UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ANÁLISE IN SILICO DA INTERAÇÃO ENTRE O HLA-A*0201 E PEPTÍDEOS MODIFICADOS DO MELANOMA COM POTENCIAL IMUNOTERÁPICO
ANNE CAROLINE LEONIDAS PEREIRA
NATAL – RN 2020
ANNE CAROLINE LEONIDAS PEREIRA
ANÁLISE IN SILICO DA INTERAÇÃO ENTRE O HLA-A*0201 E PEPTÍDEOS MODIFICADOS DO MELANOMA COM POTENCIAL IMUNOTERÁPICO
Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco
NATAL – RN 2020
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título em Mestre em Ciências Biológicas.
Defesa da dissertação de mestrado da discente Anne Caroline Leonidas Pereira intitulada: “análise in silico da interação entre o HLA-A*0201 e peptídeos modificados com potencial imunoterápico do melanoma”, orientada pelo Prof. Dr. Umberto Laino Fulco, apresentado à banca examinadora designada pelo Programa de Pós-Graduação em ciências Biológicas da UFRN.
Os membros da Banca Examinadora consideraram a candidata _______________.
Banca Examinadora:
_________________________________________ (Prof. Dr. Umberto Laino Fulco - DBF/UFRN)
__________________________________________ (Prof. Examinador interno)
__________________________________________ (Prof. Examinador externo)
Pereira, Anne Caroline Leonidas.
Análise in silico da interação entre o HLA-A*0201 e peptídeos modificados do melanoma com potencial imunoterápico / Anne Caroline Leonidas Pereira. - Natal, 2020.
99 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco.
1. Melanoma - Dissertação. 2. Imunoterapia - Dissertação. 3. DFT - Dissertação. I. Fulco, Umberto Laino. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Universidade Federal do Rio Grande do Norte por toda infraestrutura oferecida aos seus alunos, como também a todos os docentes do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas que foram essenciais, compartilhando seus conhecimentos científicos durante esta jornada de dois anos. Em especial, ao professor Umberto Laino Fulco, orientador deste trabalho, que depositou, em mim, confiança durante todo o projeto.
Também agradeço a todos os colegas do laboratório de Biofísica e Simulação Computacional pelo companheirismo neste período acadêmico, principalmente, àqueles que se tornaram amigos, podendo compartilhar nossas vivências e dificuldades diárias: John e Lucas. E em especial a doutoranda Katy, que me forneceu ajuda em todos os momentos do início ao fim, transmitindo mais do que conhecimento, demonstrou paciência, empenho e dedicação com uma humildade que deveria ser vista com mais frequência no ambiente acadêmico. Muito obrigada!
Sou grata ainda a todos os amigos, principalmente, àqueles que trago desde a graduação, Wilo e Marília, que me ouviram frequentemente relatar as dificuldades e o cansaço durante esse período. Além dos amigos do trabalho que conheci durante este percurso e que agregam profundamente ao meu crescimento profissional, servindo-me de exemplos a serem seguidos: Fernanda e Karine, em especial.
À CAPES, instituição que forneceu o apoio financeiro a esta pesquisa, também fica minha gratidão. Ainda que fazer ciência no Brasil seja difícil, são apoios como esse que tornam viável e possível o crescimento científico desse país.
Por último, e não menos importante, sou grata à minha família por todo o apoio e incentivo para que iniciasse esta etapa e que a concluísse, mesmo mediante as incertezas e a dificuldade em conciliar com o trabalho. Aos meus pais e minhas irmãs, deixo minha gratidão por terem construído isso comigo, pela compressão nas ausências semanais dedicadas ao projeto e por acreditarem em mim mais do que eu mesma.
E a Deus, fica minha gratidão imensurável por sempre me dar forças em todos os desafios da vida.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Domínios que compõe o HLA I. Elaborada pela autora. ... 25 Figura 2 - Ciclo da imunidade no câncer. Adaptado de ALDOUS & DONG (2018). .. 27 Figura 3 – Raio de interação (8Å) pontilhado de cor preta utilizado a partir do aminoácido Gly5 do peptídeo. Elaborada pela autora. ... 41 Figura 4 - Subsistemas referentes à equação, sendo (A) correspondente ao primeiro subsistema (Cp-1RpCp+1-Ch-1RhCh+1), (B) o segundo (Cp-1RpCp+1-Ch-1Ch+1), (C) o terceiro (Cp-1Cp+1-Ch-1RhCh+1) e (D) o último(Cp-1Cp+1-Ch-1Ch+1). Elaborada pela autora. ... 43 Figura 5 - Representação das cadeias do MHC de classe I formadas por domínios α1 (verde), α2 (roxo) e α3 (vermelho); e o sulco de interação do peptídeo (amarelo) composto pelos domínios α1 e α2. Elaborada pela autora. ... 47 Figura 6 - Representação do raio de interação entre os aminoácidos dos peptídeos e os aminoácidos do HLA-A*0201 no raio de 8Å. Os aminoácidos em destaque, Gly 5 (peptídeo) e Lys66 (HLA) interagindo a uma distância de 5.7Å. Elaborada pela autora. ... 48 Figura 7 - Representação dos PDB’s 5EU4 (A), 5EU5 (B) e 5EU6 (C). Elaborada pela autora. ... 48 Figura 8 - Peptídeos das estruturas 5EU4 (A), 5EU5 (B) e 5EU6 (C) com as mutações destacadas de laranja, rosa e roxo, respectivamente. Elaborada pela autora... 49 Figura 9 - Comparação do perfil energético de cada resíduo dos peptídeos A, B e C com a molécula de HLA-A*0201. Mutações destacadas: peptídeo A (laranja), peptídeo B (vermelho) e peptídeo C (roxo). Elaborada pela autora. ... 52 Figura 10 - Principais interações entre os resíduos do peptídeo A e os aminoácidos do HLA-A*0201. Elaborada pela autora. ... 52 Figura 11 - Principais interações entre os resíduos do peptídeo B e os aminoácidos do HLA-A*0201. Elaborada pela autora. ... 53 Figura 12 - Principais interações entre os resíduos do peptídeo C e os aminoácidos do HLA-A*0201. Elaborada pela autora. ... 53 Figura 13 - Principais interações entre a tirosina 1 dos peptídeos A (laranja) e B (rosa) com os aminoácidos do HLA-A*0201. Elaborada pela autora. ... 55 Figura 14 - Principais interações entre a tirosina 1 (roxo) do peptídeo C e os aminoácidos do HLA-A*0201. Elaborada pela autora... 56
Figura 15 - Principais interações entre a Leucina 2 dos peptídeos A (laranja), B (rosa) e C (roxo) com os aminoácidos do HLA-A*0201. Elaborada pela autora. ... 57 Figura 16 - Principais interações entre o resíduo 3 dos peptídeos A (laranja), B (rosa) e C (roxo) com os aminoácidos do HLA-A*0201. Elaborada pela autora. ... 60 Figura 17 - Representação da estrutura atômica dos aminoácidos glicina (I) e alanina (II), variando na cadeia lateral com um grupamento metil na alanina (verde). Elaborada pela autora. ... 61 Figura 18 - Principais interações entre a treonina 8 dos peptídeos A (laranja), B (rosa) e C (roxo) com os aminoácidos do HLA-A*0201. Elaborada pela autora. ... 63 Figura 19 - Principais interações entre o resíduo 9 do peptídeo C (roxo) com os aminoácidos do HLA-A*0201. Elaborada pela autora. ... 64 Figura 20 - Representação do posicionamento dos principais aminoácidos do HLA-A*0201 que interagiram com os peptídeos. Elaborada pela autora. ... 66
LISTA DE ABREVIAÇÕES
APC Células apresentadoras de antígeno, do inglês antigen presenting cells APL Ligantes peptídicos alterados, do inglês altered peptide ligands CD28 Cluster of diferentiation 28
CD80/86 Cluster of diferentiation 80/86
Charmm Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics Forcefield DANT Doenças e agravos não transmissíveis
DFT Teoria do Funcional da Densidade, do inglês Density Functional Theory ERK Quinase regulada por sinal extracelular
GGA Aproximação de Gradiente Generalizado, do inglês Generalized Gradient Approximation
GP100 Glicoproteína 100 GTP Trifosfato de guanosina
HF Hartree-Fock
HLA Antígeno leucocitário humano, do inglês Human Leukocyte Antigen MC1R Receptor de melanocortina
MFCC Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas, do inglês Molecular Fractionation With Conjugated Caps
MHC Complexo de histocompatibilidade maior, do inglês Major Histocompatibility Complex
MITF Fator de transcrição indutor de melanócito
MM Mecânica molecular, do inglês Molecular Mechanics MSH Hormônio estimulante do melanócito
NF1 Fator 1 do neurofibroma PAX3 Paired box gene 3
PBE Perdew-Burke-Ernzerhof
PD-1 Proteína de morte celular programada PD-L1 Ligante de morte programada 1 PMEL Proteína pré-melanossômica pMHC Peptídeo-MHC
QM Mecânica quântica, do inglês Quantum Mechanics
RCSB/PDB Research Collaboratory for Structural Bioinformatics – Protein Data Bank
TAA Antígenos associados ao tumor, do inglês Tumor-Associated Antigen TCR Receptores de células T, do inglês T Cell Receptor
Treg Células T regulatórias
TSA Antígenos específicos tumorais, do inglês Tumor-Specific Antigen UV Radiação Ultravioleta
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Energia total e quantidade de interações entre cada resíduo do peptídeo A com os aminoácidos do HLA-A*0201. ... 49 Tabela 2 - Energia total e quantidade de interações entre cada resíduo do peptídeo B com os aminoácidos do HLA-A*0201. ... 50 Tabela 3 - Energia total e quantidade de interações entre cada resíduo do peptídeo C com os aminoácidos do HLA-A*0201. ... 50 Tabela A. 1 - Interações realizadas entre os resíduos do HLA-A*0201 e os resíduos do peptídeo A...83 Tabela A. 2 - Interações realizadas entre os resíduos do HLA-A*0201 e os resíduos do peptídeo B... 89 Tabela A. 3 - Interações realizadas entre os resíduos do HLA-A*0201 e os resíduos do peptídeo C... 95
RESUMO
O melanoma é um tipo de câncer de pele, com crescente incidência no mundo, que acomete os melanócitos e é caracterizado por sua elevada letalidade e capacidade de ocasionar metástases. Devido a severidade da doença, formas convencionais de tratamento, como radioterapia e quimioterapia, não costumam ser eficientes nos estágios avançados. Por isso, desenvolveu-se estudos de novas abordagens terapêuticas baseadas na imunoterapia, que tem como princípio modular o sistema imune contra as células neoplásicas, ainda que essas células possuam capacidade de evadir das respostas imunológicas. Em consequência dos avanços na imunologia molecular, observou-se que a glicoproteína 100 (gp100), componente estrutural do melanossoma, é super expressa no melanoma e é capaz de desencadear a ativação de células T. Através de modificações nas sequências peptídicas nas regiões de reconhecimento pelos antígenos leucocitários humano (HLA), é possível aumentar a afinidade dessa interação e promover uma melhor resposta imunológica. Neste sentido, este trabalho realizou um estudo ab initio da interação de peptídeos modificados provenientes da gp100 com a molécula do HLA-A*0201. Para isso, utilizou-se métodos baseados em mecânica quântica, tendo como base a Teoria do Funcional da Densidade (DFT). As energias de interação entre peptídeo-HLA foram calculadas após a partição das estruturas pelo Método de Fragmentação Molecular com Capas Conjugadas (MFCC). Os resultados observados demonstraram que os aminoácidos terminais dos peptídeos exibiram maior interação energética frente aos aminoácidos centrais. O peptídeo C, em que se substituiu uma alanina por valina na posição 9, foi o que apresentou maior energia de interação pelo HLA-A*0201 e foi a única mutação que aumentou a afinidade individual do resíduo. Já as mutações nos peptídeos B, glutamato por alanina na posição 3, e C, glicina por alanina na posição 5, provocaram perca de afinidade pelo receptor. Além disso, devido às mutações na sequência peptídica, percebeu-se que mudanças conformacionais nos peptídeos impactaram no perfil energético de resíduos adjacentes. Delimitou-se também as principais interações resíduo-resíduo para cada posição das sequências peptídicas, notando-se assim que os aminoácidos: Tyr59, Glu63, Lys66, Asp77, Trp167, Tyr159, Thr143 e Lys146 do HLA-A*0201 foram os que realizaram as interações mais energéticas com diferentes resíduos dos peptídeos.
ABSTRACT
Melanoma is a type of skin cancer affects melanocytes increasing incidence worldwide. It is highly lethal and cause metastases. Due to the severity of the disease, conventional formal treatments such as radiotherapy and chemotherapy are not usually effective in the advanced stages of melanoma. Therefore, studies of new therapeutic approaches based on immunotherapy were developed, which have the principle of modulating the immune system against neoplastic cells. However, neoplastic cells can evade anti-tumor immune responses. After to advances in molecular immunology, it has been observed that glycoprotein 100 (gp100), the structural component of melanosome, is over-expressed in melanoma and it causes to trigger T cell activation. However, modifications in peptide sequences recognized by human leukocyte antigens (HLA) regions, it is possible increase affinity promoting a better immune response. In this sense, this work conducted an ab initio study of the interaction of gp100 modified peptides between HLA-A*0201. For this, we used methods based on quantum mechanics, like the Density Functional Theory (DFT). The peptide-HLA interaction energies were calculated after the partition of the structures by the Conjugated Caps Molecular Fragmentation Method (MFCC). The results showed that the terminal amino acids of the peptides had greater energetic interaction compared to the central amino acids. Peptide C, which replaced one alanine with valine at position 9, was the one with the highest HLA-A*0201 interaction energy and was the only mutation that increased the individual affinity of the residue. Mutations in peptides B, alanine by glutamate at position 3, and C, glycine by alanine at position 5, caused loss of affinity for the receptor. In addition, due to mutations in peptide sequence, conformational changes in peptides impacted the adjacent amino acids energy profile. The main residue-residue interactions were also established for each position of peptide sequences. The main HLA-A*0201 amino acids were: Tyr59, Glu63, Lys66, Asp77, Trp167, Tyr159, Thr143 and Lys146 showing the most energetic interactions with the peptide residues.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 15
1.1 Melanoma ... 16
1.1.1 Melanócitos e síntese de melanina ... 16
1.1.2 Patogenia do melanoma ... 17
1.1.3 Epidemiologia ... 19
1.1.4 Fatores de risco ... 20
1.2 Resposta imune ... 21
1.2.1 Organização do sistema imune ... 21
1.2.2 Reconhecimento peptídico ... 23
1.2.3 Papel do MHC na resposta imune ... 24
1.2.4 Imunoterapia ... 26 1.2.5 Glicoproteina 100 ... 29 1.3 Modelagem molecular ... 31 OBJETIVOS ... 35 2.1 Objetivos Gerais ... 36 2.2 Objetivos Específicos ... 36 METODOLOGIA ... 37
3.1 Obtenção da estrutura cristalográfica ... 38
3.2 Otimização da Estrutura e Simulação Computacional ... 39
3.3 Simulação computacional de sistemas biológicos ... 40
3.3.1 Determinação das Energias de Interação ... 40
3.3.2 Método de Fragmentação Molecular com Capas Conjugadas ... 41
3.3.3 Teoria do Funcional Densidade (DFT) ... 43
3.3.4 Constante dielétrica ... 44
4.1 Caracterização dos dados cristalográficos ... 46 4.1.1 Resíduo 1 ... 54 4.1.2 Resíduo 2 ... 56 4.1.3 Resíduo 3 ... 58 4.1.4 Resíduo 4 ... 60 4.1.5 Resíduo 5 ... 60 4.1.6 Resíduo 6 ... 61 4.1.7 Resíduo 7 ... 61 4.1.8 Resíduo 8 ... 62 4.1.9 Resíduo 9 ... 62
4.2 Principais resíduos do HLA-A*0201 ... 65
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ... 68
5.1 Conclusões ... 69
5.2 Perspectivas ... 71
REFÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 73
INTRODUÇÃO
CAPÍTULO 1
16
1.1 Melanoma
1.1.1 Melanócitos e síntese de melanina
Os melanócitos são derivados das células da crista neural, uma estrutura anatômica desenvolvida durante a fase embrionária, que origina diferentes linhagens celulares, como: células neurais, mesenquimais e melanócitos. O processo de diferenciação é controlado por mecanismos moleculares complexos mediado por fatores de transcrição (MITF, SOX10, Pax3) controlados por vias de sinalização extracelulares (TESTA; PELOSI, 2017).
A distribuição dos melanócitos no organismo é ampla, sendo encontrados na epiderme e nos folículos do cabelo, em torno da superfície mucosa e meninges. Essas células são responsáveis pela produção e liberação de melanina, que age protegendo o DNA de possíveis danos causados pela radiação UV. Por sua vez, os queratinócitos, células presentes na pele, produzem o hormônio estimulante do melanócito (MSH) que se associará ao receptor de melanocortina (MC1R) dos melanócitos, estimulando a via de produção da melanina (LEONARDI et al., 2018). A melanina sintetizada é armazenada nos melanossomas, organelas intracelulares, e irá proteger componentes do citosol e outras organelas membranosas do ataque oxidativo durante a síntese de melanina, além de concentrar a melanina para armazenamento nas células pigmentadas dos olhos ou para transferência aos queratinócitos da pele e do cabelo (RAPOSO; MARKS; 2007).
Os melanócitos também estão presentes em tecidos que não necessitam de proteção solar, como em membranas mucosas, mas sua função não é bem compreendida, embora se acredite que exercem função fagocítica, atuem na apresentação de antígenos e produzem citocinas (MIHAJLOVIC et al., 2012).
Apesar da sua relevante importância em produzir melanina, os melanócitos podem acumular mutações, principalmente ocasionadas devido a exposição à radiação UV, desencadeando a transformação maligna dessas células, o que acarreta na oncogênese de um tipo de câncer que possui alta letalidade no mundo: o melanoma (LEONARDI et al., 2018).
17
1.1.2 Patogenia do melanoma
Atualmente, as doenças e agravos não transmissíveis (DANT) são consideradas as principais formas de adoecimento e óbito na população mundial, com destaque para o câncer que corresponde a 21% dos casos de DANT. O seu impacto ocorre principalmente em países de baixo e médio desenvolvimento, com previsão de que sua incidência continue ascendente nas próximas décadas (INCA, 2018).
O câncer é uma doença caracterizada pelo crescimento celular descontrolado, onde células neoplásicas surgem a partir da evolução de células normais por meio de um acúmulo de mutações somáticas e epigenéticas sequenciais. A evolução e progressão tumoral são processos que selecionam habilidades e vantagens específicas, envolvendo o acontecimento de vários mecanismos de alterações celulares e genéticas que afetam o controle de proliferação e diferenciação celular (ciclo celular) e podem provocar a inibição da apoptose. Diferentemente de proliferações benignas, tumores malignos crescem de forma indiscriminada invadindo tecidos subjacentes com capacidade de colonizar outros órgãos (LI et al., 2017; WIESNER et al., 2016).
Entre os diversos cânceres, o de pele apresenta uma elevada incidência no mundo, correspondendo de 1% a 2% de todas as mortes causadas por câncer anualmente. Em geral, podem ser classificados de duas formas: não-melanoma (carcinoma bascoleular e carcinoma espinocelular) e melanoma. O segundo, é uma neoplasia maligna que, embora represente apenas 4% de todos os tumores de pele, é responsável pela maioria das mortes causadas por câncer de pele e surge da proliferação descontrolada dos melanócitos (MATHEUS; VERRI, 2015; WARD; FARMA, 2017). O melanoma se divide em 4 subtipos principais: melanoma extensivo superficial, nodular, lentigo maligno e lentiginoso acral, variando de acordo com suas características fisiopatológicas (TESTA; PELOSI, 2017).
Esse tipo de câncer é altamente agressivo e possui um prognóstico ruim, principalmente quando desenvolve metástase. No melanoma cutâneo, por exemplo, o tumor cresce horizontalmente através da epiderme, mas com baixa capacidade de disseminação para outros órgãos. Porém, na fase de crescimento vertical, com a capacidade de se aderir as paredes dos vasos sanguíneos e invadi-los, o tumor adquire condições de provocar metástases no organismo (HUANG; ROFSTAD; 2018).
18 A forma cutânea geralmente é a mais comum e costuma ser agressiva e resistente ao tratamento convencional com radioterapia, principalmente quando está em estágio avançado. No entanto, essa doença é capaz de afetar diversas outras áreas corporais em que a melanina esteja presente, ocorrendo casos de melanomas oculares, nas meninges, nas mucosas, embora seja raro, e até mesmo em órgãos internos (MIHAJLOVIC et al., 2012; PIENIAZEK; MATKOWSKI; DONIZY, 2012).
Vale ressaltar que é uma doença geneticamente heterogênea, envolvendo uma série de eventos genéticos e epigenéticos até o seu desenvolvimento. Ocorre alterações irreversíveis, como: deleções, amplificações e mutações gênicas. Já as alterações epigenéticas estão associadas a mudanças na expressão gênica sem alterações na sequência do DNA, tendo como principais eventos regulatórios a metilação do DNA e a modificação das histonas (ASCIERTO et al., 2015; HOWELL et al., 2009).
Em 50% dos casos de melanoma cutâneo, a mutação ativadora do gene BRAF da serina-treonina quinase é a mais comum. Com a mutação nesse gene, a proteína BRAF é ativa, o que aumenta a proliferação e o tempo de vida das células tumorais. Em 90% das vezes, ocorre uma troca do aminoácido de valina pelo glutamato na posição 600 do códon (MACKIEWICZ; MACKIEWICZ, 2018).
O BRAF é um oncogene importante para a proliferação e sobrevivência de células do melanoma, ativando vias de sinalização de mitose. Em condições normais, BRAF é recrutado para a membrana plasmática, após a ativação dos receptores dos fatores de crescimento que permitem a ligação do GTP as proteínas RAS. A RAS vinculada ao GTP se liga diretamente ao BRAF, promovendo a ativação da sua atividade quinase. A partir disso, BRAF fosforila MEK quinase, levando ao aumento da atividade catalítica de MEK que, por sua vez, irá fosforilar as cinases reguladas por sinais extracelulares, como ERK1 e ERK2. Essas se translocam para o núcleo onde reside uma variedade de substratos ERK, incluindo fatores de transcrição e tradução, o que resulta na inibição da apoptose (SPAGNOLO; QUEIROLO, 2012).
Já a segunda mutação mais frequente é no gene RAS, presente em 25% dos casos. O que mantém a proteína RAS ativa, tornando-a capaz de ativar outras vias de sinalização. E a terceira mutação mais frequente (14% dos casos) ocorre no gene NF1 (fator 1 do neurofibroma) que perde suas habilidades regulatórias, mantendo a ativação de RAS (MACKIEWICZ; MACKIEWICZ, 2018).
19 Além disso, o microambiente do melanoma é composto por uma população heterogênica de células que também parece contribuir significativamente para o desenvolvimento tumoral, como: fibroblastos, macrófagos, linfócitos, células do sistema imune, adipócitos e células que compõe elementos estruturais dos vasos sanguíneos na matriz extracelular. Esse complexo microambiente está em constante interação, seja diretamente, seja através de proteínas secretoras ou fatores de crescimento (PIENIAZEK; MATKOWSKI; DONIZY, 2012).
1.1.3 Epidemiologia
O melanoma tem aumentado a incidência mais rápido do que qualquer outro câncer no mundo. De 1973 a 2002, cresceu 270%, tornando-se um problema socioeconômico que afeta principalmente a população caucasiana. Em 2018, estima-se mais de 280 mil casos e mais de 60 mil mortes no mundo inteiro. E a expectativa de vida é de apenas 2 anos para pacientes com a forma metastática (HOWELL et al., 2009; RASTRELLI et al., 2014; VICENTE et al., 2019).
Apesar de ser uma parcela menor dos casos de canceres de pele, é responsável por mais de 80% das mortes relatadas por esse tipo de tumor. E isso se deve a forma avançada da doença que causa metástases no sistema linfático e em outros órgãos. Com os tratamentos convencionais de quimioterapia, o tempo médio de sobrevivência dos pacientes nos estágios III e IV do melanoma é de 6 a 9 meses, tendo uma sobrevida em torno de 5 anos somente 5% dos pacientes. Além disso, pacientes tratados com melanoma nos estágios III e IV tem de 50-90% de risco de terem recorrência da doença e, quando recorrente, as chances de óbito são extremamente altas (LI et al., 2017; SCHNEBLE et al., 2014).
A sua ocorrência varia consideravelmente de acordo com a etnia populacional, localização geográfica, assim como a idade e o gênero. São comumente mais observados casos em populações caucasianas, por apresentarem menos melanina, logo menos fotoproteção. Tendo em vista que indivíduos da pele mais escura apresentam mais melanina expressa, o que diminui a penetrância da radiação UVA e UVB através da pele. É sabido que nesses indivíduos essas radiações possuem menor capacidade de induzir a transformação maligna das células da pele (MATTHEWS et al., 2018).
20 O melanoma também é considerado o tipo de câncer mais comum em adultos jovens de 25 a 29 anos, apresentando uma taxa de incidência de 10,2% em homens e 9,8% em mulheres em países desenvolvidos (CiREN; WANG; LONG, 2016).
No entanto, apesar do prognóstico ruim, quando descoberto precocemente, excisões cirúrgicas levam à cura na maioria das vezes (BENSON et al., 2017; MATHEUS; VERRI, 2015). Todavia, 50% dos pacientes com melanoma uveal, por exemplo, desenvolve a forma metastática da doença, que comumente acomete o fígado e costuma ser fatal em 1 ano após o surgimento dos sintomas (DAMATO et al., 2019). Não sendo suficiente abordagens cirúrgicas na forma avançada da doença, o tratamento se torna difícil (WARD; FARMA, 2017).
Um dos órgãos que pode ser acometido durante a sua disseminação é o coração, entretanto, raramente é diagnosticado, pois a maioria dos acometidos são assintomáticos. Estima-se que o tempo de vida desses pacientes é entre 5 e 11 meses, embora os dados a respeito sejam escassos (BENSON et al., 2017).
1.1.4 Fatores de risco
Para o desenvolvimento do melanoma, uma doença considerada multifatorial, é necessário condições genéticas e ambientais favoráveis, as quais são significativamente associadas a susceptibilidade de desenvolver a doença, como: histórico familiar, tipo de pele, quantidade de sardas, cor da pele, olhos e cabelo; lesões pré-malignas e cancerígenas na pele (CiREN, WANG, LONG; 2016; RASTRELLI et al., 2014).
Entre os fatores de risco, destaca-se os indivíduos com histórico familiar de primeiro grau, assim como o desenvolvimento anterior de alguma neoplasia cutânea. Além disso, fatores intrínsecos (idade e classificação de fototipo da pele), genótipo e fenótipo, fatores extrínsecos e de exposição também foram considerados agravantes no desenvolvimento da doença (MATHEUS; VERRI, 2015).
A susceptibilidade genética, por exemplo, parece contribuir, visto que os polimorfismos presentes no gene do receptor MC1R são responsáveis pelos diferentes fenótipos da cor da pele. Da mesma maneira, pacientes com histórico familiar da doença correspondem de 7-15% dos casos (LEONARDI et al., 2018).
Fatores de risco ambientais também estão envolvidos no desenvolvimento do melanoma, sendo a radiação da luz ultravioleta (UV) solar considerada o principal fator
21 para o desenvolvimento de danos em células da pele, incluindo inflamação, imunossupressão e a carcinogênese. Provocando 46% das mutações na patogênese da forma cutânea dessa doença. A radiação UV atua induzindo danos ao DNA devido o surgimento de espécies reativas de oxigênio, seja por reações químicas que ocorrem dentro da molécula de DNA, seja através da quebra do material genético. Enquanto a radiação ionizante é capaz de produzir aglomerados de DNA de cadeia dupla e provocar quebras que medeiam a parada do ciclo celular, a apoptose e o reparo do DNA (LI; HOU; 2018).
Já crianças e adolescentes com histórico de mais de cinco queimaduras solares também apresentam maior risco de desenvolver melanoma. Outro fator correlacionado é a presença de nevo congênito ou adquirido, manchas marrons regulares na pele, visto que 25% dos casos de melanoma surgem de um nevo pré-existente (LEONARDI et al., 2018).
1.2 Resposta imune
1.2.1 Organização do sistema imune
O sistema imune funciona como uma linha de defesa contra patógenos no organismo. Dividindo-se em imunidade inata e adaptativa. A imunidade inata é composta pelos glóbulos brancos (granulócitos, macrófagos, células dendríticas e células natural killer) que possuem atividade fagocítica, secretória citotóxica, assim como também possuem proteínas de fase aguda e moléculas do complemento. De modo geral, são consideradas moléculas que participam da primeira linha de defesa do organismo (MARCONCINI et al., 2018).
Por sua vez, a resposta imune adaptativa é constituída por linfócitos e células apresentadoras de antígeno (APC, do inglês Antigen Presenting Cell), que reconhecem antígenos estranhos e migram aos linfonodos, aonde apresentam patógenos aos linfócitos T, o que requer diversos sinais envolvidos para a sua ativação completa (MARCONCINI et al., 2018).
Para uma resposta imune adaptativa de sucesso é necessário o reconhecimento desses antígenos pelos linfócitos T. No caso das células T alfa e beta, os receptores de células T (TCR, do inglês T Cell Receptor) reconhecem antígenos peptídicos processados apresentados pelo complexo de histocompatibilidade maior (MHC, do inglês Major Histocompatibilty Complex) (BENVENISTE et al., 2018).
22 Logo, linfócitos T naive são ativados e a resposta citotóxica pode ser iniciada por duas vias: o primeiro sinal é mediado pelos TCR’s conectados ao antígeno específico apresentado por uma APC, já o segundo sinal é baseado na interação entre o receptor de CD28 na superfície do linfócito e o CD80/86 na APC. Em contrapartida, células do sistema imune também podem receber sinais inibitórios, a fim de evitar respostas autoimunes, reduzir processos inflamatórios e habilitar uma tolerância fetomaternal (LUGOWASKA; TETERYCZ; RUTKOWSKI, 2018).
Por sua vez, células T reativas contra moléculas próprias são capturadas pela seleção do timo, que atua na auto tolerância evitando o surgimento de doenças autoimunes. Ainda assim, algumas células T auto reativas escapam do timo, mas são reguladas por mecanismos de tolerância periférica. Dessa forma, células T auto reativas são normalmente inibidas, inativadas ou excluídas por células dendríticas que atuam no processo de auto tolerância, possuindo papel importante na manutenção da auto tolerância central e periférica, seja de modo direto, seja gerando e ativando células T regulatórias (Treg) (DAMATO et al., 2019).
O câncer tem como característica a capacidade de evasão dos mecanismos do sistema imune. Embora as mutações cancerígenas possam gerar novos antígenos não-próprios que deveriam ser reconhecidos e extintos pelas células T citotóxicas, a resposta imunológica costuma estar limitada frente a esses antígenos, por geralmente serem semelhantes a moléculas do próprio organismo (DAMATO et al., 2019).
O câncer é clinicamente detectável quando consegue evadir da destruição do sistema imune. Os tumores malignos criam um ambiente imunossupressivo, por exemplo, expressando o ligante de morte programada 1 (PD-L1), que regula a atividade de células T citotóxicas, atraindo células Treg e secretando citocinas imunossupressivas (DAMATO et al., 2019).
PD-L1 se associa a proteína de morte celular programada (PD-1) na superfície de células T e B ativadas, que irão induzir vias inibitórias e gerar um efeito imunossupressor. De modo geral, o microambiente tumoral é caracterizado por múltiplos mecanismos de supressão imune capazes de afligir a imunidade celular efetiva (PETRIZZO et al., 2017).
23
1.2.2 Reconhecimento peptídico
No que concerne ao reconhecimento de peptídeos por TCR’s, para que seja eficaz, é necessário que o complexo MHC-peptídeo seja estável, mas para isso é essencial a afinidade entre peptídeo e MHC. Por isso, novos estudos que observam peptídeos com modificações nos seus resíduos têm sido desenvolvidos para aumentar a estabilidade dos epítopos tumorais (MILES et al., 2011).
A imunogenicidade do peptídeo também está associada com a afinidade pelo MHC, de modo que fortes ligantes são considerados mais propensos a alcançar a apresentação na superfície celular e, portanto, o reconhecimento imunológico. Diversos fatores são considerados relevantes na imunogenicidade de um peptídeo, como a sua abundância, afinidade com o MHC, estabilidade e composição de aminoácidos (GHORANI et al., 2017).
A partir de estudos com peptídeos modificados, foi percebido que o reconhecimento de antígenos é flexível, podendo resultar em funções e sinalizações distintas na seletividade de células T. De acordo com a resposta imunológica provocada, os peptídeos podem ser classificados em agonistas, que induzem a ativação de linfócitos T, a proliferação e secreção de citocinas e a morte celular citotóxica; agonistas parciais, ativam linfócitos T e funções efetoras; agonistas nulos, não ativam linfócitos T e, por último, os antagonistas, que inibem a ativação dessa linha de defesa (SCHAFT et al., 2013).
Uma classe de antígenos tumorais que tem sido alvo de estudo são os neoantígenos ou antígenos específicos tumorais (TSA, do inglês Tumor Specific Antigen), que correspondem a peptídeos não próprios de mutações genéticas específicas de tumores, que são apresentados nas superfícies de células tumorais com potencial de desencadear uma resposta imune. Essas mutações geralmente são únicas para cada indivíduo, representando medicina personalizada (GRENIER; YEUNG; KHANNA, 2018; JIANG et., 2019; WOOD et al., 2018).
Antígenos próprios também podem ser expressos em tecidos neoplásicos, com capacidade de desencadear uma resposta imune, mas devido a expressão em tecidos normais também podem promover a ativação de mecanismos de auto tolerância. Em contrapartida, os antígenos derivados de proteínas mutadas são reconhecidos por células T sem sofrer influência da tolerância imunológica central, por não serem expressos em
24 tecidos saudáveis. Além disso, o direcionamento de neoantígenos tumorais pode ser mais específico e menos tóxico do que outras abordagens, o que os tornaram alvos atraentes para imunoterapia (EFREMOVA et al., 2017).
Curiosamente, as células do melanoma são capazes de processar e apresentar peptídeos modificados antagonistas, o que fornece sugestões para prevenir a ativação máxima de células T intra-tumorais e facilitar a evasão imune. No entanto, a supressão imune mediada por peptídeos variantes antagonistas pode ser invertida pelos ligantes peptídicos alterados (APL, do inglês Altered Peptide Ligands), que são capazes de sensibilizar células T. Por isso, os APL’s também estão sendo usados na imunoterapia com o objetivo de aumentar a resposta imunológica contra doenças autoimunes, infecciosas e o câncer (SCHAFT et al., 2013).
Estudos anteriores demonstraram que neoepítopos derivados de mutações são capazes de aumentar a afinidade pelo MHC de classe I, resultando numa apresentação de ligantes que normalmente não seriam apresentados. Além disso, a estabilidade da interação MHC-TCR pode ser melhorada, levando a diferentes respostas imunes (JIANG et al., 2019). Mas a qualidade dos neoantígenos depende crucialmente da posição do aminoácido mutado na sequência peptídica ligada ao MHC. Mutações em posições de ancoragem afetam substancialmente a afinidade do peptídeo, enquanto mutações fora da interação com a âncora do MHC irão influenciar na interação do complexo peptídeo-MHC com o TCR (WIRTH; KUHNEL, 2017).
1.2.3 Papel do MHC na resposta imune
Em humanos, o MHC é codificado pelo gene do HLA (do inglês, Human Leukocyte Antigen), localizado no cromossomo 6p21.3. Esses locus é caracterizado pelo seu elevado polimorfismo, com mais de 12 mil alelos já descobertos. Por causa dos genes do HLA serem extremamente individualizados, a tipagem precisa desses genes é essencial na predição de novos antígenos, o que também será fundamental numa apresentação antigênica eficaz, considerando que o reconhecimento peptídeo-MHC (pMHC) se baseia na afinidade de ligação desse complexo (RICHTERS et al., 2019).
O HLA se divide em classe I e classe II, diferenciando-se de acordo com o tipo de células que os expressam, pelo processamento intracelular e pelo tipo de célula T que os reconhecem. O primeiro é responsável por processar principalmente proteínas intracelulares e apresentam peptídeos curtos de 8-10 aminoácidos para linfócitos T CD8+;
25 enquanto o HLA de classe II processam proteínas extracelulares endocitadas, referindo-se a peptídeos maiores de 11-20 aminoácidos que são aprereferindo-sentados a linfócitos T CD4+ (GOEDEGEBUURE; GILLANDERS, 2017; MULLER et al., 2017).
O MHC de classe I é expresso na superfície celular como um complexo constituído por uma cadeia pesada α polimórfica, que reconhece o peptídeo, apresentando uma porção transmembrana e uma porção extracelular (compostos de 362-366 aminoácidos), dividindo-se em três domínios: α1, α2 e α3; e pela subunidade beta conservada codificada pelo cromossomo 15, denominada de β2-microglobuina (β2m), que é necessária para a estruturação e ligações adequadas (Figura 01). A população humana tem ampla diversidade da cadeia alfa, apresentando tipos de alelos que se enquadram em três principais subtipos: HLA-A, HLA-B e HLA-C. Cada um apresentando centenas de variações com ligações peptídicas específicas (ALDOUS; DONG, 2018; POSCH; HURLEY, 2011; WINCHESTER, 2008).
Figura 1 – Domínios que compõe o HLA I. Elaborada pela autora.
As cadeias α1 e α2 se dobram para formar um sulco (para ligação do antígeno) distal à membrana celular, formada por oito fitas beta antiparalelas e duas hélices alfa. Enquanto a cadeia α3 proximal da membrana se dobra em uma estrutura semelhante à dos domínios da região constante das imunoglobulinas, composto por duas folhas beta antiparalelas ligadas por uma ponte dissulfeto. Já a cadeia β2m não está covalentemente
26 associada ao domínio α3 e é necessária para a expressão na superfície celular, sendo idêntica ao domínio α3 (POSCH; HURLEY, 2011).
Até então, mais de 15 mil moléculas de HLA já foram identificadas que participam do reconhecimento de antígenos. Apesar da sua diversidade, alguns alelos têm motivos de ligação semelhantes, o que se torna útil em pesquisas envolvendo peptídeos apresentados por MHC de classe I, contribuindo em estudos de reconhecimento e desenvolvimento de vacinas (ZHU et al., 2019).
1.2.4 Imunoterapia
Considerando a possibilidade de interação do sistema imune com moléculas presentes nas superfícies de células cancerígenas, a imunoterapia tem revolucionado os tratamentos na área da oncologia (LUGOWASKA; TETERYCZ; RUTKOWSKI, 2018). Progredindo, consideravelmente, graças à introdução de anticorpos bloqueadores, especialmente os bloqueadores de PD-1 e PD-L1. No entanto, apenas uma parte dos pacientes é beneficiada e funciona apenas para alguns tipos de câncer (FOTAKI et al., 2018).
O melanoma por ser altamente resistente a diversos regimentos quimioterápicos e ser um dos tumores mais imunogênicos, tornou-se alvo de estudo com abordagens imunoterápicas que consistem em: inibidores imunes de checkpoint, citocinas e vacinas; estando o estudo de novas abordagens terapêuticas em foco por décadas (BOUDEWIJNS et al., 2016; CHANG; XIA, 2015).
Os anticorpos inibidores imunes de checkpoint têm demonstrado benefícios clínicos duráveis em pacientes com melanoma, embora parte dos pacientes permaneçam refratários à doença. Através da combinação com imunizações ativas, a resposta desses pacientes é melhorada, sendo as vacinas consideradas uma boa opção como tratamento complementar (ROJAS-SEPÚLVEDA et al., 2018).
Devido à baixa imunogenicidade de muitos tumores, por ser a imunidade mediada por células T CD8+ geralmente fraca e insuficiente, a vacinação poderia induzir a expansão e diversificação do pool de linfócitos T tumor-específicos. Nesse sentido, houve progresso nas formulações clínicas de vacinas contra o câncer, assim como na habilidade de potencializar a resposta antitumoral (HAILEMICHAEL et al., 2018).
27 Esse tema é estudado desde 1950, quando se percebeu que antígenos específicos eram capazes de induzir uma resposta imune. Desde então, diversos estudos têm focado em vacinas para o melanoma. Importantes avanços ocorreram no delineamento de princípios básicos no design de vacinas antitumorais, embora os resultados ainda não sejam satisfatórios, não demonstrando os benefícios e o efeito esperado (MARCOCINI et al., 2018; VASQUEZ; TENESACA; BERRAONDO, 2017).
Essas vacinas visam “educar” o sistema imune dos pacientes a reconhecer e erradicar células cancerígenas, ativando e amplificando o pool de células T CD8+ contra peptídeos antigênicos do tumor ou neopeptídeos expressos por células cancerígenas (FOTAKI et al., 2018; JIANG et al., 2019).
Esses neoantígenos são capturados por APC’s que ao serem ativadas migram para os linfonodos, onde as moléculas de MHC apresentam os neoepítopos aos linfócitos T. O reconhecimento dos TCR’s pelos antígenos apresentados resulta na ativação da imunidade das células T e posteriormente na sua expansão, tráfego e infiltração no microambiente tumoral, onde os linfócitos T citotóxicos atuam eliminando as células cancerígenas (Figura 02) (PAN et al., 2018). Esse é um método potencial para gerar uma resposta imune adaptativa contra células tumorais, apesar de demonstrar limitações até então como monoterapia (GRENIER et al., 2018; HIRAYAMA; NISHIMURA, 2016).
28 Percebeu-se ainda que as vacinas apresentavam uma toxicidade mínima ao induzir novas respostas imunes ou aumentar respostas imunológicas fracas contra antígenos específicos associados ao melanoma. Por isso, tais abordagens tornaram-se uma opção em atuar como aditivos ou sinérgicos a imunoterapias existentes e emergentes. Até então, diversas estratégias vacinais para imunoterapia já obtiveram resultados favoráveis, que são melhoradas quanto à resposta imune gerada ao se utilizar adjuvantes e citocinas modificadoras de resposta biológica (CHANG; XIA; 2015).
Em diversos estudos pré-clínicos e clínicos, peptídeos têm sido usados na formulação de vacinas e apresentam diversas vantagens como: baixo custo, estabilidade aumentada e segurança relativa. Todavia, ainda há algumas limitações a serem enfrentadas, o que inclui a evasão imune e antígenos tumorais com imunogenicidade fraca (PAN et al., 2018).
De modo geral, não são observados efeitos graves após a administração de peptídeos sintéticos. Ocorrendo eritema, dor e febre na minoria dos casos; sendo esses sintomas geralmente associados aos adjuvantes administrados juntamente com a vacina. No entanto, alguns pacientes demonstram sinais clínicos de resposta à terapia (PARMIANI et al., 2003).
Quando comparado a tratamentos convencionais, como agentes quimioterápicos, que tem efeito diretamente citotóxico contra as células neoplásicas, avaliando-se a resposta ao tratamento de acordo a redução do volume tumoral; a imunoterapia é diferente, induzindo a morte celular mais sofisticada e envolvendo a ação de diferentes células e mecanismos do sistema imunológico. Tendo em vista que pacientes podem apresentar efeitos clínicos relevantes, mas conseguindo estabilizar a doença por um longo período, a avaliação isolada da resposta citotóxica não é totalmente capaz de avaliar corretamente o benefício gerado (LINCK; COSTA; GARICOCHEA, 2017).
Os avanços terapêuticos até então observados através da imunoterapia se devem crucialmente às descobertas científicas nas áreas da imunologia molecular e biologia das neoplasias. Tornando essa opção de tratamento viável para pacientes com câncer avançado ao produzir efeitos mais eficazes e ser uma abordagem mais direcionada (SCHNEBLE et al., 2014; LIMA et al., 2017). Todavia, esses tratamentos podem provocar efeitos colaterais severos, possuem um custo elevado e nem todos os pacientes
29 conseguem desenvolver uma resposta antitumoral eficaz (LINCK; COSTA; GARICOCHEA, 2017).
Por isso, frente a essas limitações, a determinação dos antígenos tumorais ideais é fundamental na formulação de vacinas para futuras pesquisas. Só assim, se chegará a melhor formulação da vacina, que, por enquanto, ainda é desconhecida (GRENIER; YEUNG; KHANNA, 2018).
1.2.5 Glicoproteina 100
Atualmente, as vacinas contra o câncer têm utilizado antígenos associados ao tumor (TAA, do inglês Tumor-Associated Antigen), que são altamente expressos no tecido neoplásico, mas também são expressos em tecidos normais. De modo geral, os TAA´s com potencial imunogênico podem ser classificados de diferentes formas. Um subtipo classificatório são os antígenos que expressam moléculas relacionadas com a diferenciação celular como, por exemplo, a glicoproteína 100 (gp100), encontrada principalmente em melanomas (ASCIERTO et al., 2015; BABA et al., 2010; JIANG et al., 2019).
A gp100 é uma glicoproteína transmembrana de linhagem melanocítica, constituída por 661 aminoácidos, expressa na maioria dos melanomas malignos, mas não em outros tipos celulares tumorais ou células normais (com exceção dos melanócitos e células pigmentadas da retina) (BABA et al., 2010). Atua como componente estrutural fibrilar do melanossoma, onde a melanina é armazenada. Acumulando-se nos estágios iniciais de formação e maturação dos melanossomas e é mascarada pela melanina nos estágios posteriores. Participando de forma crucial da produção de melanina (GRAHAM et., 2019; PATEL et al., 2018; RAPOSO; MARKS; 2007).
A gp100 também é conhecida como proteína pré-melanossômica (PMEL, do inglês pre-melanosomal protein) ou PMEL17. De natureza amiloide, é composta de um peptídeo sinal pequeno, que é removido por peptidases, um domínio N-terminal longo luminal, um domínio transmembrana único e um domínio C-terminal citoplasmático. Devido ao processo de splicing alternativo, quatro diferentes isoformas humanas são encontradas: uma longa, uma intermediária e duas curtas, de forma que todas são co-expressas e desempenham funções distintas na oligomerização e formação fibrilar (BISSIG; ROCHIN; NIEL, 2016; WATT et al., 2013).
30 Essa glicoproteína é reconhecida por anticorpos que são utilizados como marcadores no diagnóstico do melanoma humano (NKI-beteb, HMB-50 e HMB-45). Observou-se também que clones de células T de pacientes com melanoma apresentavam rejeição espontânea do tumor, devido o reconhecimento desse alvo terapêutico. Logo, peptídeos epítopos derivados da gp100 têm sido considerados promissores antígenos para imunoterapia contra essa forma de câncer de pele, pois seriam capazes de induzir uma resposta imune anti-gp100 e suprimir o crescimento tumoral (BABA et al., 2010; GUPTA et al., 2015; PATEL et al., 2018).
A gp100 foi primeiramente identificada associada ao melanoma após o isolamento de linfócitos T citotóxicos específicos da doença que reconheceram fragmentos da glicoproteína apresentados pelo HLA. Em condições normais, costuma ser pouco expressa nos melanócitos, mas altamente expressa nas células cancerígenas do melanoma. Observando-se que o fragmento da gp100280-288 tem afinidade pelo HLA-A*0201, o que
a tornou uma fonte de estudo terapêutico (DAMATO et al., 2019; GELBART et al., 2004).
Considerando o potencial imunogênico dessa glicoproteína, pacientes com melanoma foram vacinados com epítopos provenientes desse antígeno, induzindo uma fraca resposta de células T, por serem antígenos próprios. No entanto, quando se introduzia alterações nos resíduos da sequência peptídica, a sua imunogenicidade aumentou significativamente, devido ao aumento da afinidade pelo MHC (ALDOUS; DONG, 2018; GRENIER; YEUNG; KHANNA, 2018).
Por isso, diversos trabalhos testando peptídeos gp100 modificados têm sido realizados, apresentando respostas clínicas melhoradas e aumento no tempo de sobrevida. Demostrando que são necessárias alterações peptídicas que aprimorem a eficácia no seu reconhecimento pelo sistema imune. O que requer um conhecimento estrutural detalhado dessas interações imunológicas (COLE et al., 2011; KWAK et al., 2019).
Outros fatores determinantes para a imunogenicidade provocada pela vacina são: a escolha do antígeno a ser utilizado; o próprio microambiente tumoral, por possuir diversos mecanismos capazes de interferir na função das células do sistema imune, e até o comprimento dos peptídeos utilizados. Os peptídeos pequenos são constituídos de 8-11 aminoácidos que correspondem a região do epítopo que se ligará ao HLA. Sendo crucial
31 que a interação pMHC seja específica, a fim de garantir uma resposta de células T contra o antígeno (ALDOUS; DONG, 2018; GRENIER; YEUNG; KHANNA, 2018).
Tendo em vista que pacientes com a forma metastática do melanoma não têm muitas opções de tratamento eficazes, a vacinação com antígenos específicos do tumor se tornou uma alternativa para a regressão tumoral. Porém, esse tipo de tratamento ainda é limitado quanto aos seus benefícios clínicos, ocorrendo a regressão tumoral completa em apenas 10% dos pacientes vacinados. Para que sejam desenvolvidas abordagens terapêuticas mais efetivas é necessário um melhor conhecimento dos mecanismos celulares e moleculares existentes envolvidos na doença (CORBIÈRE et al., 2011; HOWELL et al., 2009).
Além disso, as vacinas até então utilizadas para o tratamento de pacientes com a forma avançada do melanoma causam nos indivíduos efeitos adversos, como o surgimento de reação granulomatosa com nódulos subcutâneos, indicando uma forte resposta a terapia. Portanto, torna-se explícita a necessidade de novos estudos sobre a formulação dos peptídeos usados para vacinação na imunoterapia com o intuito de diminuir os riscos para o paciente (ARIA et al., 2018).
1.3 Modelagem molecular
Técnicas computacionais para modelagem de estruturas biológicas grandes surgiram como um modelo experimental importante, permitindo conhecer informações essenciais na análise de dados estruturais e cinéticos de macromoléculas, além de fatores estáticos e dinâmicos (BIKIEL et al., 2006). Foi considerado um avanço no estudo da biologia molecular e biofísica compreender, a nível atômico, moléculas proteicas e as interações químicas que as norteiam (MENDIATA-MORENO et al., 2015).
Por meio da modelagem computacional, o design de ligantes com funções farmacológicas específicas é facilitado, pois contribui na compreensão acerca das interações envolvidas no reconhecimento molecular entre ligante-receptor (GILSON; ZHOU, 2007; YILMAZER; KORTH, 2016). Além disso, o estudo sobre afinidades de ligações é de imenso interesse na química farmacêutica e no desenvolvimento de novas drogas (RYDE; SODERHJELM, 2016).
Isso tem sido possível devido as melhorias das metodologias e dos hardwares empregados, permitindo o estudo de biomoléculas in silico (BIKIEL et al., 2006).
32 Contribuindo, inclusive, de acordo com estudos recentes, na descoberta de neoantígenos relacionados ao processo de tumorogênese (MULLER et al., 2017).
Obtendo-se boa acurácia nos resultados, até então, os métodos baseados em mecânica quântica (QM, do inglês Quantum Mechanics) têm sido utilizados na compreensão dessas estruturas biológicas, como as interações envolvidas no sítio de ligação de complexos droga-receptor (KOLLAR; FRECER, 2017; MERZ JR., 2014). Conseguindo descrever reações químicas para sistemas que envolvem centenas de átomos com um bom nível de precisão (FRIESNER; GUALLAR, 2005).
Anteriormente, a QM era utilizada para o estudo de moléculas pequenas, devido ao tempo computacional e o espaço de memória requerido. Porém, devido aos avanços nas metodologias utilizadas, seu uso se expandiu para o estudo de estruturas mais complexas. Conseguindo determinar propriedades moleculares quantitativamente e explicar a natureza das ligações químicas presentes (GAVEZZOTTI, 2011; MORGON; CUSTODIO, 1994).
Os métodos de QM são baseados na solução da equação de Schrodinger (Ĥψ = Eψ), onde E é a energia total e Ĥ é o operador hamiltoniano que define o sistema (as partículas envolvidas, ou seja, elétrons, núcleos e suas interações). E, a partir da função de onda, ψ, todas as propriedades mensuráveis do sistema podem ser calculadas. No entanto, o seu uso só é viável para cálculos mais simples de um elétron, para todos os outros sistemas, apenas soluções aproximadas podem ser encontradas (RYDE; SODERHJELM, 2016).
Há dois tipos básicos de métodos baseados em QM: o modelo ab initio que requer apenas as posições e o número de átomos, e funciona resolvendo a equação de Schrodinger para cada elétron do sistema. Sendo capaz de descrever interações moleculares, mas a um custo computacional muito alto para sistemas biológicos. E o segundo modelo é o semi-empírico, que parametriza o Hamiltoniano para ajustá-lo aos dados experimentais ou aos resultados dos cálculos principais. Considerado um modelo com excelente eficiência computacional (JING; HAN, 2009).
Ainda há o conhecido método de Hartree-Fock (HF) que supõe que cada elétron interage com o campo médio de todos os outros elétrons, entretanto é uma aproximação generalista por omitir o movimento correlacionado dos elétrons (RYDE; SODERHJELM, 2016).
33 Os métodos de QM são necessários em estudos onde ocorre um rearranjo significativo da densidade eletrônica devido a associação ao ligante, como: a formação de ligações covalentes, transferência de prótons, transferência de carga, quelação de metais, forte polarização do ligante ou local de ligação, etc. Esses fenômenos não podem ser adequadamente descritos por Mecânica molecular (MM) que depende (com exceção de campos de forças reativos e polarizáveis) de moléculas pré-determinadas, parâmetros dos campos de força atômicos fixos e cargas atômicas parciais constantes (KOLLAR; FRECER, 2017).
Além disso, nos métodos de MM, os elétrons são ignorados e a energia do sistema em função das coordenadas é descrita por uma função empírica, um campo de força (RYDE, 2016). Dessa maneira, os teoremas padrões da física clássica fornecem uma avaliação pouco precisa quanto as baseadas na densidade eletrônica (GAVEZZOTTI, 2011).
No que se refere aos campos de força da mecânica molecular, fornecem uma boa descrição da energia conformacional e interações de estruturas proteicas. Por isso, criou-se abordagens que envolvem QM/MM, capazes de descrever adequadamente as superfícies potenciais de energia relevantes (FRIESNER; GUALLAR, 2005). O modelo híbrido QM/MM representa uma solução para estudos computacionais que envolvem uma extensa quantidade de ligantes, tendo em vista que o ligante e a parte selecionada do sítio de ligação da proteína são tratados por QM, enquanto a parte restante da estrutura e o solvente que a circunda é tratada pela abordagem MM, que é computacionalmente menos exigente (KOLLAR; FRECER, 2017).
Uma das principais vantagens dos cálculos QM/MM é que permitem uma interpretação e compreensão completa dos resultados. Reproduzindo dados experimentais de maneira razoável e demonstrando como o ambiente afeta as estruturas e as energias de reação (RYDE, 2016).
Além disso, a utilização de abordagens hibridas de QM/MM requerem uma demanda computacional menor. Tornando-se uma opção viável no estudo de biomoléculas através de cálculos baseados nas suas estruturas eletrônicas, quando levado em conta a complexidade e o tamanho de sistemas biológicos (BIKIEL et al., 2006; KOLLAR; FRECER, 2017).
34 No entanto, o desempenho de abordagens de QM/MM é limitado. Seja por limitações do campo de força, seja pela inexatidão do próprio modelo. Porém, os erros podem ser diminuídos através da utilização de funcionais de densidade (ALBAUGH et al., 2016). Permitindo uma melhor descrição de sistemas com ligações não-covalentes, como as forças de Van der Waals (FRAZÃO et al., 2016).
Para se obter melhor acurácia na aproximação para os valores dos funcionais obtidos, a variação espacial da densidade pode ser considerada, por meio do termo de troca e correlação da Aproximação de Gradiente Generalizado (GGA, do inglês Generalized Gradient Approximation), parametrização desenvolvida por Perdew-Burke-Ernzerhof (PBE), assim como associado de uma correção de dispersão e conjunto de bases (ANTONY; GRIMME, 2012; OURIQUE et al., 2016).
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OBJETIVOS
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2.1 Objetivos Gerais
Este trabalho pretende, através de uma abordagem quântica in silico, determinar as interações existentes entre três peptídeos provenientes da proteína gp100, apresentando mutações distintas em sua sequência, com a molécula de HLA-A*0201. A fim de identificar os resíduos de maior importância nesta ligação e avaliar o impacto gerado na afinidade pela molécula de HLA-A*0201 devido as mutações na sequência peptídica.
2.2 Objetivos Específicos
• Quantificar as energias de interação entre os resíduos dos três peptídeos alvos do estudo e os resíduos do HLA-A*0201;
• Identificar os resíduos mais importantes dos peptídeos e do HLA-A*0201 para interação;
• Observar o impacto na energia de interação com o HLA-A*0201, devido as mutações na sequência de aminoácidos dos peptídeos, comparando-se as divergências energéticas entre as estruturas;
• Descrever as interações mais pertinentes que norteiam os sistemas peptídeo-HLA-A*0201, caracterizando os tipos de interação e avaliando de acordo com a sua importância;
• Comparar os resultados obtidos com os dados já existentes na literatura acerca do tema.
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METODOLOGIA
38 Neste tópico, será abordado os fundamentos metodológicos utilizados como base experimental neste estudo. Explorando-se a forma de obtenção das moléculas, o processo de otimização a qual foram submetidas, as diretrizes de simulação computacional utilizadas e os métodos empregados, que se baseiam sumariamente em modelos ab initio de mecânica quântica, na Teoria do Funcional da Densidade (DFT) e no Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas (MFCC).
3.1 Obtenção da estrutura cristalográfica
A obtenção das estruturas cristalográficas utilizadas para realização de cálculos de estudos in silico foi através do banco de dados Research Collaboratory for Structural Bioinformatics – Protein Data Bank (RCSB/PDB), que contém moléculas biológicas tridimensionais em seu repositório. As macromoléculas utilizadas nesse estudo são identificadas pelos códigos e suas respectivas resoluções: 5EU4 (2.12 Å), 5EU5 (1.54 Å) e 5EU6 (2.02 Å) (BIANCHI et al., 2016). A estrutura 5EU4 é constituída pela cadeia alfa e beta-2-microglobulina da molécula HLA-A2 e o peptídeo YLAPGPVTA. Já a estrutura5EU5 é constituída pela cadeia alfa e beta-2-microglobulina da molécula HLA-A2 e o peptídeo YLEPAPVTA. Enquanto a estrutura 5EU6 é constituída pela cadeia alfa e beta-2-microglobulina da molécula HLA-A2, as cadeias leve e pesada do TCR e o peptídeo YLEPGPVTV. Os peptídeos variavam na sequência de aminoácidos constituintes (destacado em negrito):
• 5EU4: Tyr-Leu-Ala-Pro-Gly-Pro-Val-Thr-Ala • 5EU5: Tyr-Leu-Glu-Pro-Ala-Pro-Val-Thr-Ala • 5EU6: Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Val-Thr-Val
As estruturas cristalográficas de complexos proteína-ligante, como as utilizadas neste trabalho, são comumente obtidas através da técnica de difração por Raio-X. Decorrente das interações com os elétrons das moléculas, os Raio-X são irradiados criando padrões de difração. A partir disso, softwares são utilizados para associar as coordenadas atômicas à densidade eletrônica, de acordo com o padrão de difração de raio-X. Logo, um conjunto de posições atômicas pode ser identificado, gerando-se estruturas tridimensionais in sílico que servem como modelos para o estudo da interação entre ligantes e proteínas (GAVEZZOTTI, 2011; LUKAC et al., 2019).
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3.2 Otimização da Estrutura e Simulação Computacional
No estudo de sistemas proteína-ligante, que utiliza metodologias aplicadas envolvendo mecânica quântica/mecânica molecular, é necessário processos de otimização geométrica nas estruturas cristalográficas, para se trabalhar com modelos energeticamente estáveis. Sendo, por exemplo, otimizadas através de campos de força e pré-fixadas no espaço por meio de simulação computacional (RYDE, 2016; XIANG; ZHANG; ZHANG, 2004). Nesse trabalho, utilizou-se o software Discovery Studio 3.1 para as otimizações necessárias nos sistemas.
Como já exposto, atualmente, a maioria das informações estruturais sobre macromoléculas biológicas é obtida a partir da cristalografia por raio-X. No entanto, uma limitação relevante desse modelo de estudo é que os átomos de hidrogênio raramente podem ser visualizados nos mapas de densidade eletrônica, pois a dispersão de apenas um elétron é muito fraca. Requerendo protocolos de refinamento para aprimorar essas estruturas (CALDARARU et al., 2019). Por isso, os átomos de hidrogênio foram adicionados as suas respectivas posições no processo de otimização (VIANNA et al., 2019).
Considerando que os campos de força de mecânica molecular (MM), para o estudo de proteínas, aumentaram consideravelmente em precisão e robustez, fornecendo informações energéticas conformacionais razoáveis e distribuição de cargas de energia em aplicações realísticas (FRIESNER; GUALLAR, 2005). Foi utilizado o campo de força Charmm (do inglês, Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics Forcefield), que é um modelo molecular de simulação de fase condensada amplamente disponível. O seu uso permite uma melhor distribuição espacial ou média temporal das moléculas que é ditada pela lei da estatística mecânica, tratando-se de um modelo de otimização geométrica parametrizado especialmente para moléculas orgânicas (ALBAUGH et al., 2016; LIMA NETO et al., 2017).
Neste tipo de estudo teórico, a água pode ser considerada, a fim de similar o ambiente solvatado, tendo em vista que as moléculas de água que estão presentes no ambiente proteico desempenham um papel importante na sua estabilidade estrutural e também na sua função (GILSON; ZHOU, 2007; KATAGIRI et al., 2008). Além disso, a maioria dos processos biológicos ocorrem em solução, tais como: associação proteína-ligante, interação proteína-proteína e dobragem de proteínas (o que também afeta sua
40 conformação) (WANG et al., 2018). Portanto, as moléculas de água presentes nas estruturas cristalográficas foram consideradas para os cálculos energéticos, de modo que cada molécula foi associada uma única vez apenas ao aminoácido mais próximo em que fazia ligação de hidrogênio.
As estruturas estavam em Ph fisiológico e o estado de protonação dos complexos peptídeo-HLA também foram ajustados, de acordo com os resultados obtidos do PROPKA 3.1 (TAVERES et al., 2019).
3.3 Simulação computacional de sistemas biológicos
3.3.1 Determinação das Energias de Interação
Inicialmente, estabeleceu-se limites para o estudo das interações entre os peptídeos e o HLA-A*0201, pois o cálculo a nível quântico de todas as interações envolvidas entre o complexo ligante-receptor é inviável por simulação computacional (BEZERRA et al., 2018). Desta forma, determinou-se um raio de 8Å em torno de cada aminoácido constituinte dos peptídeos, a fim de estudar apenas as interações mais relevantes com o HLA englobadas nesse raio (Figura 03).
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Figura 3 – Raio de interação (8Å) pontilhado de cor preta utilizado a partir do aminoácido Gly5 do peptídeo. Elaborada pela autora.
Por isso, a cadeia beta-2-microglobulina do HLA não foi considerada nos cálculos energéticos de nenhuma das estruturas, por seus aminoácidos estarem a uma distância superior a estipulada. Já o complexo identificado pelo código 5EU6 também havia cadeias referentes ao TCR, que também foram desconsideradas, visto que o alvo do estudo é analisar as interações apenas com a molécula de HLA. Logo, os procedimentos prévios de otimização de cada estrutura ocorreram apenas entre os peptídeos e as cadeias alfas do HLA, assim como os cálculos das energias de interação dos sistemas.
Para realização de cálculos energéticos e estudo físico/químico envolvendo a interação de biomoléculas, a metodologia empregada neste estudo baseou-se no modelo QM, devido as vantagens explicitadas anteriormente no tópico 1.3 Modelagem molecular. E, para melhorar a acurácia dos resultados frente à limitação dessa abordagem, utilizou-se o modelo GGA com funcional de densidade com correção de dispersão associado do tipo B97D e o conjunto de bases cc-pvtz.
3.3.2 Método de Fragmentação Molecular com Capas Conjugadas
Os métodos de fragmentação emergiram como uma abordagem de alta eficiência para o estudo de sistemas grandes, baseando-se na “localidade química” de estruturas macromoleculares, que pressupõe que a região local de uma macromolécula é influenciada fracamente pelos átomos de longa distância. Dividindo-se, neste caso, a estrutura em subsistemas. Posteriormente, a energia total e as propriedades moleculares podem ser obtidas com uma combinação adequada dos termos correspondentes da fragmentação individual. Por isso, essa metodologia tem sido largamente aplicada no estudo de sistemas moleculares complexos (HE et al., 2014).
Entre esses métodos, o Método de Fragmentação Molecular com Capas Conjugadas (MFCC, do inglês Molecular Fractionation with Conjugated Caps) pode ser aplicado para estudar proteínas (ou macromoléculas de modo geral). Essas estruturas são virtualmente decompostas em fragmentos à base de aminoácidos cujas extremidades são delimitadas por caps (par de grupamentos químicos que separem os fragmentos vizinhos e é conjugado ao fragmento alvo de estudo, a fim de mimetizar o ambiente proteico nas interações de resíduos e saturar as valências pendentes). Além disso, átomos de hidrogênio são introduzidos nas extremidades dos caps, a fim de atender aos requisitos
