Dinâmica da resposta imune inata do sistema respiratório de bezerros

Texto

(1)CAMILA FREITAS BATISTA. Dinâmica da resposta imune inata do sistema respiratório de bezerros. São Paulo 2011.

(2) CAMILA FREITAS BATISTA. Dinâmica da resposta imune inata do sistema respiratório de bezerros. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências. Departamento: Clínica Médica Área de Concentração: Clínica Veterinária Orientadora: Profª Drª Alice Maria Melville Paiva Della Libera. São Paulo 2011.

(3) Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.. DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO. (Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo). T.2460 FMVZ. Batista, Camila Freitas Dinâmica da resposta imune inata bezerros / Camila Freitas Batista. -- 2011. 121 f. : il.. do. sistema. respiratório. de. Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Clínica Médica, São Paulo, 2011. Programa de Pós-Graduação: Clínica Veterinária. Área de concentração: Clínica Veterinária. Orientador: Profa. Dra. Alice Maria Melville Paiva Della Libera.. 1. Bezerros. 2. Fagocitose. 3. Metabolismo oxidativo. 4. Lavado broncoalveolar. 5. Imunidade inata. I. Título..

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(5) FOLHA DE AVALIAÇÃO. Nome: Batista, C.F.. Título: Dinâmica da resposta imune inata do sistema respiratório de bezerros Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências. Aprovado em:___/___/___. Banca Examinadora. Prof.Dr._______________________________________Instituição:________________ Julgamento:___________________________________Assinatura:________________. Prof.Dr._______________________________________Instituição:________________ Julgamento:___________________________________ Assinatura:_______________. Prof.Dr._______________________________________Instituição:________________ Julgamento:___________________________________Assinatura:________________.

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(7) DEDICATÓRIA. À minha mãe Lidia, pequena e guerreira Meu pai Hélio E à minha grande família (irmãos, tias e tios, primas e primos) que SEMPRE me apoiaram, NUNCA desistiram e principalmente, ACREDITARAM. Os meus mais sinceros e profundos agradecimentos Sem vocês não teria conseguido.

(8) AGRADECIMENTO ESPECIAL. À minha desde sempre orientadora Alice Maria Melville Paiva Della Libera Orientadora, professora, amiga, confidente, terapeuta E nas horas vagas mãe, esposa, filha, neta Um exemplo de dedicação, carinho, afeto e profissionalismo Agradeço por todos esses anos de convívio e ensinamentos Choros e risos Alegrias e tristezas E principalmente todas as conquistas Muito Obrigada.

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(10) AGRADECIMENTOS. A Deus que sempre permaneceu ao meu lado, nunca me abandonou e me deu força para continuar. À minha família Obrigada pelo amor, carinho e compreensão durante minha caminhada. À Profª Drª Alice Maria Melville Paiva Della Libera Minha Orientadora, que acreditou no meu trabalho e principalmente acreditou em mim. Obrigada por nunca ter desistido, obrigada por cada puxão de orelha, por cada bronca, por cada conselho e por cada abraço. Serei eternamente grata. À equipe Della Libera, minha família científica Maiara Garcia Blagitz, Andrea Cristina Parra, Heloisa Godoi Bertagnon, Bruna Parapinski dos Santos, Milton Ricardo Azedo, Giancarlo Bonagura, Raphael Schneider Vianna, Gabriel Garone de Lucca, Daniel Magalhães Lima, Débora Silveira Santos e Rebecca Bastos Pessoa, gostaria de agradecer cada um individualmente, pela ajuda, pela companhia, pelas risadas, pelas lágrimas, por cada minutinho que cada um dedicou a mim. Sem vocês esse trabalho nunca teria terminado. À Médica Veterinária Melissa Hartman Pela ajuda no início deste trabalho, muito obrigada. À Médica Veterinária e Amiga Danielle Yuri Massukado Rodrigues da Silva Pelas risadas, companhia e momentos de reflexão durante nossas longas horas nos caminhos da vida. Ao Esquadrão Bruna Stefania Tadini, Daniela Soares Ferraz, Mariana Sequetin Cunha, Marina de Melo Del Grande, Marina Godoy Gimeno, Lucila Oliveira Vilela, Eduardo de Oliveira Pontes, Ana Letícia Gulin da Silva e.

(11) Izabella Moreno Ferreira Ducatti, por me apoiar apesar de nem sempre compreender a minha ausência, meu eterno agradecimento aos meus sempre e amados amigos. Ao Prof. Dr. Stefano Carlo Filippo Hagen Pelos momentos filosóficos e de muita reflexão, pelos ensinamentos, pela paciência e por todas as risadas dadas. Ao Prof. Dr. Wilson Roberto Fernandes Sempre pronto a ajudar e tirar minhas dúvidas, e sempre pronto para elogiar e dar bronca com a mesma tranquilidade, obrigada por esses anos de ensinamentos. Ao Prof. Dr. Fernando José Benesi Pelas palavras de carinho e aconchegantes, pelas broncas homéricas, pela ajuda na execução desse projeto, pelas piadinhas, por transmitir seus conhecimentos. Muito obrigada. À Profª Drª Silvia Renata Gaido Cortopassi Pela ajuda na execução do projeto, por tirar muitas dúvidas, por se materializar nas horas que eu precisei, por sempre atender minhas ligações nos momentos de desespero, Agradeço de coração. Aos Médicos Veterinários Raphael Rosseti Lavado, Giovanna Cestari Ravedutti, Thales dos Anjos de Faria Vechiato, Greyson Vitor Zanatta Esper Sempre que preciso estavam prontos a ajudar, mesmo que de forma discreta muito obrigada. Às meninas do laboratório Clara Satsuki Mori, Marly Elizabete Ferreira de Castro, Maria Helena da Silva Pelissari, Maria Luiza Franchini, Samanta Ive Miyashiro, Carmen Silvia Ribeiro, Edina Santana dos Santos, Creide Donizete Costa, por toda ajuda durante todos esses anos..

(12) À Claudia Regina Stricagnolo A minha querida Claudinéia, que sempre me ajudou e me apoiou, mesmo nos momentos em que eu queria desistir, obrigada por tudo. Às secretárias da do Departamento de Clínica Médica Silvana Rossi Guedes, Maria Aparecida de Freitas e Carolina Alaís Aroma Pelo carinho e ajuda durante esses anos. Aos funcionários da Administração do HOVET Janilda Suadaria Costa, Márcio de La Penha Chiacchio, Leonardo Dourado da Silva, Joselma Gomes da Silva, Edvaldo José Tagino Pela ajuda e pelos momentos agradáveis. Aos Funcionários da Clínica de Bovinos e Pequenos Ruminantes Luis Cosmo Rodrigues, Edson Diogo, Francisco Antonio de Souza Pela ajuda, pelo carinho, almoços deliciosos e pelas conversas. Aos funcionários do Departamento de Cirurgia Selene Aparecida de Oliveira e José Miron Oliveira da Silva Pela ajuda na execução das hemogasometria. Ao Dr. Ermelindo Della Libera Junior Que acreditou no trabalho e me ensinou os segredos da endoscopia, obrigada pela ajuda e pelos ensinamentos. Aos Médicos Veterinários residentes do ano de 2010 Aline Alberti Morgado, Carolina Harumi Seino e Francisco Leonardo Costa de Oliveira Pelo cuidado com os animais, pela ajuda e pelo carinho..

(13) Aos Médicos Veterinários residentes do ano de 2011 Arnaldo Sotero, Maíra Bianchi Rodrigues Alves e Vanessa Grosso Pelo carinho e colaboração. À Secretária da pós-graduação do Departamento de Clínica Médica Adelaide Fátima de Jesus Borges Por todo carinho, dedicação e ajuda durante essa fase. À minha Amiga e Irmã Bruna Stefania Tadini Por me acompanhar, me ajudar, me ouvir, incentivar, por dar broncas, oferecer um ombro, casa, comida, abrigo, por todas as horas de choro e de riso, alegrias e tristezas, pelos abraços e palavras de carinho, por fazer parte da minha vida. Muito, muito obrigada. Aos Professores do Departamento de Clínica Médica Archivaldo Reche Junior, Carla Bargi Belli, Carlos Eduardo Larsson, Cássio Xavier de Mendonça Junior ( in. memorian), Denise Saretta Schwartz, Enrico Lippi Ortolani, Fábio Celidônio Pogliani, Fernando José Benesi, Lilian Gregory, Marcia Mery Kogika, Maria Helena Matiko Akao Larsson, Maria Claudia Araripe Sucupira, Mitika Kurubayashi Hagiwara, Raquel Yvonne Arantes Bacarin, Silvia Regina Ricci Lucas, Viviani Gomes, Wanderley Pereira de Araújo (in memorian) e Wilson Roberto Fernandes, obrigada pelos ensinamentos e pela convivência. Aos funcionários da Clínica de Equinos Marcos Roberto Rodrigues Alves, Cícero Antonio da Silva e Henrique Fragoso Que sempre estiveram na torcida e me ajudaram, mesmo com pequenos gestos. Aos colegas de pós-graduação Laura, Bruno, Carol Araújo, Melina, Leonardo Frasson, Frederico, Enoch, Rebeca, Paula Itikawa, Claudio, Arine, Alexandre, Ariane, Priscilla, Ana Guiomar, Tiago, Patricia Sakê, Carol Manguaça, Dani Ramos, Humberto, Fernanda Cyrillo, Raquel, Maurício, Francisco, Karina, Rogério, Marjorie, Tatiana, Barbara, Dani Passarelli, Priscila Fragoso. Obrigada pela convivência..

(14) À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Pelos auxílios financiamentos de bolsa (Processo n° 08/08006-0) e de auxílio à pesquisa (Processo n° 09/06013-1) que possibilitaram a realização desse trabalho..

(15) RESUMO BATISTA, C. F. Dinâmica da resposta imune inata do sistema respiratório de bezerros. [Dynamic of the innate immune response of the respiratory system in calves] 2011. 121f. Dissertação (mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011. As influências etárias do sistema imune de bezerros são descritas na primeira fase de vida desses animais e a hipótese de também ocorrerem variações nos principais mecanismos de resposta inata do pulmão pode identificar períodos de maior suscetibilidade às principais doenças respiratórias que acometem os bezerros nesse período. Com a finalidade de minimizar os prejuízos econômicos associados às doenças respiratórias em bezerros, este estudo objetivou avaliar a dinâmica imunológica inata do sistema respiratório de bezerros sadios nos três primeiros meses de vida, no qual nove bezerros sadios foram acompanhados por três meses e submetidos a oito avaliações imunológicas. O material recuperado do lavado broncoalveolar colhido por broncoscopia foi submetido à avaliação funcional dos macrófagos alveolares utilizando as provas de fagocitose (SaPI e E.coli), burst oxidativo, quantificação de imunoglobulinas e expressão de CD14. Os dados foram avaliados pelo teste ANOVA oneway (unstacked) (paramétricos) e pelo teste Mann-Whitney (não paramétricos). Verificaramse alterações funcionais de fagócitos CD14+, que apesar de se manterem constantes em seus valores relativos durante todo o período, apresentou intensidade de fagocitose elevada pontual na terceira semana de vida e um aumento da fagocitose por mononucleares CD14+ aos 45 dias de idade com diminuição da intensidade da fagocitose por essas mesmas células a partir dessa idade. Conclui-se que a partir de 45 dias de vida os animais começam a montar uma resposta imune própria, porém pontual e que até os 90 dias não atingem a estabilidade necessária para atestar a conclusão do processo de maturação da resposta inata local.. Palavras-chave: Bezerros. Fagocitose. Metabolismo oxidativo. Lavado broncoalveolar. Imunidade inata..

(16) ABSTRACT BATISTA, C. F. Dynamic of the innate immune response of the respiratory system in calves. [Dinâmica da resposta imune inata do sistema respiratório de bezerros] 2011. 121f. Dissertação (mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011. The influences of age in calves’ immune system are described in their first phase of life. The hypothesis that variations occur in the main mechanisms of lung innate response can help to identify periods of greater susceptibility to the respiratory diseases that affect calves in the first stage of their life. With the purpose of minimizing the economic losses associated with respiratory disease in calves, this study aimed to evaluate the innate immune dynamics of the respiratory system of healthy calves in the first three months of life. Nine healthy calves were monitored for three months and eight immunologic evaluations were performed. Bronchoalveolar lavage samples were recovered by bronchoscopy. Then, the alveolar macrophages in samples were identified by protein expression of CD14 and undergone functional evaluation of phagocytosis (SAPI and E.coli) and oxidative burst. Immunoglobulin were also quantified in samples. Data was assessed by one-way ANOVA (unstacked) (parametric) and the Mann-Whitney test (nonparametric). Functional alterations in phagocytes CD14 + were observed, and although their relative values were kept throughout the period, higher intensity of phagocytosis in the third week and increased phagocytosis by macrophages CD14 + at 45 days of life was observed. Decreased intensity of phagocytosis was observed after this age. It is concluded that from 45 days of life on, calves began to maintain their immune response, but until 90 days of life they did not achieve the stability to conclude the maturation of local innate response.. Key-words: Cattle. Phagocytosis. Oxidative burst. Bronchoalveolar lavage. Innate Immunity.

(17) LISTA DE TABELAS. Tabela 1 -. Valores absolutos séricos de proteína total e da fração gamaglobulina dos animais incluídos na pesquisa – São Paulo – 2010............................. Tabela 2 -. 57. Valores das médias e desvios padrão das funções vitais: temperatura, frequência de movimentos respiratórios e frequência de batimentos cardíacos de bezerros nos três primeiros meses de vida – São Paulo – 2010............................................................................................................ Tabela 3 -. Valores. das. médias. e. desvios. padrão. dos. 61. parâmetros. hemogasométricos de amostras de sangue arterial de bezerros nos três primeiros meses de vida – São Paulo – 2010............................................ Tabela 4 -. 65. Valores das medianas e valores mínimo e máximo dos parâmetros hemogasométricos SO2 e BE de amostras de sangue arterial de bezerros nos três primeiros meses de vida - São Paulo – 2010................................. Tabela 5 -. 66. Valores médios absolutos e desvios padrão dos componentes do leucograma de amostras de sangue de bezerros nos três primeiros meses de vida - São Paulo – 2010............................................................. Tabela 6 -. 67. Valores médios absolutos e desvios padrão dos componentes hematimétricos de amostras de sangue de bezerros nos três primeiros meses de vida - São Paulo – 2010............................................................ Tabela 7 -. 68. Valores percentuais das médias e desvios padrão das células mononucleares, frequência de mononucleares CD14+, produção de peróxido de hidrogênio intracelular e intensidade de fluorescência em valores arbitrários no lavado broncoalveolar de bezerros nos três primeiros meses de vida – São Paulo – 2010............................................ 70.

(18) Tabela 8 -. Valores percentuais das médias e desvios padrão das células mononucleares, frequência de mononucleares CD14+, fagocitose de SaPI e intensidade de fagocitose em valores arbitrários no lavado broncoalveolar de bezerros nos três primeiros meses de vida – São Paulo – 2010.............................................................................................. Tabela 9 -. 73. Valores percentuais das médias e desvios padrão das células mononucleares, frequência de mononucleares CD14+, fagocitose de E.coli e intensidade de fagocitose em valores arbitrários no lavado broncoalveolar de bezerros nos três primeiros meses de vida – São Paulo – 2010............................................................................................. Tabela 10 -. 77. Valores médios e desvios padrão dos níveis séricos de proteína total, albumina e frações alfa, beta e gamaglobulinas e da atividade sérica de bezerros nos três primeiros meses de vida - São Paulo – 2010........................................................................................................... Tabela 11 -. 80. Valores das médias e desvios padrão dos valores séricos das concentrações das imunoglobulinas IgA, IgM, IgG1 e IgG2 de bezerros nos três primeiros meses de vida – São Paulo – 2010............................... Tabela 12 -. 82. Valores médios e desvios padrão das porcentagens das concentrações das imunoglobulinas IgA, IgM, IgG1 e IgG2 do LBA de bezerros nos três primeiros meses de vida – São Paulo – 2010..................................... 87.

(19) LISTA DE GRÁFICOS. Gráfico 1 -. Médias e desvios padrão das frequências cardíacas nos três primeiros meses de vida dos bezerros em batimento cardíacos por minuto (bpm) – São Paulo – 2010........................................................ Gráfico 2 -. 62. Médias e desvios padrão das frequências respiratórias nos três primeiros meses de vida dos bezerros em movimentos respiratórios por minuto (mr/m) – São Paulo – 2010............................................... Gráfico 3 -. 63. Médias e desvios padrão das temperaturas corpóreas nos três primeiros meses de vida dos bezerros – São Paulo – 2010..................................................................................................... Gráfico 4 -. 64. Valores das médias das células mononucleares, das mononucleares CD14+ e das CD14+ produtoras de peróxido de hidrogênio em amostras do lavado broncoalveolar de bezerros - São Paulo – 2010..................................................................................................... Gráfico 5 -. Valores. das. médias. e. dos. desvios. padrão. das. 72. células. mononucleares, das mononucleares CD14+ e das CD14+ que fagocitaram a SaPI nas amostras do lavado broncoalveolar de bezerros - São Paulo – 2010............................................................... Gráfico 6 -. Valores. das. médias. e. dos. desvios. padrão. das. 76. células. mononucleares, das mononucleares CD14+ e das CD14+ que fagocitaram a E.coli nas amostras de lavado broncoalveolar de bezerros - São Paulo – 2010............................................................... Gráfico 7 -. 79. Valores médios das frações protéicas totalizando o valor da proteína sérica total nos três primeiros meses de vida de bezerros – São Paulo – 2010......................................................................................... 81.

(20) Gráfico 8 -. Médias e desvios padrão das concentrações da imunoglobulina IgA sérica ao longo do tempo – São Paulo – 2010..................................... Gráfico 9 -. Médias e desvios padrão das concentrações da imunoglobulina IgM sérica ao longo do tempo – São Paulo – 2010...................................... Gráfico 10 -. 85. Médias e desvios padrão das concentrações da imunoglobulina IgG2 sérica ao longo do tempo – São Paulo – 2010.......................... Gráfico 12 -. 84. Médias e desvios padrão das concentrações da imunoglobulina IgG1 sérica ao longo do tempo – São Paulo – 2010.......................... Gráfico 11 -. 83. 86. Médias e desvios padrão das porcentagens da imunoglobulina IgA no lavado broncoalveolar de bezerros ao longo do tempo – São Paulo – 2010........................................................................................ Gráfico 13 -. 88. Médias e desvios padrão das porcentagens da imunoglobulina IgM no lavado broncoalveolar de bezerros ao longo do tempo – São Paulo – 2010........................................................................................ Gráfico 14 -. 89. Médias e desvios padrão das porcentagens da imunoglobulina IgG1 no lavado broncoalveolar de bezerros ao longo do tempo – São Paulo – 2010........................................................................................ Gráfico 15 -. 90. Médias e desvios padrão das porcentagens da imunoglobulina IgG2 no lavado broncoalveolar de bezerros ao longo do tempo – São Paulo – 2010........................................................................................ Gráfico 16 -. 91. Correlação entre o comportamento dos teores de imunoglobulinas séricas (mg/dL) e as porcentagens de fagocitose de SaPI, E.coli e produção de peróxido de hidrogênio intracelular por macrófagos (CD14+) do lavado broncoalveolar de bezerros nos três primeiros meses de vida – São Paulo – 2010....................................................... 92.

(21) Gráfico 17 -. Correlação entre o comportamento dos teores de imunoglobulinas séricas (mg/dL) e as intensidades de fagocitose de SAPI, E.coli e de produção de peróxido de hidrogênio intracelular por macrófagos (CD14+) do lavado broncoalveolar de bezerros nos três primeiros meses de vida – São Paulo – 2010....................................................... 93.

(22) LISTA DE QUADROS. Quadro 1 - Distribuição dos momentos experimentais e idade dos bezerros – São Paulo – 2010............................................................................................... 42. Quadro 2 - Limites considerados para inclusão dos animais no estudo – São Paulo – 2010........................................................................................................ Quadro 3 - Fluxograma da exclusão. 43. dos animais durante os momentos. experimentais – São Paulo – 2010............................................................. 44. Quadro 4 - Protocolo dos tubos de calibração e tubos de experimento (anticorpos monoclonais primários e secundários) para realização da quantificação da liberação de peróxido de hidrogênio e de fagocitose das amostras de LBA no Citômetro de fluxo (FACSCaliburTM - Becton Dickinson Immunocytometry SystemTM) – São Paulo – 2010..................................... 50.

(23) LISTA DE FIGURAS Figura 1 -. Identificação das populações de macrófagos alveolares – São Paulo – 2010........................................................................................................ 51. Figura 2 -. Macrófagos alveolares expressando CD14 – São Paulo – 2010............ 51. Figura 3 -. Macrófagos alveolares expressando CD14 que produziram peróxido de hidrogênio – São Paulo – 2010.......................................................... Figura 4 -. Macrófagos alveolares expressando CD14 que fagocitaram SaPI – São Paulo – 2010................................................................................... Figura 5 -. 52. 53. Perfil eletroforético das proteínas séricas: Albumina, alfaglobulina, betaglobulina e gamaglobulina das amostras de soro dos bezerros com até cinco dias de vida – São Paulo – 2010...................................... Figura 6 -. Imagem broncoscópica de vias respiratórias de bezerro hígido aos 48 dias de vida – São Paulo – 2010............................................................. Figura 7 -. 60. Imagem broncoscópica de vias respiratórias de bezerro com secreção aos 24 dias de vida – São Paulo – 2010................................................. Figura 8 -. 58. 60. Exemplos da sequência de identificação das células mononucleares do lavado broncoalveolar de bezerros. A imagem maior indica a seleção das células em relação à população geral de leucócitos. A imagem (a) indica a população que está expressando CD14 dentro da população selecionada na imagem maior. A imagem (b) indica a população CD14+ que está produzindo peróxido de hidrogênio São Paulo – 2010.................................................................................. 71.

(24) Figura 9 -. Exemplos da sequência de identificação das células mononucleares do lavado broncoalveolar de bezerros. A imagem maior indica a seleção das células em relação à população geral de leucócitos. A imagem (a) indica a população que está expressando CD14 dentro da população selecionada na imagem maior. A imagem (b) indica a população CD14+ que fagocitou a SaPI - São Paulo – 2010..................................................................................................... Figura 10 -. 75. Exemplos da sequência de identificação das células mononucleares do lavado broncoalveolar de bezerros. A imagem maior indica a seleção das células em relação à população geral de leucócitos. A imagem (a) indica a população que está expressando CD14 dentro da população selecionada na imagem maior. A imagem (b) indica a população CD14+ que fagocitou a E.coli - São Paulo – 2010.............. 78.

(25) SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO.................................................................................... 27. 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................... 30. 2.1. LAVADO BRONCOALVEOLAR............................................................... 31. 2.2. DEFESA IMUNOLÓGICA........................................................................... 33. 2.2.1. Transferência de imunidade passiva.......................................................... 34. 2.2.2. Avaliação do metabolismo oxidativo e de fagocitose................................ 36. 3. OBJETIVO................................................................................................. 39. 4. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ 41. 4.1. ANIMAIS UTILIZADOS E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL...... 41. 4.2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO AMOSTRAL................................................ 43. 4.2.1. Determinação da proteína total e suas frações.......................................... 43. 4.3. CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO AMOSTRAL............................................... 44. 4.3.1. Exame Clínico.............................................................................................. 44. 4.3.1.1. Exame específico do sistema respiratório..................................................... 45. 4.3.1.2. Inspeção indireta por broncoscopia.............................................................. 45. 4.3.2. Análise hematológica................................................................................... 46. 4.3.3. Colheita de sangue arterial e determinação hemogasométrica............... 46. 4.4. COLHEITA DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)........................ 47. 4.4.1. Isolamento da suspensão celular das amostras LBA................................ 4.4.2. Viabilidade e concentração celular das amostras de LBA....................... 48. 4.5. AVALIAÇÃO IMUNOLÓGICA DO LBA.................................................. 48. 4.5.1. Avaliação funcional dos fagócitos............................................................... 49. 4.5.2. Quantificação e identificação de células mononucleares do LBA........... 49. 4.5.3. Análise da citometria de fluxo.................................................................... 50. 47.

(26) 4.6. PROTEINOGRAMA E ANÁLISE DAS IMUNOGLOBULINAS.............. 53. 4.6.1. Quantificação de imunoglobulinas séricas................................................ 53. 4.6.2. Quantificação de imunoglobulinas do LBA.............................................. 54. 4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................ 54. 5. RESULTADOS............................................................................................ 57. 5.1. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO AMOSTRAL................................................ 57. 5.2. FASE EXPERIMENTAL.............................................................................. 58. 5.2.1. Critérios de Exclusão................................................................................... 58. 5.2.2. Quantificação e identificação de células mononucleares do LBA e avaliação funcional dos fagócitos................................................................ 69. 5.2.3. Proteinograma e análise das imunoglobulinas.......................................... 79. 5.3. ANÁLISE DE CORRELAÇÕES.................................................................. 91. 6. DISCUSSÃO................................................................................................. 95. 6.1. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E MANUTENÇÃO DOS ANIMAIS........... 95. 6.2. RECUPERAÇÃO DE CÉLULAS DO TRATO RESPIRATÓRIO.............. 98. 6.3. IMUNOGLOBULINAS SÉRICAS E DO LBA............................................ 99. 6.4. AVALIAÇÃO DOS FAGÓCITOS PULMONARES................................... 101. 7. CONCLUSÃO.............................................................................................. 107. REFERÊNCIAS........................................................................................... 109.

(27) Introdução.

(28) 1 I n t r o d u ç ã o | 27. 1 INTRODUÇÃO. A bovinocultura tem um impacto importante na econômia brasileira e gerou um lucro bruto de aproximadamente R$ 67 bilhões em 2010. Neste mesmo ano o rebanho composto por 205,3 milhões de bovinos, permitiu um abate de 7,183 milhões de cabeças, e 8,802 mil toneladas de leite foram exportadas (IBGE, 2011). Neste contexto, a perda de bezerros representa um prejuízo considerável, pois além da sua morte comprometer as taxas de reposição, impede o retorno do investimento de sua concepção e nascimento, muitas vezes expressivo. Vários estudos têm sido realizados na fase neonatal (PRINGLE et al., 1988; BORGES et al., 2001; COSTA et al., 2007; SNOWDER et al., 2006; GORDEN; PLUMMER, 2010), a mais crítica para a sobrevivência dos bezerros (PICCIONE et al., 2010), para minimizar. Nessa fase deve ocorrer a adaptação do neonato à vida extrauterina e a necessidade de atender exigências vitais como homeotermia, nutrição e função cardiorespiratória imediatas ao nascimento (KASARI, 1994), representam um estresse natural tornando-os mais susceptíveis a determinadas enfermidades. A superação dessa fase de estresse natural é gradual para muitas funções como, por exemplo, o sistema imune, que adquirirá pleno funcionamento em um momento mais tardio de suas vidas (BENESI, 1993). Ao nascimento o sistema imune está totalmente desenvolvido, mas ainda imaturo (CORTESE, 2009).. Essa imaturidade se reflete na. ocorrência de enfermidades localizadas particularmente sobre determinados órgãos e sistemas, onde o sistema respiratório é frequentemente afetado por enfermidades neonatais (KOTERBA, 1993). Dentre as afecções do sistema respiratório, a mais comum é o Complexo Doença Respiratória ou a Pneumonia Enzoótica (AMES; BAKER; WIKSE, 2006). O complexo constitui uma das maiores causas de perdas econômicas na bovinocultura, no âmbito nacional e internacional, Possui etiologia multifatorial e qualquer estímulo estressante pode afetar adversamente o sistema imune do hospedeiro provocando uma infecção viral primária seguida de infecção bacteriana secundária (LEKEUX, 1994; GONÇALVES et al., 2000; ACKERMANN; DERSCHEID; ROTH, 2010). As broncopneumonias são mais observadas até o quinto mês de idade dos bezerros e apesar de serem bastante associadas à falha de imunidade passiva (GONÇALVES Batista, 2011.

(29) 1 I n t r o d u ç ã o | 28. et al., 2000; AMES; BAKER; WIKSE, 2006), também acometem bezerros que mamaram níveis adequados de colostro (SNOWDER et al., 2006; ACKERMANN; DERSCHEID; ROTH, 2010; GORDEN; PLUMMER, 2010). Os macrófagos alveolares representam a principal defesa celular do pulmão e são responsáveis pela fagocitose de partículas exógenas entre outras mediações inflamatórias. São o tipo celular predominante do trato respiratório de bezerros com mais de uma semana de vida, e guiam a resposta imunológica posterior, recrutando outros tipos celulares e/ou componentes humorais locais ou do sangue (YEO et al.; 1993; ACKERMANN; DERSCHEID; ROTH, 2010). Para este processo ser efetivo, as células das respostas imunes local e sistêmica devem estar ativas. Existem pesquisas estudando a maturidade do sistema imunológico sanguíneo (COSTA et al., 2008; FEITOSA et al., 2003; KAMPEN; TOLLERSRUD; LUND, 2004b), porém são poucos os trabalhos que avaliam a imunologia do sistema respiratório, e quando o fazem, abordam indistintamente neonatos e animais adultos e os relacionam a quadros infecciosos específicos (FAGLIARI, 2003; NIEMCZUK; BEDNAREK, 2003; HAGBERG et al., 2005; GRELL et al., 2005a; GRELL et al., 2005b) ou a fatores que levam a Síndrome do Estresse Respiratório (KARAPINAR; DABAK, 2008; BLEUL, 2009). A função de macrófagos alveolares já foi estudada em leitões (DICKIE et al., 2009), ratos neonatos (BAKKER et al., 1998); hamster adultos (KOBZIK; GODLESKI; BRAIN, 1990) e equinos adultos (RAIDAL; BAILEY; LOVE, 1998a,b). Em bovinos, Gonçalves (1997) e Wachholz (2002) avaliaram o sistema respiratório de bezerros, abordando quantificações celulares mas não suas funções. Bertagnon (2003), estudou a inter-relação das imunoglobulinas séricas e do trato respiratório durante o primeiro mês de vida, período em que ainda há forte influência das imunoglobulinas colostrais. Como a maturação da resposta inata do pulmão de bezerros pode ser gradual, e não há pesquisas avaliando esta dinâmica de maturação em bovinos, o presente trabalho avaliou a função dos macrófagos alveolares e as imunoglobulinas séricas e do lavado broncoalveolar durante os primeiros três meses de vida dos bezerros, com a finalidade de verificar quando esta resposta torna-se efetiva. Essa informação contribuirá para identificar períodos de maior susceptibilidade a infecções respiratórias durante esse período.. Batista, 2011.

(30) Revisão Bibliográfica.

(31) 2 R e v i s ã o B i b l i o g r á f i c a | 30. 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. Durante os primeiros dias de vida, o recém-nascido sofre alterações fisiológicas deixando de ser um feto dependente da circulação materna, onde a troca gasosa ocorria através do cordão umbilical, para um ser autossuficiente (DUNCAN, 1999; BLEUL, 2009). O momento imediatamente após o nascimento é crítico para um ruminante recém-nascido (PICCIONE et al, 2010) e algumas funções, apesar de prontamente adquiridas, são aperfeiçoadas para atingir a plenitude nesse período inicial, classificado como período neonatal. Durante essa fase de adaptação o animal torna-se mais susceptível a enfermidades, pois entre as funções que precisam ser aperfeiçoadas estão as do sistema imune (KOTERBA, 1993; CORTESE, 2009). As doenças do recém-nascido e a mortalidade neonatal são causas importantes de perdas econômicas na produção pecuária (RADOSTITIS et al., 2002, POULSEN; McGUIRK, 2009). O prejuízo causado pela mortalidade perinatal dos bovinos constitui um dos principais problemas da pecuária de leite e de corte em todo o mundo. A mortalidade de bezerros é a segunda principal causa de perda econômica da criação de bovinos nos EUA, sendo superada apenas pelos prejuízos causados por falhas no manejo reprodutivo (KASARI; WIKSE, 1994). De acordo com as observações de Gonçalves et al. (1993) e Benesi (1996), as taxas de mortalidade de bezerros no Brasil podem chegar a 25 % especialmente causadas pelas diarreias e pelas pneumonias. Animais que não receberam um correto fornecimento de colostro estão prejudicados imunologicamente e são mais susceptíveis a doença, essa deficiência imunológica aliada à incorreta desinfecção do umbigo, prática comum na criação de bezerros, os predispõe ao desenvolvimento de pneumonias causadas pela colonização dos pulmões por agentes infecciosos bacterianos que penetraram no organismo por vasos umbilicais patentes (COUTINHO, 2005). Outra particularidade que torna os bovinos mais suscetíveis à pneumonia são as características anatômicas e fisiológicas do trato respiratório, que possui uma grande área de espaço morto e a septação interlobular, reduzindo a oxigenação alveolar e permitindo a permanência mais prolongada de patógenos nas vias aéreas (GONÇALVES et al.; 2000; ACKERMANN; DERSCHEID; ROTH, 2010).. Batista, 2011.

(32) 2 R e v i s ã o B i b l i o g r á f i c a | 31. A broncopneumonia é o problema respiratório mais frequente em bezerros, com incidência de 8,7% (TAVERA et al., 1982) a 15% (ANDREWS et al., 1981), sendo responsável por 24,63% das mortes em bezerros com até 90 dias de idade (SANTRA; PACHALAG, 1996). No Brasil, como em outros países em que a criação bovina é significativa, as maiores taxas de mortalidade de bezerros são registradas ao longo do primeiro mês de vida (BENESI, 1993), sendo a broncopneumonia considerada como um problema de grande relevância, atingindo 12,7 % de bezerros criados em sistema extensivo (BARROS et al., 1994), e constituindo entre 13 % (GONÇALVES; KUCHEMBUCK; ALMEIDA, 1990) e 23,9 % das afecções que acometem bezerros com até 1 ano de idade (RABELO et al., 1996). A visão clínica moderna obriga o médico veterinário a trabalhar com relação custo-benefício, de maneira que quanto mais acurado e precoce o diagnóstico clínico, menos dispendioso é o tratamento (GONÇALVES et al., 2001) e maiores serão as chances de cura do animal e menores serão os prejuízos para o produtor. Assim, uma forma de minimizar essas taxas é representada pela adequada avaliação clínica dos neonatos, de modo a fundamentar correta e precocemente o diagnóstico dessas doenças (KOTERBA, 1993; STÖBER, 1993; GONÇALVES; FEITOSA, 2008).. 2.1 LAVADO BRONCOALVEOLAR. Bezerros. neonatos. apresentam. evolução. rápida. nos. quadros. de. broncopneumonias, muitas vezes animais aparentemente sadios podem apresentar alterações nas vias respiratórias posteriores, não sendo possível estabelecer o diagnóstico correto e precoce apenas com métodos semiológicos tradicionais (KOTERBA, 1993). Apesar dos métodos semiológicos diretos fundamentarem o exame clínico, métodos indiretos, principalmente de inspeção, aumentam a precisão do diagnóstico. Para confirmar e reforçar o exame físico e a inspeção direta, lançamos mão dos exames complementares. Esses exames auxiliam na detecção de agentes infecciosos, no delineamento do perfil de resposta do sistema respiratório, no grau da lesão, no local acometido, facilitando a escolha do tratamento e a obtenção de um prognóstico mais preciso (GONÇALVES, 1997; FRANZ, 2008; GONÇALVES; FEITOSA, 2008; COOPER; BRODERSEN, 2010). Batista, 2011.

(33) 2 R e v i s ã o B i b l i o g r á f i c a | 32. No âmbito das doenças respiratórias, as análises microbiológica, citológicas e imunológicas das secreções do trato respiratório constitui um método importante na elucidação do estado funcional pulmonar, uma vez que o sucesso do tratamento da doença está intimamente relacionado com o seu diagnóstico precoce e reconhecimento de seu agente etiológico (PRINGLE et al., 1988; GONÇALVES, 1997; NOGUEIRA; PARDO, 2001). Pringle et al. (1988), chegaram à mesma conclusão trabalhando com bezerros holandeses considerados sadios por meio dos exames clinico geral do trato respiratório, radiografia torácica, hemograma completo e citologia do lavado broncoalveolar. Exames como a análise de lavado traqueobrônquico e/ou broncoalveolar permitem estabelecer diagnóstico mais eficiente e precoce de alterações do trato respiratório. A obtenção do lavado broncoalveolar (LBA) é fácil de ser realizado e pode ser repetido várias vezes para avaliar a saúde pulmonar em bezerros (ALLEN et al., 1992). Em bovinos, a técnica para a obtenção de lavado broncoalveolar foi descrita pela primeira vez em um isolado de pulmão por Fox (1973). Tal procedimento atualmente é utilizado corriqueiramente para a recuperação de macrófagos alveolares. A partir do final dos anos 70 e início dos anos 80 (WILKIE; MARKHAM, 1979; WILKIE et al., 1980; WILKIE; MARKHAM, 1981) as técnicas de broncoscopias começaram a ser utilizadas para a realização de lavados broncoalveolares (PRINGLE et al., 1988; ALLEN et al., 1991). Essa técnica é excelente por permitir direcionar e selecionar os locais de lavagem, além de proporcionar a visão direta das vias aéreas (THRUNAVUKKARASU et al., 2005). Essa visualização direta pode facilitar a interpretação das alterações patológicas, importante não só para o diagnóstico, mas também contribuem no prognóstico e monitorização de terapias (STIERSCHNEIDER; FRANZ; BAUMGARTNER, 2007). Na medicina humana é uma técnica rotineira e segura (European Society of Pneumology Task Group on BAL, 1989; American Thoracic Society, 1990) e é a mais indicada para a realização da coleta de LBA, inclusive em animais de outras espécies (PETERSON et al., 1990; GRIFFITH et al., 2004) e não causa alterações nos componentes do LBA, mesmo quando realizada repetidas vezes (MUGGENBURG et al., 1980; BEGIN et al., 1981). Entretanto o custo elevado da aparelhagem para utilização desse método, local apropriado para sua aplicação e necessidade de habilidade profissional para seu manuseio, são fatores limitantes para o uso rotineiro por profissionais de campo (GONÇALVES, 1997).. Batista, 2011.

(34) 2 R e v i s ã o B i b l i o g r á f i c a | 33. 2.2 DEFESA IMUNOLÓGICA. O termo imunidade é derivado da palavra latina immunitas, que se refere à proteção contra processos legais que os senadores romanos tinham durante o seu mandato. Historicamente, imunidade significa proteção contra doenças, e a função fisiológica do sistema imunológico é a defesa contra microrganismos infecciosos, embora, até mesmo substâncias estranhas não infecciosas possam desencadear uma resposta imunológica (ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2008). Os microrganismos com os quais um indivíduo saudável se depara, ocasionalmente causam enfermidades perceptíveis. A maior parte é detectada e destruída em pouco tempo por mecanismos de defesa que não requerem um longo período de indução (AZEDO, 2007). A defesa contra microrganismos é mediada pelas reações iniciais da imunidade natural e as respostas tardias da imunidade adquirida. A imunidade natural ou imunidade inata é a linha de defesa inicial contra os microrganismos celulares e bioquímicos que já existiam antes do estabelecimento de uma infecção e que estão programados para responder rapidamente a infecções (ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2008; TIZARD, 2009). O sistema imune inato não tem memória, portanto cada infecção é tratada da mesma maneira e intensidade, não importando a frequência com que encontre o patógeno, porém está sempre pronto para atuar quando encontrar um invasor (TIZARD, 2009). Paralelamente a esta primeira tentativa de eliminação do patógeno é estimulada uma resposta imunológica adaptativa, com geração de células efetoras antígeno-específicas e de células de memória que podem prevenir uma infecção pelo mesmo microrganismo (ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2008). Entretanto, essa resposta adaptativa necessita de muitos mecanismos efetores utilizados pelo sistema imunológico inato (JANEWAY et al., 2004). Ao nascimento o sistema imune está totalmente desenvolvido, porém imaturo (HAUSER; KOOB; ROTH, 1986; PHIPPS et al., 1989; WONG; YEATES, 1990; YEO et al., 1993; CORTESE, 2009; TIZARD, 2009), há uma lenta maturação do sistema imune em mamíferos, e nos bovinos a maior parte da maturidade do sistema imune é observada por volta de 5 a 8 meses de idade (CORTESE, 2009). Após o nascimento, em um intervalo muito curto de tempo, o neonato tem que assumir controle de suas trocas gasosas, eliminar seus próprios excrementos, controlar a sua Batista, 2011.

(35) 2 R e v i s ã o B i b l i o g r á f i c a | 34. temperatura e seu fluxo sanguíneo e ainda procurar comida (ALVARENGA et al., 2006). Todas essas necessidades representam um estresse natural tornando-os susceptíveis às doenças que tornam-se características do período. A imaturidade do sistema imune se reflete na ocorrência de enfermidades localizadas particularmente sobre determinados órgãos e sistemas. O sistema respiratório é frequentemente afetado por enfermidades no período neonatal, seja por condições primárias ou secundárias, redundando no prejuízo direto de sua função, com evolução para a morte dos animais afetados, ou então, em um desenvolvimento retardado de animais sobreviventes, com perdas econômicas consideráveis (KOTERBA, 1993). Indiscutivelmente, a função mais importante que o bezerro recém-nascido deve dominar é o início da respiração e subsequente oxigenação do sangue (KASARI, 1994) e para realizar tal função é necessário um sistema imune local adequado que mantenha um ambiente saudável capaz de realizar as trocas gasosas. A defesa do sistema respiratório começa através das barreiras físicas impostas pela anatomia do animal, as partículas maiores são filtradas na cavidade nasal e as menores que conseguem atingir os pulmões são submetidas às barreiras da própria mucosa do trato respiratório e ainda à eliminação por reflexo da tosse e espirros. As partículas depositadas na zona coberta por cílios são removidas pelo mecanismo de limpeza mucociliar (ALBERTS et al., 2002; GONÇALVES; FEITOSA, 2004), partículas menores que conseguem ultrapassar essa barreira são ingeridas pelos macrófagos alveolares (TIZARD, 2009). Os macrófagos alveolares residentes representam a principal defesa celular do pulmão e são responsáveis pela fagocitose de partículas exógenas entre outras mediações inflamatórias mantendo a homeostase imunológica no pulmão (BILYK; HOLT, 1993; LOHMANN-MATTHES; STEINMÜLLER; FRANKE-ULLMANN, 1994). Segundo Yeo, et al. (1993) os macrófagos são predominantes em bezerros com mais de uma semana de vida. Em segundo lugar encontramos os neutrófilos que são mais ágeis na fagocitose e morte bacteriana que os macrófagos, porém liberam produtos reativos que podem causar injúrias teciduais. Os anticorpos também estão presentes auxiliando na defesa pulmonar, existindo grande secreção de imunoglobulinas (GONÇALVES; FEITOSA, 2008).. 2.2.1 Transferência de imunidade passiva. Batista, 2011.

(36) 2 R e v i s ã o B i b l i o g r á f i c a | 35. A importância da correta transferência de imunidade passiva através da ingestão do colostro foram bem estabelecidas por diversos autores (BENESI, 1992; FEITOSA, 1998; BORGES et al., 2001), uma vez que o neonato não apresenta imunidade específica, isso ocorre por causa do tipo de placentação do ruminante, que é do tipo sindesmocorial; ou seja, o epitélio coriônico fica em contato direto com os tecidos uterinos. Esse tipo de placenta impossibilita totalmente a passagem transplacentária das moléculas de imunoglobulinas (TIZARD, 2009). Durante a mamada do colostro nas primeiras horas de vida, as proteínas nele presentes são absorvidas pelo trato gastrointestinal do bezerro. Com a ingestão do colostro, ocorre um rápido aumento na quantidade de proteínas séricas do bezerro, principalmente as frações globulinas, como resultado da absorção das imunoglobulinas maternais (COSTA et al., 2007). Para garantir uma eficiente imunidade os animais precisam de uma quantidade adequada de proteínas, entretanto existe uma enorme discordância de opiniões entre vários autores quanto à definição de um valor ideal de proteína total, da concentração de imunoglobulinas e da atividade da GGT no soro de bezerros recém-nascidos (FEITOSA et al., 2001b). A maioria gira em torno dos 4,5 e 5,0 g/dL para proteína total, 1,0 a 1,5 g/dL para gamaglobulina e 800 e 1500 mg/dL para IgG, conforme dados apresentados por Feitosa et al. (2010). Proteínas totais séricas são compostas por um grande número individual de proteínas com cargas elétricas, pesos moleculares e funções diferentes. Os principais grupos com as respectivas funções são albumina, regula pressão osmótica sanguínea e transporta substâncias no sangue, alfa e betaglobulinas agem como imunomoduladores inatos e gamaglobulinas que são os anticorpos IgG, IgM e IgA (ECKERSALL, 2004). Os valores de proteína total e de suas frações eletroforéticas podem variar de acordo com a idade dos animais (BORGES et al., 2001; FEITOSA et al., 2001b; LEAL et al., 2003; COSTA et al., 2007) e com a quantidade de proteína ingerida na dieta (COSTA et al., 2007). Na fase neonatal, a proteção pulmonar é bastante dependente das imunoglobulinas colostrais, pois durante a gestação não ocorre passagem de imunoglobulinas da vaca para o bezerro através da placenta e o líquido pulmonar fetal, que mantém o ambiente pulmonar protegido, é reabsorvido no momento do parto (BLAND, 1998; BLOOD; RADOSTITS, 1989; SEGRE, 2002). Batista, 2011.

(37) 2 R e v i s ã o B i b l i o g r á f i c a | 36. As imunoglobulinas presentes no colostro são a IgG, sendo que a IgG1 constitui 70 a 80 % das imunoglobulinas totais (CORTESE, 2009), a IgM (10-15 %) e a IgA (10-15 %). A IgG tem como função identificar e destruir possíveis patógenos, a IgM funciona como primeira defesa nos casos septicêmicos e a IgA atua na proteção das mucosas prevenindo a adesão de patógenos (TIZARD, 2009). Parte dessas imunoglobulinas séricas é transferida para o trato respiratório com a finalidade de garantir proteção local (MAYER, 2003). Essas estão presentes na sua maioria na forma de IgG (PRINGLE et al., 1988; BERTAGNON et al., 2007; TIZARD, 2009) e caso ocorra colonização pulmonar nesse período, a quantidade de IgA se eleva (WILKIE, 1982).. 2.2.2 Avaliação do metabolismo oxidativo e de fagocitose. Os fagócitos mononucleares e os neutrófilos quando recebem estímulos de membrana ou quando realizam fagocitose apresentam aumento do consumo de oxigênio, conhecido como burst respiratório que produz uma grande quantidade de superóxido e peróxido de hidrogênio, dos quais derivam metabólitos oxidantes, este processo é benéfico quando direcionado para a eliminação de bactérias internalizadas, mas pode ser prejudicial quando células e tecidos adjacentes são afetados (KLEBANOFF, 1980). O metabolismo oxidativo de leucócitos pode ser monitorado através de ensaios de consumo de oxigênio, como o shunt de hexose monofosfato (HMPS), geração de radicais oxidativos, geração de produtos reduzidos como, por exemplo, a redução do corante tetrazólio (NBT). Entretanto essas técnicas geralmente necessitam de isolamento das populações celulares e pode apresentar uma fonte de variação entre os ensaios (KAMPEM et al., 2004). O ensaio ideal para a avaliação da atividade oxidativa de leucócitos requer um volume pequeno de amostras, deve ser simples e prover resultados quantitativos e qualitativos de muitas células individualmente e sem a necessidade de isolamento das populações leucocitárias (VOWELLS et al., 1995). Para tal, uma opção é o uso de métodos fluorescentes para quantificar a produção desses radicais oxidativo através da citometria de fluxo. Citometria de fluxo é uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente (tamanho e complexidade interna), através de um aparelho de Batista, 2011.

(38) 2 R e v i s ã o B i b l i o g r á f i c a | 37. detecção óptico-eletrônico que possibilitam a mensuração da fluorescência emitida individualmente pelas células (MCCOY, 1994). Para medir a geração de peróxido de hidrogênio (H 2O2), Bass et al. (1983) utilizaram o diacetato de 2,7-Diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), que ao entrarem no citoplasma das células são hidrolisados e deixam livres as moléculas DCFH que tornam-se substrato para o H2O2. Essa oxidação gera 2,7-Diclorofluoresceína (DCF) que emite fluorescência verde (BASS et al., 1983). Fagocitose é um mecanismo de defesa imune inata pelo qual certas células como os macrófagos e neutrófilos englobam grandes partículas (UNDERHILL; OZINSKY, 2002; ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2008). Ensaios de fagocitose por citometria de fluxo podem ser usados para avaliar a proporção. de células capazes. de interagir com. as. partículas fluorescentes marcadas. (CANTINIEAUX, 1989; RAIDAL; BAILEY; LOVE, 1998a; LEHMANN; SORNES; HALSTENSEN, 2000). Uma ampla variedade de métodos utilizando a citometria de fluxo para avaliar simultaneamente a fagocitose e o metabolismo oxidativo no sangue de humanos tem sido realizada (LEHMANN; STEINAR; HALSTENSEN, 2000; SILVEIRA, 2004; SOH, 2006), ensaios também realizados em equinos (FLAMINIO et al., 2000; MASSOCO; PALERMO NETO, 2003) e em bovinos (AZEDO, 2007; BOHLAND, 2008; SOUZA, 2010; BLAGITZ, 2011) e em amostras de leite bovino (BLAGITZ, 2011). Alguns estudos avaliam células de lavado broncoalveolar, principalmente em humanos (LOHMEYER et al., 1994; GARN, 2006; GUTH et al.; 2009) e em equinos (RAIDAL; BAILEY; LOVE, 1998a; FLAMINIO et al., 2000), mas poucos em bovinos (SOETHOUT et al., 2004) e até onde se sabe nenhum que avalie dinamicamente essas células durante o período de imunidade passiva do animal.. Batista, 2011.

(39) Objetivo.

(40) 3 Objet ivo| 39. 3 OBJETIVO. Estudar a dinâmica imunológica inata do sistema respiratório de bezerros sadios nos três primeiros meses de vida.. Batista, 2011.

(41) Material e Métodos.

(42) 4 M a t e r i a l e M é t o d o s | 41. 4 MATERIAL E MÉTODOS. O projeto desenvolvido foi aprovado pela Comissão de Bioética da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, em 21 de janeiro de 2009, protocolado sob o nº 1591/2009. Para execução do projeto, as avaliações da resposta imune do sistema respiratório de bezerros foram balizadas pelos critérios de inclusão amostral descritos a seguir (4.2) e em cada momento amostral foram considerados critérios de exclusão amostral para limitar à higidez dos mesmos (4.3).. 4.1 ANIMAIS UTILIZADOS E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL. Inicialmente foram utilizados 14 bezerros machos da raça Holandesa preto e branco, provenientes de propriedades leiteiras localizadas no Estado de São Paulo para a realização da pesquisa, sendo que nove completaram as avaliações durante os primeiros três meses de vida. Foi considerado como principal critério de inclusão amostral a adequada transferência de imunidade passiva. Os animais incluídos no estudo receberam adequada quantidade de colostro (10% do peso vivo), verificado por determinação da proteína sérica total e pela separação das frações proteicas do soro sanguíneo por meio do método eletroforético (Friedman, 1961). Uma vez incluídos na pesquisa esses animais foram pesados, examinados clinicamente e monitorados periodicamente durante o experimento de acordo com os momentos experimentais (quadro 1). Durante o presente estudo, os bezerros foram instalados no Setor Experimental da Clínica de Bovinos e Pequenos Ruminantes do Hospital Veterinário da FMVZ/USP, inicialmente em gaiolas de ferro, individuais, suspensas, medindo 1,40 cm de largura, por 1,47 cm de comprimento e 72 cm de altura. Após completarem um mês de vida foram tranferidos para baias medindo 137,5 cm de largura, por 200 cm de comprimento e com piso elevado de madeira. A limpeza e desinfecção do local eram realizadas diariamente e repetida sempre que necessário, com a utilização de solução de hipoclorito (10%) e formaldeído Batista, 2011.

(43) 4 M a t e r i a l e M é t o d o s | 42. (7,99%). Durante o dia os animais permaneciam soltos em local acimentado e com incidência de sol. O manejo nutricional consistiu da ingestão inicial de leite integral em pó1 e a partir de 21 dias de vida o fornecimento de sucedâneo2, sendo fornecidos dois litros de sucedâneo lacteo ou leite pela manhã e igual volume à tarde em mamadeiras. Foi mantido continuamente o fornecimento de água, ração inicial peletizada3, sal mineral4 e feno ad libitum. Estes animais tiveram sua função imune respiratória avaliada em oito momentos, conforme descrito no quadro 1, por meio das amostras de lavado broncoalveolar (LBA), nas quais foram realizadas quantificação das populações leucocitárias, avaliação funcional das células da linhagem fagocítica, e a determinação de imunoglobulinas. Nesses momentos, procedia-se também a avaliação do hemograma, da hemogasometria, a determinação de proteína sérica total, das frações proteicas e das taxas de imunoglobulinas (IgA, IgM, IgG1 e IgG2) séricas.. Momento. Idade. 1º. 1º semana de vida. 2º. 8º ao 14º dia de vida. 3º. 15º ao 22º dia de vida. 4º. 23º ao 30º dia de vida. 5º. 31º ao 40º dia de vida. 6º. 41º ao 50º dia de vida. 7º. 51º ao 60º dia de vida. 8º. 90º dia de vida. Quadro 1 - Distribuição dos momentos experimentais e idade dos bezerros – São Paulo – 2010. 1. Heloisa®, Italac® Lacthor® Tortuga, Bovilac® Nutron 3 Ração Ternerina® com 40kg- Marca Purina 4 Purina Gold® com 30kg- Marca Purina 2. Batista, 2011.

(44) 4 M a t e r i a l e M é t o d o s | 43. 4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO AMOSTRAL. Foi utilizado como critério de inclusão amostral a adequada transferência de imunidade passiva, baseado nos valores apresentados no quadro 2 para as variáveis de proteína sérica total e sua fração gamaglobulina.. Valores. Proteína Total (Smith, 2002) ≥ 5,0 g/dL. Gamaglobulina (Feitosa et al., 2001) ≥ 1,0 g/dL. Quadro 2 – Limites considerados para inclusão dos animais no estudo – São Paulo – 2010. 4.2.1 Determinação da proteína total e suas frações. Foi colhida, de cada animal, uma amostra de sangue, utilizando sistema a vácuo5, com agulhas para múltiplas colheitas 25 x 8 mm por venopunção jugular, em tubo siliconizado, sem anticoagulante, com capacidade de 10 mL. Após a coagulação do sangue e retração do coágulo, as amostras foram centrifugadas6 a 2265 G por 10 minutos para obtenção do soro sanguíneo. Para a determinação da proteína total foram utilizados 300 µL de soro sanguíneo em analisador bioquímico automático7 pelo método do biureto (GORNALL; BARDAWILL; DAVID, 1949). A separação das frações proteicas do soro sanguíneo foi realizada por meio do método eletroforético de acordo com Friedman (1961) em fita de acetato de celulose. A leitura foi realizada em software SilverFast Ai e o cálculo das frações separadas pela eletroforese (albumina, alfa, beta e gama globulinas) foram realizadas pelo programa VisionWorks®LS Image Analysis Software.. 5. Sistema Vacuntainer® - Becton DickinsonTM, SanDiego, CA. Centrifuga CELM LS-3 Plus 7 Labtest – Tokyo Boeki – Labmax 240 6. Batista, 2011.

(45) 4 M a t e r i a l e M é t o d o s | 44. 4.3 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO AMOSTRAL. Durante a fase experimental, utilizou-se como critério de exclusão amostral, o exame físico, o hemograma e a hemogasometria. Caso alguma alteração fosse encontrada, os animais eram excluídos do momento amostral. A exclusão dos animais dos momentos experimentais ocorreu de acordo com o quadro 3.. Quadro 3 - Fluxograma da exclusão dos animais durante os momentos experimentais – São Paulo – 2010. 4.3.1 Exame Clínico. Os animais foram avaliados pelos métodos semiológicos classicamente preconizados por Dirksen (1993), na qual foram realizadas as avaliações das funções vitais constituídas por frequências respiratória e cardíaca, temperatura corporal, estado de hidratação, coloração das mucosas aparentes e palpação de linfonodos; além de caracterização das fezes e acompanhamento do processo de cicatrização do umbigo, sendo que os umbigos, ainda em processo de cicatrização, eram higienizados diariamente com tintura de iodo a 2%8 até a completa cicatrização deste. Posteriormente, foi realizado o exame específico do sistema respiratório, com o. 8. Tintura de Iodo a 2% - Miyako Batista, 2011.

(46) 4 M a t e r i a l e M é t o d o s | 45. emprego dos diferentes meios semiológicos como a inspeção, palpação, percussão, auscultação e olfação (GONÇALVES; FEITOSA, 2008).. 4.3.1.1 Exame específico do sistema respiratório. Na inspeção direta do sistema respiratório dos animais avaliou-se a frequência, o tipo e o ritmo respiratório. Em seguida foi realizada a inspeção nasal, observando a presença de secreção, umidade do muflo e coloração da mucosa. O exame foi seguido pela palpação, verificando-se a velocidade e temperatura do fluxo de ar expirado, reflexo da tosse e palpação do tórax. A percussão foi realizada dos seios paranasais até porção final de tórax. Foi realizada a auscultação de vias anteriores e de campos pulmonares, o exame foi realizado no sentido cranio-caudal e dorso-ventral da região torácica de cada animal. E por fim foi realizada a olfação, observando o odor da expiração.. 4.3.1.2 Inspeção indireta por broncoscopia. A inspeção indireta do sistema respiratório foi realizada por meio de broncoscopia, utilizando um videogastroscópio flexível9, com 8,2 mm de diâmetro e comprimento de trabalho de 1100 mm, acoplado a uma processadora de imagens com fonte de luz10. O exame foi realizado por via nasofaríngea, diferentemente do proposto inicialmente, para aumentar a segurança do manipulador, do animal e do aparelho, onde se observou toda a via aérea até a região de brônquios principais. Para realização do exame, cada animal foi previamente sedado com 0,02 mg/kg de xilazina11 por via intramuscular, após a sedação foi instilado na narina do animal lidocaína em. 9. EG-250PE5, Fujinon® System 2200 Processador, Fujinon® 11 Calmiun® 2%, Agener União Saúde Animal 10. Batista, 2011.

(47) 4 M a t e r i a l e M é t o d o s | 46. spray12 e o aparelho foi lubrificado com lidocaína em gel13.. 4.3.2 Análise hematológica. Foi colhida de cada bezerro uma amostra de sangue em tubo siliconizado com EDTA. 14. dipotássico, com capacidade de 4 mL, para a realização de hemograma em cada. momento. O número total de leucócitos e de eritrócitos por microlitro foi mensurado através de analisador automático de hematologia15. A contagem diferencial foi feita por esfregaços sanguíneos corados pela técnica de Rosenfeld (1947) para a diferenciação do padrão leucocitário ao microscópio óptico16 com objetiva de imersão e aumento de 1000x, sendo identificados e contados 100 leucócitos, conforme metodologia descrita por Birgel (1982).. 4.3.3 Colheita de sangue arterial e determinação hemogasométrica. Para a determinação hemogasométrica foi colhido de cada animal 0,5 mL de sangue arterial por punção da artéria auricular caudal. O sangue foi colhido em seringa previamente umedecida com solução de heparina sódica17 e foram tomados todos os cuidados para a manutenção da anaerobiose durante a colheita e conservação das amostras até a determinação hemogasométrica de acordo com as recomendações propostas por Fisher et al. (1980) e Lisboa et al. (2001). Em até duas horas após a colheita, as amostras foram processadas em analisador automático18 de pH e gases sanguíneos, conforme metodologia descrita por Clark (1956).. 12. Xylestesin Spray 10%®, Cristália. Xylestesin Geléia 2%®, Cristália. 14 Ethylenediamine tetraacetic acid - ácido etilenodiamino tetra-acético 15 BC2800Vet® - Mindray 16 Nikon® ECLIPSE E200 16 Nikon® ECLIPSE E200 17 Liquemine – ROCHE Químicos e Farmacêuticos S.A. 18 Hemogasômetro ABL 05, Radiometer, Copenhagen 13. Batista, 2011.

(48) 4 M a t e r i a l e M é t o d o s | 47. 4.4 COLHEITA DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA). Durante a inspeção indireta pela endoscopia foi realizado o lavado broncoalveolar (LBA). Como descrito anteriormente o exame foi realizado por via nasofaríngea, utilizando um videogastroscópio flexível9. Os animais foram posicionados em decúbito esternal e introduziu-se o videogastroscópio pela cavidade nasal, até chegar aos brônquios finais. Após a inspeção do aparelho respiratório foi instilado através do canal de trabalho 60 mL de Solução Fisiológica estéril, dividida em três seringas com capacidade de 20 mL. Em seguida esse material foi aspirado pelo próprio canal de trabalho, com auxílio de um aspirador19, recuperando aproximadamente 50 mL de LBA. O material coletado foi acondicionado em dois tubos do tipo Falcon de 50 mL e colocado em isopor com gelo até ser encaminhado para o laboratório, medidas essas tomadas para manter a viabilidade das células recuperadas, as amostras foram processadas em até quatro horas após a colheita. Dessas amostras foi realizada a quantificação e identificação de células mononucleares do LBA e avaliação funcional dos fagócitos.. 4.4.1 Isolamento da suspensão celular das amostras de LBA. No laboratório, as amostras de LBA foram centrifugadas20 a 1000 g por 15 minutos (4°C). Após a centrifugação, o sobrenadante foi armazenado em tubos cônicos e congelado para posterior quantificação de imunoglobulinas. O botão celular, conservado na superfície inferior do frasco, foi removido através de aspersão gentil de aproximadamente 30 mL de PBS21 e a centrifugação foi repetida desta vez a 400 g por 10 minutos (4°C). Após desprezar o sobrenadante, as células foram ressuspendidas em um mL de meio de cultivo. 19. Aspiramax Suction device compacto MA-520 ®– NS Indústria de Aparelhos Médicos Ltda. Eppendorf® Centrifuge 5810R 21 Phosphate Buffered Saline – Tampão Fosfato Salino 20. Batista, 2011.