dos fragmentos amplificados é possível, pois sabe-se em Apis mellifera a posição dos primers utilizados nos nossos estudos e, em conseqüência, o conteúdo desses trechos. O tamanho total do genoma mitocondrial dos meliponíneos estudados é de aproximadamente 18.500 pares de bases (pb), cerca de 2000 pb maior que o de
Apis mellifera. Tal diferença de tamanho parece residir na
Os dados obtidos para as 5 espécies de Plebeia (FRANCISCO et al. 2001), mostraram a existência de sítios
de restrição espécie específicos e outros conservados entre essas espécies e também em relação à Apis
mellifera, como o sítio Pst I localizado no gene da
subunidade ribossômica 16S. Foram mapeados no total 28 sítios de restrição, porém o número de sítios por espécie variou de 16 a 23.
O mesmo tipo de estudo foi realizado para as espécies de Melipona (WEINLICH et al. no prelo) e do mesmo modo
foram verificados sítios espécie específicos e outros conservados entre essas espécies e Apis mellifera, como também o sítio Pst I no gene 16S. Foram mapeados no total 27 sítios de restrição, variando de 12 a 19 entre as espécies.
Os dados obtidos de presença ou ausência de sítio de restrição em determinada posição do mapa, nos permitiram construir uma matriz e submetê-la a programas computacionais de análise filogenética. Os dados do mapa de restrição para a espécie Schwarziana quadripunctata foram incluídos, embora o mapa de restrição ainda não esteja publicado. A Fig. 2 contém a árvore obtida com os dados de RFLP do mtDNA para as 13 espécies de meliponíneos.
A resolução das relações filogenética obtida nesse exemplo mostra que subespécies como Melipona
quadrifasciata quadrifasciata e M. q. anthidioides
apresentam distância genética menor do que a observada entre as espécies do gênero, conforme esperado. Tal resultado é um forte indicativo de que a metodologia de análise de sítios de restrição pode fornecer dados consistentes para esses estudos. É interessante notar que a distância genética entre as duas amostras de
Plebeia remota é maior do que a verificada entre todas as
outras 4 espécies desse gênero. Vale ressaltar que P.
remota 1 é originária de São Paulo e P. remota 2 é de
Prudentópolis. Esse resultado corrobora os obtidos nas análises populacionais de P. remota, novamente indicando que as abelhas dessas duas regiões encontram-se isoladas e muito possivelmente passando por um processo de especiação.
EVOLUÇÃO DO GENOMA MITOCONDRIAL Uma das características mais intrigantes do genoma mitocondrial diz respeito à sua origem. Embora ainda controversa, a teoria do endossimbionte tem sido a mais aceita para a explicação da origem da mitocôndria e do seu genoma. Essa teoria baseia-se em que uma célula eucariótica teria fagocitado uma α-protobactéria e esta se diferenciado em mitocôndria; durante esse processo, parte do genoma da α-protobactéria teria sido transferido para o núcleo celular e o inverso também teria ocorrido (GRAY et al. 2001).
A origem da mitocôndria parece ter ocorrido uma única vez na história evolutiva dos organismos; tal evidência é apoiada pelo fato de que o conteúdo gênico mitocondrial é altamente conservado entre os mais diversos organismos. Essa conservação de conteúdo em uma ampla gama de organismos dificilmente seria explicada por convergência evolutiva.
Uma outra característica importante do genoma mitocondrial é a ordem em que os genes estão arranjados nesse genoma. Essa ordem é muito conservada, principalmente em se tratando dos genes codificadores de proteínas e das subunidades ribossômicas. Alterações na ordem desses genes maiores só são verificadas entre organismos filogeneticamente distantes, como por exemplo entre insetos e mamíferos.
O genoma mitocondrial completo de Apis mellifera foi obtido em 1993 (CROZIER & CROZIER 1993) e a ordem dos
principais genes (genes codificadores de proteínas) é extremamente conservada quando comparada com
Drosophila. No entanto, 8 translocações de genes de tRNA
são verificadas. Dentre os genes mitocondriais, sabe-se na literatura que estes últimos são os mais passíveis de sofrerem rearranjos (CUROLE & KOCHER 1999).
A necessidade de conhecermos a seqüência de um genoma mitocondrial de uma abelha nativa brasileira para servir como referência para o desenho de primers, e evidências indiretas de diferenças de tamanho de produtos de PCR em relação ao esperado em Apis mellifera, nos levaram a desenvolver o projeto de seqüenciamento do genoma mitocondrial de Melipona bicolor (SILVESTRE 2002).
O tamanho total desse genoma já havia sido estimado, por RFLP, em 18.500 pb. Desse total, aproximadamente 15.000 pb foram seqüenciados e anotados. Características como propriedades físico-químicas das proteínas codificadas, uso de códons, conteúdo de A+T, tamanho dos genes, estrutura secundária dos tRNAs, regiões intergênicas, e ordem gênica foram analisadas.
Assim como o genoma de Apis mellifera, o de Melipona
Fig. 1. Fenogramas obtidos pelo método de Evolução Mínima
relacionando as quatro populações de P. remota: SP (São Paulo), PRp (Prudentópolis, PR), PRc (Curitiba, PR) e SC (Santa Catarina). A. Fenograma obtido a partir dos valores de δ. B. Fenograma obtido a partir dos valores de FST.
A 0,0005 PRp SC PRc SP B SC PRc PRp SP 0,05
bicolor, apresentou alto conteúdo de bases adenina e
timina (84,3% e 86,6%, respectivamente). A região intergênica presente em Apis mellifera entre os genes COI e COII e que parece desempenhar a função de uma segunda origem de replicação e transcrição desse genoma nessa espécie (CORNUET et al. 1991), está ausente em Melipona bicolor. Evidências indiretas, obtidas por
amplificação in vitro (PCR) dessa região do genoma em outras espécies de meliponíneos (15 espécies, totalizando 5 gêneros), também indicaram a ausência da região intergênica. Se a presença ou ausência dessa região, e seu possível papel funcional, estão relacionados com o comportamento ou outros aspectos da biologia dessas espécies, ainda é motivo de especulação.
A ordem dos genes codificadores de proteínas é idêntica entre essas duas abelhas, no entanto pelo menos nove translocações de genes de tRNA foram verificadas (Fig. 3). Esse número de translocações é maior do que o verificado dentre os insetos da ordem Diptera até o momento seqüenciados.
O fato desses eventos de translocações serem considerados raros entre organismos filogeneticamente próximos faz dessa marca molecular uma forte ferramenta em estudos de caráter evolutivo dentro da família Apidae, pois essas nove translocações foram verificadas entre espécies pertencentes a duas tribos diferentes. Mais interessante ainda é o fato de que essas duas tribos são as únicas nessa família a apresentarem somente espécies com alto nível de eussocialidade. O estudo da ordem dos genes mitocondriais em outras espécies de abelhas, pertencentes a outras tribos, poderá acrescentar novas informações a respeito da origem e evolução do comportamento social nas abelhas corbiculadas.
De um modo geral parece que o genoma mitocondrial dos Hymenoptera apresenta maior plasticidade em termos de acúmulo desse tipo de rearranjo gênico. DOWTON &
AUSTIN (1999) verificaram alterações na ordem de genes
de tRNA entre vespas de uma mesma família, estudando
uma única região do genoma, que parece ser um “ponto quente”, do inglês hot spot, para esse tipo de alteração. Os mecanismos moleculares que poderiam levar a esses rearranjos já foram descritos (CANTATORE et al. 1987;
LEVINSON & GUTMAN 1987; MACEY et al. 1997; DOWTON &
AUSTIN 1999), porém o fato deles ocorrerem com maior
freqüência em abelhas e vespas é ainda um campo aberto para pesquisas.
CONCLUSÃO
Os exemplos descritos acima ilustram o potencial desse pequeno genoma em acrescentar informações relevantes a respeito da biologia e evolução dessas espécies, assim como sobre a própria evolução do genoma mitocondrial em abelhas. Estudos complementares, com a utilização de outros marcadores moleculares, como microssatélites, e comparações multidisciplinares, certamente contribuirão para a construção de um cenário mais significativo a respeito da biologia das nossas abelhas sem ferrão.
Agradecimentos. Dedicamos este trabalho ao Padre Moure por todo o seu incentivo e interesse nos estudos moleculares e pelas ricas discussões sempre repletas de muitas novas idéias.
Gostaríamos de agradecer à Susy Coelho pelo serviço técnico; ao Ricardo Weinlich e à Daniela Rimoldi Cunha pelo desenvolvimento experimental de alguns desses trabalhos; e à Dra Vera Lúcia Imperatriz-Fonseca pelo fornecimento de amostras e pelo grande apoio e incentivo. À FAPESP e CNPq pelos auxílios financeiros.
Fig. 2. Árvore filogenética obtida a partir de matriz gerada pela
presença/ausência de sítios de restrição, usando o método de Neighbor joining (vide texto para detalhes adicionais).
Fig. 3. Representação esquemática da ordem gênica mitocondrial de A. mellifera e M. bicolor. Somente estão representados os genes
para tRNA que apresentaram posições diferentes no genoma das duas espécies. As setas finas indicam as translocações e as setas grossas circulares indicam inversões do sentido de transcrição dos genes. As letras são as abreviações padrão para os aminoácidos transportados por cada um dos tRNA, conforme a legenda: E: ácido glutâmico; S: serina; M: metionina; O: glutamina; A: alanina; I: isoleucina; C: cisteína; Y: tirosina; W: triptofano; K: lisina; T: treonina. Em M.
bicolor, a região assinalada “S, O, C?” não foi seqüenciada, mas
esses genes devem ocupar essa posição, não necessariamente nessa ordem. E SMOA I C Y W K T I A K M WY E T S, O, C? A. mellifera M. bicolor P. droryana P. emerina P. saiqui Plebeia sp. P. remota1 P. remota2 M. bicolor M. compressipes M. quadrifasciata anthidioides M. quadrifasciata quadrifasciata M. subnitida M. melanoventer M. rufiventris Schwarziana quadripunctata Apis mellifera
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