UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO UNIVERSITÁRIO NORTE DO ESPÍRITO SANTO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE
TROPICAL
DIVERSIDADE GENÉTICA DE Tapirus terrestris
(LINNAEUS 1758) EM REMANESCENTES
FLORESTAIS NA MATA ATLÂNTICA NO
ESTADO DO ESPÍRITO SANTO, BRASIL
DAHIANI NUNES BOSSI
São Mateus Junho de 2018
DIVERSIDADE GENÉTICA DE Tapirus terrestris
(LINNAEUS 1758) EM REMANESCENTES
FLORESTAIS NA MATA ATLÂNTICA NO ESTADO
DO ESPÍRITO SANTO, BRASIL
Dahiani Nunes Bossi
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Biodiversidade Tropical da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção de título de Mestre em Biodiversidade Tropical.
Orientadora: Dr
a. Ana Paula Cazerta Farro
São Mateus
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ser meu porto seguro e meu amparo em todos os momentos.
Aos meus pais Reinilde Francisca Nunes Bossi e José Carlos Bossi Ribeiro, meu irmão, Carlos Alberto Nunes Bossi e, meu esposo, Ailton Valandro pela compreensão nos meus momentos sentimentalistas, por sempre terem acreditado em mim e por todo apoio que me deram durante o mestrado.
Ao Centro Universitário Norte do Espírito Santo (CEUNES-UFES), ao Programa de Pós Graduação em Biodiversidade Tropical (PPGBT) e ao Laboratório de Genética e Conservação Animal do CEUNES por proporcionarem toda a estrutura necessária para a realização deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de estudo concedida, e à Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Espírito Santo (FAPES), pelo financiamento do projeto.
Há alguém muito especial, que me deu a oportunidade de continuar crescendo academicamente e que confiou em mim a realização do projeto. Minha orientadora Dra Ana Paula Cazerta Farro, que com sua amizade, experiência e dedicação, me auxiliou a todo o momento na realização desta pesquisa. Muito Obrigada!
Aos integrantes (Fernanda, Vanessa, Nálita, Fabio, Drienne, Naymara e Cecília) do Grupo de Estudos para a Conservação de Mamíferos (GECOM) pelo apoio e pelas dicas nas pré-apresentações deste trabalho. À Msc. Drienne Messa Faria pelo auxílio e dicas com os programas genéticos. À Nálita Scamparle pelo convívio laboratorial e por ser uma ótima conselheira.
À Equipe do Programa de Monitoramento e Conservação das antas na Mata Atlântica Capixaba (Pró-Tapir), pela amizade e por todo apoio e esforço em campo para as coletas das amostras fecais. Aos mateiros Rony e Moisés, por toda a dedicação e atenção que tiveram para nos instruir na mata. Sem vocês com certeza seria muito difícil encontra as amostras.
À Dra Andressa Gatti, coordenadora do Pró-Tapir, pela amizade e seriedade com que realiza seu trabalho, e por ter me auxiliado no desenvolvimento desta dissertação.
À Danielle Moreira, pela confecção dos mapas utilizados nesta dissertação e pelo apoio em campo.
Agradeço a todos os professores do PPGBT por todo empenho e dedicação no momento de lecionar as disciplinas.
À Dra Ana Carolina Srbek de Araújo e Dr Vander Calmon Tosta por aceitarem o convite para fazer parte da banca examinadora e com suas sugestões contribuir para o enriquecimento deste trabalho.
SUMÁRIO LISTA DE TABELAS...VII LISTA DE FIGURAS...VIII LISTA DE ANEXOS...X RESUMO...XI ABSTRACT...XII 1. INTRODUÇÃO... ...13 2. OBJETIVOS...17 3. MATERIAL E MÉTODOS...17 3.1 Área de Estudo...17 3.2 Coleta de Dados...18
3.3 Extração e Quantificação do DNA...21
3.4 Amplificação por PCR...22
3.5 Identificação Individual e Diversidade Genética...24
4. RESULTADOS...25
4.1 Amostras...25
4.2 Sucesso de Amplificação dos Locos Microssatélites e Genotipagem...26
4.3 Número de Indivíduos Identificados...26
4.4 Análise da Diversidade Genética Total...27
4.5 Análise da Diversidade Genética Por Área...28
4.6 Estrutura Populacional...29
4.7 Estrutura populacional no Structure...29
4.8 Parentesco...30
6. CONCLUSÕES...36 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...37
VII LISTA DE TABELAS
TABELAS PÁGINAS Tabela 1: Loci de microssatélite, sequências dos primers, tipo de marcação fluorescente (Marc: NED ou FAM), temperatura de anelamento (T), faixa de tamanho (pb) dos fragmentos amplificados e Duplex utilizados para avaliar as amostras fecais de T. terrestris coletadas no Complexo Florestal Linhares-Sooretama do Espírito Santo...23 Tabela 2. Análise de diversidade genética por locus microssatélite da antas identificadas. Número de alelos por locus (K), Número de amostras (N), Heterozigosidades observada (Ho) e esperada (He), Conteúdo de informação polimórfica (PIC), Índice de endogamia (Fis), Riqueza alélica (Ra), Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e Frequência de alelo nulo (F Null)...28 Tabela 3: Análise de diversidade genética por locus microssatélite das antas identificadas no Complexo Florestal Linhares-Soortetama. Número de alelos por locos (K), heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) na área oeste da BR-101 (Reserva Biológica de Sooretama) e na área leste (RPPN recanto das Antas, fazenda Cúpido e Refúgio e Reserva Natural Vale)...28 Tabela 4. Categorias de relacionamentos identificadas para as antas no Complexo Florestal Linhares-Sooretama com base em quatro possíveis parentescos, sendo a primeira coluna os indivíduos relacionados e a segunda coluna o possível parentesco..31 Tabela 5: Diversidade alélica (K), heterozigosidade média observada (Ho), média do número de locos (Locos), número de indivíduos estimados (Indivíduos), material coletado, área de estudo de trabalhos que acessaram a variabilidade genética de antas a partir de dados originados de marcadores microssatélites e área em hectares do estudo...33
VIII LISTA DE FIGURAS
FIGURAS PÁGINAS Figura 1: Anta (Tapirus terrestris) registrada no Complexo Florestal Sooretama-Linhares, ES, Brasil. Foto: (armadilha fotográfica) (Pró-Tapir)...14 Figura 2: Desenvolvimento de plântulas em latrina de fezes de Tapirus terrestris na Reserva Biológica de Sooretama, Linhares, ES. Foto: Dahiani N. Bossi...15 Figura 3: Localização dos cinco remanescentes florestais do norte do Espírito Santo, onde foram coletadas as amostras fecais de Tapirus terrestris e da RPPN Mutum Preto que não foi utilizada neste estudo. Cada área está representada por uma tonalidade de verde. Fonte: Pró-Tapir...18 Figura 4: Coleta de amostras fecais em uma latrina visitada por antas na Reserva Biológica de Sooretama, ES. Foto: Pró-Tapir...20 Figura 5: Anta anestesiada para coleta de tecido em Complexo Florestal Linhares-Sooretama, ES. Foto: Pró-Tapir...21 Figura 6: Pontos de coleta das 66 amostras fecais de antas no Complexo Florestal Linhares-Soortema, sendo as na cor azul utilizadas e na cor preta descartadas das análises (6A). Os círculos em laranja são as localidades onde foram coletadas as amostras dos 40 indivíduos diferentes identificados a partir do programa Mstools (6B). Pontos de deslocamento dos indivíduos, a mesma cor vista mais de uma vez no mapa são os indivíduos reamostrados em pontos diferentes (6C). Círculos na cor laranja são pontos onde foram encontradas as latrinas (6D)...27 Figura 7: Número de populações de anta baseado em um logaritmo da probabilidade posterior dos dados [L(D|K)] em função do K médio em 10 corridas independentes feitas no programa Structure e observadas no Structure Havester, e os seus respectivos desvios padrões...29 Figura 8: Análise Bayesiana das amostras fecais das antas no complexo Linhares-Sooretama. A figura mostra a probabilidade de atribuição de cada indivíduo (linhas
IX verticais) em cada um dos dois grupos (K = 1, vermelho e Verde) para as 40 antas amostradas...30 Figura 9: Número de populações de antas baseado em valores de Delta (K), segundo correção de Evanno et al., (2005), mostrando o maior valor de delta (K) para K=2. No eixo y estão os valores de delta (K) e eixo x, os diferentes K testados. O desvio padrão para cada K testado está representado na forma de uma barra vertical...30
X LISTA DE ANEXOS
ANEXOS PÁGINAS Anexo 1: Amostras genéticas coletadas nos quatro remanescentes florestais de Mata
Atlântica do estudo. Nome das amostras, latitude, longitude, localidade, data de coleta, se é pilha isolada ou latrina e conservação em álcool da amostra...42 Anexo 2. Protocolo de Extração de fezes (kit de extração QIAmp® DNA Stool Mini Kit)...44
XI Resumo
A anta (Tapirus terrestris) é o maior mamífero terrestre brasileiro. É um importante dispersor de sementes a longas distâncias, mas que vem sofrendo com a forte fragmentação de seu habitat, principalmente no Bioma Mata Atlântica. Este trabalho, por meio principalmente de metodologia não invasiva (amostras fecais), buscou acessar a diversidade genética das antas no Complexo Florestal Linhares-Sooretama, ES, bem como, sugerir um número mínimo de indivíduos presentes na área, a partir da identificação individual dos animais. Foram coletadas 66 amostras, sendo 61 fezes e cinco tecidos provindos de campanhas de captura ou atropelamentos na BR-101. A partir de sete marcadores microssatélites, foram identificados 40 indivíduos. Um total de 67 alelos foram detectados, variando de oito (Tter 5) a doze (Tter 3) alelos por locus, e diversidade alélica média de 9,51 alelos/locus. A heterozigosidade observada média (ho) para os sete locus polimórficos analisados foi de 0,538, sendo que Tter 3 apresentou maior ho, 0,867; enquanto o marcador Tter 4 apresentou a menor ho, 0,325; indicando, uma diversidade genética moderada. A média do valor de FIS indica endocruzamento na população de estudo, visto que o valor se apresentou positivo (FIS = 0,324). Quando se avaliou a funcionalidade da BR-101 como barreira (estruturação entre as porções leste e oeste do Complexo Linhares-Sooretama) observou-se um FST de 0,018 (p<0,05), o que evidencia uma baixa estruturação genética entre as duas localidades estudadas. Como a estruturação indicada foi muito baixa e não evidenciada em todos os parâmetros avaliados no programa Structure, considerou-se que existe uma população de antas na região. O fluxo gênico entre essas áreas ainda ocorre, independente da grande mortalidade por atropelamentos na BR.
XII ABSTRACT
The tapir (Tapirus terrestris) is the largest terrestrial mammal in Brazil. It is an important seed disperser at long distances, but it has been suffering from the strong fragmentation of its habitat, mainly in the Atlantic Forest Biome. This work, through mainly non-invasive methodology (fecal samples), sought to access the genetic diversity of tapirs in the Linhares-Sooretama Forest Complex, ES, as well as to suggest a minimum number of individuals present in the area, based on the individual identification of animals. A total of 66 samples were collected, 61 faeces and five tissues from capture campaigns or trampling on BR-101. From seven microsatellite markers, 40 individuals were identified. A total of 67 alleles were detected, ranging from eight (Tter 5) to twelve (Tter 3) alleles per locus, and medium allelic diversity of 9.51 alleles / locus. The observed mean heterozygosity (ho) for the seven polymorphic locus analyzed was 0.538, with Tter 3 showing higher ho, 0.867; while the Tter 4 marker had the lowest ho, 0.325; indicating, a moderate genetic diversity. The mean FIS value indicates inbreeding in the study population, since the value was positive (FIS = 0.324). When the BR-101 functionality was evaluated as a barrier (structuring between the east and west portions of the Linhares-Sooretama Complex), a FST of 0.018 (p <0.05) was observed, which shows a low genetic structuring between the two studied. As the structuring indicated was very low and not evidenced in all the parameters evaluated in the Structure program, it was considered that there is a population of tapirs in the region. Gene flow between these areas still occurs, regardless of the large mortality from road deaths in BR.
13 1. INTRODUÇÃO
A perda e a fragmentação de habitats representam a mais séria ameaça à diversidade biológica das biotas terrestres e as principais causas da atual crise de extinção de espécies (Gascon et al., 2001; Hanski et al., 2013). A fragmentação é um processo com o qual habitats contínuos são subdivididos em “pedaços” pequenos e isolados uns dos outros (Fahrig, 2003), os quais reduzem ainda mais o habitat disponível para as espécies da biota (Scariot, 1999). Na Mata Atlântica, a ação antrópica combinada com a fragmentação tem grande impacto sobre a biodiversidade. Como consequência, populações isoladas e/ou reduzidas, impedimento do fluxo gênico (Frankham et al., 2008) .
Pequenas populações são mais propensas a experimentar deriva genética causada por isolamento populacional e fluxo de genes reduzido, levando a uma diminuição da diversidade genética e um aumento na estrutura genética (isto é, diferenciação genética e distribuição espacial da diversidade genética), o que tem um impacto negativo na de populações silvestres (Allendorf et al., 2005). Os baixos níveis de diversidade genética diminuem a aptidão reprodutiva e a resistência às doenças e aumenta os níveis de endogamia, o que pode diminuir ainda mais a variabilidade individual dentro das populações e, em geral, ocasiona um menor potencial adaptativo (Lacy, 1997; Frankham, 2005).
Esse cenário é bastante preocupante para grandes vertebrados ameaçados de extinção, uma vez que eles precisam de grandes áreas de vida para sobreviver e possuem características intrínsecas que aumentam sua vulnerabilidade à extinção (Medici et al., 2012). Muitas populações de grandes mamíferos sobrevivem apenas em áreas protegidas, especialmente na Mata Atlântica, como a anta (Tapirus terrestris) (Perissodactyla, Tapiridae) (Medici et al., 2012). No entanto, somente uma pequena parcela dessas áreas é grande o suficiente para manter populações viáveis de antas em longo prazo (Flesher, 1999; Gatti et al., 2011).
Tapirus terrestris é o maior mamífero terrestre brasileiro (Medici et al., 2012) e está ameaçado de extinção em nível global pela lista da IUCN (União Internacional para Conservação da Natureza) 2016 como vulnerável, nacional pelo MMA (Ministério do
14 Meio Ambiente) 2014 como vulnerável e estadual em perigo IPEMA (Instituto de Pesquisas da Mata Atlântica) 2007 (Fig 1). Por exibir hábito solitário, noturno e não ter marcas distinguíveis que facilitariam a identificação dos indivíduos a partir de armadilhas fotográficas, os estudos populacionais de antas ficam dificultados quando se aplicam técnicas tradicionais de campo (Norton et al., 2004; Oliveira-Santos et al., 2010). O difícil acesso ao animal faz com que metodologias não invasivas (fezes e pelos), que são independentes do encontro do animal na natureza, assim como o uso de técnicas moleculares (Garcia, 2010), sejam boas estratégias para estudos populacionais e genéticos (Sanches et al., 2009; Godoi, 2011; Ramirez, 2013; Pinho et al., 2014). Dessa forma, o estudo da diversidade genética, a partir de amostras fecais, auxilia na descrição dos níveis de variabilidade genética mantida entre e dentro das populações (Hamrick,1983).
Figura 1: Anta (Tapirus terrestris) registrada no Complexo Florestal Sooretama-Linhares, ES, Brasil. Foto: (armadilha fotográfica) (Pró-Tapir).
15 As antas são atores-chave na dinâmica de florestas, atuando como importantes dispersoras e predadoras de sementes (Fragoso et al., 2000, Guimarães et al., 2008), sendo muitas vezes chamadas "jardineiras" ou "arquitetas" das florestas (Taber et al., 2008; Fig. 2).
Figura 2: Desenvolvimento de plântulas em latrina de Tapirus terrestris na Reserva Biológica de Sooretama, Linhares, ES. Foto: Dahiani N. Bossi.
Segundo Melo (2012), o passo mais importante para escolher populações naturais para um programa de manejo e conservação é caracterizar essas populações. Um dos principais métodos para essa caracterização é a utilização de marcadores moleculares. Através destes é possível obter informações preciosas sobre as populações, como o fluxo gênico, as medidas de diversidade genética e o grau de estruturação populacional. Os marcadores moleculares são de grande importância, identificando simples mudanças nas sequências de DNA (Jones, 2009). Dentre eles, um que se destaca em análises de identificação individual é o DNA microssatélite, que apresenta um alto grau de polimorfismo identificando diversos alelos em pequenas populações (Vowles et al., 2004). Depois de identificados os indivíduos, os dados de microssatélite podem ser usados para questões de pesquisa relacionadas à diversidade, fluxo genético, relações filogenéticas, paternidade, estrutura social, ou forense (Waits e Paetkau 2005), como já foi realizado para T. terrestris em outras regiões ao longo de sua distribuição (Godoi, 2011; Ramirez, 2013; Pinho et al., 2014).
16 Sendo assim, avaliar a estrutura populacional e diversidade genética de T. terrestris, na Mata Atlântica, onde a espécie é considerada “Em Perigo”, torna-se crucial para a implementação de ações de manejo e conservação, especialmente em uma das poucas áreas que ainda estima-se que mantém uma população viável da espécie, no bioma. Esta região localiza-se no estado Espírito Santo, onde a espécie já foi amplamente distribuída até o final do século XIX, mas, com a intensa ação antrópica, ocorreu uma diminuição de habitat e declínio acentuado das populações (Flesher e Gatti, 2010). Com isso, as populações de antas foram reduzidas a três ou, possivelmente, quatro (Flesher e Gatti, 2010). Atualmente, essas estão localizadas ao norte do Rio Doce, onde ainda há registros de ocorrência atual (Flesher e Gatti, 2010). Uma dessas populações está localizada no Complexo Florestal Linhares-Sooretama (Flesher e Gatti, 2010), onde se estima possa haver uma população, com 200 indivíduos, considerando a estimativa realizada por Gatti et al. (2011). Esse número é pequeno e pode estar afetando na diversidade genética, com possível efeito de endogamia. Apesar dessa região ser considerada não-defaunada e uma das poucas áreas a manter populações viáveis da espécie no bioma, há vários conflitos que podem impactar negativamente a espécie, em médio e longo prazo, como a presença da Rodovia Federal BR-101 (Flesher e Gatti, 2010.
Esta circunstância torna estudos de diversidade genética altamente relevante, uma vez que a estimativa populacional e avaliação da diversidade genética da espécie são de grande importância para auxiliar a formulação de medidas de manejo e conservação na região e que pouco se sabe sobre a demografia e genética dessa população. Além disso, não se sabe se existe alguma limitação de fluxo gênico, ou seja, alguma barreira que poderia promover a separação dos indivíduos em sub-populações no Complexo Linhares-Sooretama. Sabe-se que, com a interrupção do fluxo gênico, ocorre um aumento dos níveis de endogamia, ocasionando redução da variabilidade genética ao longo das gerações subsequentes (Sezen et al., 2005). Portanto, uma das principais questões avaliadas é se a rodovia BR-101 poderia atuar como barreira para o fluxo gênico da população, na região.
17 2. OBJETIVOS
Objetivo geral
Realizar a estimativa populacional e diversidade genética de Tapirus terrestris em Remanescentes Florestais de Mata Atlântica no Estado do Espírito Santo.
Objetivos específicos
(1) Determinar índices de diversidade genética a partir de marcadores moleculares;
(2) Verificar a existência de estruturação genética entre os indivíduos para os fragmentos do leste e oeste da BR101 Norte, ES;
(3) Identificar se os indivíduos amostrados no leste do complexo Linhares-Sooretama deslocaram-se para o oeste do complexo e vice-versa;
(4) Determinar o grau de parentesco entre alguns indivíduos identificados.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Área de estudo
O estudo foi realizado no Complexo Florestal Linhares-Sooretama que são remanescentes de Mata Atlântica no estado do Espírito Santo. As amostras foram coletadas no lado leste e oeste do Complexo. A divisão em leste e oeste foi feita com base na BR-101. O Complexo é composto pelos seguintes remanescentes são: 1. Reserva Biológica de Sooretama (40º15’W, 19º05’S), localizada do município de Sooretama, ES, que possui uma área de 27.858,68 hectares, essa área fica no lado oeste do estudo; 2. Reserva Natural Vale (40° 8'51.83 W, 19° 3'24.51 S) com uma área de 22.711 hectares; 3. Reserva Particular do Patrimônio Natural Recanto das Antas (39°58’W,19° 05’S), maior RPPN da Fibria, que ocupa 2.212 hectares ; 4. Fazenda Cúpido e Refúgio (FCR) (39°59’W,19°03’S) com 180 hectares; 5. Reserva Particular do Patrimônio Natural Mutum Preto com uma área de 378,73 hectares. As quatro
18 últimas áreas ficam do lado leste do complexo e estão localizadas no munícipio de Linhares (Fig 3).
Figura 3: Localização dos cinco remanescentes florestais do norte do Espírito Santo, onde foram coletadas as amostras fecais de Tapirus terrestris e da RPPN Mutum Preto que não foi utilizada neste estudo. Cada área está representada por uma tonalidade de verde. Fonte:Pró-Tapir
3.2. Coleta de Dados
A amostragem foi realizada em acordo com a autorização n. 32565-6 para a RPPN Recanto das Antas e a autorização n.52528-3 para a Reserva Biológica de Sooretama, Reserva Natural Vale e Fazenda Cupido & Refúgio, todas emitidas pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio / MMA). Estas autorizações são para coleta de amostras fecais, coleta de frutos nas áreas de estudo,
19 execução da atividade educativo cultural: Dia da Anta, caracterização florística e fitossociológica, construção das armadilhas para captura, construção das armadilhas para captura, realização das campanhas de captura, coleta de material biológico (indivíduos capturados), monitoramento por telemetria e análises laboratoriais das amostras biológicas.
Nove campanhas foram realizadas com média de cinco dias cada entre janeiro de 2015 a junho de 2017. Em todas as saídas de campo, as amostras fecais (pilhas isoladas) ou latrinas foram encontradas através de busca ativa (Tabela 1; Anexo 1). Já amostras de tecidos foram provindas de campanhas de captura (Fig. 5), atropelamentos ou animal encontrado morto no Complexo.
Só foram coletadas amostras fecais com um curto período de exposição, aparentemente esverdeadas. Encontrar amostras fecais viáveis demanda tempo, paciência, observação da área e disposição, pois não é tão simples adentrar em uma área florestal e localizar as amostras viáveis para estudos genéticos, por isso uma boa dica é observar se na área tem pegadas, ou trilhas do animal.
A definição dos locais para serem realizadas as buscas por fezes frescas foi realizada com o auxílio das avaliações das armadilhas fotográficas e encontro de vestígios de antas (pegadas, amassados e trilhas). O período de busca por local durava em média duas horas e era realizada por quatro pessoas. Quando as amostras eram encontradas, eram registradas as seguintes informações: coordenadas geográficas, código de coleta, data, se a amostra foi encontrada em latrina ou pilha isolada, tipo de ambiente, o estágio de deposição da amostra e o tipo de ambiente que foi encontrada. Para a manipulação das fezes foram utilizadas luvas de látex e uma pequena quantidade da amostra era colocada em tubos falcon (50 ml) contendo 30 ml de etanol 90% (Fig. 4). As amostras foram mantidas à temperatura ambiente até a chegada ao alojamento, onde eram armazenadas em congelador, para posterior armazenamento no laboratório de Genética e Conservação Animal do CEUNES, na UFES. As amostras foram mantidas a -20ºC, para posterior análise.
Para a captura das antas, foram construídas armadilhas de tela (2,8m de comprimento, 2,2m de altura, 1,5m de largura) contendo cochos com sal mineral. As armadilhas foram dispostas na área de estudo, de acordo com os vestígios de antas encontrados, previamente à construção. Uma vez capturados, os animais tiveram seu peso estimado e, utilizando-se projetor de dardos anestésicos, foram anestesiados pelo médico veterinário. Durante a contenção e manipulação, foram monitorados a
20 frequência cardíaca, frequência e padrão respiratórios de cada indivíduo capturado. Além disso, foram realizados a biometria corporal e exame físico geral. Com o animal anestesiado, foi retirado um pedacinho da ponta da orelha e armazenado o tecido em tubo falcon com álcool 90%. Posteriormente, as amostras de tecido foram levadas para o laboratório de Genética e Conservação Animal do CEUNES, na UFES. As amostras foram mantidas a -20ºC para análise.
Figura 4: Coleta de amostras fecais em uma latrina visitada por antas na Reserva Biológica de Sooretama, ES. Foto: Pró-Tapir.
21 Figura 5: Anta anestesiada para coleta de tecido em
Complexo Florestal Linhares-Sooretama, ES. Foto: Pró-Tapir.
3.3. Extração e Quantificação do DNA
Para a extração do DNA fecal foi utilizado o kit de extração QIAmp® DNA Stool Mini Kit, seguindo o protocolo do fabricante (Anexo 2).
Além da extração das fezes, foi possível extrair DNA de tecido (músculo) de cinco amostras de antas obtidas a partir de animais atropelados e /ou capturados em campanhas do Pró-Tapir. Para os tecidos musculares se utilizou o protocolo de extração com solução Salina (BRUFORD et al., 1992, adaptado por David Vieites), detalhado a seguir.
Com auxílio de uma pinça e um bisturi, cortou-se o tecido em cima de um Parafilm apoiado em uma placa de Petri. Utilizou-se água sanitária e álcool para esterilizar a pinça e o bisturi cada vez que o tecido foi trocado. Adicionou-se o tecido picado a um tubo de 1,5ml. Em seguida, adicionou-se a solução de lise aos tubos (410μL de buffer de extração + 80μL SDS 10% + 10μL proteinase K). Incubou-se o tecido a 55ºC overnight até a digestão do tecido. Centrifugou-se a 13.000 rpm por 5 min, transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo de 1,5mL. Adicionou-se 180μL
22 NaCl (5M). Inverteu-se o tubo 50 vezes para homogeneizar. Um precipitado branco foi formado. Centrifugou-se a 13.000 rpm por 5 min e transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo resfriado e adicionou-se 1 ml de isopropanol gelado, misturou-se gentilmente. Centrifugou-se a 13.000 rpm por 7 min e descartou-se o sobrenadante. Adicionou-se 250μL etanol 80%. Inverteu-se 50 vezes para misturar. Mais uma vez centrifugou-se a 13000 rpm por 7 min e descartou-se o sobrenadante. Adicionou-se 250μL etanol 80%. Inverteu-se 50 vezes para misturar. Centrifugou-se a 13.000 rpm por 7 minutos. Descartou-se o sobrenadante. Removeu-se o álcool completamente no banho a 50-55ºC. Ressuspendeu-se o DNA em 50μL de água ultrapura. Deixaram-se os microtubos com DNA ressuspendido na geladeira overnight (4ºC) para a completa dissolução do pellet.
As amostras de DNA foram quantificadas por espectrofotômetro (NanoDrop® ND-2000) utilizando-se 1 µL do DNA extraído.
3.4. Amplificação por PCR
Para as análises moleculares foram utilizados dez locus microssatélites publicados para a espécie: Tter 3, Tter 4, Tter 5, Tter 7 Tter 9, Tter 11, Tter 13, Tter 14, Tter 17 e Tter 18 (Sanches et al., 2009; Tabela 1).
As reações de PCR foram preparadas a partir de testes feitos no laboratório para um volume final de 12μL: Tampão 10X; BSA 1,0 μL; 2,0 mM de MgCl2 (50 mM); 0.2
mM de dNTPs; 1U de Taq DNA polimerase (INVITROGEN); 0,5 μL de Primer Foward; 0,4 μL de Primer Reverse; 40 ng de DNA. Foram utilizadas as seguintes condições: 94°C por 5 min, 35 ciclos (94°C por 30 s; 48-52 por 1min; 72°C por 45 s) e 72°C por 10 minutos, conforme Godoi (2011).
De acordo com a literatura os primers citados foram descritos para uma faixa de temperaturas de 48ºC a 56ºC. Desta forma, foram realizados testes para a detecção da temperatura ideal de anelamento para cada par de primer. Após a PCR, o resultado foi observado em gel de agarose 2% corado com GelRed.
Após a determinação das temperaturas de anelamento mais adequadas foram realizadas amplificações simples, com apenas um par de primers microssatélites e reações duplex, nos quais dois loci foram amplificados numa única reação (Tab. 1). Para tal, cada loci utilizado no duplex apresentou faixas de tamanhos de fragmentos diferentes e também marcação diferenciada, conforme Tabela 1.
23 Tabela 1: Loci de microssatélite, sequências dos primers, tipo de marcação fluorescente (Marc:
NED ou FAM), temperatura de anelamento (T), faixa de tamanho (pb) dos fragmentos amplificados e Duplex utilizados para avaliar as amostras fecais de T.
terrestris coletadas no Complexo Florestal Linhares-Sooretama do Espírito Santo.
Loci Sequência primer 5’-3’ Marcação T (ºC) Pb Duplex
Tter 3 ATCTCAGAGGTTCCACACTG GCTGGAAGGTAAGATCTGTG Ned 52ºC 156-168 A Tter 4 FCGTTAGCATGATCTCTAGACC CCAGATGAGAAGCAGGATAG Fam 50 ºC 246-256 B Tter 5 TGCCCTGATTTAGAGAAAAC AGGAGAAGTTAGAAGGGGAA Fam 52 ºC 194-216 A Tter 7 CCTGTGCAGCATTTGATAAC GGTTGACCAGTTTAATGCAG Ned 48 ºC 142-174 C Tter 9 GGACACTCAAGTGGGTCAAG AGTGTATGCTTGTCGCGC Fam 50 ºC 168-192 D Tter 11 GCTCTCTGGCTTTTACACACT GGAAAGCTGAAAAGGAGGA Ned 50 ºC 176-193 B Tter 13 CCATGCAATTAAGAGAAAGC CAGCTAAGGACAGGAAAATG Fam 52 ºC 249–260 E Tter 14 GATCCTCCTGTTTGCAGAT AGCCAAATGTTTTAGACTGAG Fam 52 ºC 174-208 F Tter 17 TGCCACATTTGTTCAGTCTC GGCTGAAATATTGTATCTGCA Fam 48 ºC 274-300 C TTer 18 AGAGTGTCAGATGTCCTGCC TGCTTTGTGTTTGAGTGTGC Ned 52 ºC 92–117 E
Legenda: Duplex A = Tter 3 e Tter5; B = Tter 11 e Tter 4; C = Tter 7 e Tter 17; E= Tter 13 e 18, cada duplex foi colocado em uma mesma reação de PCR. Os marcadores Tter 9 e Tter 14 foram amplificados isoladamente.
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2% com marcador molecular 100bp a fim de se confirmar a amplificação dos fragmentos. A visualização foi realizada sob luz ultravioleta, em um sistema de fotodocumentação. As amostras que não amplificaram adequadamente (ausência de bandas ou bandas fracas) foram reamplificadas utilizando: Tampão 10X; BSA 1,0 μL; 2,0 mM de MgCl2
(50 mM); 0.2 mM de dNTPs; 1U de Taq DNA polimerase; 0,5 μL de Primer F; 0,4 μL de Primer R; 30 ng do produto de PCR.
Após confirmação da amplificação, os produtos de PCR (microssatélites) foram desnaturados com um mix contendo um padrão interno (Liz) e formamida HIDI a 95°C por três minutos. Imediatamente após, os produtos foram deixados no gelo por 2 min e submetidos à eletroforese capilar no sequenciador automático ABI 3500 (Genetic Analyzer).
24
Após a eletroforese capilar, os alelos microssatélites foram identificados no programa GeneMapper v.4.1 (Applied Biosystems), de acordo com o tamanho dos picos do eletroferograma.
As reações de sequenciamento e análise dos microssatélites no GeneMapper foram realizadas no Núcleo de Genética Aplicada à Conservação da Biodiversidade (NGACB), Vitória, ES.
Um total de 10 locos microssatélites polimórficos foi testado na amplificação de todas as 66 amostras. O sucesso de amplificação de cada loco foi examinado a fim de se avaliar a viabilidade da utilização dos mesmos para o estudo. Quanto à viabilidade da utilização de cada loco, foram avaliados dois fatores: o sucesso de amplificação para a maioria das amostras utilizadas e a qualidade da genotipagem.
Amostras que apresentaram 100% de locos combinados e foram considerados portadores do mesmo genótipo para todos os locos, foram retiradas das análises.
3.5. Identificação Individual e Diversidade Genética
Os genótipos foram analisados para a presença de alelos nulos e erros de genotipagem com o programa MICRO-CHECKER v.2.2 (Van Oosterhout et al., 2004).
O Mstools v. 3.1 (PARK, 2001) foi utilizado para identificar genótipos idênticos e também para exportar arquivos para outros formatos. Nos programas Fstat v.2.9.3.2 (Goudet, 2001) e Arlequim v.3.5 (Excoffier et al., 2010) foram calculados índices de diversidade genética, estimativa de frequências, número e riqueza de alelos, heterozigosidades esperada e observada e o FIS (índice que nos mostra o grau de endogamia da população).
O programa Genepop on the Web (http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop) foi utilizado para verificar o desequilíbrio de ligação e desvio de Hardy-Weinberg entre os loci.
O programa GenAlex v.6.5 (Peakall e Smouse, 2006) foi utilizado pra converter a planilha de dados para o arquivo de entrada requerido por cada programa e para o cálculo do FST e FIS de Wright (1969).
No programa Structure V.2.3.4 foi feita aanálise bayesiana para atribuir as antas em um grupo (cluster) ou população com base em seus genótipos, sem levar em conta de onde foram coletadas as amostras (Pritchard et al., 2000). As análises foram realizadas com o número de grupos (K) ajustado de 1 a 10 para determinar o número
25 provável de aglomerados representativo dos dados com análises de 10 réplicas por cada K (Pritchard et al., 2000). Foi utilizado também o gráfico de L(K) de probabilidade implementado no Structure Harvester V 0.6.94. (Earl e vonHoldt 2012), para determinar o número mais provável de grupos. Além do Structure, foram utilizados os dados da análise de variância molecular (AMOVA) obtidos a partir do GenAlex v.6.5 (Peakall e Smouse, 2006) para determinar com maior confiabilidade o número de populações possíveis a partir dos dados de FST obtidos por esse programa.
As análises de parentesco entre indivíduos foram feitas no programa ML Relate (Kalinowski et al., 2006). Um programa projetado para acomodar loci microsatélites com alelos nulos. Antes de rodar a análise faz-se necessário um teste no próprio programa para saber quais locus apresentam alelos nulos. Marcando esses locus é possível rodar a análise de parentesco com maior confiabilidade. O programa ML-RELATE assume que o parentesco genealógico é representado de forma convincente, por meio de probabilidades matemáticas baseadas em estimadores de máxima verossimilhança, por exemplo: probabilidades dos indivíduos compartilharem zero (Ko), um (K1) ou dois (K2), alelos entre todos os loci analisados (Kalinowski et al., 2006).
4. RESULTADOS
4.1. Amostras
O esforço total despendido nas áreas para a busca de fezes foi de 220 horas. Foram coletadas 61 amostras de fezes e cinco amostras de tecido. Das amostras (tecidos e fezes), em torno de 51,5% (n= 34) foram coletadas na Rebio de Sooretama, 31,8% (n= 21) na RPPN Recanto das antas, 10,6% (n= 7) na Reserva Natural Vale e 6,0% (n= 4) na Fazenda Cúpido e Refúgio.
Das 61 amostras fecais, 47 (77%) foram coletadas em áreas de latrina ou pilhas isoladas dentro da mata e 14 (23 %) foram coletadas dentro de áreas alagadas.
Na RPPN Recanto das Antas e Fazenda Cúpido e Refúgio foi mais fácil encontrar amostras fecais em alagados, onde demandou menos tempo para encontrar amostras viáveis, do que em plantações de eucaliptos e mata ciliar. Já na Reserva Biológica de Sooretama e Reserva Natural Vale, onde havia a necessidade de se
26 adentrar mais na mata, o esforço e busca pelas fezes frescas foi maior, e nem sempre positivo. O maior número de amostras coletadas em latrinas ou pilhas isoladas dentro da mata foi porque em certo momento, o esforço de busca foi todo concentrado nessas áreas para poder ter informações genéticas desses fragmentos e não só de regiões de alagados. Tanto as fezes coletadas em água quanto em áreas no interior da mata obtiveram sucesso de amplificação.
Na Reserva Natural Vale foi percorrido área como o rio Barra Seca que poderiam ter amostras fecais em suas margens, no entanto, não foram encontradas amostras nestes pontos. Em certo ponto desse rio encontrou-se uma trilha de pegadas adentrando a mata. Seguindo essa trilha a uns 200 metros foi encontrada uma latrina com amostras frescas. Na Fazenda Cúpido e Refúgio as amostras foram encontradas em fragmentos de mata, em volta de cisterna e dentro destas (cisternas cimentadas utilizadas para depositar água para molhar as plantações). E na Reserva Biológica de Sooretama para encontrar amostras foi necessário adentrarmos a mata e percorrermos quilômetros em busca de amostras. Nas bordas da reserva foram encontradas apenas algumas amostras..
4.2. Sucesso de Amplificação dos Locos Microssatélites e Genotipagem
Dos 10 locos testados, um (Tter 14) produziu picos (na genotipagem) de difícil interpretação para todas as amostras, e por isso foi retirado das análises posteriores. Outros dois marcadores (Tter 9 e Tter 17) apresentaram problemas na amplificação dos fragmentos para a maioria das amostras e também foram retirados. Desta forma, foram considerados sete marcadores para as análises populacionais.
4.3. Número de Indivíduos Identificados
Das 66 amostras genotipadas (Fig. 6A), 20 amostras (30,3%) foram desconsideradas, pois amplificaram para apenas três ou menos locos. Das 46 restantes, seis foram consideradas como sendo mesmos indivíduos. Foram identificados, portanto, 40 indivíduos diferentes (Fig. 6B).
27
Figura 6: Pontos de coleta das 66 amostras fecais de antas no Complexo Florestal Linhares-Soortema, sendo as na cor azul utilizadas e na cor preta descartadas das análises (6A). Os círculos em laranja são as localidades onde foram coletadas as amostras dos 40 indivíduos diferentes identificados a partir do programa Mstools (6B). Pontos de deslocamento dos indivíduos, a mesma cor vista mais de uma vez no mapa são os indivíduos reamostrados em pontos diferentes (6C). Círculos na cor laranja são pontos onde foram encontradas as latrinas (6D).
4.4. Análise da Diversidade Genética Total
A média de heterozigosidade observada para os sete locos polimórficos analisados foi de 0,538, sendo que Tter 3 apresentou a maior heterozigosidade observada, 0,867; enquanto o marcador Tter 4 apresentou a menor heterozigosidade observada, 0,325; mostrando assim uma diversidade genética moderada (Tab. 2). Um total de 67 alelos foi detectado pela análise de todos os indivíduos, variando de oito (Tter 5) a doze (Tter 3) alelos por locos. A média de diversidade alélica foi de 9,51 alelos/locos. A heterozigosidade esperada variou de 0,550 (Tter 13) a 0,884 (Tter 7) (Tab. 2). Os marcadores Tter 4, Tter 5, Tter 11 e Tter 13 se mostraram em desequilíbrio de Hardy-Weinberg. A partir do teste de desequilíbrio de ligação, nota-se que nenhum marcador apresentou-se ligado. A média do PIC de 0,748 do presente estudo, o que indica que os marcadores são informativos.
28 Tabela 2. Análise de diversidade genética por locus microssatélite da antas
identificadas. Número de alelos por locus (K), Número de amostras (N), Heterozigosidades observada (Ho) e esperada (He), Conteúdo de informação polimórfica (PIC), Índice de endogamia (Fis), Riqueza alélica (Ra), Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e Frequência de alelo nulo (F Null).
4.5. Análise da Diversidade Genética por Área
O número de alelos por loco e as estimativas de heterozigosidade esperada, heterozigosidade observada, e Fis (endogamia) das duas áreas estão apresentadas na Tabela 3. A heterozigosidade observada no lado oeste do complexo Linhares-Sooretama foi menor (0,49) que no lado leste (0,56). A endogamia foi mais pronunciada na área do oeste (0,37).
Tabela 3: Análise de diversidade genética por locus microssatélite das antas identificadas no Complexo Florestal Linhares-Soortetama. Número de alelos por locos (K), heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) na área oeste da BR-101 (Reserva Biológica de Sooretama) e na área leste (RPPN recanto das Antas, fazenda Cúpido e Refúgio e Reserva Natural Vale).
Locos K N Ho He PIC FIS RA HW F(Null)
Tter 3 12 15 0,867 0,883 0,841 -0,019 10,886 0,322 -0,0012 Tter 4 9 40 0,325 0,682 0,651 0,527 6,670 0,000 0,3539 Tter 5 8 28 0,429 0,774 0,737 0,451 6,972 0,000 0,2641 Tter 7 10 12 0,500 0,884 0,830 0,445 10,000 0,253 0,2651 Tter 11 9 15 0,600 0,887 0,842 0,332 8,555 0,022 0,1680 Tter 13 9 36 0,361 0,550 0,516 0,347 5,506 0,006 0,2021 Tter 18 10 19 0,684 0,863 0,824 0,212 8,690 0,310 0,1100 Média 9,571 23,57 0,538 0,789 0,748 0,324 8,182 0,130 -0,0012
29 4.6. Estrutura Populacional
O valor de FST observado para as áreas do leste e oeste foi 0,018, sendo estatisticamente significativo, indicando que há uma baixa diferenciação genética entre as duas localidades. Os resultados da AMOVA indicaram uma maior percentagem de variação (55%) entre indivíduos..
4.7. Estrutura Populacional no Structure
O gráfico de L(K) de probabilidade mostra o número mais provável de populações existentes na área avaliada e o desvio padrão correspondente para cada número (Fig 7). O menor desvio corresponde ao K=1.
Figura 7: Número de populações de anta baseado em um logaritmo da probabilidade posterior dos dados [L(D|K)] em função do K médio em 10 corridas independentes feitas no programa Structure e observadas no Structure Havester, e os seus respectivos desvios padrões.
Com base na análise Bayesiana (Fig. 8), estimou-se que exista apenas uma população entre as áreas a leste e a oeste da BR. Não sendo observada estruturação genética aparente entre as duas áreas amostradas. Tanto para o cluster verde como para o vermelho foi observado um alto grau de mistura, o que demonstra alto grau de fluxo gênico entre as áreas do leste e oeste do complexo Linhares-Sooretama, mesmo separados pela BR-101.
30 Figura 8: Análise Bayesiana das amostras fecais das antas no complexo Linhares-Sooretama. A figura mostra a probabilidade de atribuição de cada indivíduo (linhas verticais) em cada um dos dois grupos (K = 1, vermelho e Verde) para as 40 antas amostradas.
Com base nos valores de Delta (K) pode ser sugerida a existência de dois grupos genéticos na área avaliada (Fig 9)
Figura 9: Número de populações de antas baseado em valores de Delta (K), segundo correção de Evanno et al., (2005), mostrando o maior valor de delta (K) para K=2. No eixo y estão os valores de delta (K) e eixo x, os diferentes K testados. O desvio padrão para cada K testado está representado na forma de uma barra vertical.
4.8. Parentesco
Para a análise de parentesco não foram utilizadas os 40 indivíduos, pois muitos amplificaram para apenas quatro marcadores. Para uma análise mais criteriosa foram utilizados 11 indivíduos, sendo incluídos apenas aqueles que amplificaram para cinco ou mais marcadores.
As comparações feitas entre os indivíduos mostraram a presença de quatro categorias de relacionamento: irmãos-completos (FS), meio-irmãos (HS), Progenitor
31 (PO) e não relacionados (U). Foi possível observar quatro relações entre os indivíduos, conforme a tabela 4. Duas relações de possíveis progenitores, uma de meio irmão e uma de irmãos completos. CG 06, CG21, CG30, CG36, CG55, CG59 são indivíduos identificados a partir de amostras fecais, já a CGT03 é uma amostra de tecido de uma anta fêmea nomeada como fofinha capturada na FCR. Fofinha, na análise de parentesco, foi identificada como irmã completa do indivíduo CG21 que teve sua amostra fecal coletada na RPPN Recanto das Antas.
Tabela 4. Categorias de relacionamentos identificadas para as antas no Complexo Florestal Linhares-Sooretama com base em quatro possíveis parentescos, sendo a primeira coluna os indivíduos relacionados e a segunda coluna o possível parentesco.
Indivíduos relacionados Possível parentesco
CG36 e CG06 Progenitor
CG55 e CG36 Meio irmãos
CG59 e CG30 Progenitor
CGT3 e CG21 Irmãos completos
4. DISCUSSÃO
A partir da análise de identificação, foi possível estimar um número mínimo de 40 antas na paisagem do Complexo Linhares-Sooretama. Este valor é relativamente pequeno para o tamanho da área total avaliada, no entanto, esse estudo ainda terá continuidade e novos indivíduos poderão ser identificados. O método de coleta de fezes tem se mostrado importante para o desenvolvimento de análises genéticas e estimativas populacionais, sendo complementar a outros estudos e metodologias. Moreira et al. (2018) constataram um mínimo de 29 indivíduos na Reserva Particular do Patrimônio Natural Recanto das Antas e arredores, em apenas um dos quatro remanescentes estudados neste estudo, utilizando método de análise não invasivo para identificação de espécies, a técnica de identificação de pegada (FIT). Gatti et al.(2011) estimaram 200 indivíduos, para o Complexo Linhares-Sooretama, por meio de uma análise de simulação computacional utilizando o programa Vortex.
Com relação à diversidade genética encontrada nas amostras, a heterozigosidade observada (Ho) média mostrou-se relativamente elevada, porém menor que a
32 heterozigosidade esperada (He). Alguns locus, porém, apresentam uma diferença maior entre Ho e He, evidenciado por um valor de FIS maior que zero. Exemplos são os locos Tter 4, Tter 5 e Tter 7, que apresentam os maiores valores de FIS e, consequentemente, uma menor heterozigosidade observada com relação à esperada. A média do valor de FIS indica endocruzamento na população de estudo, visto que o valor se apresentou positivo. Tapirus terrestris teve um coeficiente de endogamia de FIS = 0,324, que é considerado alto quando FIS ≥ 0,5, intermediário quando FIS ≥ 0,25 e baixo quando FIS < 0,25 (Willis, 1993; Ritland, 1996). Apenas para o locus Tter 3 o valor de FIS não foi estatisticamente significativo. Este resultado fornece indícios de uma deficiência de heterozigotos, o que pode ser o resultado de endogamia por relacionamentos entre parentes, ou presença de alelos nulos. No complexo Linhares-Sooretama somente os loci Tter 3 e Tter 18 não tiveram desvios significativo do equilíbrio de Hardy-Weinberg (P >0,05). Segundo Falconer (1964) e Hartl e Clark (1989) a endogamia é o acasalamento entre indivíduos que são relacionados por descendência, tendo como primeiro efeito uma mudança nas frequências genotípicas de Hardy-Weinberg devido a um aumento na frequência de genótipos homozigotos. Como a presença de alelos nulos foi identificada pelos programas Microcheker e ML Relate, essa pode ser a principal causa para os desvios encontrados. O ML Relate realiza uma correção antes de rodar as análises de parentesco com alelos nulos, impedindo que eles interfiram no resultado (Wagner et al., 2006).
Os resultados revelaram diversidade genética moderada para os indivíduos de Tapirus terrestris amostrados nas diferentes áreas do Complexo Linhares-Sooretama. A eficiência dos marcadores foi confirmada pelo Conteúdo de Informação Polimórfica, sendo que os valores foram superiores a 50% em todos os locos analisados. Os microssatélites mostraram-se polimórficos e o PIC apresentou-se em média de 0,75 por loco. O PIC é um indicador da qualidade do marcador em estudos genéticos, sendo útil para a segregação, identificação de populações e controle de paternidade (Botstein et al., 1980). Os marcadores que apresentam valores de PIC superiores a 0,50 são considerados muito informativos, outros com valores variando entre 0,25 e 0,50 são considerados mediamente informativos e com valores inferiores a 0,25 são classificados como pouco informativos (Botstein et al., 1980).
A heterozigosidade média observada (Ho) neste estudo possui valores próximos aos encontrados por Sanches et al. (2009) para a espécie Tapirus terrestris no Parque Nacional das Emas e em diferentes Zoológicos brasileiros, que encontraram uma Ho de
33 0,45; e por Godoi (2011), que encontrou Ho de 0,56 no Mato Grosso do Sul (Brasil). Já Ramírez (2013) encontrou Ho de 0,19 para Tapirus terrestris na Serra do Mar (SP) e Ashley (2005) obteve uma Ho de 0,39 para Tapirus bairdi na América Central. Alta heterozigosidade observada, com valores superiores ao reportado por esse estudo é observada para: De Thoisy et al. (2006); Gonçalves da Silva et al. (2010); Pinho et al. (2014); Zavala-Páramo et al. (2017).
A diversidade alélica apresentada neste estudo foi maior do que a dos demais com uma média 9,5 alelos por locus (Tab 5). Essas comparações devem ser interpretadas com cautela, considerando que os estudos foram realizados em diferentes regiões ou países e, em alguns casos, com marcadores diferentes e duas espécies: Tapirus terrestris e T. bairdi.
Tabela 5: Diversidade alélica (K), heterozigosidade média observada (Ho), média do número de locos (Locos), número de indivíduos estimados (Indivíduos), material coletado, área de estudo de trabalhos que acessaram a variabilidade genética de antas a partir de dados originados de marcadores microssatélites e área em hectares do estudo.
Espécie K Ho Locos Indivíduos Material coletado Área de estudo Referências Área Tapirus terrestris 9,5 0,53 7 40 Fezes e tecido Complexo Linhares-Sooretama (ES) Brasil Presente estudo 52961,68 ha Tapirus terrestris 7,4 0,45 10 24 Pelo e sangue Parque Nacional das Emas e diferentes Zoológicos Brasileiros Sanches et al., 2009 Não informado Tapirus terrestris
5,0 0,67 10 41 Sangue Argentina Gonçalves da Silva et al,. 2010 Não informado Tapirus terrestris 8,0 0,76 5 37 Tecido Guiana Francesa de Thoisy et al., 2006 Não informado Tapirus terrestris 8,0 0,56 5 20 Fezes Mato Grosso do Sul (Brasil) Godoi 2011 5270,2 ha Tapirus terrestris 7,7 0,19 5 39 Fezes Serra do Mar (SP) Brasil Ramírez 2013 129705 ha Tapirus terrestris 6,6 0,77 5 32 Fezes Amazônia Central Pinho et al.,2014 236000 ha Tapirus bairdi 3,8 0,39 6 33 Pelo, tecido e sangue América Central Norton e Ashley 2005 Não informado Tapirus bairdi 8,1 0,821 6 9 Pelo, fezes e sangue México Zavala-Páramo et al., 2017 Não informado
34 O FST é uma medida de diferenciação genética, que está diretamente relacionado à variação na frequência alélica entre populações e, de modo inverso, ao grau de semelhança entre os indivíduos dentro das populações (Holsinger e Weir 2009). Foi avaliada a funcionalidade da BR-101 como barreira, o que poderia estar impedindo ou diminuindo o fluxo gênico das antas dos fragmentos florestais do leste com as do oeste, do complexo Linhares-Sooretama. O resultado estatístico de FST (0,018) mostrou uma leve estruturação genética entre as duas localidades estudadas. O mesmo ocorreu com o gráfico de valores de delta (K), que mostrou um K provável de 2, evidenciando essa leve estruturação (duas populações). No entanto, no gráfico de L(K) (fig7), observou-se que o K com menor desvio padrão foi de K=1. Pela estruturação encontrada no FST ser tão baixa, provavelmente ela não foi evidenciada no gráfico de L(K) gerado no Structure. Por enquanto podemos considerar uma população de anta no Complexo, no entanto, essa leve estruturação no decorrer dos anos pode vir a aumentar, caso medidas para a conservação das antas não sejam tomadas.
Indivíduos jovens normalmente se deslocam de uma área para outra em busca de territórios para reprodução e esse processo de deslocamento pode favorecer a morte por atropelamentos (Ramirez, 2013). Barreiras antrópicas, como estradas ou outro tipo de desenvolvimento humano, podem limitar a distribuição de espécies e o fluxo gênico (Mader, 1984; Cegeslki et al., 2003). A fragmentação das populações por estradas tem sido relatada por reduzir o nível do fluxo gênico em várias populações naturais, por exemplo, sapos Rana arvalis (Vos et al., 2001), pequenos roedores Clethrionomys glareolus (Gerlach e Musolf, 2000), e grandes mamíferos Panthera onca, Puma concolor e Leopardus pardalis (Wultsch et al., 2016).
Com a aprovação da duplicação da BR-101, a travessia das antas de um lado da BR-101 ao outro (leste-oeste do Complexo Linhares-Sooretama) pode ser prejudicado e as antas se tornarem isoladas, por isso sugere-se fortemente que a manutenção da conectividade entre os fragmentos seja prioridade no caso da conservação das antas no ES. Uma possibilidade de medida poderia ser o desvio da BR-101 no trecho que abrange o Complexo Florestal Linhares-Sooretama, transformando esse trecho de 25 quilômetros em uma estrada-parque estadual, para que as muitas espécies que ali habitam não sejam afetadas e possam ser extintas localmente.
A presença de estradas (Rodovias) ao longo do Complexo Linhares-Sooretama já tem impacto sobre as antas, devido aos atropelamentos e consequentemente morte de alguns indivíduos de antas, que de 2015 até o momento vem sendo relatado em alguns
35 pontos da BR. Ciocheti (2014) utilizou em seu estudo, registros de morte de mamíferos de médio e grande porte obtido da rodovia SP 225 (Rodovia Engenheiro Paulo Nilo Romano) em um trecho 150 km antes e depois da duplicação deste trecho da rodovia. A vegetação original do local de estudo é cerrado, floresta semi-decídua e mata ciliar, todos ainda presentes em alguns fragmentos remanescentes. Houve um aumento nos registros de atropelamentos após a duplicação de estradas para lebres e tatus. Em outro estudo realizado em Michigan (EUA) Reilly e Green (1974) durante 13 anos (quatro anos antes da duplicação e nove após a duplicação) mostraram que a duplicação de uma estrada interestadual resultou em um aumento imediato de aproximadamente 500% sobre a taxa de mortalidade anual veado-de-cauda-branca (Odocoileus virginianus), comparado com a taxa média registrada nos quatro anos anteriores duplicação. Após certo período, houve uma diminuição gradual em acidentes envolvendo veados, até que a taxa anual permanecesse, em média, duas vezes mais do que a taxa registrada antes duplicação (Reilly e Green, 1974). O que se observa é que a duplicação do Complexo Sooretama assim como essas áreas citadas, pode a interferir negativamente na manutenção de espécies no complexo, assim como Tapirus terrestris uma espécie que se desloca a grandes distâncias.
A respeito da análise de parentesco, dos sete marcadores avaliados, cinco apresentaram alelos nulos. Em uma análise de parentesco, mesmo os alelos nulos ocorrendo em frequências muito baixas, eles podem eliminar um possível candidato a parente. Pais e filhos, por exemplo, devem compartilhar um alelo idêntico em cada locus. Se os genótipos observados em um loco não apresentam alelos idênticos entre um pai e um descendente, a probabilidade da relação pai-descendentes é zero (Blouin, 2003). Quando alelos nulos estão presentes, os genótipos observados representam um dos vários possíveis genótipos verdadeiros. Se alelos nulos forem detectados, mas as análises não se ajustarem à sua presença, as estimativas de parentesco e relacionamento podem estar incorretas (Wagner et al.,2006).Em situações mais realistas, isto é, quando os alelos nulos microssatélites são incomuns ( p<0.2), sua presença causa uma leve subestimativa da probabilidade de exclusão m édia em um locus, mas provavelmente não é de magnitude suficiente para justificar uma grande preocupação (Dakin et al., 2004). No entanto, quando a frequência de um alelo nulo é > 0,2, as probabilidades médias de exclusão 'estimadas com valor nulo' podem ser muito mais altas do que os valores 'verdadeiro' e 'estimado sem nulo'.
36
No presente estudo, os alelos nulos não foram excluídos das análises porque suas frequências estavam com p-value ≤ 0,2 além de ter sido usada uma análise que comporta locus com alelos nulos (Wagner et al., 2006). Os marcadores utilizados e seus respectivos p-value Tter 3 :-0,0012; Tter 4: 0,244; Tter 5: 0,2003; Tter 7: 0,206; Tter 11: 0,1419; Tter 13: 0,1542; Tter 18: 0,0983.
Para antas, o comportamento de defecação em latrina é muito comum. No entanto, a questão se seria o mesmo indivíduo a defecar ou não, em uma mesma latrina, continua sendo discutido. Com base nesse estudo, notou-se que diferentes indivíduos utilizam uma mesma latrina. Obtendo-se dois casos como exemplo: dois indivíduos diferentes defecaram em uma mesma latrina CG47 e CG48; e, CG42 e CG43 (Fig 6.D). E um caso em que o mesmo indivíduo defecou em latrinas diferentes nomeados como CG49 e CG51 (Nome que se deu a amostra em diferentes coletas) Não foi possível inferir o parentesco entre esses indivíduos. No estudo preliminar, realizado em 2015, mesmo com menos amostras também foram identificados dois indivíduos distintos para uma mesma latrina. Por meio de vídeo de armadilha fotográfica, na mesma área avaliada em nosso estudo, também foi possível ver indivíduos distintos defecando em uma mesma área na RPPN Recanto das Antas (dados Pró-Tapir). Pinho (2011) também observou dois casos em que diferentes indivíduos utilizaram uma mesma latrina. Para Tapirus terrestris, não há estudos voltados ao comportamento de defecação em latrinas e pouco se sabe sobre a função biológica-ecológica. Entretanto, esse comportamento deve influenciar no padrão de dispersão de sementes por esses frugívoros e possivelmente no controle populacional das espécies vegetais (Tokumoto, 2012).
Com o presente estudo foi possível acessar a diversidade genética da população Tapirus terrestris no Complexo Florestal Linhares-Sooretama, ainda pouco estudada. Juntamente com outras informações, já obtidas por armadilhas fotográficas, pegadas e dieta, pretende-se entender como esta espécie se mantém e quão viável é a população de antas no Complexo Linhares-Sooretama a médio e longo prazo.
5. CONCLUSÕES
Existe fluxo gênico entre as antas das áreas leste e oeste do Complexo Linhares-Sooretama. No entanto, esses indivíduos apresentam diversidade genética moderada e uma leve estruturação, fatores que reforçam a importância de conservação (não
37 fragmentação) dessas matas e de medidas para diminuição de atropelamentos na BR-101, para, com isso, favorecer a permanência da espécie na região.
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