Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento IP&D Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia Mestrado em Bioengenharia

Ovídio César Lavesa Martin

AVALIAÇÃO POR MICROFLUORESCÊNCIA DE RAIOS X, DOS EFEITOS DO CONDICIONAMENTO DA DENTINA PELO LASER DE ER:YAG

São José dos Campos, SP 2011

Ovídio César Lavesa Martin

AVALIAÇÃO POR MICROFLUORESCÊNCIA DE RAIOS X, DOS EFEITOS DO CONDICIONAMENTO DA DENTINA PELO LASER DE ER:YAG

Orientador: Prof. Dr. Luís Eduardo Silva Soares

São José dos Campos, SP 2011

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioengenharia, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica

Autorizo exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta dissertação, por processo fotocopiadores ou transmissão eletronica.

Aluno: Data

Ovídio César Lavesa Martin

AVALIAÇÃO POR MICROFLUORESCÊNCIA DE RAIOS X, DOS EFEITOS DO CONDICIONAMENTO DA DENTINA PELO LASER DE ER:YAG

Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Bioengenharia, do Programa de Pós Graduação em Bioengenharia, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora.

Profª. Drª. Ivone Regina de Oliveira (UNIVAP)

Prof. Dr. Luís Eduardo Silva Soares (UNIVAP)

Profª. Drª. Luciane Dias de Oliveira (UNESP)

Profª. Dra. Sandra Maria Fonseca da Costa. Diretora do IP&D - Univap

DEDICATÓRIA

A minha esposa Kátia que esteve sempre presente nas horas que me ausentei, suprindo as necessidades de nossa família.

A meus filhos Felipe e Letícia, razão da minha vida, e motivação da minha busca para ser uma pessoa melhor em todos os sentidos.

A meus pais Ovídio e Linda, que sempre me orientaram e apoiaram nas decisões importantes da minha vida, orando a Deus para que Ele sempre me iluminasse e me protegesse.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Prof. Dr. Luís Eduardo Silva Soares, minha eterna gratidão, pelo incentivo, pela cobrança nos momentos necessários, pela paciência e compreensão nos momentos difíceis que passei durante a fase de elaboração de minha pesquisa.

Ao Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento – IP&D da UNIVAP, pela disponibilidade dos laboratórios durante a pesquisa.

À FAPESP, pela utilização do equipamento de fluorescência de raios-X, instalado no Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica (LEVB).

A Dra. Lilian Tan Moriyama por ter me auxiliado na disponibilização do aparelho de laser Er:YAG, do IFSC-USP.

AVALIAÇÃO POR MICROFLUORESCÊNCIA DE RAIOS X, DOS EFEITOS DO CONDICIONAMENTO DA DENTINA PELO LASER DE ER:YAG

RESUMO

Atualmente a odontologia vem buscando novas tecnologias, novas técnicas e materiais que aumentem a resistência adesiva resultando em interfaces eficientes e em restaurações mais duradouras. Os lasers de alta intensidade têm sido utilizados como ferramenta na Odontologia para diversos fins. Na Dentística, esses lasers são capazes de modificar e/ou remover esmalte e dentina, buscando a descontaminação ou mesmo o aumento de resistência química desses tecidos à erosão ácida. Outra aplicação dos lasers de alta potência inclui o condicionamento do esmalte e dentina para aplicação de um sistema adesivo e uma restauração de resina composta. A espectrometria de Fluorescência de raios X é uma técnica não destrutiva que permite uma análise tanto qualitativa (identificação dos elementos presentes numa amostra) como quantitativa, permitindo estabelecer a proporção mineral do esmalte dental. Este estudo in vitro tem por objetivo analisar, por meio da técnica de microfluorescência de raios X por energia dispersiva (µ-EDX), os efeitos do condicionamento com ácido fosfórico, comparado com irradiação a laser com diferenças de energia aplicada sobre os componentes da dentina. Vinte terceiros molares humanos foram preparados para expor a dentina. As superfícies das amostras de dentina foram esquematicamente divididas em quatro áreas, cada uma correspondendo a um grupo de tratamento. Os espécimes foram divididos em 4 grupos sendo o grupo controle (GC) foi condicionado com ácido fosfórico a 37%, por 15 s e os demais grupos irradiados com laser de érbio dopado com ítrio-alumínio-granada (Er:YAG): grupos GI - 100 mJ, 10Hz, 3s; GII – 160 mJ, 10Hz, 3 s e GIII - 220 mJ, 10Hz 3s. As amostras foram analisadas por µ-EDX através de mapeamentos em área (80x60 pontos com passos de 20 µm). O condicionamento com laser de Er:YAG produziu padrões irregulares na distribuição dos elementos inorgânicos da dentina. A energia do laser de 220 mJ resultou nas maiores porcentagens em peso de cálcio. Os mapeamentos por µ-EDXRF mostraram que o condicionamento com ácido fosfórico resultou na melhor distribuição dos elementos cálcio e fósforo por toda a dentina. A energia do laser de 220 mJ provavelmente desnaturou o colágeno da dentina alterando assim a proporção estequiométrica da hidroxiapatita como demonstrado pela variação mineral positiva. Segundo os resultados obtidos, recomenda-se para o condicionamento da dentina a aplicação de ácido fosfórico a 37%.

Palavras-chave: Dentina. Condicionamento. Laser de Er:YAG. Microfluorescência de Raios X por Energia Dispersiva.

X-RAY FLUORESCENCE STUDY OF DENTIN ETCHED BY ER:YAG LASER

ABSTRACT

Today, dentistry has been searching for new technologies, new techniques and materials that increase the interface bond strength resulting in efficient and more durable restorations. The high-intensity lasers have been used as a tool in dentistry for various purposes. In dentistry, these lasers are able to modify and / or remove enamel and dentin, seeking clean-up or even increase the chemical resistance of these tissues to acid erosion. Another application of high power lasers includes the conditioning of enamel and dentin for applying an adhesive system and composite resin restoration. X-ray fluorescence spectrometry is a nondestructive technique that allows both qualitative (identification of elements present in a sample) and quantitative analysis of teeth, allowing to establish the proportion of mineral components of enamel and dentin. This in vitro study aims to analyze, by micro energy-dispersive X-ray fluorescence spectrometry (µ-EDXRF), the effects of phosphoric acid etching, compared with irradiation with different laser energy applied to the components of dentin. Twenty human third molars were prepared to expose the dentin. The surfaces of the dentin samples were schematically divided into four areas, each corresponding to a treatment group. The specimens were divided into four groups and the control group (CG) was conditioned with 37% phosphoric acid for 15. The other groups were irradiated with erbium-doped yttrium-aluminum-garnet (Er:YAG) laser: GI - 100 mJ, 10 Hz, 3s, GII - 160mJ, 10Hz, GIII - 220 mJ, 10Hz 3s. The samples were analyzed by using μ-EDX mapping area (80x60 points with steps of 20 µm). Er:YAG laser etching produced irregular patterns of elemental distribution in the dentin. Laser energy of 220 mJ produced the highest calcium values. µ-EDXRF mappings illustrated that phosphoric acid etching produced the best distribution of calcium and phosphorus content throughout dentin surface. Er:YAG laser etching produced irregular patterns of elemental distribution in dentin. The laser energy of 220 mJ probably denatured the collagen of dentin thus changing the stoichiometric proportions of hydroxyapatite as showed by positive mineral variations. According to the results obtained, it is recommended for dentine conditioning the application of phosphoric acid at 37%.

Keywords: Er:YAG laser; dentin etching; dentin mapping; energy-dispersive X-ray fluorescence spectrometry; scanning electron microscopy.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: 43 dentes terceiros molares humanos hígidos obtidos em consultórios odontológicos. ... 23

Figura 2: Máquina de corte de precisão utilizada no preparo dos discos de dentina. ... 23

Figura 6: Ponto de referência (seta) criado na amostra no quadrante do grupo controle. ... 25

Figura 8: Sistema de Microfluorescência de Raios X (ED-XRF) comercial utilizado neste estudo. ... 26

Figura 9: Aparelho de laser de Er:YAG utilizado para irradiar as amostras de dentina. ... 28

Figura 11: Aplicação do laser de Er:YAG nos quadrantes GI ; GII e GIII. ... 29

Figura 14: Imagens gráficas representativas de uma amostra selecionada do tratamento com ácido fosfórico (grupo controle) antes (A: Ca e B: P) e depois (C: Ca e D: P) do tratamento.

Pontos maior concentração mineral (cor vermelha), e de menor concentração mineral (cor

azul). ... 35

Figura 15: Imagens gráficas representativas de uma amostra selecionada do tratamento com laser de Er:YAG 100 mJ (GI) antes (A: Ca e B: P) e depois (C: Ca e D: P) do tratamento.

Observa-se uma distribuição menos uniforme dos componentes Ca e P na superfície da

dentina e alguns pontos de maior (cor vermelha) e menor (cor azul escuro) concentração

mineral quando comparado ao controle... 36

Figura 16: Imagens gráficas representativas de uma amostra selecionada do tratamento com laser de Er:YAG 160 mJ (GII) antes (A: Ca e B: P) e depois (C: Ca e D: P) do tratamento.

Observa-se uma distribuição muito irregular dos componentes Ca e P na superfície da dentina

com alguns pontos de maior concentração mineral (cor vermelha) e de menor concentração

mineral (cor azul escuro) quando comparado ao controle. ... 37

Figura 17: Imagens gráficas representativas de uma amostra selecionada do tratamento com laser de Er:YAG 220 mJ (GIII) antes (A: Ca e B: P) e depois (C: Ca e D: P) do tratamento.

Observa-se uma distribuição muito irregular dos componentes Ca e P na superfície da dentina

com alguns pontos de maior concentração mineral (cor vermelha) e várias áreas de menor

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Descrição dos grupos experimentais e dos parâmetros utilizados... 29

condicionamento (ácido ou laser) de superfície na dentina. As comparações estatísticas entre

os dados normais e tratados foram realizadas pelo teste t não pareado com correção de Welch.

As comparações significantes estão realçadas na cor cinza. ... 32

Tabela 3: Resultados estatísticos obtidos nas comparações considerando os elementos Ca e P (% em peso) e a relação molar Ca/P após os tratamentos. As comparações foram realizadas

(a) entre o grupo controle e os grupos irradiados e (b) entre os grupos irradiados (teste de

múltiplas comparações de Dunn). As comparações significantes estão realçadas na cor cinza.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... 13 

1.1  Características dentais ... 13 

1.2  Condicionamento dentinário ... 13 

1.3   Laser de Er:YAG ... 15 

1.4   Técnica de microfluorescência de raios X ... 19 

2. OBJETIVOS ... 20 

3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 21 

3.1   Preparação das Amostras... 22 

3.2  Seleção das amostras ... 26 

3.3   Irradiação laser e condicionamento ácido ... 27 

3.4   Análise da variação mineral das amostras ... 30 

3.5   Análise estatística ... 30 

4. RESULTADOS ... 32 

5. DISCUSSÃO ... 39 

6. CONCLUSÃO ... 41

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 43

1 INTRODUÇÃO

1.1 Características dentais

A dentina é um tecido conjuntivo avascular, mineralizado, especializado que forma o corpo do dente, suportando e compensando a fragilidade do esmalte. A dentina é recoberta pelo esmalte na sua porção coronária e pelo cemento na porção radicular. Sua superfície interna delimita a cavidade pulpar onde se aloja a polpa dentária. Por ser um tecido vivo, contém prolongamentos de células especializadas e substância intercelular.

A dentina caracteriza-se pela presença de múltiplos túbulos dentinários dispostos muito próximos, que atravessam toda a sua espessura e contêm as extensões citoplasmáticas dos odontoblastos, os quais formaram a dentina e, agora, a mantêm. Os corpos celulares dos odontoblastos alinham-se ao longo da face interna da dentina, formando, também, o limite periférico da polpa dentária. A dentina madura é composta, por volume, aproximadamente, de 50% material inorgânico, 30% material orgânico e 20% de água. Seu componente inorgânico consiste, principalmente, em hidroxiapatita e a fase orgânica em colágeno. A porção orgânica consta de fibras colágenas (17%), dispostas em pequenos feixes ao redor e entre os prolongamentos odontoblásticos. Estas fibras são unidas pela substância amorfa de natureza glicoprotéica (SCHILKE et al., 2000; LIMA, 2009)

1.2 Condicionamento dentinário

O maior problema da Dentística Restauradora era a falta de adesão dos materiais restauradores às estruturas dentárias, a qual permitia uma infiltração marginal, que leva à descoloração marginal, fraturas marginais, reincidência de cárie, sensibilidade pós-operatória e reações pulpares (MANDARINO, 2003).

No entanto, através da introdução da técnica do condicionamento ácido do esmalte por Buonocore em 1955, criou-se uma nova perspectiva nos procedimentos restauradores dando início a Odontologia Adesiva. O condicionamento ácido do esmalte cria uma descalcificação seletiva, formando poros. Esses poros na superfície do esmalte aumentam o embricamento

14

mecânico pela penetração da resina formando o que se chama de tags permitindo a adesão (MANDARINO, 2003).

A adesão ao esmalte é um processo universalmente aceito e de efetividade comprovada, entretanto, nem sempre as margens de uma restauração estão exclusivamente em esmalte (MANDARINO, 2003).

A ciência vem se desenvolvendo, com o passar dos anos, pela introdução de conhecimentos obtidos através de pesquisas e de descobertas. Tudo isso, nas áreas biomédicas, tem trazido inúmeros benefícios, como descoberta de novos medicamentos, técnicas de tratamento de enfermidades e também a utilização de equipamentos dos mais simples aos mais sofisticados.

Atualmente a odontologia vem buscando novas tecnologias, novas técnicas e materiais, que aumentem a resistência adesiva resultando interfaces eficientes e restaurações mais duradouras.

Desde que Buonocore (1955) preconizou o condicionamento ácido do esmalte, o assunto adesão em estrutura dental passou a ser amplamente discutido e pesquisado. A técnica de condicionamento ácido em dentina preconizada por Fusayama et al., (1979), abre os túbulos dentinários aumentando a permeabilidade e conseqüente infiltração bacteriana ou passagem de fluídos e estímulos (ODA, OLIVEIRA; LIBERTI, 2001), desencadeando processos dolorosos no pós-operatório. Sendo a micro-infiltração e a adesividade aspectos importantes no sucesso clínico das restaurações com sistemas de resina, Suzuki et al. (1998), publicaram uma pesquisa interessante na qual correlacionaram testes de tração e a micro-infiltração. Concluíram que existe uma relação inversa entre esses dois valores, ou seja, quanto maior a força de união, menor o nível de micro-infiltração.

Várias pesquisas demonstraram que algumas soluções ácidas, especialmente as fosfórica, promoviam uma limpeza completa da superfície dentinária. O estudo feito por Lee em 1973, onde utilizou o ácido fosfórico e o ácido cítrico ambos a 50%, revelou que estes ácidos utilizados por cinco minutos na área afetada penetravam profundamente e exerciam pouco efeito na superfície dentinária. Por outro lado, Retief em 1974, observou que a aplicação do ácido fosfórico a 50% em dentina de macaco resultou em uma resposta pulpar severa e por essa razão, sugeriu como proteção o emprego de protetores pulpares (MANDARINO 2003).

Em 1979, Fusayama empregou o ácido fosfórico a 37% para condicionar o esmalte e a dentina para posterior aplicação do sistema adesivo. Nakabayashi, Watanabe e Gendusa em 1992 definiram a formação da camada híbrida, resultante da infiltração de monômeros

resinosos entre as fibras colágenas expostas, devido à remoção total da smear layer e da maioria dos smear plugs e da dentina peritubular e intertubular (MANDARINO, 2003).

Em relação ao condicionamento da dentina, no início utilizava o ácido fosfórico a 50%, mas esta concentração foi considerada muito forte, e hoje existe um direcionamento para a utilização de uma concentração menor como 10 ou 37% com o intuito de diminuir a possível agressão ao complexo dentino pulpar (MANDARINO, 2003).

A camada de smear layer (restos de dentina) formada após o preparo cavitário se não removida, diminui a energia de superfície, reduzindo assim a resistência adesiva, tornando os sistemas adesivos mais susceptíveis à micro-infiltração, desnaturando com o tempo e podendo até mesmo apresentar microorganismos em seu interior. Nestas condições, esta camada pode se constituir em fonte constante de irritação pulpar. Portanto a remoção da camada de smear layer proporcionará um substrato fisicamente resistente quimicamente favorável às manobras adesivas (FUSAYAMA et al., 1979; NAKABAYASHI; WATANABE; GENDUSA, 1992; PERDIGÃO et al., 1994).

Foi notado, que atualmente existe uma considerável evolução no desenvolvimento de sistemas adesivos, produtos com fórmulas mais simplificadas, onde os condicionadores ácidos de esmalte e dentina foram substituídos pelos primers acidificados, que solubilizam parcialmente a camada de smear layer, fazendo com que monômeros resinosos entrem no interior da dentina (MANDARINO, 2003).

O uso de aparelhos emissores de raios laser, e outras formas de pré-tratamento dentinário, dentro da Odontologia, vêm melhorando sobremaneira o desempenho dos sistemas adesivos. Assim dependendo dos parâmetros de irradiação utilizados, ocorrem modificações na estrutura física da dentina, havendo projeções fungiformes que poderiam ajudar na união mecânica, remoção de smear layer e abertura dos túbulos dentinários (COOPER et al., 1988; PASHLEY; PASHLEY, 1991; WHITE et al., 1998).

1.3 Laser de Er:YAG

Todos os lasers são definidos por um comprimento de onda próprio que apresenta monocromaticidade, unidirecionalidade e coerência. O raio laser é produzido quando o meio ativo é excitado de modo contínuo ou pulsátil. Os meios mais comumente para a emissão de

16

energia laser podem ser líquidos, gasosos, cristais sólidos ou semicondutores (CERNAWIN et al., 1994)

O Laser de Érbio é um sistema consagrado para uso odontológico, isso se deve ao seu comprimento de onda em 2,94 mm que coincide com o pico máximo de absorção da água, resultando em boa absorção pelos tecidos biológicos, incluindo os tecidos dentais duros. Devido às suas características de absorção, o laser de Er:YAG é visto como um meio alternativo para a ablação de tecidos dentais, sem causar injúrias térmicas aos tecidos duros adjacentes e órgão pulpar.

A maioria dos procedimentos operatórios odontológicos tem como principais tecidos-alvo esmalte, dentina e cemento, sendo preocupação constante a preservação da integridade biológica desses tecidos. Por gerações, os autores preconizavam, para tecidos duros alterados, um tratamento com base na "extensão para prevenção". Com o advento das técnicas adesivas, foi deixado de estender os preparos e passado a praticar a filosofia de selar para prevenir. Com a real possibilidade do uso do feixe laser, está mais próximo o momento de evitar a verdadeira destruição desnecessária de tecido sadio (LIZARELLI et al., 1998), devido a uma característica interessante da interação laser-tecido vivo: a seletividade.

O laser de Érbio:YAG (meio ativo de estado sólido, sendo um cristal de ytrium-alumínio-granada dopado com érbio) trata-se de um dos sistemas mais recomendados para a Dentística Restauradora, tendo surgido em 1988 (HIBST; KELLER; STEINER, 1988) como um novo instrumento para remoção de esmalte e dentina, porém foi aprovado nos Estados Unidos apenas em 1997 pela Food and Drug Administration (FDA), com a finalidade de ablacionar os tecidos duros dentais (COZEAN et al., 1997) realizando preparos cavitários e modificando esses tecidos superficialmente. Seu comprimento de onda de 2940 nm coincide com o pico máximo de absorção da água permitindo que, após a absorção da energia do laser pela água, ocorram vaporização e expansão da mesma com aumento da pressão interna do meio. Este aumento gera micro-explosões resultando em ejeção do substrato em forma de partículas microscópicas, removendo tecido cariado e deixando os canalículos dentinários abertos. Neste processo, conhecido como efeito fotomecânico, a maior parte da energia incidente é consumida, sendo que, apenas uma pequena fração resulta em aquecimento do tecido remanescente, contrastando com o mecanismo fototérmico presente em outros sistemas laser (HIBST; KELLER; STEINER, 1988; MISERENDINO et al., 1995; LIZARELLI et al., 1998).

A máxima absorção do laser de Er:YAG pela água o torna seletivo ao tecido cariado, mais úmido, permitindo uma remoção mais efetiva da dentina infectada durante o processo de

ablação. Esta notável característica permite sua utilização com segurança no tratamento da cárie dental, com precisão e ausência de sintomatologia dolorosa. Além de preparos cavitários conservadores, existem outras aplicações clínicas, como nos casos de osteotomias e apicectomias (pela grande afinidade com a hidroxiapatita), cirurgias em tecido mole (devido absorção pela água), limpeza de fóssulas e fissuras, redução bacteriana nas bolsas periodontais e nos condutos intra-radiculares.

Ishikawa et al. (1996), verificaram in vitro que a remoção de tecido cariado com laser de Er:YAG não provocou carbonização e trincas na superfície irradiada da cavidade. Os autores observaram que, após a irradiação, a superfície dentinária não apresentava smear layer, revelando irregularidades acompanhadas de túbulos dentinários abertos.

Analisando a força de união do esmalte à resina composta utilizando apenas a irradiação com laser de Er:YAG, apenas o condicionamento com ácido fosfórico a 35% e uma associação entre o laser e o ácido, Groth (1997) constatou que os valores de adesão do grupo que foi exclusivamente condicionado com laser foram estatisticamente mais baixos, porém a modificação da superfície do esmalte pela irradiação do laser pode ser entendida como uma técnica alternativa para a adesão de compósitos, já que os melhores resultados foram obtidos quando associou-se o laser com o ácido fosfórico. De acordo com Tanji et al., (1997) o laser de Er:YAG pode condicionar a superfície dentinária em procedimentos de adesão a compósitos provendo um melhor microembricamento mecânico.

Além da ablação do esmalte e dentina o laser de Er:YAG permite a remoção de materiais restauradores como cimento fosfato de zinco, cimento carboxilato, ionômero de vidro, materiais de obturação de canal radicular, resinas compostas. No entanto não é recomendável a remoção de amálgama de prata com o laser devido à alta concentração de mercúrio na pluma durante a ablação; ligas de ouro e cerâmicas também não podem ser removidas (HIBST; KELLER, 1993).

Segundo Cozean et al. (1997), pesquisas in vivo realizadas em animais indicam que a resposta pulpar a cavidades preparadas com laser de Érbio são mínimas, reversíveis e semelhantes àquelas provocadas pelo uso dos instrumentos manuais rotatórios na técnica convencional. De acordo com a autora, temperaturas menores que 5,5ºC não são capazes de causar injúrias irreversíveis à polpa. Tokonabe et al. (1999), ratificam que o laser de Érbio é capaz de remover esmalte e dentina de forma eficiente com mínimos danos ao complexo dentino-pulpar.

Devido suas características de interação com a matéria, os lasers se desenvolveram rapidamente, como uma ferramenta prática para o uso na clínica odontológica. Possivelmente

18

o maior avanço em sua aceitabilidade, como instrumento clínico, foi o desenvolvimento do laser de Er:YAG e similares híbridos de érbio operando na região do infravermelho do espectro eletromagnético (MORIYAMA, 2006).

O laser de Er:YAG constitui-se num laser de estado sólido, cujo meio ativo é um “garnet”, de ítrio e alumínio, dopado com érbio, sendo assim sua principal linha de emissão se dá em 2940 nm. Esta emissão está próxima de um forte pico no espectro de absorção da água ao redor de 3µm que conduz a uma ablação eficiente. O laser de érbio é o único dispositivo capaz de acessar essa região do espectro (MORIYAMA, 2006).

Corona et al. (2003), estudaram a influência do laser de Er:YAG na adesão. As superfícies dentinárias foram tratadas com Er:YAG (80 mJ, 2 Hz, distância focal 17 mm), Er:YAG com condicionador ou primer, e somente condicionador ou primer (controle) e, posteriormente restauradas com dois ionômeros de vidro modificados por resina (Vitremer e ProTec CEM). Os autores concluíram que houve diminuição da adesão quando o laser foi utilizado sem o condicionador ou primer, e que a aplicação do primer ou condicionador após a irradiação com laser promoveu uma melhor adesão entre o dente e o material restaurador.

Lizarelli et al. (2004) estudaram a microinfiltração de cavidades classe V re- hidratadas ou não (com primer), preparadas com brocas ou laser de Er:YAG (300 mJ, 10Hz) em dentes permanentes. As amostras receberam diferentes tratamentos: (I) preparo com broca + ácido fosfórico a 37% + adesivo (Single Bond) + resina composta (Z250), (II) preparo com broca + ácido fosfórico a 37% + Primer (Scothbond Multi-Porpose) + adesivo + resina composta, (III) preparo com laser + adesivo + resina composta, (IV) preparo com laser + ácido fosfórico + adesivo + resina composta e (V) preparo com laser + ácido fosfórico + primer + adesivo + resina composta. Através dos resultados os autores concluíram que a aplicação de laser Er: YAG não substitui o uso de ácido fosfórico e a aplicação de primer logo após o ácido fosfórico reduz significativamente a microinfiltração.

Monghini et al. (2004), pesquisaram a influência da irradiação do Er:YAG (Kavo Key 2) laser na adesão e analisaram as alterações morfológicas dentinárias de dentes deciduos. Sessenta e nove caninos decíduos foram divididos em quatro grupos: 1) controle, condicionamento com ácido fosfórico 37%; 2) laser a 60 mJ, 2 Hz + ácido; 3) laser a 80 mJ, 2 Hz + ácido e 4) laser a 100 mJ, 2 Hz + ácido. A irradiação foi a 17 mm de distância, desfocado, 35 segundos. Os resultados mostraram que a irradiação com laser previamente à aplicação do adesivo influenciou negativamente a adesão, pois forças superiores de adesão foram encontradas no grupo controle (somente ácido fosfórico).

Alguns estudos com os lasers de Er:YAG e Er,Cr:YSGG demonstraram seu potencial preventivo em lesões de cárie através do aumento da resistência ácida do esmalte dental (MORIOKA et al., 1991; FRIED et al., 1996; ARIMOTO et al., 1998; YOUNG et al., 2000). Além disso, o laser de Er:YAG mostrou efetiva redução microbiana na realização de preparos cavitários (BLAY, 2001; SHARON-BULLER et al., 2001).

Apesar do grande número de publicações sobre o laser de Er:YAG em preparos cavitários, microinfiltração e adesão, em dentes permanentes (WRIGHT et al., 1992; PELAGALLI et al, 1997; NIU et al.,1998; PULGA et al. 2002; CHINELATTI et al., 2004), ainda a Odontologia vem buscando novas técnicas, que aumentem a resistência adesiva. Com o presente estudo, foram dadas condições para poder responder alguns questionamentos sobre os efeitos do condicionamento com ácido fosfórico, e o mesmo comparando com a irradiação a laser.

Diferentes técnicas analíticas são empregadas para avaliar alterações na composição ou estrutura dental após irradiação laser, dentre elas podemos destacar a microfluorescência de raios X.

1.4 Técnica de microfluorescência de raios X

A espectrometria de microfluorescência de raios X é uma técnica não destrutiva que permite uma avaliação tanto qualitativa (identificação dos elementos presentes numa amostra) como também quantitativa, permitindo estabelecer a proporção em que cada elemento se encontra presente na estrutura química. Ainda, permite a comparação entre as leituras inicial, denominada controle (antes do tratamento), e final (após o tratamento) para todos os grupos (LIMA, 2009).

Quando uma amostra é irradiada com um feixe de elétrons ou raios X os elétrons dos elementos químicos presentes na mesma passam do estado fundamental para o estado excitado. Os elétrons tendem a mudar de camadas eletrônicas para retornar para o estado fundamental e, dessa forma, desprendem energia sob a forma de raios X. Essa energia emitida é bem definida e, por isso, “exclusiva” para cada elemento, chamada de raios X característicos. Este efeito permite a identificação elemental por meio da avaliação do espectro de dispersão de raios X característico (LIMA, 2009).

20

A intensidade do pico característico emitida pelos componentes da amostra está relacionada com a concentração de cada elemento presente na mesma. Deste modo, uma avaliação quantitativa por comparação pode ser conduzida para determinar a relação dos teores dos elementos cálcio (Ca) e fósforo (P) presentes no composto mineral do esmalte dental (LIMA, 2009). A análise por ED-XRF vem sendo recentemente utilizada para o estudo da irradiação da dentina por laser de Er:YAG (SOARES et al., 2011).

Oliveira et al. (2008), realizaram um estudo utilizando a técnica analítica de microfluorescencia de raios X por energia dispersiva (ED-XRF) e verificaram que, após o tratamento da superfície da dentina com ácido fosfórico, ocorreu uma redução estatisticamente significativa dos componentes cálcio, fósforo e da relação Ca/P, além de apontar maior uniformidade da distribuição química dos componentes inorgânicos desta dentina do que nas áreas irradiadas com laser de Er: YAG (80, 120 e 180 mJ).

Entretanto, informações sobre os efeitos do condicionamento da dentina com ácido fosfórico comparado com laser de Er: YAG se faz necessário, para analisarmos estatisticamente os componentes cálcio e fósforo, antes e após o condicionamento.

2 OBJETIVOS

Este estudo teve como objetivo a avaliação in vitro, por microfluorescência de Raios-X por energia dispersiva (-EDX), os efeitos da irradiação pelo laser de Er:YAG na dentina humana.

Assim, os objetivos específicos deste estudo foram:

1. Analisar, através de mapeamentos em área por -EDX, os efeitos do condicionamento ácido nos componentes inorgânicos da dentina humana.

2. Analisar, através de mapeamentos em área por -EDX, os efeitos da irradiação com laser de Er:YAG com três diferentes parâmetros de energia, nos componentes inorgânicos da dentina humana.

3. Avaliar a variação mineral na dentina humana após o condicionamento ácido e o condicionamento com laser de Er:YAG.

22

3 MATERIAIS E MÉTODOS

As amostras foram preparadas no Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica (LEVB) no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP). As amostras foram analisadas e caracterizadas por microfluorescência de Raios-X no equipamento de µ-EDX-1300 Shimadzu®, Kyoto, Japão) (processo FAPESP nº05/50811-9).

Para a realização deste estudo foram seguidos os princípios éticos das diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisa envolvendo seres humanos, conforme Resolução no 196/96, do Conselho Nacional de Saúde, sendo o projeto aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da Universidade do Vale do Paraíba (H146/CEP/2009, ANEXO A).

3.1 Preparação das Amostras

Para a realização deste trabalho foram utilizados a princípio 43 dentes terceiros molares humanos hígidos obtidos em consultórios odontológicos (Figura 1). Os dentes foram manipulados e limpos no Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica do IP&D sob adequada paramentação (luvas, máscara, gorro, avental e óculos de proteção) conforme as precauções universais e normas de biossegurança do Ministério da Saúde.

A limpeza dos dentes foi realizada com curetas periodontais (7/8 Golgran®), e estes foram polidos com pedra pomes (Asfer) e água, utilizando-se escovas de Robinson (Viking® – KG Sorensen) em baixa rotação montada em um micro-motor (LB100-Beltec®) sendo lavados em seguida com água destilada.

Para o processo de descontaminação, os dentes foram armazenados em solução aquosa contendo Timol a 0,1% em geladeira a uma temperatura de 9° C por uma semana. Após este período, os dentes foram retirados da geladeira e lavados em água corrente por 24 horas para remoção dos traços de Timol.

Figura 1: 43 dentes terceiros molares humanos hígidos obtidos em consultórios odontológicos.

O corte das amostras seguiu o protocolo estabelecido por Soares et al., (2007a). Os dentes foram cortados em uma máquina de corte de precisão (Isomet 1000 – BUEHLER®, Lake Bluff, IL, EUA) (Figura 2) por um disco diamantado de corte sob refrigeração de água com velocidade de 450 rpm e um contrapeso de 100 g, removendo a porção oclusal do dente para expor a dentina (Figuras 3 e 4). Para produzir as amostras de discos de dentina, as raízes foram removidas e o tamanho das amostras foi padronizado quanto à espessura em aproximadamente 4 mm no sentido cérvico-apical. Na seqüência a dentina foi polida em uma politriz refrigerada a água (MetaServ 2000 - BUEHLER®, Lake Bluff, IL, EUA) com lixa d’água granulação n°600 (AROTEC, São Paulo, SP, Brasil) para produzir uma superfície plana e homogênea (Figura 5). Depois das raízes removidas foram descartadas 18 amostras, por não estarem em condições de análise, restando 25 amostras para leitura inicial (figura 7).

24

Porção da coroa clínica do dente  removida

Porção da raiz do dente removida Porção do dente a ser analisada (amostra)

 4mm

Figura 3: Esquema do corte das amostras. Corte da porção de esmalte e da raiz do dente.

Figura 5: Politriz refrigerada a água utilizada para polimento das amostras com lixa d’água granulação n°600.

Um ponto de referência foi criado em cada amostra através da realização de uma cavidade na lateral da amostra com uma ponta diamantada (n° 1016 - KG Sorensen®, Brasil) utilizando-se turbina de alta rotação (KaVo, Brasil) (figura 6) (SOARES et al., 2007a). As amostras foram colocadas em frascos individuais e numeradas de forma aleatória de 1 a 25 (figura 6).

Figura 6: Ponto de referência (seta) criado na amostra no quadrante do grupo controle

26

Figura 7: Frascos individuais onde as amostras foram armazenadas aleatoriamente e numeradas de 1 a 25.

3.2 Seleção das amostras

A superfície da dentina das 25 amostras preparadas antes de qualquer tratamento foi submetida à análise química por microfluorescência de Raios X por energia dispersiva (ED-XRF) realizada em um espectrômetro marca Shimadzu modelo µEDX-1300. A superfície da amostra foi analisada longitudinalmente por dispersão de energia da radiação proveniente de um tubo de Rh, posicionado a 90° e acoplado a um sistema computadorizado. A amostra foi irradiada com feixe de raios-X de raio de 50 µm. A figura 8 mostra o equipamento de ED-XRF utilizado. Esta leitura foi realizada com o objetivo de selecionar as amostras com a distribuição mais homogênea dos componentes inorgânicos.

Para a execução dos mapeamentos, as amostras foram colocadas na câmara do equipamento fixadas sobre uma placa de vidro e a superfície da dentina foi irradiada com raios X. A superfície de cada amostra foi mapeada antes do condicionamento com ácido fosfórico e por laser de Er:YAG, em 4 locais que correspondiam aos 4 tratamentos realizados na seqüência.

O mapeamento de cada uma das 4 áreas de cada amostra foi realizado em uma área de 40 x 30, com passo de 20 µm. O tempo de leitura foi estipulado em 10 s por ponto. A contagem da radiação foi feita por um detector semicondutor de Si (Li) refrigerado por nitrogênio líquido.

Como referência de calibração foi utilizada o reagente de hidroxiapatita estequiométrica sintética, marca Sigma-Aldrich, grau de pureza 99.99% [Ca10(PO4)6(OH)2]. As condições analíticas foram baseadas no método dos parâmetros fundamentais. As variáveis para o cálculo da fórmula química foram estabelecidas para os pesos relativos de cálcio (Ca) e fósforo (P), e o elemento oxigênio (O) foi utilizado como balanço químico. O elemento hidrogênio (H) não foi considerado no balanço total de massa, uma vez que a sua massa é equivalente a 0,1% do peso total da hidroxiapatita (SOARES et al., 2009a).

Após a realização dos mapeamentos das 4 áreas sem tratamento de cada uma das 25 amostras de dentina (n=60), os dados correspondentes a cada amostra foram processados utilizando o software do sistema do EDX (PCMEDX V. 1.04, Shimadzu Corp., Japão) e em seguida os valores da concentração em peso dos componentes cálcio e fósforo (médio) na área foram anotados e tabulados numa planilha no programa Excel. Para a calibração do laser de Er:YAG foram utilizadas e depois descartadas 5 amostras. Das 20 amostras restantes, após a análise por microfluorescência de raios x, foram selecionadas as amostras com uma distribuição mais homogênea dos elementos Ca e P. Utilizou-se o valor do cálcio e fósforo médio nas áreas condicionadas (GC; GI; GII e GIII) e as amostras com os valores fora da média foram excluídas, e foram selecionadas ao final 10 amostras para o estudo.

3.3 Irradiação laser e condicionamento ácido

As amostras foram esquematicamente divididas em quatro áreas (Figura 10) e cada uma das áreas das amostras recebeu um tratamento diferente, gerando quatro grupos descritos

28

na tabela 1. As amostras foram retiradas da solução fisiológica e irradiadas por um laser de Er:YAG (Twin Light, Fontana Medical Lasers, Slovenia) (Figuras 9 e 11) pulsado que opera na região infravermelha do espectro eletromagnético, no modo sem contato, comprimento de onda de 2940 nm, com peça de mão a uma distância focal de 15 mm, com refrigeração por spray ar e ou água 20 ml/min.

A irradiação do quadrante do grupo controle foi evitada, e uma distancia visual foi mantida entre os lados de cada grupo. Após a irradiação foi realizado o condicionamento ácido no quadrante Grupo controle (GC) com ácido fosfórico a 37% (FGM, Brasil), por 15 s. A superfície tratada foi então lavada com um spray ar/água por 15 s (Figura 12). Para evitar que as outras áreas fossem contaminadas com ácido, no momento da lavagem, a amostra foi inclinada no sentido de deslocamento do jato de ar/água.

Figura 9: Aparelho de laser de Er:YAG utilizado para irradiar as amostras de dentina.

Figura 11: Aplicação do laser de Er:YAG nos quadrantes GI ; GII e GIII.

Tabela 1: Descrição dos grupos experimentais e dos parâmetros utilizados.

Grupos Tratamentos de superfície

Grupo Controle (GC) ácido fosfórico a 37 % (15 s) Grupo I (GI) Laser de Er:YAG (100mJ, 10 Hz, 3s) Grupo II (GII) Laser de Er:YAG (160mJ, 10 Hz, 3s) Grupo III (GIII) Laser de Er:YAG (220mJ, 10 Hz, 3s)

30

3.4 Análise da variação mineral das amostras

Após os tratamentos de superfície, mapeamentos em área (n=40) de todas as 10 amostras tratadas foram realizados com os mesmos parâmetros utilizados na seleção das amostras. Os dados dos mapeamentos em área das amostras tratadas foram novamente processados utilizando o software do sistema do EDX e os valores obtidos de cálcio e fósforo foram tabulados em planilha no programa Excel.

A variação dos componentes inorgânicos da dentina foi calculada a partir da diferença entre a porcentagem em peso dos componentes cálcio e fósforo das amostras antes do tratamento (conteúdo mineral inicial – CMI) e depois dos tratamentos (conteúdo mineral final – CMF), sendo que cada grupo apresentou conteúdo inicial diferente. A variação mineral (VM) entre os dados coletados foi calculada da seguinte forma:

VM (%) = [(CMI – CMF)/ CMI]*100

3.5 Análise estatística

Todas as comparações estatísticas foram realizadas no programa Instat® (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). O teste t não pareado com correção de Welch foi utilizado para comparação entre os valores iniciais e finais da porcentagem em peso dos componentes da dentina (cálcio e fósforo). As comparações entre o grupo controle e os grupos irradiados e entre os grupos irradiados foram realizadas pelo teste de comparações múltiplas de Dunn.

3.6 Fluxograma

O procedimento experimental deste estudo é descrito no fluxograma abaixo:

Limpeza dos dentes com curetas periodontais

Seleção de 43 dentes terceiros molares humanos hígidos

Remoção da porção oclusal de esmalte

do dente

Remoção da porção da raiz do dente

18 dentes foram descartados por não se encontrarem em condições adequadas p/ o experimento

Leitura inicial (µ-EDX) do conteúdo mineral (Ca e P) nas 25 amostras nos Grupos GC; GI; GII e GII

5 dentes foram usados para calibração dos parâmetros do Laser

de Er:YAG e ao final descartadas

Irradiação das 20 amostras com Laser de Er:YAG

GII 160 mJ 10Hz–3s

Condicionamento da área do grupo controle (GC) com ácido fosfórico

37% nos mesmos 20 dentes

Lavagem das amostras c/ jato de ar / água para remoção do ácido

Leitura final (µ-EDX) do conteúdo mineral (Ca e P) das 20 amostras

Grupos GC, GI, GII e GIII

10 amostras com valores de Ca e P mais discrepantes

foram descartadas

Análise estatística do conteúdo mineral de Ca e P

das 10 amostras finais

GIII 220 mJ 10Hz–3s GI 100 mJ 10Hz–3s Lavagem dos dentes em água

corrente durante 24 horas

Armazenamento dos dentes em solução de timol 0,1 % em geladeira à 9ºC

32

4. RESULTADOS

As comparações estatísticas dos conteúdos minerais de cálcio (Ca) e fósforo (P) como também a relação Ca/P foram realizadas entre as amostras sem tratamento (normal) e as amostras tratadas considerando todos os grupos experimentais (Tabela 2).

As quantidades de Ca e P (% em peso) diminuíram significativamente nas amostras que foram condicionadas com o ácido fosfórico em gel (p<0,0001 e p=0,0085). A irradiação laser com 220 mJ (GIII) resultou em um aumento na porcentagem em peso de Ca e P após a irradiação (p=0,0153 e p=0,0005). Não foram observadas alterações significativas nos componentes da dentina após as irradiações com 100 mJ (GI) e 160 mJ (GII). Após a irradiação laser, uma redução extremamente significante foi observada na relação Ca/P para as amostras do grupo I (p=0,0001).

Tabela 2: Média e desvio padrão (D.P.) (n = 10) dos elementos Ca e P (% em peso) e da relação Ca/P obtidos por fluorescência de raios-X, antes (Normal-N) e depois (Tratado-T) do condicionamento (ácido ou laser) de superfície na dentina. As comparações estatísticas entre os dados normais e tratados foram realizadas pelo teste t não pareado com correção de Welch. As comparações significantes estão realçadas na cor cinza.

Grupos Ca P Ca/P

Média (D.P.) Valor de p Média (D.P.) Valor de p Média (D.P.) Valor de p GCN 29,36 (1,31) p<0,0001 es 15,91 (0,51) p=0,0085 ms 1,85 (0,03) p=0,9641 ns GCT 23,37 (1,04) 12,99 (2,71) 1,85 (0,27) GIN 30,03 (3,09) p=0,8128 ns 16,23 (1,50) p=0,3054 ns 1,85 (0,03) p=0,0001 es GIT 29,74 (2,34) 16,82 (0,93) 1,77 (0,04) GIIN 30,53 (3,15) p=0,4217 ns 17,66 (4,18) p=0,9754 ns 1,83 (0,06) p=0,1206 ns GIIT 31,59 (2,60) 17,62 (0,98) 1,79 (0,05) GIIIN 28,93 (0,99) p=0,0153 s 15,73 (1,33) p=0,0005 es 1,84 (0,03) p=0,0645 qns GIIIT 32,22 (3,42) 17,90 (1,30) 1,80 (0,06)

Legenda: (ns) não-significante; (qns) quase não significante; (s) significante; (ms) muito significante; (es) extremamente significante.

O tratamento com ácido fosfórico em gel (GC) resultou em valores menores de Ca com diferença estatística quando comparado aos grupos irradiados (Tabela 3 - a) (p<0,05 GI e p<0,001 GII e III). Para o elemento fósforo esta diferença foi observada entre o controle e os

grupos II e III (p>0,01). A relação Ca/P foi estatisticamente menor nos grupos irradiados quando comparado com o controle (p>0,01 GI e p<0,05 GII e III).

Entretanto, não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos irradiados para os elementos Ca e P e para a relação Ca/P (Tabela 3 - b) (p>0,05).

Tabela 3: Resultados estatísticos obtidos nas comparações considerando os elementos Ca e P (% em peso) e a relação molar Ca/P após os tratamentos. As comparações foram realizadas (a) entre o grupo controle e os grupos irradiados e (b) entre os grupos irradiados (teste de múltiplas comparações de Dunn). As comparações significantes estão realçadas na cor cinza.

Comparações Ca P Ca/P (a) GC vs. GI * p<0,05 ns p>0,05 ** p>0,01 GC vs. GII *** p<0,001 ** p>0,01 * p<0,05 GC vs. GIII *** p<0,001 ** p>0,01 * p<0,05 (b) GI vs. GII ns p>0,05 ns p>0,05 ns p>0,05 GI vs. GIII ns p>0,05 ns p>0,05 ns p>0,05 GII vs. GIII ns p>0,05 ns p>0,05 ns p>0,05

A figura 13 mostra os resultados da análise da variação mineral encontrada após os tratamentos. O condicionamento ácido resultou em maior redução mineral (20% de Ca e -18% de P) do que nos grupos irradiados com laser. A irradiação laser com 220 mJ (GIII) resultou em variação mineral positiva após o tratamento (+11% de Ca e +14% de P).

34

Figura 13: Gráfico representativo do cálculo da variação mineral (VM) encontrado após os tratamentos com

ácido fosfórico (GC) e com laser (GI; GII e GIII).

As imagens gráficas produzidas como resultado dos mapeamentos em área (Figuras 14) mostram que o condicionamento com ácido fosfórico em gel produziu um padrão de desmineralização homogêneo para os componentes Ca e P (Figura 14 - C e D) com os elementos distribuídos uniformemente pela dentina.

22.52 38.27 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm CaKa (A) 8.377 24.99 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm P Ka (B) 17.58 31.35 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm CaKa (C) 5.344 19.43 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm P Ka (D)

Figura 14: Imagens gráficas representativas de uma amostra selecionada do tratamento com ácido fosfórico

(grupo controle) antes (A: Ca e B: P) e depois (C: Ca e D: P) do tratamento. Observa-se uma distribuição uniforme dos componentes Ca e P na superfície da dentina. Pontos maior concentração mineral (cor vermelha), e de menor concentração mineral (cor azul).

36

Em contraste, o condicionamento da dentina com o laser de Er:YAG produziu um padrão de desmineralização irregular, com alguns pontos com concentração dos elementos (Figuras 15-17). A irradiação com 100 mJ resultou em pequenas alterações na distribuição dos elementos por toda a superfície da dentina (Figura 15).

20.97 37.50 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm CaKa (A) 5.845 23.64 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm P Ka (B) 19.83 39.66 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm CaKa (C) 7.066 25.15 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm P Ka (D)

Figura 15: Imagens gráficas representativas de uma amostra selecionada do tratamento com laser de Er:YAG

100 mJ (GI) antes (A: Ca e B: P) e depois (C: Ca e D: P) do tratamento. Observa-se uma distribuição menos uniforme dos componentes Ca e P na superfície da dentina e alguns pontos de maior (cor vermelha) e menor (cor azul escuro) concentração mineral quando comparado ao controle.

A irradiação pelo laser de Er:YAG com 160 e 220 mJ de energia (GII e III) produziu padrões similares nas imagens obtidas pelos mapeamentos por EDX. A irradiação com estes parâmetros de energia resultou em uma distribuição mais irregular dos elementos Ca e P na superfície da dentina, com áreas concentradas de desmineralização (cor azul escura e clara) e áreas com significante concentração mineral (cores laranja e vermelho) (Figuras 16 e 17). As imagens também mostram os maiores valores de Ca e P (pontuais) para o grupo III (64,22 % de Ca e 32,52% de P) (Figura 17). As imagens do grupo III mostram o padrão mais irregular de distribuição dos componentes do que nos outros grupos (Figura 17).

20.45 36.26 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm CaKa (A) 8.095 22.77 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm P Ka (B) 18.03 53.80 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm CaKa (C) 10.23 31.68 [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm P Ka (D)

Figura 16: Imagens gráficas representativas de uma amostra selecionada do tratamento com laser de Er:YAG

160 mJ (GII) antes (A: Ca e B: P) e depois (C: Ca e D: P) do tratamento. Observa-se uma distribuição muito irregular dos componentes Ca e P na superfície da dentina com alguns pontos de maior concentração mineral (cor vermelha) e de menor concentração mineral (cor azul escuro) quando comparado ao controle.

38 21. 38. [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm CaKa (A) 7.4 23. [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm P Ka (B) 19. 64. [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm CaKa (C) 9.4 32. [%] 0.80 x 0.60mm 0.16mm P Ka (D)

Figura 17: Imagens gráficas representativas de uma amostra selecionada do tratamento com laser de Er:YAG

220 mJ (GIII) antes (A: Ca e B: P) e depois (C: Ca e D: P) do tratamento. Observa-se uma distribuição muito irregular dos componentes Ca e P na superfície da dentina com alguns pontos de maior concentração mineral (cor vermelha) e várias áreas de menor concentração mineral (cor azul escuro) quando comparado ao controle.

5 DISCUSSÃO

No presente estudo, a análise da dentina utilizando o equipamento de µ-EDX forneceu informações importantes sobre os efeitos da irradiação da dentina com o laser de Er:YAG. A utilização de opções alternativas ao condicionamento ácido da dentina para restaurações estéticas adesivas, como os laseres Er:YAG, vem sendo estudada.

Os benefícios do condicionamento da dentina com laser antes de procedimentos adesivos ainda são controversos e os resultados de diversos estudos são conflitantes (MARTINEZ-INSUA et al., 2000; CEBALLOS et al., 2002; KAMEYAMA et al., 2002; SOUZA et al., 2004; SOARES et al., 2007a). Este fato evidencia uma motivação para a realização de mais estudos para selecionar os parâmetros de irradiação mais adequados para se conseguir uma adequada união adesiva entre dente e restauração.

Esta união adesiva é realizada tradicionalmente utilizando-se o condicionamento ácido da dentina o qual é um passo operatório fundamental no processo de restauração de um dente com resinas compostas. O condicionamento ácido é efetivo na remoção da smear layer e também para ampliar os túbulos dentinários ou descalcificar a superfície da dentina inter-tubular. Com esta técnica consegue-se expor uma superfície livre de detritos e facilitar o contato direto do adesivo com a dentina (CHENG et al., 2005).

Diversos estudos da irradiação da dentina com os lasers de Er:YAG vem sendo realizados por técnicas analíticas como a microscopia eletrônica de varredura (MEV) (MARTINEZ-INSUA et al., 2000; SOUZA et al., 2004; SOARES et al., 2007b; RODRÍGUEZ-VILCHIS et al., 2011), por espectroscopia Raman (SOARES et al., 2007ab; SOARES et al., 2009a), por microscopia de força atômica (RODRÍGUEZ-VILCHIS et al., 2011) e também por microfluorescência de raios X (SOARES et al., 2009b; SOARES et al., 2011) dentre outras técnicas.

Os mapeamentos da dentina por µ-EDXRF realizados no presente estudo permitiram a avaliação do conteúdo mineral da dentina condicionada com ácido ou laser e a porcentagem em peso dos elementos cálcio (Ca) e fósforo (P) apresentaram variações significativas (Tabelas 2 e 3).

Por meio da análise estatística da porcentagem em peso dos elementos Ca e P verificou-se que o tratamento da dentina com ácido fosfórico em gel reduziu significativamente a porcentagem dos elementos inorgânicos quando comparado com a leitura inicial do mesmo grupo sem tratamento (p<0,0001 e p=0,0085) (Tabela 2). Este resultado

40

confirma o mecanismo de ação deste tratamento onde o ácido fosfórico condiciona a dentina, remove preferencialmente a dentina peritubular, e desmineraliza a dentina intertubular adjacente o que resulta em uma matriz de colágeno desmineralizada a qual é susceptível ao colabamento (MARSHALL et al., 1997). Um adequado condicionamento da dentina é necessário para que ocorra sucesso, pois a adesão na dentina é dependente da infiltração dos monômeros da dentina condicionada seguido da polimerização deste material (MIYAZAKI et al., 2003).

A representação gráfica da distribuição de Ca e P na superfície da dentina obtida por EDX (Figura 6) mostra que o condicionamento com ácido fosfórico resulta em redução da concentração mineral com uma distribuição homogênea de Ca e P na área analisada. Este resultado é confirmado por estudos anteriores por microscopia eletrônica de varredura (MEV) (SOARES et al., 2007b) onde as micrografias mostram a abertura dos túbulos dentinários de forma homogênea por toda a superfície analisada e também por mapeamento em área por EDX onde o mesmo padrão foi observado (SOARES et al., 2009b).

A irradiação com laser de Er:YAG não causou alterações significantes na porcentagem em peso de Ca e P nos grupos I e II (GI: p=0,8128 e p=0,3054; GII: p=0,4217 e p=0,9754) (Tabela 2). Somente com a irradiação do laser de Er:YAG com 220 mJ de energia ocorreu significante aumento na porcentagem em peso de Ca (p=0,0153) e P (p=0,0005) (Tabela 2).

A irradiação com laser utilizando 100 mJ de energia mostrou um padrão diferente do produzido pelo ácido fosfórico, com concentração mineral em certas regiões da amostra (Figura 14). Com o aumento da energia do laser o padrão de condicionamento tornou-se mais irregular conforme verificado nas imagens dos mapeamentos dos grupos II (160 mJ, Figura 16) e III (220 mJ, Figura 17). O mapeamento químico da distribuição dos elementos Ca e P após a irradiação com 220 mJ mostra um padrão irregular com vários pontos de reduzida concentração mineral (cor azul) e pontos de maior concentração (cor vermelha) (Figura 17). Este fato se deve ao mecanismo de ação do laser de Er:YAG e sua afinidade com a dentina o qual promove a ablação dos tecidos duros por micro-explosões no interior da estrutura mineral do dente (DUNN; DAVIS; BUSH, 2005).

Estudos prévios também mostraram que a irradiação com laser de Er:YAG na dentina bovina com energias de pulso de 120 e 180 mJ resultaram em maiores valores do cálcio máximo (SOARES et al., 2009b; 2011). O cálculo da variação mineral realizado neste estudo também mostra este fato onde a energia de 220 mJ resultou em incremento de 11 e 14% na porcentagem de Ca e P respectivamente (Figura 5). Este resultado pode ter sido causado pela ablação da dentina e por uma evaporação dos componentes orgânicos devido a um aumento

da temperatura na área irradiada (ROHANIZADEH et al., 1999). Yu et al. (2000) também encontraram um aumento no cálcio da estrutura dental após a irradiação com laser Er,Cr:YSGG no esmalte e dentina relatando que este efeito foi devido a um aumento de temperatura na região.

Soares et al., (2007b) avaliaram por espectroscopia FT-Raman os efeitos da irradiação com o laser Er:YAG nos componentes orgânicos e inorgânicos da dentina. Através da espectroscopia FT-Raman, foi observado que o conteúdo mineral da dentina foi mais alterado pelas maiores energias de pulso (120 e 180mJ, 15,3 e 22,9J/cm2). Este fato foi atribuído ao mecanismo do laser o qual promove a ablação dos tecidos duros por micro-explosões no interior da estrutura mineral do dente (DUNN, DAVIS; BUSH, 2005). O conteúdo orgânico da dentina também sofreu maiores alterações no grupo irradiado pelo laser de Er:YAG com 180mJ (22,9J/cm2) de energia de pulso, evidenciando uma possível desnaturação das proteínas por efeito térmico. Bachmann. Gomes e Zezell (2005), estudaram por espectroscopia no infra-vermelho com transformada de Fourier (FTIR) os efeitos da irradiação do laser de Er:YAG com fluências subablativas e em parte ablativas na composição química e estrutura do colágeno da dentina onde observaram uma diminuição na intensidade das bandas da água e da matriz orgânica evidenciando perda de água e degradação parcial do colágeno.

De acordo com Çelik et al., (2008), estas alterações significantes na relação Ca/P após tratamento com laser ocorrem devido a uma alteração nos componentes orgânicos e inorgânicos da dentina e isto pode alterar a permeabilidade, solubilidade e as características adesivas da área irradiada. Os resultados obtidos neste estudo mostram que a escolha de um parâmetro de irradiação adequado para o laser de Er:YAG é muito importante. Energias de pulso altas podem prejudicar a adesão dos materiais restauradores à dentina irradiada com laser de Er:YAG, pois os sistemas adesivos interagem com a hidroxiapatita da dentina por ligações fosfato-cálcio. Então, variações na quantidade de íons Ca ou na relação Ca/P, podem afetar negativamente o padrão de adesão dos materiais restauradores (ÇELIK et al., 2008).

42

6 CONCLUSÃO

Considerando a metodologia empregada e os resultados obtidos neste estudo, concluímos que:

1. O condicionamento com ácido fosfórico da dentina produziu uma distribuição homogênea de cálcio e fósforo por toda a superfície da dentina reduzindo a concentração mineral tornando-se uma superfície favorável para a adesão.

2. O condicionamento da dentina com laser de Er:YAG produziu uma distribuição irregular de cálcio e fósforo na superfície da dentina sendo que a energia de 220 mJ resultou em significativo aumento da concentração mineral o que produz uma superfície desfavorável para a adesão.

3. A técnica de microfluorescência de raios-X permitiu um adequado estudo da variação mineral na superfície da dentina após o condicionamento com ácido ou laser de Er:YAG.

4. Segundo os resultados obtidos, recomenda-se para o condicionamento da dentina a aplicação de ácido fosfórico.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARIMOTO, N. et al., Acid resistance in lased dentin. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON LASERS IN DENTISTRY, 6., 1998, Maui. Proceedings... Maui: ISLD, 1998. p. 61 – 62, 1998.

BACHMANN, L.; GOMES, A. S. L.; ZEZELL, D. M. Collagen absorption bands in heated and rehydrated dentine. Spectrochim. Acta, PartA, v. 62, p. 1045–1049, 2005.

BLAY, C. A. Análise comparativa da redução bacteriana com irradiação do laser de Er:YAG ou ponta montada em alta rotação convencional após remoção de tecido cariado em dentina: estudo em anima mobile. 2001. Dissertação (Mestrado

profissionalizante - Lasers em Odontologia) - IPEN – Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo, São Paulo 2001.

BUONOCORE, M. G. A simple method of increasing the adhesion of acrylic filing materials to enamel surfaces. J. Dent Res., v.34, p.849-853, 1955.

CEBALLOS, L. et al. Bonding to Er-YAG-laser-treated dentin. J. Dent. Res., v.81, n.2, p.119-122, 2002.

ÇELIK, E. U. et al.Effect of Different Laser Devices on the Composition and Microhardness of Dentin. Operat. Dent., v. 33, p. 496-501, 2008.

CERNAWIN, A. P. et al. Laser applications in dentistry: a review of the literature. Australian Dental Journal, v.39, n. 01, 0. 28-32, 1994.

CHENG J.-T., et al. Effect of dentine conditioners on the bonding efficacy of one-bottle adhesives. J. Oral Rehab., v. 32, p. 28–33, 2005.

CHINELATTI, M. A. et al., Influence of the use of Er:YAG laser for cavity preparation and surface treatment in microleakage of resin-modified glass ionomer restorations. Oper Dent., v. 29, n.4, p. 430-436, Jul-Aug. 2004.

COOPER, L. et al. Shear strength of composite bonded to laser-pretreated dentin J. Prosthet. Dent., v 60, n.01, p. 40-49, 1988.

CORONA, S. A. M. et al. Assessing microleakage of different class V restorations after Er:YAG laser and bur preparation. J. Oral Rehab., v.30, p.1008-1014, 2003.

COZEAN, C. et al. Dentistry for the 21st Century ? Erbium:YAG laser for teeth. J. Am Dent Assoc., v. 128, n. 8, p. 1080-1087, aug.1997.

44

DUNN, W. J.; DAVIS, J. T.; BUSH, A. C. Shear bond strength and SEM evaluation of composite bonded to Er:YAG laser-prepared dentin and enamel. Dent Mater., v. 21, p.616– 624, 2005.

FRIED, D. et al. Infrared Radiometry of Dental Enamel During Er: YAG e Er: YSGG laser Irradiation. J . Biomed. Optics, v. 1, n. 4, p. 455-465, 1996.

FUSAYAMA, T. et. al. Non-pressure adhesion of a new adhesive restorative resin J. Dent. Res., v.58, p. 1364-1370, 1979.

GROTH, E.B. Estudo comparative do condicionamento do esmalte dental com Er:YAG laser e ácido fosfórico: analise morfológica e resistência à tração. São Paulo, 1997, 98p. Tese (Doutorado em Dentística) – Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo.

HIBST, R.; KELLER, U.; STEINER, R. Die wirkung gepulster Er:YAG: Laserstrahlung aufzahngewebe. Laser in Medicine and Sugery, v. 4, p. 163-165, 1988.

HIBST, R.; KELLER, U.; The mechanism of Er:YAG laser induced ablation of dental hard substances. Proc. SPIE, v. 1880, p. 156-162, 1993.

ISHIKAWA, I. et al. Er:YAG laser: The promising procedure for root caries treatment. Laser in Dentistry II. Proc. SPIE, v 2672, p. 131-134, 1996.

KAMEYAMA, A., et al. Influence of different acid conditioner on tensile bond strength of 4-META/MMA-TBB resin to Er :YAG laser-irradiated bovine dentin. J Adhes Dent.; v.2, p. 297-304, 2002.

LEE, J. et al., Effects of acid etchants on dentin. J. Dent. Res., v.52, n. 6, p. 1228-1233, 1973.

LIMA, Luciana Reinaldo. Estudo do efeito da erosão ácida nas restaurações radiculares por fluorescência de raios-X. 2009. 62 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) – Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, 2009.

LIZARELLI, R.F. et al., A Tratamento de cárie inicial com laser de alta densidade de energia de Er:YAG. J Bras Odontopediatr Odontol Bebe, Curitiba, v.1, n.4, p.73-76, out./dez. 1998.

LIZARELLI, R. F. et al. Study of microleakage at class V cavities prepared by Er: YAG laser using rewetting surface treatment. J. Clin. Laser Med. Surg., v. 22, n. 1, p. 52- 55, 2004.

MANDARINO, F. Adesivos odontológicos, 2003. Disponível em:

http://www.forp.usp.br/restauradora/dentistica/temas/adesivos/adesivos.htm. Acesso em 05 Out. 2011.

MARSHALL, G. W. JR. et al. The dentin substrate: structure and properties related to bonding. J. Dent., v.25, n. 6, p.441-458, 1997.

MARTINEZ-INSUA, A. et al. Differences in bonding to acid-etched or Er:YAG-laser-treated enamel and dentin surfaces. J. Prosthet. Dent., v84, p.280–288, 2000.

MISERENDINO, L.J. et al., Laser in dentistry. Quintessence, Chicago, p.17-25, 161-172, 1995.

MIYAZAKI, M. et al. Analysis of the enamel/adhesive resin interface with laser Raman microscopy. Oper Dent., v. 28, p. 136-142, 2003.

MONGHINI, E. M. et al. Bond strength to dentin of primary teeth irradiated with varying Er: YAG laser energies and SEM examination of the surface morphology. Lasers Surg. Med., v. 34, n. 3, p. 254-259, 2004.

MORIOKA, T. et al. Acid resistence of lased human enamel with Erbium:YAG laser. J. Clin Laser Med Surg., v. 9, n.3, p.215-217, 1991.

MORIYAMA, L. T. Ablação de resinas compostas com laser de Er:YAG sob diferentes fluxos de água. 2006. 85p. Dissertação (Mestrado em Ciências: Física aplicada) – Instituto de Física de São Carlos, 2006.

NAKABAYASHI, N.; WATANABE, A.; GENDUSA, N. J. Dentin adhesion of “modified” 4- META MMA-TBB resin: function of HEMA. Dent. Mater., v.8, n.4, p. 259-264, 1992.

NIU, W. et al., A study on microleakage after resin fi lling of class V cavities prepared by Er:YAG laser, J Clin Laser Med Surg., v.16, p.227-231, 1998.

ODA, M.; OLIVEIRA, D.C.; LIBERTI, E. A. Avaliação morfológica da união entre adesivo resina composta e dentina irradiada com laser de Er:YAG e laser Nd:YAG: estudo

comparativo por microscopia de varredura. Pesqui. Odontol. Bras., v. 15, n. 4, p. 283-289, 2001.

OLIVEIRA, R. et al. Avaliação dos componentes inorgânicos da dentina após

condicionamento para procedimentos adesivos por fluorescência de raios-X. Exacta, São Paulo, v.6, n.1, p. 139-146, jan./jun. 2008.

PASHLEY, D. H.; PASHLEY, E. L. Dentin permeability and restorative dentistry: a status report for the American journal of dentistry. Am. J. Dent., v.4, n. 01, p. 4-9, Feb. 1991.

46

PELAGALLI, J. et al. Investigational study of the use of Er:YAG laser versus dental drill for caries removal and cavity preparation: phase I. J. Clin. Laser Med. Surg., v.15, n.3, p. 109-115, 1997.

PERDIGÃO, J. et al. In vitro bond strengths an SEM evaluation of dentin bonding systems to different dentin substrates. J. Dent. Res., v. 73, p. 44-45, 1994.

PULGA, N. V. G. et al. Marginal microleakage evaluation in Class V composite restorations of deciduous teeth prepared conventionally and using Er.YAG laser. Lasers Surg. Med., v. 14, Suppl. p. 81, 2002.

RETIEF, D.H. et al., Pulpal response to phosphoric acid. J. Oral Pathol., v. 3, p. 114-22, 1974.

RODRÍGUEZ-VILCHIS, L. E., et al. Morphological and Structural Changes on Human Dental Enamel After Er:YAG Laser Irradiation: AFM, SEM, and EDS Evaluation. Photomed Laser Surg., v29, p.493-500, 2011.

ROHANIZADEH, R. et al. Ultrastructural Properties of Laser-irradiated and Heat-treated Dentin. J. Dent. Res., v. 78, p. 1829-1835, 1999.

SCHILKE, R. et al., Comparison of the number and diameter of dentinal tubules in human and bovine dentine by scanning electron microscopic investigation, Arch. Oral Biol., v. 45, p. 355-361, 2000.

SHARON-BULLER, A. et al. Elimination of bacteria with Er:YAG laser in cavity

preparation. Inc: 1o. CONGRESS OF THE EUROPEAN SOCIETY FOR ORAL LASER APPLICATIONS ESOLA. Austria, Abstracts… Esola, May. 2001. p.10,

SOARES, L. E. S., et al. Effects of heating by steam autoclaving and Er:YAG laser etching on dentin components. Lasers Med Sci., v. 26, p.605–613, 2011.

SOARES, L. E. S., et al. Effects of treatment for manipulation of teeth and Er:YAG laser irradiation on dentin: A Raman spectroscopy analysis. Photomed Laser Surg., v.25, p.50-57, 2007a.

SOARES, L. E. S., et al. Combined FT-Raman and SEM studies of the effects of Er:YAG laser irradiation on dentin. Photomed Laser Surg., v.25, p.239-244, 2007b.

SOARES, L. E. S., et al. Effects of Er:YAG laser irradiation and manipulation treatments on dentin components, part 1: Fourier transform-Raman study. J Biomed Optics, v.14,