UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
YANNE NAARA TEIXEIRA DE CARVALHO
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE DE BACILOS GRAM-NEGATIVOS ISOLADOS DE CULTURA DE VIGILÂNCIA AO IMIPENEM E
POLIMIXINA B
NATAL Abril 2021
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE DE BACILOS GRAM- NEGATIVOS ISOLADOS DE CULTURA DE VIGILÂNCIA AO IMIPENEM E
POLIMIXINA B
Por
YANNE NAARA TEIXEIRA DE CARVALHO
Monografia Apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto
NATAL Abril 2021
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Carvalho, Yanne Naara Teixeira de.
Avaliação do perfil de susceptibilidade de bacilos Gram-negativos isolados de cultura de vigilância ao imipenem e polimixina B / Yanne Naara Teixeira de Carvalho. - Natal, 2021.
86 f.: il.
Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Curso de Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto.
1. Resistência bacteriana a antibióticos - Monografia. 2. Bactérias Gram-Negativas - Monografia. 3. Infecção hospitalar - Monografia. 4. Imipenem - Monografia. 5. Polimixina B - Monografia. I. Motta Neto, Renato. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSCB CDU 579.84
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
A Monografia „‟Avaliação do perfil de susceptibilidade de bacilos Gram-negativos isolados de cultura de vigilância ao imipenem e polimixina B‟‟ elaborada por Yanne Naara Teixeira de Carvalho e aprovada por todos os membros da Banca examinadora foi aceita pelo Curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de
BACHAREL EM BIOMEDICINA
Natal, 19 de abril de 2021
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________ Prof. Dr. Renato Motta Neto
(Departamento de Microbiologia e Parasitologia - UFRN)
_________________________________________ Prof Dra. Rosely de Vasconcellos Meissner
(Departamento de Microbiologia e Parasitologia - UFRN)
_________________________________________ Isabela Maria Fortaleza Neves Bomfim
AGRADECIMENTOS
A Deus, criador de todas as coisas, pela vida, saúde, por guiar o meu caminho e ser diariamente o meu suporte.
A minha família por sempre me apoiar, incentivar e reerguer. Pela paciência, amor, parceria e por serem responsáveis pelo que sou. Agradeço em especial a minha mãe, Leila Karla Teixeira, por ser o meu maior exemplo de mulher guerreira, forte, persistente e inteligente. Por abdicar de tanto para sempre me dar o melhor, pelo amor e cuidado incondicional, por sempre me aconselhar, proteger, corrigir, incentivar e ensinar o certo. Ao meu irmão, Yann Muniz, pelos conselhos, amizade e parceria. Por cuidar de mim, me incentivar, impulsionar, amar e por ser um excelente irmão, amigo e confidente.
A minha tia Liege Maria por todo investimento feito em mim, apoio, carinho e por ajudar a cuidar da nossa família.
A Bela Fortaleza que me recebeu de braços abertos em sua pesquisa, pelos inúmeros ensinamentos, pela confiança depositada em mim, por nossa amizade e pelo auxílio inestimável na realização desse trabalho.
Ao meu orientador Prof. Dr. Renato Motta Neto pelos ensinamentos, projetos desenvolvidos e orientação.
Aos membros da banca, pela disponibilidade e atenção.
Aos colegas, professores e colaboradores do LABMIC e todo o DMP.
Aos amigos de curso (Juliane, Marília, Helmut, Thayrone, Vladimir, Francielton, Maíra e Camila) que me acompanharam durante os anos de graduação e facilitaram todo esse processo. Por nossa amizade, risadas, fofocas, ajuda, apoio, companheirismo, carinho e amparo psicológico.
A UFRN por possibilitar uma formação profissional de excelência durante toda a graduação. A todos os laboratórios, técnicos e professores que fizeram parte dessa trajetória.
E a todos que de alguma forma contribuíram para que esse sonho fosse realizado.
RESUMO
Introdução: A ascendência de bactérias resistentes a antibióticos de última linha
tem ameaçado a terapêutica das infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), constituindo um problema de saúde mundial. Nesse contexto a implementação das culturas de vigilância mostram-se úteis no monitoramento e prevenção da disseminação de multirresistentes no ambiente hospitalar. Objetivo: Determinar o perfil de susceptibilidade frente ao imipenem e polimixina B de bactérias Gram-negativas isoladas de amostras de cultura de vigilância de pacientes internados na UTI. Metodologia e Resultados: Durante o estudo foram isoladas 48 cepas classificadas como membros da família Enterobacteriaceae e bacilos Gram-negativos não fermentadores. Avaliou-se o perfil de sensibilidade aos antibacterianos, produção de β-lactamases e determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) frente ao imipenem e a polimixina B. Observou-se um elevado perfil de resistência no antibiograma nos grupos analisados, seguida da alta produção de ESBL com ênfase para a família Enterobacteriaceae 26 (54,16%). Foi detectada resistência fenotípica aos carbapenêmicos em 5 (16,1%) das Enterobactérias e 14 (82,35%) de bacilos Gram-negativos não fermentadores de açúcares (BGNNF). Das cepas resistentes aos carbapenêmicos testados, 17 (89,4%) foram identificadas como produtoras de metalo-β-lactamases. Quanto ao perfil de susceptibilidade traçado a partir da determinação da CIM 18 (94,7%) das amostras testadas apresentaram resistência ao imipenem com CIMs entre ≥ 32 - ≥ 512 µg/mL. Para a Polimixina B observou-se resistência em 6 (33,33%) das amostras enquanto 3 (16,6%) apresentaram sensibilidade intermediária. Discussão: O elevado índice de amostras resistentes aos carbapenêmicos condiz com a antibioticoterapia empregada nas UTIs, uma vez que o uso empírico desses fármacos aumenta a pressão seletiva nesses ambientes, conduzindo a altos níveis de resistência, impulsionando o aparecimento de cepas produtoras de carbapenemases e outras β-lactamases, pondo em risco a terapêutica das IRAS. Conclusão: A identificação de cepas resistentes aos antibacterianos utilizados como últimas opções no tratamento de infecções causadas por microrganismos resistentes neste trabalho evidenciaram um grave problema de saúde mundial no combate às infecções bacterianas.
Palavras chaves: Resistência bacteriana a antibióticos; Bactérias Gram-Negativas;
ABSTRACT
Introduction: The ascendancy of bacteria resistant to last-line antibiotics has
threatened the treatment of healthcare-related infections (HAIs), constituting a worldwide health problem. In this context, the implementation of surveillance cultures is useful in monitoring and preventing the spread of multidrug-resistant drugs in the hospital environment. Objectives: Determine the susceptibility profile to imipenem and polymyxin B of Gram-negative bacteria isolated from surveillance culture samples from ICU patients. Methodology and Results: During the study, 48 strains classified as members of the Enterobacteriaceae family and non-fermenting Gram-negative bacilli were isolated. The profile of sensitivity to antibacterial agents, production of β-lactamases was evaluated and the minimum inhibitory concentration (MIC) compared to imipenem and polymyxin B was determined. A high profile of resistance was observed in the antibiogram in the groups analyzed, followed by the high production of ESBL with emphasis on the Enterobacteriaceae family 26 (54.16%). Phenotypic resistance to carbapenems was detected in 5 (16.1%) of Enterobacteria and 14 (82.35%) of Gram-negative non-fermenting sugar bacilli (BNF). Of the strains resistant to the carbapenems tested, 17 (89,4%) were identified as producing metalo-β-lactamase. About the susceptibility profile drawn from the MIC determination, 18 (94.7%) of the tested samples showed resistance to imipenem with MICs between ≥ 32 - ≥ 512 µg / mL. For Polymyxin B, resistance was observed in 6 (33.33%) of the samples, while 3 (16.6%) presented intermediate sensitivity.
Discussion: The high index of samples resistant to carbapenems is consistent with
the antibiotic therapy used in ICUs, since the empirical use of these drugs increases the selective pressure in these environments, leading to high levels of resistance, conducting the appearance of strains producing carbapenemases and other β- lactamases, endangering HAI therapy. Conclusion: The identification of strains resistant to antibacterial agents used as the last options in the treatment of infections caused by resistant microorganisms in this work showed a serious global health problem in the fight against bacterial infections.
Keywords: Bacterial resistance to antibiotics; Gram-Negative Bacteria; Hospital
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AMC Amoxicilina com Ácido Clavulânico µg/ml Micrograma por mililitro
AmpC Ampicilinases
AS Ágar Sangue
ATCC AmericanType Culture Collection BGN Bacilos Gram-negativos
BHI Brain Heart Infusion Broth
CCIH Comissão de Controle de Infecção Hospitalar CDC Centro de Controle e Prevenção de Doenças CGP Cocos Gram-positivos
CLSI Clinical and Laboratory Standards institute CRE Enterobacteriaceae Carbapenem-resistentes DNA Ácido Desoxirribonucléico
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético ESBL β-lactamase de Espectro Estendido
IRAS Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde KPC Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
MBL Metalo-β-lactamase MC Ágar MacConkey MH Ágar Muller Hinton
MRSA Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina OXA Oxacilinase
PBP Protein Binding Penicilllin
SCN Staphylococcus Coagulase Negativa
TSA Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos TSI Triple Sugar Iron
UFC Unidade Formadora de Colônia UTI Unidade de Terapia Intensiva
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Procedência das cepas controle: 1 Adquiridas comercialmente; 2 Doadas pelo Laboratório de Pesquisa em Infecções Hospitalar/ LAPIH - Fiocruz/RJ. ... 38 Tabela 2 - Discos utilizados para avaliação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos para membros da família Enerobacteriaceae ... 39 Tabela 3 - Discos utilizados para avaliação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos para Acinetobacter spp... 39 Tabela 4 - Discos utilizados para avaliação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos para Pseudomonas aeruginosa ... 40 Tabela 5 - Frequência de espécies bacterianas isoladas. ... 46 Tabela 6 - Classificação do perfil de sensibilidade frente ao imipenem das amostras segundo o CLSI 2018. ... 52 Tabela 7 - Classificação do perfil de sensibilidade frente à polimixina B das amostras segundo o CLSI 2018. ... 53
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Mecanismos de ação dos antimicrobianos ... 17 Figura 2 - Estrutura química do imipenem/cilastatina...19 Figura 3 - Como os antibióticos selecionam cepas resistentes. ... 26 Figura 4 - Formação da „‟Zona ghost‟‟ representativa de bactéria produtora de ESBL ... 41 Figura 5 - Teste do bloqueio enzimático (EDTA). O halo identificado com „‟EDTA‟‟ apresentou diâmetro 12 mm maior que o halo sem adição do ácido. ... 42 Figura 6 - Bactéria com resultado positivo para a produção de carbapenemases. ... 43
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Frequência de isolados baseada nas características morfotintoriais –
Classificação morfotintorial das amostras ... 45
Gráfico 2 - Quantidade de bactérias identificadas por sítio (nasal, axilar e retal) – número de isolados por sítio ... 46
Gráfico 3 - Distribuição de espécies bacterianas isoladas nos sítios coletados (axilar, nasal e retal) ... 47
Gráfico 4 - Perfil de resistência observado na família Enterobacteriaceae ... 48
Gráfico 5 - Perfil de resistência observado no grupo dos Bacilos Gram-negativos não fermentadores de açúcares. ... 48
Gráfico 6 - Frequência de Gram-negativos produtores de ESBL. ... 49
Gráfico 7 - Frequência de amostras resistentes aos carbapenêmicos. ... 50
Gráfico 8 - Frequência de espécies de bactérias produtoras de MBL. ... 51
Gráfico 9 - Concentração inibitória mínima das amostras frente ao imipenem. - MIC ... 52
ÍNDICE 1 INTRODUÇÃO ... 12 1.1 FÁRMACOS ANTIBACTERIANOS ... 14 1.1.1 Imipenem ... 18 1.1.2 Polimixina B ... 21 1.2 RESISTÊNCIA BACTERIANA ... 25
1.2.1 Transferência Horizontal de Genes ... 26
1.2.2 Mutação ... 27
1.2.3 Tipos de resistência ... 28
1.3 INFECÇÕES RELACIONADAS À ASSISTÊNCIA À SAÚDE ... 31
1.4 CULTURA DE VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA ... 32
2 OBJETIVOS ... 35
2.1 OBJETIVOS GERAIS ... 35
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 35
3 METODOLOGIA ... 36
3.1 APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA ... 36
3.2 CRITÉRIO DE INCLUSÃO ... 36
3.3 COLETA ... 36
3.3.1 Procedimento de coleta ... 36
3.4 ISOLAMENTO PRIMÁRIO ... 37
3.4.1 dentificação de Bacilos Gram-negativos ... 37
3.4.2 Estocagem ... 38
3.4.3 Linhagem controle ... 38
3.5 TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ... 38
3.6 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DA RESISTÊNCIA AOS CARBAPÊNEMICOS EM BACILOS GRAM-NEGATIVOS ... 40
3.6.1 Identificação de Enterobacteriaceae produtora de β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) ... 41
3.6.2 Determinação presuntiva de cepas produtoras de Metalo- β-lactamase – Teste do bloqueio enzimático ... 42
3.6.3 Teste de inibição dos Carbapenêmicos ... 42
3.7 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA POR MICRODILUIÇÃO EM CALDO FRENTE AO IMIPENEM E POLIMIXINA B ... 43
4 RESULTADOS ... 45
4.2 PERFIL DE SUSCETIBILIDADE BACTERIANA ... 47
4.3 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA ... 49
4.3.1 Caracterização fenotípica para a produção β-lactamases de Espectro Estendido ... 49
4.3.2 Caracterização fenotípica para a resistência aos carbapenêmicos .... 49
4.3.3 Teste de inibição dos Carbapenêmicos ... 50
4.3.4 Caracterização fenotípica para a produção Metalo-β-lactamase (MBL) ... 50
4.4 ANÁLISE DO PERFIL DE SENSIBILIDADE FRENTE AO IMIPENEM – DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) ... 51
4.5 ANÁLISE DO PERFIL DE SENSIBILIDADE FRENTE À POLIMIXINA B – DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) ... 53
5 DISCUSSÃO ... 55
6 CONCLUSÃO ... 66
REFERÊNCIAS ... 67
12 1 INTRODUÇÃO
Desde sua descoberta os antibióticos revolucionaram a terapêutica das doenças de caráter infeccioso, possibilitando a redução das taxas de morbidade e mortalidade associadas a essas condições. Contudo, o uso indiscriminado desses fármacos ao longo dos tempos acelerou o processo natural de resistência contra esses agentes, tornando-se uma grande preocupação que ameaça a saúde pública principalmente por intensificar os riscos associados às infecções hospitalares. (COSTA; JUNIOR, 2017).
A resistência antimicrobiana (AMR do inglês antimicrobial resistance) é um grave problema de saúde pública especialmente no que diz respeito aos pacientes hospitalizados em estado grave e mais susceptíveis a infecções hospitalares, sendo considerada ameaça também a sociedade e economia mundial (HENGEL; MARIN, 2019). O Centro de Controle de Prevenção e Doenças (CDC do termo em inglês Centers for Disease Control and Prevention) estimou custos anuais de 20 a 35 bilhões de dólares em saúde relacionados à resistência bacteriana nos Estados unidos. Estima-se que por ano aproximadamente 700 mil mortes sejam causadas pela resistência aos antibióticos e segundo essas analises, sem uma mudança de cenário para a contenção do problema, até 2050, a AMR poderá matar mais que o câncer (VAN DUIN; DOI, 2017; O‟NELL, 2016).
Umas das principais barreiras no enfrentamento à resistência antimicrobiana são a escassez de investimentos das indústrias farmacêuticas na busca por novos agentes antibacterianos, devido ao baixo retorno financeiro desse campo e ausência no desenvolvimento de novas tecnologias em saúde, que não tem acompanhado a velocidade da capacidade de adaptação dos microrganismos. A crise mundial da saúde ocasionada pela emergência de bactérias resistentes é uma problemática relevante na atualidade, pois ainda é considerado incerto se futuramente existirão fármacos capazes de tratar infecções graves causadas por estes microrganismos (WACLAW,2016; ESTRELA, 2018).
13 Histórico
Por muitos anos a população esteve à mercê de várias infecções que comumente tomavam proporções epidêmicas e custavam milhares de vidas, desde então se iniciava a busca por medidas de combate e cura dessas doenças. Após a identificação de bactérias como agentes causadores de infecções, foram surgindo substâncias antimicrobianas que possibilitaram que doenças como Sífilis, Cólera, Febre Tifóide fossem combatidas (MOHR, 2016).
Indiscutivelmente, o verdadeiro marco que mudou o curso do tratamento das doenças infecciosas que assombravam a população, aconteceu em 1928 com a descoberta da penicilina por Alexander Fleming que percebeu a capacidade antimicrobiana do fungo Penicillium notatum diante de colônias de Staphylococcus spp. e após a purificação e testes „‟in vitro‟‟, essa substância foi capaz curar infecções anteriormente fatais (LOBANOVSKA; PILLA, 2017).
A descoberta e comercialização dos primeiros antibióticos foi o ponto de partida para a pesquisa e a descoberta de novos antibacterianos. Na década de 1940 iniciou-se a era de ouro dos antibióticos, caracterizada pelo uso massivo desses fármacos e o rápido avanço no desenvolvimento de novos agentes antibacterianos (GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010; MEDELLÍN, 2011).
Depois do entusiasmo inicial da descoberta dos primeiros antibióticos e na crença precoce de que estes colocariam um fim nas doenças infecciosas, com a pressão seletiva causada pelo uso excessivo da penicilina, começaram a surgir casos em que este antibiótico não fazia mais efeito e observou-se a disseminação da resistência à penicilina entre cepas bacterinas (MOHR, 2016). Constatou-se então que as bactérias eram capazes de rapidamente desenvolver, adquirir e disseminar inúmeros mecanismos de resistência e sempre que um novo antibiótico era lançado no mercado, logo em seguida já eram observados casos de microrganismos resistentes a estes (MOHR, 2016). A incidência de cepas resistentes não foi acompanhada pela introdução de novos antibacterianos e como consequência, o tratamento de doenças bacterianas está ameaçado (DAVIES, 2006).
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1.1 FÁRMACOS ANTIBACTERIANOS
Os agentes antibacterianos podem ser utilizados no tratamento de várias infecções. São definidos como substâncias de origem natural ou sintética que agem sobre microrganismos visando inibir seu crescimento ou provocando sua destruição (FURTADO et al., 2019). São prescritos em larga escala, sendo a 2° classe de fármacos mais utilizada no mundo e responsáveis por 20-50% das despesas hospitalares (MOTA et al., 2010).
Inicialmente esses fármacos são classificados como bactericidas ou bacteriostáticos. Os antibióticos bacteriostáticos são aqueles que inibem o crescimento e a multiplicação da população bacteriana, impedindo o agravamento da infecção e possibilitando que o sistema imune do hospedeiro ataque e elimine os patógenos (CLARK et al., 2013). Já os fármacos bactericidas atuam em processos vitais da célula bacteriana, causando sua morte (KATZUNG; MASTERS; TREVOR, 2014; BRUNTON; LAZO; PARKER, 2009).
Com o passar dos anos e a origem de novas classes de antibióticos fez-se necessário a criação de novos sistemas de classificação. Geralmente estes são classificados com base em sua estrutura molecular e seus mecanismos de ação que de forma geral alteram funções metabólicas específicas da célula bacteriana ou interrompem a síntese de componentes estruturais (BECKER, 2013). Então os antibacterianos podem também ser divididos quanto aos seus mecanismos de ação antimicrobiana, sendo eles: A) Inibição da síntese proteica; B) Inibição de vias metabólicas bacterianas; C) Inibição da síntese de ácidos nucleicos; D) Desestabilização da membrana e E) inibição da síntese de parede celular (REYGAERT, 2018).
a) Inibidores da síntese proteica
Os antibióticos podem atuar inibindo a síntese de proteínas, tendo como alvo as subunidades 30s ou 50s do ribossomo bacteriano (GUIMARÃES; MONESSO; PUPO, 2010). Como consequência, ocorre a inibição da síntese de cadeias peptídicas, erros de leitura ou paradas antecipadas (BRUNTON; CHEBNER; KNOLLMANN, 2012).
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As tetraciclinas são antibióticos bacteriostáticos de amplo espectro, eficazes contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo anaeróbios (KATZUNG; MASTERS; TREVOR, 2014). Estes fármacos ligam-se de forma reversível a subunidade 30s ribossomal, bloqueando o acesso do RNAt ao complexo RNAm-ribossomo, local aceptor, impedindo a adição de aminoácidos no processo de síntese proteica e liberação da mesma. (BRUNTON; CHEBNER; KNOLLMANN, 2012; CLARK et al., 2013).
Os aminoglicosídeos também atuam através da ligação a subunidade 30s antes que o ribossomo seja formado. Estes antibióticos interferem na montagem do aparelho ribossomal provocando erros de leitura do código genético (CLARK et al., 2013).
clorofenicol, macrolídeos e oxazolidinonas são exemplos de antibióticos que atuam sobre a unidade 50s (BRUNTON; CHEBNER; KNOLLMANN, 2012). Os macrolídeos ligam-se a esta subunidade inibindo etapas como a translocação e transpeptidação na síntese proteica. Já o cloranfenicol atua inibindo as reações da peptidiltransferase, por meio da ligação à subunidade 50s (CLARK et al., 2013).
Oxazolidinonas, como o antibiótico linezolida, apresentam ação contra microrganismos Gram-positivos, como Staphylococcus spp., Streptococcus spp. e Enterococcus spp. (CLARK et al., 2013). Seu efeito antibacteriano é garantido através da inibição do complexo de iniciação 70s por meio da sua ligação a subunidade 50s (KAPOOR; SAIGAL; ELONGAVAN, 2017).
b) Inibidores do metabolismo do ácido fólico
Sulfonamidas e trimetoprim são fármacos que inibem etapas distintas do metabolismo do ácido fólico. O ácido fólico é um composto essencial utilizado pelas bactérias para síntese de ácidos nucleicos (GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010). Em inúmeras bactérias, o ácido di-hidrofólico é sintetizado a partir do percussor ácido p-aminobenzoico (PABA, do inglês p-aminobenzoic acid) e outros componentes. Assim, todas as sulfonamidas utilizadas na prática clínica são análogos do PABA (CLARK et al., 2013).
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As sulfanamidas inibem a di-hidropteroato sintase uma vez que possuem uma maior afinidade por esta enzima que o substrato natural ácido p-amino benzoico (KAPOOR; SAIGAL; ELONGAVAN, 2017). As sulfas, como cotrimoxazol, são bacteriostáticas e apresentam boa atividade contra algumas Enterobactérias que causam infecções no trato urinário (CLARK et al., 2013). O trimetoprim por sua vez possui espectro bacteriano semelhante ao das Sulfas e age na etapa posterior da síntese do ácido fólico, e inibindo a enzima di-hidrofolato redutase diminuindo a biodisponibilidade da tetra-hidrofolato, coenzima indispensável para síntese de purina, pirimidina e aminoácidos (CLARK et al., 2013; KAPOOR; SAIGAL; ELONGAVAN, 2017).
c) Inibidores da transcrição e tradução
As fluoroquinolonas bloqueiam a síntese do DNA bacteriano por meio da inibição da topoisomerase II (DNA-girase) e da topoisomerase IV bacteriana. Ao inibir a DNA-girase, este fármaco impede o relaxamento do DNA, feito necessário para os mecanismos de para a transcrição e a replicação normais (KATZUNG; MASTERS; TREVOR, 2014).
A rifampicina é um antibiótico bactericida eficaz contra Gram-positivos e Gram-negativos, é a droga de escolha para o tratamento de micobactérias incluindo M. tuberculosis (BRUNTON; CHEBNER; KNOLLMANN, 2012). Este fármaco atua inibindo a enzima RNA polimerase, impossibilitando a síntese do RNA e bloqueando a transcrição do material genético (CLARK et al., 2013).
d) Desestabilizadores da membrana
As polimixinas são uma classe de antibióticos polipeptídicos com espectro de ação contra Gram-negativas, seus principais representantes são a polimixina B, sintetizada pelo Bacillus polymyxa e a Colistina, produzida pelo Bacillus colistinus. As polimixinas interagem com os fosfolipídeos da membrana celular bacteriana, atuando como detergente catiônico provocando sua desestabilização (BRUNTON; CHEBNER; KNOLLMANN, 2012).
17 e) Inibidores da parede celular
Os β-lactâmicos e glicopeptídeos atuam inibindo a síntese da parede celular (BECKER, 2013). Os β-lactâmicos são os antibióticos mais prescritos na prática clínica sendo um amplo grupo que abrange penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos, monobactâmicos e cefamicinas. Estes fármacos exercem sua função por meio da inibição da parede celular através da sua ligação às PBP‟s (do inglês Penicillin-Binding Proteins) que interferem no mecanismo de transpeptidação (BRUNTON; CHEBNER; KNOLLMANN, 2012; KATZUNG; MASTERS; TREVOR, 2014).
Os glicopeptídeos tem como principais representantes da classe à vancomicina e teicoplamina, fármacos que possuem amplo espectro de atividade contra bactérias Gram-positivas e atuam inibindo a síntese da parede celular através da ligação a subunidade D-alanil-D-alanina, impedindo a polimerização, alongamento e ligações cruzadas, quando acontece o bloqueio da ligação ao polímero glicopeptídico (CASTLE, 2017; KAPOOR; SAIGAL; ELONGAVAN, 2017). Como consequência ocorre o enfraquecimento e maior susceptibilidade a lise celular, a membrana também é atingida, contribuindo para o efeito antibacteriano (KATZUNG; MASTERS; TREVOR, 2014).
Figura 1 - Mecanismos de ação dos antimicrobianos
18 1.1.1 Imipenem
O imipenem é um antibiótico β-lactâmico pertencente à subclasse dos carbapenêmicos (NEVES et al., 2011). Derivado do composto tienamicina, apresenta um amplo espectro de ação e elevado potencial bactericida, sendo eficaz contra microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos. Apresenta baixa biodisponibilidade oral, não atravessando membranas gastrointestinais com facilidade, sendo, portanto, administrado por via intravenosa ou intramuscular (PALIOSA, 2012; CODJOE; DONKOR, 2017).
Com atividade dose-dependente, este fármaco está facilmente sujeito a degradação pela desidropeptidase-1 (DHP-1), enzima presente nos túbulos renais, fazendo necessário sua co-administração com o inibidor enzimático cilastatina a fim da diminuição de seu potencial nefrotóxico (PAPP-WALLACE et al., 2011; ZHANEL et al., 2007). Apesar do uso do imipenem/Cilastatina não implicar em um elevado grau de toxicidade e ser relativamente seguro, é necessário cautela na sua administração, pois seu uso prolongado pode estar relacionado a problemas gastrointestinais, nefrotoxicidade e risco de crises convulsivas (ANVISA, 2007; PAPP-WALLACE et al., 2011).
Estruturalmente o imipenem possui um anel β-lactâmico ligado a um anel „‟carbapema‟‟ (Cadeia não saturada pentacíclica ligada a um átomo de carbono), esta ligação confere a molécula uma maior proteção e estabilidade contra hidrólise provocada pela maioria das β-lactamases conhecidas, incluindo β-lactamases de espectro estendido (ESBL), metalo-β-lactamases (MBL) e a cefalosporinase AmpC (KNAPP; ENGLISH, 2001; ROSA, 2015; MELETIS, 2015).
19 Figura 2: Estrutura química do imipenem/cilastatina
Fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Imipenem_e_cilastatina#/media/Ficheiro:Imipenem.svg
De forma geral os carbapenêmicos exercem seu efeito bactericida através do mecanismo de inibição da síntese de parede celular. O fármaco se liga as PBPs (principalmente PBP1 e PBP2) presentes na parede celular, inibindo irreversivelmente essas enzimas que são responsáveis pela transpeptidação e conseguinte síntese do peptideoglicano (GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010; CARDOSO, 2018). O sucesso da inibição da síntese de peptideoglicano se dá pela capacidade que o antibiótico tem de se ligar a múltiplos sítios simultaneamente, e como consequência, a parede celular não é formada, levando a morte celular por lise osmótica (ROSA, 2014; CARDOSO, 2018).
A combinação imipenem/Cilastatina consiste em um potente e eficaz antibiótico que por suas características é tido como fármaco de reserva, utilizado em último recurso no tratamento de infecções relacionadas a assistência à saúde causadas por Enterobactérias multirresistentes, incluindo as produtoras de β-lactamases, sendo ainda utilizados como opção segura no tratamento de pneumonia, endocardite e sepses (GALES et al., 2002; OLIVEIRA, 2014; MORRILL et al., 2015).
De forma geral, os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos incluem: mutação do local alvo, superexpressão de bombas de efluxo e a produção de carbapenemases (enzimas capazes de inativarem os β-lactâmicos incluindo os carbapenêmicos), que têm maior impacto na saúde humana. Em Enterobacteriaceae, a redução de susceptibilidade também pode ser mediada pela
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associação de AmpCs plasmidial e enzimas ESBL que interferem no potencial de hidrólise do fármaco e alteram canais de porinas, dificultando sua penetração (CODJOE; DONKOR, 2017).
A produção de carbapenemases por Enterobactérias, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp. são atualmente o principal mecanismo de resistência a esses fármacos. O crescente número de diferentes classes de carbapenemases tais como KPC, OXA, metalo-lactamases (VIM, NDM e IMP) e β-lactamases como CYM-10 podem conferir resistência aos carbapenêmicos e demais β–lactâmicos (PAPP-WALLACE et al., 2011).
A diminuição da sensibilidade ao imipenem deve-se também a mecanismos como PBPs com baixa afinidade de ligação, superexpressão de bombas de efluxo, e diminuição do número de porinas, sendo os dois últimos capazes de conferir resistência adicional a outras classes de fármacos (OLIVEIRA, 2014). Estudos têm mostrado o recente aumento de Enterobacteriaceae produtoras de carbapenemases capazes de resistirem a todos os β-lactâmicos, incluindo os carbapenêmicos de última geração, fato que ameaça o uso dessa classe de antibióticos que tem extrema importância e utilidade para a comunidade científica e hospitalar (MORRILL et al., 2015; PALIOSA, 2012).
O desenvolvimento de resistência a estes antibióticos constitui um grande problema de saúde pública, uma vez que as infecções provocadas por CRE (do inglês carbapenem-resistant Enterobacteriaceae) geralmente acomete pacientes hospitalizados em estado grave e possuem uma elevada taxa de mortalidade que varia de 18 a 48% dependendo da eficácia terapêutica. O tratamento para esse tipo de paciente é limitado e geralmente ineficaz (FALAGAS et al., 2013; MORRILL et al., 2015). Diante desse cenário de multirresistência, os médicos têm sido forçados a adotarem terapias de emergência com fármacos já ultrapassados por sua elevada toxicidade no passado, tal como as polimixinas, fosfomicina e aminoglicosídeos ou adotarem estratégias de tratamento diferentes, fazendo uso de terapia combinada (DUNDAR et al., 2018; MORRILL et al., 2015).
21 1.1.2 Polimixina B
As polimixinas são um grupo de antibióticos polipeptídicos catiônicos formado por cinco compostos distintos denominados Polimixinas A, B, C, D e E (esta última também conhecida como colistina) (MENDES; BURDMANN, 2009; GOULART, 2017). Sintetizadas a partir de cepas de Paenibacillus polymyxa e espécies relacionadas, são produtos de fermentação bacteriana, sendo, portanto, antibióticos multicomponentes de estruturas químicas semelhantes, diferindo apenas no aminoácido do anel peptídico (HE et al., 2013; NATION et al., 2015; KAYE et al., 2016).
Descritas e isoladas de forma independente por pesquisadores ingleses e norte-americanos, as polimixinas B e E foram inseridas no mercado na década de 1950 como tratamento para infecções ocasionadas por bactérias Gram-negativas, devido sua rápida atividade bactericida e espectro de ação contra diferentes espécies de deste grupo (MENDES; BURDMANN, 2009; KAYE et al., 2016; GOULART, 2017).
A estrutura molecular da Polimixina B consiste em um anel polipeptídico composto por sete aminoácidos (D-fenilalanina na posição 6), unido a uma cadeia lateral tripeptídea com um ácido graxo na extremidade, ligados pela porção N-terminal (SANTOS, 2017). Possui alta quantidade de resíduos de ácido 2,4-diaminobutírico (Dab) em sua estrutura, que garantem que as polimixinas tenham grupamentos carregados positivamente em pH fisiológico (CARVALHO; COGO, 2014; GOULART, 2017). Trata-se de uma mistura de sulfatos de polipeptídios composta de componentes relacionados, polimixinas B1 a B4, que se diferem pelo ácido graxo (CARVALHO; COGO, 2014). São moléculas grandes, sendo pouco absorvidas após administração oral, quando utilizadas como tratamento de infecções graves, são administradas por via intravenosa (NATION et al., 2015).
Apesar dos mecanismos utilizados pelas polimixinas não serem totalmente conhecidos, para exercer sua atividade antibacteriana é necessário o reconhecimento e interações do lipopolissacarídeo (LPS) da membrana externa das bactérias Gram-negativas com o fármaco são a „‟chave‟‟ para sua atuação (NATION et al., 2015; KAYE et al., 2016). O mecanismo de ação das polimixinas tem como
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alvo principal o LPS presente na membrana externa dos microrganismos Gram-negativos e através de interações eletroestáticas entre a porção negativa do LPS e a porção carregada positivamente da polimixina B, ocorre o deslocamento competitivo de íons cálcio e magnésio, que agem como estabilizadores estruturais da membrana (ANVISA, 2013; GOULART, 2017). O desarranjo de íons e desestabilização do LPS aumenta a permeabilidade celular, acarretando na ruptura da célula, extravasamento de conteúdo celular e morte bacteriana (MENDES; BURDMANN, 2009).
A polimixina confere ainda uma atividade antiendotoxina através da neutralização de um dos constituintes do LPS, o lipídeo A (responsável pela atividade endotóxica de bactérias Gram-negativas), através da ligação com este fármaco (ANVISA, 2013; KAYE et al., 2016; GOULART, 2017). Além desses mecanismos, podem também inibir em algumas espécies enzimas vitais presentes na membrana bacteriana (GOULART, 2017). Apesar de seu potente efeito bactericida, a polimixina B caiu em desuso nos anos 70 devido a seu potencial neurotóxico e principalmente nefrotóxico, que causou efeitos adversos em cerca de 50% dos usuários, tendo sido então gradativamente substituída por novos fármacos de menor toxicidade e de espectro semelhante como as Cefalosporinas e Aminoglicosídeos (NATION et al., 2015; KAYE et al., 2016; SANTOS, 2017).
Com o crescente índice de resistência bacteriana, e o surgimento de bactérias Gram-negativas resistentes a todos os antibióticos comumente utilizados na prática clínica no ambiente hospitalar, principalmente em pacientes internados em unidades de terapia intensiva, atrelado a escassez de novos medicamentos eficazes contra esses microrganismos, as polimixinas têm sido reintroduzidas como opção terapêutica, em alguns casos, sendo a última opção de tratamento (OLAITAN; MORAND; ROLAIN, 2014; NATION et al., 2015).
Apesar da maioria dos isolados bacterianos provenientes do ambiente hospitalar ainda apresentarem-se susceptíveis às polimixinas, possivelmente devido ao período de ausência deste fármaco no mercado, é crescente o número de casos de bactérias resistentes a estas, especialmente em bactérias como Acinetobacter baumanii, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa (OLAITAN; MORAND; ROLAIN, 2014; MUNITA; ARIAS, 2016).
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Os mecanismos envolvidos na resistência as polimixinas não estão totalmente desvendados, podendo ocorrer através de adaptação ou mutação (GIRARDELLO; GALES, 2012; PARUSSOLO; GARCIA; TOGNIM, 2014). Sabe-se que existem dois fenótipos responsáveis por este processo, a resistência intrínseca que ocorre quando a bactéria é naturalmente resistente a um ou mais antimicrobianos e a resistência adquirida que está relacionada com a aquisição de elementos genéticos moveis e mutações gênicas (GIRARDELLO; GALES, 2012).
Estudos têm mostrado que em bactérias Gram-negativas, o principal meio de desenvolvimento de resistência as polimixinas ocorre devido a alterações no mecanismo de biossíntese do LPS (COSTA, 2017). A regulação desse mecanismo é mediada pelo sistema de dois componentes (two component system), sendo ativado por fatores como alterações de pH no meio, presença de ferro, baixas concentrações de magnésio, elevação da quantidade de cálcio e podendo ainda ser acionado na presença desse fármaco (GIRARDELLO; GALES, 2012; YU et al., 2015). O sistema de dois componentes PhoP-PhoQ regula o mecanismo responsável por promover alterações químicas na estrutura do LPS, que mediante ativadores, alteram a carga iônica da parede celular, reduzindo a negatividade da membrana externa acarretando na diminuição de afinidade do fármaco para a célula bacteriana (COSTA, 2017).
De forma geral, esses mecanismos dificultam a interação fármaco-célula bacteriana, causando resistência e atuando semelhantemente a mecanismos que ocorrem em bactérias intrinsicamente resistentes tais como Moraxella catarrhalis, Proteus spp., Burkholderia capacia, Neiseria spp., Helicobacter pylori, Vibrio spp. e Brucella spp. (GOULART, 2017). Em Acinetobacter baumanii, a perda total do LPS ocasionada por mutações na lpxA, lpxC e lpxD (componentes importantes para a biossíntese do LPS) e a modificação da membrana do LPS a partir da adição de fosfoetanilamina no lipídeo A foram observados em cepas resistentes a polimixina (COSTA, 2017).
Além dos mecanismos de modificação no LPS regulado pelo sistema PhoP-PhoQ, existem mecanismos frequentemente observados em espécies especificas que estão relacionados a resistência as polimixinas. As bombas de efluxo são
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importantes mecanismos observados em patógenos positivos e Gram-negativos. A bomba de efluxo AcrAB é capaz de conferir resistência a polimixina B à Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli. Além desta, a bomba MexAB-OprM está fortemente relacionada à maior tolerância as polimixinas em Pseudomonas aeroginosa (YU et al., 2015).
Constatou-se que polissacarídeos capsulares possuem um papel relevante na resistência as polimixinas. Enquanto as polimixinas são substâncias catiônicas, esses polissacarídeos são aniônicos, dessa forma os polissacarídeos da capsula podem se ligarem ao fármaco e mascarar os sítios de ligações às polimixinas, reduzindo a quantidade de peptídeos que atingiriam a superfície bacteriana, neutralizando a atividade bactericida destes antibióticos. Outros mecanismos de resistência também têm sido demonstrados em Salmonella spp. com envolvimento do gene mig-14 (PARUSSOLO; GARCIA; TOGNIM, 2014; YU et al., 2015).
Pode-se citar também o mecanismo de aquisição do gene mcr-1 mediada por plasmídeo, responsável pela transmissão horizontal de resistência as polimixinas em Enterobactérias. A enzima codificada por esse gene é responsável por adicionar fosfoetanolamina ao lipídeo A, deixando o LPS mais catiônico, diminuindo assim a interação entre o fármaco e a célula bacteriana (POIREL; JAYOL; NORDMANN, 2017).
As polimixinas são indispensáveis atualmente e desempenham um papel crucial no arsenal antimicrobiano, pois muitas vezes são os únicos antibióticos eficazes contra CRE, Pseudomonas aeroginosa e acinetobacter baumanni resistentes aos carbapenêmicos, microrganismos que foram reconhecidos pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) como uma séria ameaça a saúde humana, devido as altas taxas de mortalidade principalmente em infecções relacionadas a assistência a saúde, que pode exceder 50% (HE et al., 2013; KAYE et al., 2016).
Embora a taxa de resistência às polimixinas entre os patógenos seja ainda relativamente baixa, relatos de resistência intrínseca e adquirida em isolados clínicos é cada vez mais comum e há preocupação de que este cenário de susceptibilidade esteja mudando (GENTELUCI et al., 2016; SANTOS, 2017). Este aumento é um
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problema sério, principalmente devido ao fato de haver um baixo número de antibióticos eficazes disponíveis, limitando as alternativas de tratamento dessas infecções (OLAITAN; MORAND; ROLAIN, 2014; SANTOS, 2017).
A resistência a agentes utilizados como último recurso no tratamento de infecções causadas por bacilos Gra-negativos, como as polimixinas, que voltaram a ser comercializadas recentemente, está aumentando e mesmo que novas estratégias terapêuticas estejam sendo analisadas contra essas infecções, é provável que a história se repita e a resistência contra esses novos antibacterianos também surja com o tempo (VAN DUIN; DOI, 2017).
1.2 RESISTÊNCIA BACTERIANA
A resistência antimicrobiana (AMR do inglês antimicrobial resistance) tornou-se uma dificuldade à saúde pública desde quando a penicilina passou a tornou-ser utilizada na prática clínica, na década de 1940. Após anos de sucesso com antibióticos, o mundo vem enfrentando uma séria batalha contra infecções bacterianas e resistência a antimicrobianos, atualmente disseminadas por todo o mundo (O‟NELL, 2014; MEDELLIN, 2011).
Inicialmente, tal fenômeno não parecia ser um problema tão sério, uma vez que era parcialmente resolvido com modificações estruturais nos medicamentos já existentes e introdução de novos fármacos como Aminoglicosídeos, Macrolídeos e Glicopeptideos (FIO; MATTOS FILHO; GROPPO, 2000). Entretanto atualmente a emergência e disseminação de diferentes mecanismos e genes de resistência estão fortemente associadas à diminuição das opções terapêuticas disponíveis, aumento da morbimortalidade de pacientes e dos custos associados (REYGAERT, 2018).
Estima-se que já tenham ocorrido mais de 700.000 mortes por todo o mundo relacionadas à resistência a antimicrobianos, número que supera a quantidade de vítimas de raiva e sarampo juntos, que totalizam 190.000 mortes (ANTÃO et al., 2018). Levando em consideração a importância clínica e epidemiológica da resistência e multirresistência bacteriana, alguns patógenos incidem uma maior preocupação as unidades hospitalares como, por exemplo, Staphylococcus spp. resistentes a Oxacilina (MRSA), Enterobacteriaceae produtoras de β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e Bacilos Gram-negativos não fermentadores (BGNNF)
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resistentes aos carbapenêmicos devido sua alta patogenicidade, elevado grau de resistência e facilidade de transmissão cruzada (MAÇÃO et al., 2013; KHAN; BAIG; MEHBOOB, 2017).
A sobrevivência do mais apto é consequência da enorme plasticidade genética das bactérias, que despertam respostas especificas resultando em adaptações que lhes permite responder a ameaças no meio, incluindo o uso de antibacterianos (MUNITA; ARIAS, 2016). É importante frisar que os antibióticos não são agentes mutagênicos e que, portanto, não desenvolvem novas características em bactérias, eles exercem pressão seletiva que com o uso frequente de antibióticos acarreta no predomínio de cepas resistentes (FIO; MATTOS FILHO; GROPPO, 2000).
Figura 3 - Como os antibióticos selecionam cepas resistentes.
Fonte: AIRES; ASENSI, (2017)
As bactérias utilizam duas estratégias principais para se adaptarem e sobreviverem na presença de antimicrobianos, de forma geral a resistência se dá através de rotas de aquisição de material genético (mecanismos de Transformação, Transposição e Conjugação) ou por meio de mutações no DNA cromossômico bacteriano (REYGAERT, 2018).
1.2.1 Transferência Horizontal de Genes
A transferência horizontal de genes (THG) é o trânsito de informações genéticas entre bactérias (BURMEISTER, 2015). Ocorre quando um microrganismo recebe material genético de outro, passando a expressar características contidas nos genes recém-incorporados (MUNITA; ARIAS, 2016).
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Estes mecanismos são possíveis pela existência de elementos genéticos móveis incluindo plasmídeos e transposons (ROGERS, 2019). É mediada por três mecanismos genéticos bem compreendidos descritos a seguir:
Transformação: Neste mecanismo, as bactérias incorporam fragmentos livres de DNA encontrados no ambiente, provenientes, por exemplo, de células mortas (TRABULSI; ALTERTHUM, 2015). É o modo mais simples de transferência horizontal de genes e fatores como estado fisiológico da célula e composição do meio são relevantes nesse processo (RAGHAVENDRA; PULLAIAH, 2018).
Conjugação: Esse mecanismo de transferência de material genético requer o contato direto célula a célula. Na conjugação há a presença de elementos genéticos móveis, como plasmídeos, que atuam como veículos de transmissão que permitem o compartilhamento de DNA entre diferentes bactérias (RAGHAVENDRA; PULLAIAH, 2018).
Transdução: Nesse processo, o material genético é transmitido de uma célula para outra dentro de um vírus capaz de infectar bactérias, denominado bacteriófago (ROGERS, 2019).
Tais mecanismos combinados à existência de elementos genéticos móveis transferíveis estão relacionados com a disseminação de fatores de virulência e genes de resistência, que contribuem para o surgimento da multirresistência (MUNITA; ARIAS, 2016).
1.2.2 Mutação
Consiste em um fenômeno espontâneo que ocorre independentemente da presença do antibacteriano. É resultante de um erro na replicação do DNA, normalmente envolve mecanismos de substituição, adição ou deleção de uma ou mais pares de bases que promoverão alterações estruturais em aminoácidos de determinados peptídeos (FIO; MATTOS FILHO; GROPPO, 2000).
Uma população anteriormente susceptível desenvolve mutação nos genes que interferem na atividade do fármaco, garantindo a sobrevivência deste mesmo na
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presença da molécula antimicrobiana. O antibiótico então eliminará as cepas susceptíveis, possibilitando a emergência do mutante e sua predominância (MUNITA; ARIAS, 2016).
Geralmente, as mutações que auxiliam na resistência são prejudiciais a homeostase da célula bacteriana, sendo mantida, portanto apenas na presença do antibiótico (REYGAERT, 2018). Elas ocorrem em determinados genes que codificam os alvos desses fármacos, interferindo em sua ação através de mecanismos como a diminuição da captação da molécula antibiótica, ativação de mecanismos de extrusão, diminuição da afinidade com o fármaco e alterações em vias metabólicas (MUNITA; ARIAS, 2016). As mutações são responsáveis por promoverem uma grande variabilidade genética, e sem elas parte do processo de adaptação bacteriana não aconteceria (TRABULSI; ALTERTHUM, 2015).
1.2.3 Tipos de resistência
Existem diversos mecanismos pelos quais as bactérias podem se tornar resistentes aos antibacterianos, mas inicialmente faz-se necessário distinguir os mecanismos intrínsecos dos adquiridos (ANTÃO et al., 2018).
A resistência intrínseca ocorre quando a bactéria é naturalmente resistente a pelo menos um antibiótico (MUNITA; ARIAS, 2016). Ou seja, descreve propriedades intrínsecas de uma bactéria que não permitem que um antibiótico atue sob a mesma (ANTÃO et al., 2018). Tais mecanismos fazem parte do perfil fenotípico, estando fixado na composição genética bacteriana e podendo ser transmitida verticalmente como herança genética sem perda da característica (CORREIA, 2013). É possível que a microbiota normal e bactérias ambientais portadoras de tais mecanismos possam atuar como patógenos oportunistas em imunocomprometidos (PETERSON; KAUR, 2018).
A resistência adquirida descreve a resistência de uma bactéria a um antibiótico no qual era anteriormente suscetível, sendo resultante da aquisição elementos extracromossômicos de resistência veiculados por elementos genéticos móveis ou mutação de genes reguladores ou estruturais (CORREIA, 2013; ANTÃO et al., 2018).
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Esses mecanismos representam uma maior ameaça à saúde humana pelo fato do determinante de resistência poder ser mediado por plasmídeo, resultando em sua expressão e disseminação fácil entre espécies bacterianas (PETERSON; KAUR, 2018). Existem quatro principais mecanismos de resistência adquirida aos antibióticos: Mecanismo enzimático, bombas de efluxo, alteração da permeabilidade celular e alterações no local de ação do antibiótico (BAPTISTA, 2013).
a) Mecanismo de inativação enzimática
A modificação estrutural ou destruição de antibióticos é um dos mecanismos mais comuns de resistência envolvendo enzimas. As principais representantes do mecanismo de inativação enzimática são as β-lactamases, que degradam os antibacterianos β-lactâmicos por meio da hidrólise do anel β-lactâmico (estrutura comum entre essa classe de antibióticos), inativando as propriedades desses fármacos (ANDRADE; DARINI, 2017).
Geneticamente, as β-lactamases são codificadas por genes denominados „‟bla‟‟ seguida da denominação fenotípica da enzima. Por exemplo, os genes das enzimas TÊM e OXA são denominados blaTEM e blaOXA mas, algumas enzimas não seguem essa regra de nomenclatura, é o caso de AmpCs (MUNITA; ARIAS, 2016).
As β-lactamases existentes podem ser agrupadas de acordo como diferentes sistemas de classificações como o de Ambler que é baseado na identidade da sequência de aminoácidos e na estrutura molecular da enzima (4 grupos: A, B, C e D), de Bush, Jacoby e Medeiros (de 1 a 4, com subdivisões) e podendo ainda serem classificadas de acordo com sua função bioquímica, com base na especificidade do substrato da enzima e no perfil de inibição pelos inibidores de β-lactamases (MUNITA; ARIAS, 2016; KAPOOR; SAIGAL; ELONGAVAN, 2017).
As β-lactamases podem também ser classificadas como serina β-lactamases quando possuem um aminoácido serina no centro ativo da enzima ou como metalo-β-lactamases, enzimas que são dependentes de um metal, geralmente zinco, utilizado como cofator para sua atividade enzimática (ANDRADE; DARINI, 2017).
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Existem inúmeros componentes bacterianos que podem ser alvos de antibióticos, para que esses fármacos possam exercer seu poder de ação e interferir no metabolismo bacteriano, é necessário que esses se liguem a alvos específicos da célula (REYGAERT, 2018). É comum bactérias desenvolverem resistência através de mecanismo que impeçam essa ligação ou interfiram na afinidade de interação com a molécula do antibiótico (SILVA; AQUINO, 2018).
Esses mecanismos incluem mutações pontuais nos genes codificadores dos alvos, modificação, proteção, substituição, desvio do alvo ou alterações enzimáticas do local de ligação (MUNITA; ARIAS, 2016). Esses mecanismos atuam contra quase todas as famílias antibióticos, incluindo β-lactâmicos, glicopeptídeos, macrólidos, lincosamidas e aminoglicosídeos.
Um dos mecanismos de resistência aos β-lactâmicos utilizado principalmente por microrganismos Gram-positivos ocorre por modificações nas PBPs, alvos desses fármacos (MACEDO, 2016). Algumas bactérias são capazes de desenvolver PBPs alteradas semelhantes ao alvo original, estas, porém são menos susceptíveis a ligação e inativação pelo fármaco, possibilitando a síntese da parede celular adequada para a sobrevivência bacteriana (DIAS, 2009). O exemplo clínico deste mecanismo de resistência ocorre em Staphylococcus aureus, pela expressão do gene mecA que possibilita a produção de uma PBPs estruturalmente modificada (PBP2a), resistente a Meticilina que garante a integridade da parede celular, enquanto as PBPs originais são inativadas pelo antibiótico (REYGAERT, 2018).
c) Diminuição da permeabilidade da membrana celular
A eficácia de determinados antibióticos depende da sua capacidade de atingir seus respectivos alvos localizados intracelularmente e atingir concentrações críticas para promover efeito antibacteriano. Algumas bactérias Gram-negativas são capazes de impedir que os antibióticos atinjam seu alvo intracelular através da limitação do influxo dessas substâncias (MASI; WINTERHALTER; PAGÈS, 2019).
As protagonistas nesse mecanismo são as porinas, complexos anfipáticos proteicos presentes na membrana externa de bactérias Gram-negativas, responsáveis pelo transporte de moléculas hidrofílicas e outros solutos para o
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interior da célula. Para impedir o acesso de antibióticos e outras substancias nocivas dependentes de porinas, as bactérias adquiriram mutações nessas estruturas que promovem perda ou alteração funcional destas estruturas, limitando a entrada de substâncias do meio externo e reduzindo a captação de antibióticos hidrofílicos como β-lactâmicos, flouroquinolonas e tetraciclinas (BELLO; DINGLE, 2018; MUNITA; ARIAS, 2016).
d) Bombas de efluxo
Alguns antibióticos como aminoglicosídeos e fluroquinolonas necessitam ser internalizados na célula bacteriana para que possam exercer seu efeito farmacológico e combater a infecção (BELLO; DINGLE, 2018). Diante deste fato, proteínas da membrana plasmática de bactérias podem agir como bombas de efluxo impedindo que os fármacos atinjam a concentração efetiva (NIKAIDO, 1998). As moléculas de antibiótico que forem capazes de passar as barreiras de proteção mais externas da bactéria poderão ser capturadas e bombeadas ativamente para o meio extracelular de maneira dependente de ATP (BELLO; DINGLE, 2018).
O efluxo de antimicrobianos é um mecanismo capaz de conferir um nível residual de resistência e de forma individual não é suficiente para conferir resistência clínica, entretanto a superexpressão ou a associação a outros mecanismos como o de modificação do alvo, pode contribuir para a resistência a múltiplas drogas e ser responsável pela falência terapêutica (DIAS, 2009).
1.3 INFECÇÕES RELACIONADAS À ASSISTÊNCIA À SAÚDE
Os hospitais e outras unidades de saúde são verdadeiras „‟incubadoras‟‟ de bactérias resistentes a antibioticoterapia, estes ambientes abrigam uma variedade de microrganismos que em sua maioria não são patogênicos, mas que rapidamente são capazes driblar a fragilidade imunológica dos pacientes e causarem infecções severas (SANTOS, 2004). Aproximadamente 10% dos pacientes hospitalizados infectam-se em consequência da terapia imunossupressora ou procedimentos invasivos (GAEDICKE, 2018).
Além do ambiente hospitalar, objetos inanimados e equipamentos utilizados na assistência aos pacientes, a microbiota endógena destes também é tida como
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uma potente fonte de infecção, cerca de 70% dos patógenos envolvidos como Staphylococcus coagulase negativa (SCN) e Enterobactérias são provenientes da microbiota própria dos pacientes (GOMES et al., 2014; MENDES et al, 2016). Ademais, esses microrganismos podem facilmente ser transmitidos também pelos profissionais de saúde que não adotam medidas preventivas de higienização (GAEDICKE, 2018; GOMES et al., 2014).
As infecções hospitalares atualmente denominadas de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) são definidas como infecções adquiridas durante a hospitalização ou cuidados em unidades de assistência à saúde, e que não estavam presentes (ou em processo de incubação) no momento da admissão do paciente cujas manifestações podem ocorrer durante a internação ou após alta (DAMACENO, 2014). Representam um desequilíbrio entre a microbiota normal e os mecanismos de defesa do organismo, sendo considerada uma das principais causas de mortalidade hospitalar, seu curso é influenciado por doenças de base, idade do paciente e agente etiológico (PEREIRA et al., 2016). Desse modo, estão fortemente associadas ao aumento no tempo de internação do paciente, morbidade, mortalidade e custos associados (PADOVEZE; FORTALEZA, 2014).
Os principais patógenos causadores de infecções nosocomiais são as bactérias, fungos e vírus, sendo as bactérias os principais microrganismos relacionados, causado aproximadamente 95% dessas (KHAN; BAIG; MEHBOOB, 2017; ARCANJO, 2014).
A ocorrência de IRAS é prevalecente nos serviços de saúde e favorece o uso de diversas classes de antibióticos em grandes dimensões, fato que relacionado a outros impulsiona o desenvolvimento da resistência bacteriana (ANVISA, 2017). O uso descontrolado de antibiótico para o tratamento dessas infecções proporciona a seleção de microrganismos resistentes que futuramente poderão causar infecções dificilmente controláveis (SANTOS, 2004).
1.4 CULTURA DE VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA
As culturas de vigilância epidemiológica são um conjunto de técnicas recomendadas pelo Centers for Disease and Control and Prevention (CDC) que
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isolam e identificam microrganismos multirresistente, com o objetivo de diagnosticar pacientes infectados e colonizados possibilitando a implementação de estratégias interventivas para controle da infecção e minimização da transmissão de MDR (do inglês multidrug-resistant) entre os pacientes (ALMEIDA, 2016; FERREIRA, 2017). Portanto, a cultura de vigilância torna-se indispensável nas unidades hospitalares por atuar de forma significante no controle das IRAS, fornecendo dados epidemiológicos e verificando eficácia das medidas de contingenciamento (CATANEO et al., 2011; ORSI; FALCONE; VENDITTI, 2011).
A colonização de pacientes hospitalizados por importantes agentes de resistência demanda uma constante vigilância dos órgãos de controle de infecção hospitalar (O‟BRIEN; STELLING, 2011). Pacientes assintomáticos são tidos como principais reservatórios de microrganismos resistentes em unidades hospitalares, a alta transmissibilidade e virulência desses microrganismos evidenciam a dificuldade de erradicar esses agentes como também a necessidade de novos métodos de controle (FERRAREZE et al., 2007; MORAES et al., 2013).
Ambientes hospitalares como berçários, unidades de diálise, unidades de tratamento a imunocomprometidos e unidade de terapia intensiva (UTI) são considerados de maior risco para o desenvolvimento de IRAS, sendo os locais onde normalmente as culturas de vigilância são aplicadas (O‟BRIEN; STELLING, 2011).
Embora o perfil de microrganismos e resistência variem nos diferentes estabelecimentos de saúde, no ambiente hospitalar as UTIs enfrentam uma problemática ainda mais grave, onde pacientes internados nestas possuem de 5 a 10 vezes mais probabilidade de contrair infecções (MINHAS et al., 2011). O fato desses pacientes já estarem imunologicamente mais fragilizados e a frequente exposição a procedimento invasivos como intubação traqueal, cateteres intravasculares com fins terapêuticos que atuam como „‟porta de entrada‟‟ para microrganismos e contribuem para um risco maior de infecções provocadas por bactérias multirresistentes (FIGUEIREDO, 2012). Diante desse contexto, órgãos de saúde em conjunto com as Comissões de Controle de Infecções Hospitalar (CCIHs) tem se preocupado em adotar culturas de vigilância visando reduzir índices de morbidade e mortalidade relacionadas às infecções nosocomiais (FRANCO, 2017).
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A metodologia das culturas de vigilância varia dependendo do microrganismo de interesse, de forma geral recomenda-se a coleta de „‟swabs‟‟ axilares, nasais, retais e áreas de feridas, pele e mucosa dos pacientes, posteriormente é realizada a identificação do gênero ou espécie do microrganismo e testes de susceptibilidade a antimicrobianos, visando detectar possíveis bactérias resistentes de importância médica (O‟BRIEN; STELLING, 2011). Os principais patógenos pesquisadas são: Staphylococcus aureus resistente à Oxacilina (MRSA), Enterococcus spp. resistentes à vancomicina (VRE), Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii resistentes a carbapenêmicos, Enterobactérias produtoras de β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e carbapenemase (KPC), sendo cada um desses pesquisados em sítios estéreis específicos (GAEDICKE, 2018).
Apesar de diversos estudos comprovarem que o uso dessa prática é de fundamental importância para o controle da disseminação de bactérias multirresistentes e diminuição significativa das infecções relacionadas à assistência à saúde, sua utilização rotineira nas unidades de saúde ainda é escarça (MORAES et al., 2013).
35 2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
Traçar o perfil de susceptibilidade ao imipenem e polimixina B de Bacilos Gram negativos isolados de amostras de cultura de vigilância de pacientes internados na unidade de terapia intensiva do hospital Giselda Trigueiro (HGT).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificar a etiologia por testes fenotípicos dos bacilos Gram-negativos isolados de cultura de vigilância de pacientes internados na unidade de terapia intensiva de hospital vinculado a UFRN;
Definir o perfil de susceptibilidade das bactérias isoladas frente a diferentes antimicrobianos;
Determinar a concentração inibitória mínima de cepas resistentes aos carbapenêmicos frente ao imipenem;
Determinar a concentração inibitória mínima de cepas resistentes aos carbapenêmicos frente à polimixina B.
36 3 METODOLOGIA
3.1 APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA
O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte através da emissão do parecer consubstanciado de número 1.136.107/15 (em anexo).
3.2 CRITÉRIO DE INCLUSÃO
Foram incluídos para participação no estudo, isolados bacterianos de pacientes da Unidade de Terapia Intensiva (UTI) do Hospital Giselda Trigueiro (HGT) com tempo de internação igual ou superior a sete dias.
3.3 COLETA
As coletas foram realizadas em pacientes internados na unidade de terapia intensiva (UTI) do Hospital Giselda Trigueiro, que se enquadravam no critério de inclusão, independentemente da condição clínica e idade. A coleta foi realizada através de swabs dos sítios axilar, nasal e retal. Os espécimes clínicos foram coletados durante o período de agosto de 2018 a março de 2019.
3.3.1 Procedimento de coleta
Para coleta no sítio axilar, o swab umedecido em solução salina estéril deveria ser friccionado sob a axila, realizando movimentos circulares numa área aproximada de 2 cm². Na coleta para o sítio nasal, o swab previamente umedecido em solução salina estéril foi introduzido por 1 cm na narina, fazendo movimentos rotatórios na mucosa por um período de 10 a 15 segundos. Já para a coleta do swab retal, o mesmo já embebedado com solução salina estéril foi introduzido por 1 cm no esfíncter retal, realizando movimentos rotatórios. Durante a retirada certificou-se de que existia coloração fecal na ponta de algodão.
Imediatamente após a coleta, os swabs foram identificados, acondicionados em meio de transporte Cary-Blair (HIMEDIA) e transportados em caixa de isopor em temperatura ambiente para serem processados no Laboratório de Micobactérias
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(LABMIC) do departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
3.4 ISOLAMENTO PRIMÁRIO
Dando início ao processamento das amostras, assim que os swabs chegavam ao laboratório eram transferidos para tubos com rosca contendo caldo BHI (Brain Heart Infusion Broth), para a etapa de enriquecimento e logo em seguida foram acondicionados em estufa bacteriológica a 35°C até que fosse possível a percepção visual (macroscópica) de turvação no meio.
Após o processo de enriquecimento da amostra e obtenção de uma carga microbiana maior, as amostras do caldo foram repicadas com auxílio de alça bacteriológica estéril para placas contendo Ágar Sangue de carneiro 5% e Ágar MacConkey (KASVI) sendo novamente incubadas em estufa bacteriológica a 35° ± 2⁰ C por 24 horas, para possibilitar o crescimento bacteriano.
Respeitado o tempo de incubação, o crescimento bacteriano foi avaliado macroscopicamente, observando-se aspectos das colônias crescidas, coloração, forma, tamanho e mudanças causadas no meio. Posteriormente foi realizado a identificação das colônias a nível de espécie por meio da caracterização morfotintorial (coloração de Gram) e provas bioquímicas.
3.4.1 Identificação de Bacilos Gram-negativos
Posteriormente a confirmação das características macroscópicas e morfotintoriais das colônias, procedeu-se a identificação através da metodologia recomenda por Koneman et al. 2008. Foram realizadas as seguintes provas bioquímicas: Crescimento no meio Tríplice açúcar-ferro (TSI), prova do sulfeto-indol-motilidade (SIM), utilização do Citrato, produção de uréase e fenilalanina desaminase, provas de descarboxilação de aminoácidos (Arginina, Lisina e Ornitina), e prova do Vermelho Metila (VM). Para a identificação de bacilos Gram-negativos não fermentadores também foi avaliado a produção de pigmento e atividade da citocromo-oxidase (prova da oxidase).
