UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS FÍSICAS E MATEMATICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA QMC5515 – Estágio Supervisionado
RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO DESENVOLVIDO EM LABORATÓRIO CENTRAL DE SAÚDE PÚBLICA – LACEN
FLORIANÓPOLIS- SC
BÁRBARA MAGNUS
Florianópolis Novembro/2020
BÁRBARA MAGNUS
Acompanhamento da Rotina Laboratorial e Adaptação de Método para
Determinação de resíduos e contaminantes compostos voláteis em água por GC-MS/MS
Relatório de Estágio Supervisionado (QMC 5515) apresentado ao Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção do Título de Bacharel em Química Tecnológica. Desenvolvido no Laboratório Central de Saúde Pública - LACEN em Florianópolis.
Orientador: Ricardo F. Affeldt Supervisora: Gisele Olivo
Florianópolis - SC Novembro/2020
AGRADECIMENTOS
À Gisele minha supervisora, pela paciência e pelo aprendizado, à Jéssica do RH pela oportunidade de realizar estágio no LACEN. Aos meus colegas do setor Jaylei, Roberta e a Vânia pelas tarefas extras. A Sabrina e a Cris pelas risadas nos almoços. Ao
A todos os meus amigos (ver no TCC 2 a dedicatória).
A UFSC pela oportunidade de estudar em umas das universidades mais bem avaliadas do Brasil, a PRAE pelo apoio financeiro durante toda a graduação.
SUMÁRIO
1. JUSTIFICATIVA ... 10
2. APRESENTAÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO ... 11
3. REVISÃO DA LITERATURA ... 12
3.1. Contaminantes Orgânicos e produtos secundários da desinfecção ... 12
3.2. Toxicologia ... 15
3.3. Legislação ... 15
3.4. Preparo de amostras ... 16
3.4.1. Microextração em fase sólida (SPME) ... 18
3.4.2. Extração gasosa: Headspace Purge and trap... 18
3.4.3. Comparação SPME e P&T ... 19
3.5. Cromatografia gasosa ... 19
3.5.1. Cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas ... 20
4. OBJETIVOS ... 23
4.1. Objetivo Geral ... 23
4.2. Objetivos específicos ... 23
5. METODOLOGIA ... 24
5.1. Acompanhamento da Determinação de Resíduos de Agrotóxicos por SPME ... 24
5.2. Adaptação da metodologia de purge and trap para novos analitos ... 26
5.2.1. Materiais e reagentes ... 26
5.2.2. Amostras ... 26
5.2.3. Instrumentação e condições cromatográficas ... 26
5.3. Segurança no trabalho ... 29
6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NO ESTÁGIO ... 30
6.1. Acompanhamento da Determinação de Resíduos de Agrotóxicos por SPME ... 30
6.2. Adaptação da metodologia de purge and trap para novos analitos ... 30
6.2.1. Amostras ... 34
7. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS ... 38
8. CONTRIBUIÇÃO DO ESTÁGIO Á FORMAÇÃO PROFISSIONAL ... 39
LISTAS DE ABREVIATURAS
ANOVA- análise de variância
COBIO - Coordenadoria de Biossegurança
DBP - Subprodutos da Desinfecção (do inglês -disinfection by products) INCQS - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
GCMS-TQ (do inglês - Gas Chromatography Mass Spectrometry Triple Quadrupole) HS -headspace (do inglês headspace)
P&T- Purge and Trap PPB -Partes por bilhão LD – Limite de Detecção LQ – Limite de Quantificação
LACEN – Laboratório Central de Saúde Pública MON - matéria orgânica natural (MON)
SES/SC -Secretaria de Estado da Saúde de Santa Catarina SISLAB -Sistema Nacional de Laboratórios de Saúde Pública SPE - Extração em Fase Sólida (do inglês Solid Phase Extraction)
SPME - Microextração em Fase Sólida (do inglês– solid phase microextraction) SUS - Sistema Único de Saúde
THM - Trihalometanos
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática de formação de THM. Figura 2. Esquema representando um cromatógrafo a gás.
Figura 3. Configuração dos filtros de massas para Triplo Quadrupolo - (TQ-MS). Figura 4. GC-MS/MS com amostrador automatizado AOC-6000®.
Figura 6. Cromatograma obtido por GC-MS/MS a partir de um mix de compostos orgânicos e THM no modo SCAN, utilizando o procedimento de extração purge and trap.
Figura 7. Cromatograma dividido em duas partes: A parte A até 9 min que permite verificar a presença de THM e alguns compostos orgânicos e após o tempo de 9min, a presença de apenas compostos aromáticos.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Propriedades físico-químicas de compostos orgânicos voláteis. Tabela 2. Valor Máximo Permitido em diferentes países.
Tabela 3 – Rampa de temperatura utilizada no método de determinação de resíduos de agrotóxicos em água.
Tabela 4 – Configuração do método de corrida para aquisição de dados MRM.
Tabela 5 – Rampa de temperatura utilizada no método de determinação de resíduos de agrotóxicos em água.
Tabela 6 – Configuração do método de corrida para aquisição de dados SIM Tabela 7. Parâmetros analíticos para os compostos analisados
Tabela 8. Resultados obtidos através de ensaios de recuperação para a avaliação da exatidão e precisão do método desenvolvido.
LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1. Formação do clorofórmio através de uma cetona.
RESUMO
A geração de subprodutos da cloração da água e da indústria em geral, é um problema que vem sendo relatado há um tempo. A vista disso, o monitoramento do padrão da qualidade da água se faz necessário, pelas questões toxicológicas dos compostos analisados em relação a saúde pública, prevista na Portaria de Consolidação nº 5 de 2017. O presente trabalho reporta o acompanhamento da rotina laboratorial de um setor especializado em análise de resíduos e contaminantes e a adaptação de um método para análises desses compostos, os VOC’s. As análises são feitas pela técnica de extração Purge and Trap acoplada a um espectrômetro de massas (GC-MS/MS). Esta técnica e outras reportadas neste trabalho, fazem parte do SEARC. Através da adaptação do método se obteve resultados provenientes das amostras de água de filtros e bebedouros. Os resultados foram bastante satisfatórios, e mostraram uma grande redução com o uso, quando se compara a água da torneira. Os modelos de filtros de barro analisados se mostraram ineficientes para eliminar esse tipo de composto da água. Além desses projetos, foram realizadas outras atividades durante o período de estágio. Assim é possível notar que o estágio é uma etapa importante, pois agrega conhecimento e experiência a um químico da área tecnológica.
10 1. JUSTIFICATIVA
O controle e vigilância da qualidade da água para o consumo humano e o seu padrão de potabilidade está previsto no anexo XX da Portaria de Consolidação nº 5 de 2017. A competência dos resultados emitidos é assegurada por laboratórios que tem implementada a ABNT NBR ISO/IEC 17025, que estabelece as diretrizes e requisitos para laboratórios de ensaio e calibração.
O Laboratório Central (LACEN) é um laboratório de referência estadual integrante ao Sistema Nacional de Laboratórios de Saúde Pública (SISLAB) que é uma rede de laboratórios nacionais, que executa ações em conformidade com os princípios estabelecidos pelo Sistema Único de Saúde (SUS). No estágio atuei no Setor de Análises de Resíduos e Contaminantes (SEARC) onde se executam ensaios em matrizes de água, a fim de determinar agrotóxicos, poluentes orgânicos e produtos secundários da desinfecção através de técnicas analíticas.
Desta forma se considera importante o monitoramento da exposição das pessoas à essas classes de substâncias tóxicas, através de ingestão de água contaminada e por este motivo se faz necessário o acompanhamento e que sejam estabelecidos parâmetros rígidos de análise e coerentes com a realidade do país.
Durante o período de estágio foi adaptado um método analítico, já utilizado no laboratório para determinação de substâncias caracterizadas como produtos secundários da desinfecção de água, os trihalometanos, assim foram adicionados novos analitos, os contaminantes orgânicos voláteis, e para determinação e identificação se utilizou como técnica de extração o Purge and Trap acoplada ao GC-MS/MS. Além disso, foi acompanhado a rotina de análises de amostras de água dos municípios catarinenses e o ensaio de proficiência em análises de resíduos de agrotóxicos, ambos utilizando como técnica de extração o SPME (micro extração em fase sólida - do inglês - Solid Phase Micro Extration), e ambas técnicas de extração de amostra são acopladas ao cromatógrafo gasoso com espectrômetro de massa, as quais vêm sendo muito empregadas para avaliação de perfis voláteis. Além disso foram realizados procedimentos de rotina laboratorial como organização e separação de materiais para análise; além da verificação do controle de temperatura e umidade do laboratório e sala de reagentes.
À vista disso, a atuação de um químico tecnológico, na área de análise ambiental, tem grande relevância, pois lida muitas vezes com matrizes de alta complexidade e sensibilidade, exigindo certos conhecimentos na área de química analítica e preparo de amostras por parte do profissional que executa esta função.
11 2. APRESENTAÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO
O Laboratório Central de Saúde Pública (LACEN) é um conjunto de redes nacionais de laboratórios, organizados em sub redes, por agravos ou programas, de forma hierarquizada por graus de complexidade das atividades relacionadas à vigilância epidemiológica, ambiental em saúde, sanitária e médica. O LACEN de Santa Catarina foi criado na primeira metade do século XX (se remete ao ano de 1936) quando o governo estadual, por meio da Lei no 138 de 14 de novembro de 1936, reorganiza os serviços de saúde pública no Estado e a então Diretoria de Higiene passa a denominar Departamento de Saúde Pública. Atualmente o LACEN/SC é uma unidade assistencial descentralizada da Secretaria de Estado da Saúde de Santa Catarina (SES/SC), e é o laboratório de referência para as questões de saúde pública no Estado de Santa Catarina, integrando o Sistema Nacional de Laboratórios de Saúde Pública (SISLAB). 1
O laboratório desempenha suas atividades em dois eixos técnicos: Gerência de Biologia Médica, que contempla 3 divisões e 10 unidades organizacionais (setores), e Gerência de Meio Ambiente e Produtos, que contempla 2 divisões e 10 unidades organizacionais. A divisão de Produção de meios, corantes e reagentes apoia tanto a gerência de biologia médica quanto a de meio ambiente e produtos.
O LACEN/SC possui o sistema de gestão da qualidade ABNT NBR ISO/IEC 17025 implementado a fim de garantir o cumprimento dos requisitos para a competência de laboratórios de ensaios e a confiabilidade dos resultados emitidos.
O estágio foi realizado no Setor de Análises de Resíduos e Contaminantes (SEARC) onde se executa ensaios para determinação de resíduos de agrotóxicos e compostos orgânicos pelas técnicas de cromatografia gasosa (GC-MS/MS) e cromatografia líquida (LC-HRAM-MS) em matriz de água. A maioria das amostras analisadas no setor é proveniente do VIGIÁGUA, que é um programa nacional de monitoramento e vigilância da qualidade da água para consumo humano para garantir o acesso da população à água com qualidade compatível aos padrões de potabilidade estabelecidos no anexo XX da portaria de consolidação nº 5 de 2017.
12 3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. Contaminantes Orgânicos e produtos secundários da desinfecção
O consumo e oferta de novos produtos químicos vem crescendo pela sociedade, o que levou ao aumento, no ambiente, de grandes quantidades de diversos compostos químicos provenientes das descargas industriais e de várias outras atividades e em diferentes nichos. Os compostos orgânicos liberados no meio ambiente apresentam espécies de uma ampla faixa de tamanhos de moléculas e de grupos funcionais. A natureza dos grupos funcionais determina a reatividade e funções destes compostos.2 Alguns exemplos de compostos orgânicos e suas respectivas propriedades físico-químicas são representados na Tabela 1.
Tabela 1. Propriedades físico-químicas de compostos orgânicos voláteis. Composto Fórmula Estrutural Log Kow Ponto de
Ebulição (°C) Pressão de Vapor (mmHg à 25ºC) 1,1- Dicloroeteno 2,13 32 600 Clorofórmio 1,97 61 197 1,2-Dicloroetano 1,48 83,5 78,9 Benzeno 2,13 80 94,8 Tricloroeteno 2,61 87 69 Bromodiclorometano 2,0 90 50
13 Dibromoclorometano 2,16 120 5,54 Tetracloroeteno 3,40 121 18,50 Bromofórmio 2,40 149 5,40 Estireno 2,95 145 6,40 1,3,5-Triclorobenzeno 4,19 208,5 0,24 1,2,4-Triclorobenzeno 4,02 213 0,46 1,2,3-Triclorobenzeno 4,05 218,5 0,21
Fonte: PUBCHEM, CHEMSPIDER.3,4
Os compostos orgânicos voláteis (VOC’s – do inglês Volatile Organic Compounds,) são compostos que passam para a fase gasosa ao entrar em contato com a atmosfera, devido a sua alta pressão de vapor. A organização mundial de saúde os classifica como todos os compostos orgânicos, com exceção aos pesticidas, com ponto de ebulição entre 60 e 250 °C. Os VOC’s contaminantes que frequentemente são encontrados em água. Provenientes de processos industriais como combustíveis, solventes, plásticos, desinfecção de água, entre outros. A água subterrânea ou de superfície pode ser contaminada através dos efluentes
14 líquidos e gasosos destes processos, ou da lixiviação dos locais contaminados pela carga e descarga de eliminação de resíduos.5,6,7
A cloração é um dos processos mais utilizados na desinfecção de água, em virtude da eficácia e baixo custo. Esta técnica tem como função principal eliminar microrganismos que podem causar doenças e preservar a água de contaminação externa e recontaminação por bactérias.7
Os subprodutos da desinfecção (DBP - do inglês - disinfection by products) são formados a partir da reação desses desinfetantes com matéria orgânica. O resultado desta reação é a formação de ácidos haloacéticos, haloacetonitrilas, halocetonas e trihalometanos (THM).5 Na Figura 1, é representada uma forma deste processo de formação destes subprodutos.
Figura 1. Representação esquemática de formação de THM.
Fonte: Adaptado de BISWAS et. al (2016).8
A formação de THM ocorre, majoritariamente, a partir da reação do cloro com a matéria orgânica natural (MON). A água bruta é formada por uma mistura de vários compostos com diferentes propriedades químicas, dentre elas os ácidos fúlvicos e húmicos que são resultantes da decomposição da matéria orgânica. Dentre os THM formados estão o clorofórmio (CHCl3), diclorobromometano (CHBrCl2), dibromoclorometano (CHClBr2),
bromofórmio (CHBr3). Estes mesmo em baixas concentrações são bastante tóxicos.5,9 No
esquema 1, é representado a formação de clorofórmio.
15 3.2. Toxicologia
Há estudos que mostram que uma vez que os THM estão no sangue, podem se bioacumular no tecido adiposo, fígado, rins e pulmão de acordo com a concentração e via de exposição. Além do risco de câncer de bexiga e colorretal em humanos, há estudos que relatam a ligação entre esses compostos e problemas reprodutivos humanos, como anomalias congênitas, aborto espontâneo, entre outros problemas de reprodução.10
Os VOC’s podem ser exalados na respiração, provenientes da troca molecular entre o sangue e o pulmão, de modo que alguns podem funcionar como biomarcadores, ou seja, indicam uma condição biológica, fornecendo assim informações para o diagnóstico de doenças. O número de pacientes com câncer de pulmão é um dos maiores entre os cânceres, principalmente pelo seu diagnóstico tardio, mas atualmente alguns VOC’s podem funcionar como biomarcadores e a doença ser detectada já no estágio inicial.6
3.3. Legislação
As concentrações de THM e VOC’s em água são regulamentadas por órgãos de saúde e meio ambiente. O Ministério da Saúde é órgão de saúde responsável pela fiscalização e implementação do Programa Nacional de Vigilância da Qualidade da Água para Consumo Humano (VIGIAGUA), junto com as secretarias municipais e estaduais. O programa realiza ações previstas no Anexo XX da Portaria de consolidação nº 5 de 2017, que garante o acesso à água em quantidade suficiente e qualidade compatível com o padrão de potabilidade, estabelecido na legislação vigente.11,12 Os valores permitidos de concentração de VOC’s e THM utilizados neste trabalho, foram expostos na Tabela 2, em comparativo com outros países.
Tabela 2. Valor Máximo Permitido em diferentes países.
Valor Máximo Permitido (VMP)
Parâmetro Brasil (μL-1) EPA -USA (mgL-1) ON -Canadá (mgL-1) 1,1-Dicloroeteno 30 0,007 - Tricloroeteno 20 0,005 0,005
16 Tetracloroeteno 40 0,0003 0,01 Estireno 20 0,1 - benzeno 5 0,005 0,001 Triclorobenzeno 20 0,07 - Tetraclorometano 4 0,005 0,002 THM totais 0,1 0,08 0,1
Fonte: MS11, EPA13, ONTARIO.14
3.4. Preparo de amostras
O preparo de amostra é considerado uma etapa determinante na análise química, pois a maioria dos equipamentos analíticos não permitem analisar matrizes complexas, sendo necessário o procedimento de preparo de amostras para garantir o isolamento correto do analito de interesse e consequentemente aumentar a sensibilidade e a precisão, e exatidão.15
Portanto, os quatro principais objetivos das técnicas de preparo de amostras são: (i) simplificação e/ou substituição da matriz da amostra, (ii) enriquecimento do analito, (iii) clean-up da amostra e (iv) representatividade da amostra.
Os processos clássicos de extração consistem em muitas etapas, incluindo a purificação do solvente para a extração, como consequência perda de analitos, maior possibilidade de contaminação e maiores tempos de preparação de amostras. As técnicas de preparo de amostras vêm sendo aperfeiçoadas, para melhorar tempo de análise e em laboratório e diminuir a produção de resíduos, um exemplo disso é a extração em fase sólida (SPE, do inglês Solid Phase Extraction), que apresenta elevada importância por reduzir o consumo de solvente orgânico nas análises, mas já é considerada uma técnica tradicional, pela quantidade de resíduos gerados provenientes dos cartuchos de plásticos.5,16
Métodos de extração com pequenas quantidades ou livres de solvente orgânico podem ser divididos em três grupos: (i) extração com membranas, (ii) extração com sorventes e (iii) extração com fase gasosa.
17 Esquema 2. Classificação de métodos de preparo de amostras livres de solvente.
Fonte: Adaptado de Pawliszyn (1995).17
A técnica de extração por membrana usa uma membrana polimérica para extrair os analitos da amostra. O método é eficiente para analitos voláteis, os quais são dessorvidos da membrana por um gás, não sendo indicado para analitos com alta polaridade devido à falta de membranas específicas.17
A extração com sorvente - onde sorventes são usados para extrair compostos orgânicos de várias matrizes incluindo água, ar e solos - envolve a extração em fase sólida (SPE) e a micro extração em fase sólida (SPME - do inglês Solid Phase Micro Extration). Sorventes com forte afinidade por compostos orgânicos podem reter e concentrar estes compostos de soluções bem diluídas ou amostras gasosas. Muitos sorventes são avaliados por serem especificamente convenientes a diferentes grupos de compostos orgânicos com vários níveis de seletividade. Os sorventes usados em SPE estão disponíveis na forma de cartuchos ou de discos de extração. A técnica SPE consiste no princípio de extração do analito em uma superfície sólida modifica seguida de dessorção em solvente que tenha mais afinidade com a fase extratora. Na técnica de SPME, uma fibra de sílica fundida é recoberta com uma fase estacionária. A fibra é exposta em uma solução aquosa ou gasosa até que o equilíbrio seja estabelecido entre os analitos da amostra e os sorvidos na fibra.16,17
A extração por fase gasosa consiste na técnica de headspace estático, a qual usa o equilíbrio da fase gasosa sobre a amostra, e na técnica de headspace dinâmico, ou purge and trap, onde um gás é borbulhado através da amostra, para carregar os componentes voláteis da amostra até um trap de adsorção.5
18 3.4.1. Microextração em fase sólida (SPME)
A SPME foi desenvolvida por Janusz Pawliszyn e Catherine Arthur em 1990, com o intuito de facilitar e agilizar a etapa de preparo de amostra e diminuir o volume de solvente usado. A técnica é utilizada na extração de contaminantes orgânicos de amostras ambientais, em alimento, análises de medicamentos, entre outras aplicações.15
O método consiste na exposição da fibra na amostra num determinado tempo, em consequência o transporte do analito para a fibra é feito imediatamente. A extração deste tipo engloba a adsorção/absorção na fibra. Após completa a extração, o analito é dessorvido pela fibra e em seguida é introduzido no GC-MS.18,19,20
Há vários fatores que influenciam a velocidade e/ou a quantidade extraída, em razão disso, a eficácia da pré concentração do analito em SPME, depende de alguns parâmetros, tais como: (i) Tipo de fibra; (ii) Espessura da fase estacionária; (iii) comprimento da fibra; (iv) modo de extração (v) volume da amostra; (vi) tempo e temperatura, e (vii) salting out.21
A seleção da fibra é feita no início do desenvolvimento do método. Para garantir eficiência no processo de extração, a escolha depende da constante de distribuição entre o revestimento da fibra/matriz da amostra. Esta característica representa como será a seletividade da fibra com o analito de interesse vs. outros componentes da matriz da amostra. Geralmente a fibra é composta por um capilar de sílica fundida, recoberto por um filme polimérico adsorvente, ou um adsorvente sólido. A aplicação de nanomateriais como sorvente vem sendo cada vez mais estudada e implementada, pois esse tipo de material aumenta a seletividade, sensibilidade e ajuda a minimizar o efeito de matriz. A extração pode ser feita diretamente ou pelo headspace e é compatível para microextração líquida ou gasosa.15,21,10
3.4.2. Extração gasosa: Headspace Purge and trap
O preparo de amostra que tem todos os seus requisitos para uma análise química verde é a análise por Headspace e pode ser executado por dois modos: estático e dinâmico. O processo de análise de Headspace envolve a adição da amostra em um vial, o qual é firmemente fechado por uma tampa rosca e um septo. A amostra é então termoestatizada até atingir uma temperatura específica, para então obter o equilíbrio da amostra e o headspace. Em seguida, a amostra é injetada no GC. O tempo de temperatura de equilíbrio depende da taxa de difusão dos compostos voláteis na amostra.23
O uso de análise de Headspace estático (SHS - do inglês - Static Headspace) para a determinação VOC tem muitas vantagens, como aplicabilidade universal e trabalhar com
19 grande número de amostras, quando comparada a técnicas tradicionais se pode destacar a baixa perda de VOC e diminuição do odor. 23
A baixa sensibilidade observada em SHS, é eliminada com o uso da análise de Headspace dinâmico (DHS - do inglês - Dynamic Headspace), também chamado de Purge and Trap (P&T), pois o analito fica mais concentrado por um contínuo equilíbrio entre o headspace.23
A Purge & Trap foi desenvolvida por Bellar and Lichtenberg em 1974. A técnica é utilizada em análises em contaminantes orgânicos em águas, alimentos e poluentes atmosférico. O método consiste na injeção da amostra em um frasco de purga, assim os compostos voláteis são extraídos por um gás inerte (usualmente He, H2 e N2) que transfere
para o trap com um sorvente. Após da adsorção no sorvente, os compostos voláteis são dessorvidos termicamente até serem injetados no GC.5,23
Uma limitação da técnica é o uso de nitrogênio, pois faz com que se torne mais cara, o uso de nitrogênio de faz necessário para “secar” o gás, para remoção do vapor d’água carregado pela amostra.23
3.4.3. Comparação SPME e P&T
As análises por headspace são frequentemente usadas, pois possuem simples procedimentos e eficácia para preservar as características da amostra. A comparação entre SPME e P&T vem sendo reportada como método de análise para compostos voláteis.18,24
BOCCHINI et al.25 aplicou o método de SPME para 55 compostos voláteis (de uma lista de 60 VOC’s detectados por P&T) em água. A SPME obteve boa linearidade, comparada com P&T, e melhor sensibilidade, mas em outras amostras, (exemplo: derivados de leite), a determinação de VOC’s apresentou baixa capacidade de extração.24,25
3.5. Cromatografia gasosa
A cromatografia é uma técnica físico-química de separação de componentes de um sistema, baseada na diferença de ponto de ebulição e retenção com a fase estacionária. O sistema de GC é subdivido em duas fases: a fase móvel, a qual é um gás inerte e uma imiscível, chamada de fase estacionária (sólida ou líquida), fixado a uma coluna. Os analitos são distribuídos entre as fases móvel e estacionária de acordo com a afinidade relativa.
20 Portanto, compostos com alta afinidade com a fase estacionária tem retenção longa e são eluidos depois.20,26
A cromatografia pode ser dividida pelos seguintes mecanismos de separação: (i) adsorção; (ii) Partição ou absorção; (iii) Troca iônica; (iv) bioafinidade; (v) exclusão. Os principais componentes de um cromatógrafo, ilustrados na Figura 2, são cilindro de gás de arraste e o regulador de vazão, sistema de injeção, um forno cromatográfico onde está contida a coluna cromatográfica seguida do detector, e de um computador para o controle do sistema e análise de dados.20,27
Figura 2. Esquema representando um cromatógrafo a gás.
Fonte: TURAZZI (2016).27
3.5.1. Cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas
O espectrômetro de massas é o detector comumente usado para a determinação de VOC’s em água. Quando se compara o GC-MS, ao GC-MS/MS (também denominado de Cromatografia Gasosa Acoplada ao Espectrômetro de Massas com Triplo Quadrupolo (GC-MS-TQ - do inglês - Gas Chromatography Mass Spectrometry Triple Quadrupole)) ambos possuem boa seletividade e alta sensibilidade. Com uma das mais importantes técnicas, GC-MS/MS vem sendo reportada com muitas aplicações.23,28
A GCMS-TQ possui dois filtros de massas quadrupolos (Q1 e Q2) na separação de massas e uma cela de colisão (Q2). Baseado nessas configurações e as respectivas combinações é possível obter uma variedade de espectros de massas, ajustando o modo de análise de cada
21 quadrupolo (Q1 e Q3).29 A figura 3, representa a configuração dos filtros de massas para Triplo Quadrupolo - (TQ-MS).
Figura 3. Configuração dos filtros de massas para Triplo Quadrupolo - (TQ-MS).
Fonte: Adaptado SHIMADZU.29
Os quadrupolos são controlados para transmitir um intervalo de íons de razões m/z ou selecionar uma única razão m/z. O quadrupolo central opera somente em modo RF (radiofrequência), dando a ele propriedade de focar na trajetória dos íons. Por esta questão atua como uma cela de colisão. O mesmo é preenchido com um gás inerte (argônio) a uma determinada pressão, logo os íons irão sofrer colisão. Nestas colisões uma parte da energia cinética é convertida em energia interna. Ocasionando a dissociação destes íons, ou seja, fragmentação. É na cela de colisão que ocorre experimentos de dissociação induzida por colisão (CID - do inglês - Collision Induced Dissociation).29 O MS/MS pode operar em diferentes modos de aquisição de dados, entre eles o SCAN, SIM e MRM.
O MS quando usado no modo SIM (do inglês- Selected Ion Monitoring), pode detectar analitos seletivamente na presença de coeluição de componentes da matriz. Nesta etapa o MS/MS opera diretamente no Q3.
A maior vantagem de um MS é poder identificar compostos desconhecidos no modo SCAN e comparar com os espectros disponíveis na biblioteca do software. No modo SCAN em Q1 acontece a varredura em um intervalo delimitado de íons de razões m/z, assim esses
22 íons são fragmentados em Q2 (CID) e em Q3 são fixados um valor específico de razão m/z.23,29
O MS/MS pode ser operado pelo modo MRM (do inglês - Multiple Reaction Monitoring) que é uma vantagem para precisão e quantificação. Nesta etapa, os valores específicos m/z são fixados em Q1 e Q2, e as transições são medidas. O íon precursor e o íon produto, gerado em Q2 (CID), é selecionado em Q3, ambos são resultantes de reação de fragmentação. A transição pode ser expressada, simplesmente, como sendo o íon produto gerado a partir de um íon precursor, a um valor específico de energia de colisão e a medida é feita pelo monitoramento desses íons. A transição é expressa como “íon precursor > íon produto”. Isto implica no aumento da sensibilidade quando comparado ao modo SIM, por ser menos afetado pela presença de impurezas, e esta sensibilidade está associada ao alto poder de seletividade gerado pelo modo de análise.28,29
23 4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo Geral
Aplicar os conhecimentos adquiridos na graduação em química tecnológica, conhecer uma rotina de laboratório e o trabalho em equipe,
Adaptar um método analítico empregando purge and trap e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS), como técnica de separação e identificação dos compostos orgânicos em amostras de água destinadas ao consumo humano.
4.2. Objetivos específicos
• Adaptar método cromatográfico para determinação de compostos orgânicos e comprovar a sua validade através dos testes de linearidade e faixa de trabalho, LD, LQ, precisão e exatidão.
• Realizar estudo do método com base na Portaria de Consolidação nº 5 DE 28/09/2017
• Quantificar trihalometanos e compostos orgânicos em amostras de água da torneira e após purificação em filtros caseiros e avaliar da eficiência dos filtros na remoção destes compostos quando presentes.
• Acompanhar a rotina diária de análise das amostras de água provenientes dos municípios catarinenses para a determinação de resíduos de agrotóxicos
24 5. METODOLOGIA
5.1. Acompanhamento da Determinação de Resíduos de Agrotóxicos por SPME Durante o período de estágio foi possível acompanhar alguns tipos de análise. Entre elas a determinação de agrotóxicos por GC-MS, utilizando como metodologia de preparo de amostras a microextração em fase sólida (SPME). O método utilizado para determinação de resíduos de agrotóxicos foi desenvolvido e validado no setor. A SPME é realizada de forma automatizada para todas as amostras e/ou padrões analisados, utilizando o auto amostrador AOC-6000®, para tanto, o vial contendo 15mL de amostra e 1,5g de cloreto de sódio com pH ajustado para 3-4 é incubado por 5 minutos a uma temperatura de 60°C e posteriormente é realizada a microextração propriamente dita em fibra de poliacrilato (PA) 85 µm, na mesma temperatura e sob agitação, por 20 minutos.
Figura 4. GC-MS/MS com amostrador automatizado AOC-6000®.
Decorrido o tempo de extração, a amostra é injetada no GC-MS/MS (marca Shimadzu®) com a rampa de aquecimento descrito na Tabela 3 e analisada no modo MRM em triplo quadrupolo (TQ 8040, Shimadzu®). Os parâmetros de configuração do método estão descritos na Tabela 4.
25 Tabela 3 – Rampa de temperatura utilizada no método de determinação de resíduos de agrotóxicos em água.
Rate (°C) Temperatura (°C) Hold Time (min)
- 50.0 2,00
10.00 180.0 0.00
3.00 230.0 0.00
5.00 280.0 0.00
15.00 300.0 7.00
Tabela 4 – Configuração do método de corrida para aquisição de dados MRM.
Parâmetro Configuração
Temperatura do injetor 250ºC
Modo de injeção Splitless
Razão de split -1 (splitless)
“Sampling time” 1,0 min
Liner 0,75 mm ID
Coluna cromatográfica TG-5MS 30m x 0,25mm x 0,25 µm) Thermo® Gás de arraste Hélio com pureza ≥ 99,999%
Fluxo da coluna 1,48 mL/min
Modo de controle de fluxo Velocidade linear
Velocidade linear 44,1 cm/seg
Fluxo de purga 5,0 mL/min
Injeção com alta pressão Desligado
Temperatura do “íon source” 230ºC
Temperatura da interface 280ºC
Tempo de corte do solvente 1 min
Modo de ganho do detector Relativo ao resultado do tuning
Aquisição utilizando o “CID gás” Ligado
A quantificação dos analitos se dá por calibração externa com a curva construída em matriz. Como a quantificação destes analitos não é frequente, na rotina laboratorial a corrida é feita com o ponto referente ao LD (limite de detecção) no início e ao final da batelada. Caso todos os resultados de áreas obtidos nas amostras sejam inferiores às áreas obtidas na corrida do LD a amostra é transcrita no sistema como menor LD. Caso alguma área seja superior ao
26 LD, a amostra é corrida novamente junto com uma curva de calibração para a quantificação do analito encontrado na amostra.
5.2. Adaptação da metodologia de purge and trap para novos analitos
5.2.1. Materiais e reagentes
As soluções padrões contendo os analitos de interesse para o método, foram preparadas a partir de um mix de padrões (Spex CertiPrep, Nova Jersey) na concentração de 1000 mgL-1. As soluções para elaboração da curva de calibração foram preparadas em água ultrapurificada em sistema Mili-Q fervida e resfriada para diminuição da concentração de compostos voláteis caso estivessem presentes. Um branco da mesma água foi corrido juntamente com os pontos da curva de calibração. As soluções foram preparadas em 25mL de água ultrapurificada em vial de 40 mL. Utilizou para determinação da linearidade as concentrações de THM de 0,6μgL-1, 1,2μgL-1, 1,8μgL-1, 2,4μgL-1, 3,0μgL-1 e 3,6μgL-1 e dos
novos analitos, os compostos Orgânicos, de 0,4μgL-1, 0,8μgL-1, 1,2μgL-1,1,6 μgL-1, 2,2μgL-1,
2,4μgL-1.
5.2.2. Amostras
A coleta e transporte das amostras analisadas na rotina do laboratório são de responsabilidade das VISA municipais, seguindo um calendário para execução do programa VIGIAGUA.
Para avaliação da eficiência dos purificadores caseiros e bebedouros quanto a remoção de compostos orgânicos e trihalometanos, foram coletadas amostras de água de torneira e de filtros no mesmo horário em diferentes locais da grande Florianópolis. As amostras foram coletadas diretamente no vial de análise com uma gota da solução de 10% de tiossulfato (Na2S2O3), pois tem ação antioxidante, e é utilizado como inibidor da ação do cloro. Após as
coletas, as amostras ficaram armazenadas sob refrigeração até o momento da análise. 5.2.3. Instrumentação e condições cromatográficas
A partir das análises já realizadas no laboratório se fez necessário aprimorar a metodologia de análise de THM, a qual já é validada, com o intuito de adicionar novos analitos. O método de purge and trap é feito de forma automatizada para todas as amostras e/ou padrões analisados, utilizando o AtomX como sistema de preparação de amostra combinado com um auto amostrador purge and trap, acoplado ao cromatógrafo a gás.
27 Figura 5. AtomX - sistema purge and trap.
Após a extração, a amostra é injetada automaticamente no GC-MS/MS (marca Shimadzu®) com a rampa de aquecimento descrito na Tabela 5 e analisada no modo SIM em triplo quadrupolo (TQ 8040, Shimadzu®). Os parâmetros de configuração do método estão descritos na Tabela 6.
Tabela 5 – Rampa de temperatura utilizada no método de determinação de resíduos de agrotóxicos em água.
Rate (°C) Temperatura (°C) Hold Time (min)
- 45.0 4.50
12.00 100.0 0.00
25.00 240.0 1.32
28
Parâmetro Configuração
Temperatura do injetor 200ºC
Modo de injeção Splitless
“Sampling time” 1,0 min
Liner 0,75 mm ID
Coluna cromatográfica TG-5MS (30m x 0,25mm x 0,25 µm) Thermo® Gás de arraste Hélio com pureza ≥ 99,999%
Fluxo da coluna 0,90 mL/min
Modo de controle de fluxo Velocidade linear
Velocidade linear 34,3 cm/seg
Fluxo de purga 1,0 mL/min
Injeção com alta pressão Desligado
Temperatura do “íon source” 185ºC
Temperatura da interface 240ºC
Tempo de corte do solvente 1 min
Modo de ganho do detector Relativo ao resultado do tuning
Aquisição utilizando o “CID gás” Ligado
Os parâmetros de extração e cromatográficos foram utilizados os mesmos já utilizados no laboratório para determinação dos compostos oriundos da desinfecção.
Para identificação, determinação dos tempos de retenção e dos íons a serem utilizados no método para os novos compostos, foi preparado um mix dos padrões na concentração de 100 mg. L-1 e correu no cromatógrafo no modo SCAN. A partir dessa corrida foram determinou
cada composto do mix através do seu espectro de massas e com o auxílio da biblioteca NIST disponível no software do equipamento.
Após a montagem no método com os novos analitos, foram realizados testes preliminares para a determinação da faixa de trabalho para determinação da linearidade do método. Para avaliação da linearidade, foi utilizado uma planilha disponibilizada pelo Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) e o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) que contempla os testes estatísticos necessários.30 A precisão foi determinada através da repetibilidade e precisão intermediária, onde se analisou replicatas das concentrações baixa, média e alta intradia e interdia respectivamente. A repetibilidade foi avaliada através do cálculo de RSD (%) e a precisão intermediária através do teste de análise de variância
29 (ANOVA) A exatidão foi determinada através da fortificação da matriz de água com os analitos de interesse, também nas concentrações baixa média e alta e a avaliação foi realizada através do cálculo da recuperação.
Após a verificação de eficiência do método, realizou-se as análises nas águas coletadas para verificação da eficiência dos filtros caseiros. A quantificação dos analitos foi efetuada por padronização externa.
5.3. Segurança no trabalho
Na área técnica alguns EPI’s foram fornecidos pela Coordenadoria de Biossegurança (COBIO), jaleco, máscara e luvas e ainda o uso de calça e calçado fechado é obrigatório e previsto no POP interno. A manutenção e fiscalização do uso adequado também foram realizadas pela COBIO.
Os resíduos gerados pelos agrotóxicos e compostos orgânicos foram descartados em bombonas para serem tratados por uma empresa terceirizada. Entretanto, as luvas contaminadas utilizadas nos ensaios, eram descartadas no lixo comum.
30 6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NO ESTÁGIO
6.1. Acompanhamento da Determinação de Resíduos de Agrotóxicos por SPME Durante a vigência de estágio nenhuma amostra analisada reprovou quanto ao teor de agrotóxicos, porém vale salientar que hoje a nossa legislação é muito permissiva. Se comparado com valores estabelecidos na legislação de outros países, como exposto na Tabela 2, para a mesma matriz, a nossa legislação autoriza 5-10 e até 500 vezes mais a concentração de alguns analitos.
6.2. Adaptação da metodologia de purge and trap para novos analitos
A separação e identificação dos compostos foram realizadas no GC-MS/MS, tendo como base o método de determinação de THM, já realizado no laboratório. A partir disso foram otimizadas algumas configurações na corrida para a validação e aplicação do método. Com corrida no modo SCAN foi possível obter o cromatograma para os 13 analitos estudados neste trabalho, como exposto na Figura 6 bem como os tempos de retenção para cada analito. e para facilitar a visualização o cromatograma foi dividido em duas partes A e B, na Figura 7.
Figura 6. Cromatograma obtido por GC-MS/MS a partir de um mix de compostos orgânicos e THM no modo SCAN, utilizando o procedimento de extração purge and trap.
Figura 7. Cromatograma dividido em duas partes: A parte A até 9 min que permite verificar a presença de THM e alguns compostos orgânicos e após o tempo de 9min, a presença de apenas compostos aromáticos.
31 Através da otimização das condições da corrida, foi possível estabelecer uma condição ideal para o procedimento, sendo estas condições utilizadas para a extração de compostos voláteis e trihalometanos nas amostras de água. A curva de calibração foi realizada a partir do
32 procedimento descrito na seção 5.2.1., sendo o tempo total da corrida de 16 min. A obtenção dos parâmetros analíticos foram realizados na planilha de Avaliação de Premissas, desenvolvida pelo FIOCRUZ-INCQS.30 Assim foi possível obter os dados dos compostos analisados, expostos na Tabela 7 e 8.
Tabela 7. Parâmetros analíticos para os compostos analisados Faixa Linear (μgL-1) LQ LD r 1,1-dicloroeteno 0,4 - 2,4 0,661 0,224 0,9927 Benzeno 0,4 - 2,4 0,475 0,161 0,9956 Tricloroeteno 0,4 - 2,4 0,467 0,158 0,9959 Tetracloroeteno 0,4 - 2,4 1,30 0,460 0,9733 Estireno 0,4 - 2,4 0,582 0,197 0,9941 1,3,5-Triclorobenzeno 0,4 - 2,4 0,746 0,253 0,9899 1,2,3-Triclorobenzeno 0,4 - 2,4 0,501 0,169 0,9956 1,2,4-Triclorobenzeno 0,4 - 2,4 0,442 0,149 0,9966 Clorofórmio 0,6 - 3,6 0,704 0,237 0,968 Bromodiclorometano 0,6 - 3,6 0,903 0,306 0,9932 Dibromoclorometano 0,6 - 3,6 0,812 0,275 0,9951 Bromofórmio 0,6 - 3,6 1,44 0,388 0,9899
A partir da Tabela 7, se pode observar que o coeficiente de correlação obtidos foram satisfatórios, uma média de 0,9899. Além disso os LD ficaram bem abaixo do valor máximo permitido na Portaria de Consolidação 05 de 2017.
Tabela 8. Resultados obtidos através de ensaios de recuperação para a avaliação da exatidão e precisão do método desenvolvido.
33 Conc. (ppb) Recuperação Média (%)
(n=3) Precisão (%) ANOVA 1,1-dicloroeteno 0,80 1,60 2,40 106,04 107,17 98,88 5,16 3,18 4,08 FくFcrítico 1,2-dicloroetano 0,80 1,60 2,40 104,96 105,31 101,25 4,37 5,35 4,11 FくFcrítico Benzeno 0,80 1,60 2,40 108,21 89,29 94,86 4,35 7,09 11,28 FくFcrítico Tricloroeteno 0,80 1,60 2,40 106,54 84,90 92,21 10,02 12,18 19,00 FくFcrítico Tetracloroeteno 0,80 1,60 2,40 164,00 102,94 110,96 14,20 11,75 2,38 FくFcrítico Estireno 0,80 1,60 2,40 107,17 82,02 90,10 5,95 11,07 18,33 FくFcrítico 1,3,5-Triclorobenzeno 0,80 1,60 2,40 106,79 85,35 95,67 8,77 1,64 1,33 FくFcrítico 1,2,3-Triclorobenzeno 0,80 1,60 2,40 110,96 97,94 114,49 5,70 18,86 28,02 FくFcrítico 1,2,4-Triclorobenzeno 0,80 1,60 104,46 77,42 4,37 8,90 FくFcrítico
34 2,40 82,15 13,85 Clorofórmio 0,80 1,60 3,60 101,25 108,39 100,28 11,86 10,98 1,64 FくFcrítico Bromodiclorometano 0,80 1,60 2,40 103,22 87,92 95,94 6,44 3,82 14,28 FくFcrítico Dibromoclorometano 0,80 1,60 2,40 100,14 83,76 96,60 12,58 12,78 4,47 FくFcrítico Bromofórmio 0,80 1,60 2,40 105,11 92,25 89,86 12,15 11,52 10,33 FくFcrítico
De acordo com a Tabela 8 a recuperação variou entre 77,42 a 164%, entretanto a recuperação adequada está entre 70 a 120%, com precisão de ± 20%, isso se deve ao fato de outros componentes da matriz interferirem na separação, detecção ou quantificação da substância. Os valores para o tetracloroeteno, não foram satisfatórios e será necessário novos ensaios e avaliações. Contudo, os demais estão dentro da faixa estipulada para o método. Os outros parâmetros como precisão e a análise de variância, foram verificados e se mostraram adequados. Sendo assim a faixa linear é considerada válida para este trabalho.
6.2.1. Amostras
O método desenvolvido foi aplicado em amostras de água, os resultados obtidos nas análises foram apresentados na Tabela 9.
Tabela 9. Resultados obtidos das análises das amostras de água. Amostras1 Tempo estimado de
uso última troca
Local/ Bairro THM (mgL-1) VOC (mgL-1)
35
1-F 3 meses Pantanal 0,010 ND
1-T - 0,113 ND
2- F 8 meses Ponte do Imaruim 0,020 ND
2-T - 0,080 ND
3- F 1 mês 0,054 ND
3-T - 0,119 ND
4-Fbarro 4 meses Córrego Grande 0,034 ND
4-T - 0,119 ND 5-F 6 meses Itacorubi 0,054 ND 5-T - 0,103 ND 6-F 6 meses Aririu 0,001 ND 6-T - 0,072 ND 7-F 6 meses Aririu 0,008 ND 7-T - 0,129 ND 8-F 9 meses Barreiros 0,007 ND 8-T - 0,098 ND 9-F 1 ano Barreiros 0,010 ND 9-T - 0,108 ND 10-F 6 meses Centro 0,078 ND 10-T - 0,119 ND
11-F 1 anos e 11 meses Centro 0,101 ND
36 12-Fbarro NI Coqueiros 0,033 ND 12-T* - 0,062 ND 13-F NI 0,005 ND 14-F NI 0,156 ND 15-F NI (DQ-UFSC) 0,138 ND 16-F NI 0,229 ND 16-T* - 0,156 ND
17-F 1 ano e 7 meses Centro 0,064 ND
17-T - 0,100 ND
18-F 1 ano e 11 meses Centro 0,1382 ND
18-T - 0,100 ND
19-F 1 ano e 7 meses Centro 0,084 ND
19-T - 0,081 ND
20-F 1 ano e 7 meses Centro 0,105 ND
20-T - 0,067 ND
Legenda:
ND: não detectado NI: não informado B - Bebedouro F - Filtro T - Torneira
*- mesmo local de coleta
Os resultados expostos na Tabela 9, mostraram redução significativa de THM com o uso de filtros. Se observou também que os dois filtros de barro analisados não mostraram eficiência de redução quando se compara a filtros com carvão ativado. Já os bebedouros se mostraram totalmente ineficientes, porém há o agravante de troca/manutenção que não deve estar em dia, portanto, isso acarretaria na ineficiência. Não foram detectados compostos orgânicos nas águas analisadas.
37 Os resultados para amostras de torneira, foram alarmantes, visto que alguns valores chegaram muito próximo ao VMP, previsto na Portaria de Consolidação nº 5. A nossa legislação é bem permissível quando se comparada a outros países, como exposto na Tabela 2. O que demonstra que a água tratada em Florianópolis não é adequada para consumo.
38 7. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS
A análise de compostos orgânicos e THM demonstra ser uma área importante para pesquisa e ampla para a realização de novos métodos de água tratada ou natural. Visto que é um aspecto importante para saúde pública, previsto na legislação.
A extração por Purge and Trap foi eficiente e tem todos os requisitos para uma análise química verde, é um método relativamente simples para a extração e quantificação de VOC’s e THM e possui uma grande aplicação no monitoramento ambiental.
Em relação a metodologia, a adaptação consistiu em adequar as concentrações de THM para a realização do método e adicionar novos analitos, os VOC’s. Os parâmetros obtidos se mostraram eficiente, com baixos limites de detecção e quantidade satisfatória de recuperação.
As análises das amostras foi um tópico importante neste trabalho, a fim de garantir a saúde pública, e se notou a eficiência de filtros domésticos, sendo uma alternativa simples para a redução de VOC’s e THM.
O período de estágio foi muito produtivo, de maneira geral o acompanhamento nesses tipos de análises se mostra muito importante para a saúde pública e do ponto de vista profissional, pois é um tipo de rotina de análise diferente do que se vê nos laboratórios de pesquisa.
39 8. CONTRIBUIÇÃO DO ESTÁGIO Á FORMAÇÃO PROFISSIONAL
O estágio realizado no LACEN, proporcionou uma ampla experiência profissional para a conclusão do curso de Química Tecnológica. Os conhecimentos adquiridos durante a formação acadêmica, foram amplamente utilizados, e além disso, foi possível aprofundar técnicas e aprender novos conceitos teóricos e práticos na área de química analítica com ênfase em análise amostras ambientais.
A oportunidade de conhecer a rotina em um laboratório que segue normas internacionais de gestão de qualidade, como a ABNT NBR ISO/IEC 17025, e acompanhar um ensaio de proficiência, é fundamental para garantir a credibilidade dos resultados, algo do qual não se tem contato na prática ao longo da graduação. Os químicos de controle de qualidade são os profissionais mais requisitados do mercado de trabalho, logo, o estágio nessa área proporciona uma experiência preponderante para quem deseja seguir carreira.
A rotina de trabalho em equipe se mostrou essencial para a qualidade do trabalho realizado e um ambiente equilibrado. Portanto, o estágio obrigatório é uma importante etapa para a formação de um químico na área tecnológica, pois é o primeiro contato com o mercado de trabalho.
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