VALOR DIAGNOSTICO DE LAS PRUEBAS RAPIDAS EN LA BRUCELOSIS HUMANA*
POR EL DR. íLI. RUIZ CASTAÑEDA Instituto de Investigaciones Médicas, MBxico, D. P.
Es eviclente que el único medio que por sí solo puede servir para es- tablecer sin lugar a duda el diagnostico de brucelosis, es el aislamiento del germen infectante, sea de la sangre o de otro material proveniente del enfermo. Un cultivo aislado puede ser negativo, pero los cultivos repetidos elevan los porcentajes de aislamient,o a cifras cercanas a 90% durante las primeras etapas de la hrucelosis, siempre que no se haya administrado algún antibiótico en fecha muy próxima al día en que se practica el cultivo. Las probabilidades de aislar brucelas son cada vez menores en Bpocas más y más alejadas del principio de la infeccion. Así pues, aún en las mejores condiciones para el cultivo, algunos casos podrían escapar al diagnóstico si esa prueba fuera la única exploración empleada. Afortunadamente, la infección estimula la producción de aglutininas, que pueden titularse con relativa precisión.
En la mayoría de los enfermos, el método de titulación por diluciones progresivas muestra títulos de al menos 1: 320. Si se practicaran rutina- riamente los dos métodos de diagnóstico que se indiran, se podrían diag- nosticar casi todos los casos de hrucelosis act’iva. Por desgracia, solamente en instituciones bien equipadas pueden hacerse a satJisfacción estas prue- bas fundamentales. La mayoría de los laborat,orios clínicos prefieren las pruebas rápidas de aglutinación en lámina y rara vez practican cultivos de sangre.
Cuando el antígeno empleado para esas pruebas ha sido bien estan- darizado puede confiarse en los resultados, particularmente cuando los títulos son elevados, pero esto no ocurre clon muchos antígenos comer- ciales o preparaciones hechas para uso personal. Sin embargo, la facili- dad con que se practican las pruebas rápidas hace casi imposible esperar que todos los laboratorios reconsideren sus procedimientos volviendo al lento y difícil método de aglutinación en tubo. hdemás, hay otras razones por las que no puede recomendarse el empleo de la prueba en tubo como único medio para definir el diagnóstico. l,os anticuerpos de “bloqueo”, descritos por Griffitts (1), han sido considerados como ca- paces de inhibir la aglutinacibn o reducirla a muy hajos títulos en (*asos de brucelosis activa. En algunas regiones parece ser muy baja la inci- dencia de casos en que ocurre esta interferencia, pero en nuestro medio no son raros tales casos, quizá por diferencias en el tipo del agente in- fectante. Para evitar errores debidos a esta II otras causas, la aglutina-
* Publicado en inglés en el B&etzn oj he Wrwld Heallh Organ~sation, Vol. 9, 1953.
Octubre 19531 RRUCELOSIS 387 ción debe practicarse con antígenos preparados con las debidas pre- cauciones. Cuando se observen discrepancias, deben ejecutarse pruebas especiales.
Es opinión general que el fenómeno de aglutinación, a pesar de la sencillez de la ejecución y lectura de la prueba, está sujeto a múltiples defectos en la Gcnica y errores en la interpretación. Por tales circunstan- cias, no puede justificarse la exigencia de que tanto los laboratorios clínicos como los laboratorios veterinarios abandonen los métodos a que están acostumbrados, a menos que se logre uniformar el criterio sobre qué técnicas deben emplearse, sobre la forma de uniformar los antígenos y sobre la interpretación que debe darse a los resultados. También hay que definir la conducta que debe seguirse con respecto a los factores inhibidores que suelen alterar los resultados de la aglutinación.
Además de las pruebas fundamentales a que se ha hecho referencia, se ha empleado profusamente la prueba alérgica cutánea utilizando sus- pensiones de brucelas o extractos brucelares de composición química más o menos definida. No cabe duda sobre la especificidad de esta prueba en lo que se refiere a provocar reacciones debidas a sensibilidad celular a las brucelas, pero no ha sido posible establecer el criterio que debe emplearse para interpretarla debidamente. Por estos motivos, la prueba alérgica, empleada aisladamente, no es recomendable para el diagnóstico de la brucelosis.
En vista de las consideraciones anteriores, hemos considerado con- veniente comparar los resultados de métodos bien controlados para la práctica del hemocultivo y la aglutinación en tubo con los diversos pro- cedimientos rápidos que se han descrito, incluyendo algunos de los nuestros. En general, hemos observado que las pruebas rápidas quizás resulten satisfactorias para descubrir si hay o no anticuerpos, pero para titularlos ninguna puede compararse con la prueba en tubo. Por tal motivo, hemos concentrado nuestros esfuerzos en perfeccionar métodos rápidos de aglutinación que den buenos resultados cualitativos, y hasta donde sea posible, obtener una idea aproximada de la intensidad de la reacción, procurando evitar pruebas positivas falsas.
En lo que se refiere a la prueba cutánea, se presentan datos que per- miten apreciar las circunstancias en que esta reacción puede ser de utili- dad como procedimiento diagnóstico.
ANTÍGENOS Y MÉTODOS RÁPIDOS
Prueba rápida (2).-Es un método rápido para determinar la pre- sencia de anticuerpos brucelares directamente en la sangre del enfermo. El antígeno es una suspensión de brucelas tratada con formalina y teñida en azul.
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salina y filtra a través de algodón. Se agrega al filtrado suficiente forma- lina para obtener una concentración de 1:lO (emplear formalina de 40%) y se deja a la temperatura del laboratorio durante 24 horas. Se centrifuga suspendiendo de nuevo el sedimento en un pequeño volumen de solución salina isotónica. Entonces se ajusta la lurbidez para obtener una concentración aproximada a la del antígeno terminado. Para esto se diluye con agua 0.1 ml de la suspensión hasta obtener una turbidez que mida 2 cm con el asa de Gates. La suspensión se ajusta de tal manera que se obtenga esa turbidez diluyendo 0.1 ml en 20 ml de agua. Esta suspensión se tiñe con azul de metileno al 0.1% procurando igualar la intensidad de la coloración con un estándar. La suspensión, que debe tener color azul muy fuerte, se deja en reposo ‘24 horas y entonces se centrifuga. El sedimento se suspende de nuevo en soluci6n est&il de citrato de sodio al 1 .l % conteniendo mertiolato al 1: 10,000. El volumen debe ser un poco menor que el de la suspensión centrifugada.
Estandarización.-El color del antígeno debe corregirse, si es necesa- rio, agregando azul de metileno (no se ha intentado corregir un exceso de colorante). El método de estandarización ha sido descrito por Spink y Anderson (3), de quienes tomamos los siguientes apuntes: “El objetivo principal de la estandarización es obtener una prueba positiva en lá- mina solamente cuando hay anticuerpos a título no inferior a 1:lOO. La estandarización se lleva a cabo practicando una serie de diluciones con un suero positivo de título conocido. Castañeda recomienda agregar una gota de antígeno estándar con un asa de 4 mm a cada una de varias láminas, y se agregan al antígeno las diversas diluciones del suero con un asa de 3 mm. Se favorece la marginación de las part’ículas aglutinadas por movimiento suave de rotación de la lámina. Las dos últimas diluciones del suero que aún provocan aglutinación se seleccionan como base de comparación con varias muestras del antígeno nuevo. Estas muestras se preparan mezclando 1 ml de antígeno con 0.1 ml de solución salina: 1 ml más 0.2 ml; 1 ml más 0.3 ml, etc. La muestra que reproduzca en re- petidas pruebas con la misma intensidad las reacciones observadas con el antígeno estándar son seleccionadas como guía para la prueba final de estandarización. Esta prueba se hace diluyendo el estándar y los antígenos nuevos al 1: 50, y practicando ron amhas diluciones pruebas de aglutinación en tubo con sueros de títulos conocidos que varíen de
Octubre 195S] BRUCELOSIS 389 Prueba rápida con sangre.-Esta prueba puede hacerse empleando sangre citratada o sangre tomada directamente del dedo o del lóbulo de la oreja. Se coloca una gota de antígeno sobre una lámina limpia por medio de un asa de 4 mm de diámetro (alambre Nikromel # 24). Con un asa de 3 mm se agrega una gota de sangre y se mezcla con el antígeno. La mezcla se extiende para cubrir un círculo de 1.5 cm de diámetro. Al inclinar la lámina la mezcla se acumula en la parte baja del círculo. Esta gota se hace rotar por la periferia imprimiendo movimientos adecuados a la lámina. Si hay anticuerpos en la sangre, al cabo de 30 segundos a un minuto, se forma un anillo azul de antígeno aglutinado que se hace apa- rente en la circunferencia de la mezcla. El anillo azul rodea un fondo rojizo que resulta de la separación de los glóbulos rojos del antígeno aglutinado. La rapidez e intensidad de la reacción es proporcional al contenido de anticuerpos en la sangre. En sangres negativas se forma un anillo rojizo que se produce por acúmulo de glóbulos rojos en la periferia de la mezcla. Este anillo rodea el fondo de color verdoso de la mezcla. A menudo los glóbulos se aglutinan dejando un fondo azul en el centro por separación de ambos reactivos. Comparando una prueba positiva con una negativa el contraste no deja lugar a dudas.
.
Para el trabajo de rutina se recomienda un platillo de fonógrafo con una inclinación de 30”, que se hace rotar lentamente. Las láminas Le sujetan al fondo de cajas de Petri y se dejan girar durante dos o tres minutos.
Fijación en superficie.-Esta es una prueba que se ejecuta en forma semejante a los procedimientos cromatográficos y en que el antígeno va impreso en pequeños círculos sobre hojas de papel filtro. Cuando se coloca el suero sobre el antígeno y se hace ascender por capilaridad, una corriente de solución salina isotónica pone en evidencia la reacción que tuvo lugar entre el suero y el antígeno. Ya se ha comunicado el principio del método (4), así como los informes detallados para preparar el antí- geno para usos prácticos (7). Para uso experimental se distribuyen hojas de papel filtro de 10 x 5 pulgadas en las que van impresas 15 manchas de antígeno a lo largo de uno de los lados mayores y a una pulgada del borde. Las manchas son negras y tienen un diámetro de 5 mm. El papel filtro que ha resultado satisfactorio para esta prueba es el Eaton-Dike- man $609.
Prueba de fijación en superficie.-Para pruebas con un solo suero se corta el papel transversalmente al tamaño que contenga t,res manchas de
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La mancha del control negativo se difunde hacia arriba dejando una huella de antígeno que puede llegar hasta la parte superior. En el control positivo la mancha permanece fija. La reacción del suero desconocido se interpreta por comparación con los controles. La intensidad de la reac- ción se gradúa por los signos convencionales de 0 a 4 6 por porcentajes aproximados de fijación.
Cuando se trata de probar simultáneamente varios sueros el papel debe contener por lo menos 2 manchas adicionales para los controles.
Prueba cutánea.-Se ha preparado un extracto brucelar de caracteres semejantes a los haptenos, el cual, titulado convenientemente, permite obtener resultados satisfactorios en la determinación de la sensibilidad cutánea en la brucelosis humana.
Preparación del antígeno.-El método de preparación del antígeno ha sido descrito en detalle en informe anterior de la serie FAO/WHO de Brucelosis (5). Sucintamente, el antígeno se prepara como sigue:
Se suspenden cultivos de Br. abortus, melitensis y suis en emulsión muy espesa y se someten a desintegración en un molino de balas de acero. El material se diluye en solución salina formalinizada al 0.5% y se centrifuga a alta velocidad. El sobrenadante se estandariza a determi- nado contenido de nitrógeno total, probando su acción alergénica en cobayos infectados con brucelas. Para esto se emplean diversas dilu- ciones que se inyectan por vía intradérmica en animales infect,ados 30 días antes. La dilución máxima del extracto que produzca reacción moderada en 75% de los animales tratados se considera el equivalente de 1: 10 de dosis para el hombre.
Intradermorreacción.Se inyecta 0.1 ml del ant,ígeno estandarizado en la dermis del antebrazo y los resultados se observan a.las 24 y 48 horas. La reacción cutánea se manifiesta comúnmente por un área con- gestiva, con o sin edema, no mayor de 2.5 cm de diámetro cuando la prueba se practica en personas que han sido expuestas a infección clínica o inaparente, y que en el momento de la prueba se encuent,ran aparente- mente libres de infección activa.
Debe tenerse en cuenta que en la fase activa de la infección, muchos enfermos pueden mostrar reacciones muy moderadas o aún negativas. Por otra parte, es de suponerse que una reacrión de intensidad exagerada sea una indicación de hipersensibilidad.
RESULTADOS
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de alto título practicada al mismo tiempo o dentro de los tres meses anteriores a este estudio.
4
Las pruebas tipo que sirvieron de base para la comparación fueron: hemocultivo practicado con el medio doble descrito en otra parte (6) ; prueba de aglutinación en tubo con suspensiones de Br. abortus, cepas # 1336 obtenida por cortesía del Dr. 1. F. Huddleson y d 1119 de los Institutos Nacionales de Sanidad, Bethesda, Md., Estados Unidos. Estas emulsiones fueron calentadas a 60°C y preservadas en 0.5% de fenol en solución salina isotónica. La incubación se hizo a 37°C y las lecturas a las 48 horas.*
El Cuadro No. 1 muestra los resultados de la comparación de estas pruebas. Los casos se dividen en grupos clasificados de acuerdo con el título de aglutinación y también de acuerdo con el aislamiento de brucelas simultánea o anteriormente. El grupo de casos en que el diagnóstico se
b
CUADRO No. 1 .-Resultados de las pruebas rápidas combinadas en la bwcelosis activai
Título de Hrmocultivo positivo Diagnóstico Reacción a las tres pruebas
aglutinación Simultá- basado en
(tubo) neo a las “:’ aglutinación Prueba con sangre + + + -
pruebas meses solamente Fijaciónensuperficie Intradermorreacción + + + -- - - -
1:320 147 - - 74 73 0 0
(mínimum) - 230 - 170 60 0 0
- - 95 70 25 0 0
1:160 19 - - 9 100 0
- 57 - 46 110 0
- - 7 4 30 0
1:so 12 - - 2 100 0
1:40 - 25 - 21 31 0
Total (592 casos de brucelosis) 396 195 1 0
372 casos de otras infecciones 0 0 0 372
- ---
t Pruebas: Rápida con sangre total; fijación en superficie; alérgica cutánea.
, fundó en un título alto de aglutinación (simultáneo o anterior) se coloca en distinta columna. Los result’ados de las tres pruebas se agrupan según cuatro diferentes combinaciones.
El Cuadro No. 1 muestra también 372 enfermos de diversas infecciones
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excluyendo brucelosis (cerca de 10 % de estos pacientes acusaron títulos de aglutinarión que variaron de 1:lO a 1:SO). Este cuadro demuestra que la prueba rápida con sangre, así como la prueba de “fijación en superficie”, producen reacciones positivas en todos los rasos de brucelosis confirmada. La intensidad de las pruebas guarda por lo general relación con el título de aglutinación, según han observado Spink y Anderson (6) con la prueba con sangre total y nosotros con la prueba de “fijación en superficie”. Debido a que estas pruebas fueron hechas al menos dos veces y las de resultados dudosos repetidas tantas veces como fue nece- sario hasta aclararlas, no hubo motivo para considerar reacciones dudo- sas en el cuadro. Pudieron observarse discrepancias entre las pruebas rápida y de “fijación en superficie”, en las que la primera fué positiva y la segunda negativa. Tales discrepancias se registraron en rasos estu- diados en períodos avanzados de la infección, en que los títulos de agluti- nación habían decrecido gradualmente.
i
El Cuadro No. 1 da una idea general de los resultados que se obtienen al practicar la prueba cutánea en diversas fases de la infección humana. Puede observarse que cerca de un tercio del total de pruebas fueron negativas, hecho que por sí solo justifica la opinión muchas veces emitida de que est’a prueba es inadecuada para el diagnóstico de la hrucelosis activa. Esto se confirma al observar aumento en el porcentaje de posi- tivas en períodos avanzados de la infección, así romo en personas que se han recuperado de la misma y aún de quienes, habiéndose infectado, no llegan a presentar manifestaciones clínicas de brucelosis. A este respecto, es interesante observar el Cuadro iYo. 2, en que se muestra la evolución de la alergia bacteriana en el curso de la enfermedad humana.
Para el Cuadro No. 2 se seleccionaron siete grupos de 100 casos cada
uno, excepto el sext’o grupo que fué calculado por los resultados observa-
dos en 40 enfermos. Todos estos fueron confirmados, ya sea por aisla- CUADRO No. 2.-Evolución de la alergia bacteriana en la brucelosis
Grupos de 100 casos cada uno
1 2 3 4 5 6* 7
hración desde el principio
(meses) Hemocultivo
Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo
52 48
69 31
79 21
77 23
91 9
71 29
1 89 j 11
-
Resultado de la intradermorreacción Positiva (yo) Negativa (%)
Menos de 3 3a6 3a6 6 a 12 6 a 12 Más de 12 Más de 12
-.
* Calculados por 40 observaciones.
,
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grupos se clasificaron de acuerdo con la duración de la enfermedad desde el principio hasta el momento de la prueba, así como por los resultados del hemocultivo en el momento en que se practicó la intradermorreacción. Puede verse que la prueba cutánea, que fué negativa en cerca del 50 % de los casos durante los tres primeros meses de enfermedad, fué aumentando en positividad con el curso del tiempo, llegando a 90 % después del sexto mes. Es de interés que haya habido más reacciones negativas en pa- cientes con bacteriemia en el momento de la prueba. Estos datos corro- boran la afirmación anterior sobre el inconveniente de emplear la prueba cutánea para investigar la existencia de brucelosis activa. Sin embargo, estudiando el Cuadro No. 3, en el que se asientan los porcentajes de
CUADRO KO. 3.-Incidencia de cultivos y reacciones positivas y negativas en las
fases convencionales de la brucelo&?
Remocultivo Aelutinaciónt Intrademmrreacción
Infección
Positivo Negativo Positiva Negativa Positiva ___________
Aguda. . . . . 89 11 96 4 45
Subaguda. . 70 30 96 4 60
Crónica.. . . 20 ( 80 30 90
“Hipersensibles” 0 / 100 :o” ( 90 100
* Las cifras indican porcentajes en grupos de 100 casos. t Aglutinación por dilución en tubo.
-
Negativa
55 40 10 0
positividad y negatividad de reacción de las tres pruebas fundamen- tales (hemocultivo, aglutinación en tubo y prueba alérgica cutánea), considerándolas en las diversas fases convencionales de la enfermedad, puede notarse que hay, además, una fase especial que llamamos “hiper- sensibilidad”, en la que 100 % de los casos muestran cultivo negativo y 10 % dieron títulos moderados de aglutinación, pero en todos los casos hubo reacción intensamente positiva en el sitio de la inyección intra- dérmica del antígeno brucelar. La mayoría de estos casos tenían ante- cedentes de haber padecido brucelosis, habiéndose presentado a la clínica para nuevo examen, debido a que sufrían molestias que no pu- dieron atribuirse a causa determinada. El hecho de que estas personas, al mejorar sus síntomas mostraron notable disminución en la intensidad de la intradermorreacción, nos hace suponer que sus molestias se rela- cionaban con un estado de alergia bacteriana.
Las observaciones mencionadas han servido para orientarnos en la interpretación de la prueba cutánea. El uso de antígenos muy potentes o demasiado débiles puede resultar inútil en la clínica, pero si se emplean extractos brucelares cuidadosamente titulados creemos que pueden defi- nirse las situaciones siguientes:
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cuadro clínico agudo puede hacer pensar más bien en recaídas de una infección anterior.
(b) En el curso de la enfermedad, las variaciones en la intensidad de la prueba cutánea pueden indicar ciertos cambios en mecanismos de- fensivos del paciente.
(c) La reacción cutánea tiene tendencia a aumentar en intensidad en los últimos períodos de la enfermedad, particularmente cuando el pa- ciente sigue recibiendo estímulo antig6nico debido a la persistencia de la infección en forma de parasitismo intracelular.
(d) A menudo una reacción cutánea intensa es la única manifestación de infección no ~610 del pasado, sino del estado de hipersensibilidad
acompañado de manifestaciones clínicas que se ha catalogado con la designación de brucelosis crónica.
RESUMEN Y CONCLUSIONES
El estudio comparativo de casos de brucelosis confirmada por pruebas de laboratorio bien controladas permite considerar que el triple método descrito sirve los siguientes objetivos: (a) aumentar el número de casos sospechosos a un porcentaje mayor que el que suministra el hemocultivo ola prueba de aglutinación en tubo, pruebas que, para tener debido valor, deben practicarse en laboratorios bien equipados; (b) como muchos laboratorios prefieren pruebas rápidas, es de desearse que éstas se con- creten a suministrar informes cualitativos que sean corroborados por pruebas más precisas. Esta conducta podría ser mucho más ventajosa que la de fundar el diagnóstico en resultados que dependen solamente de titulaciones en lámina, hechas con antígenos que no siempre son buenos, o bien en pruebas de alergia cutánea que como se sabe son de tan difícil interpretación.
El empleo de las tres pruebas que se discuten en esta nota puede sub- sanar la urgente necesidad de disponer de medios rápidos para investi- gar la infección humana. Suministran un medio de selección que se prac- tica, si es necesario, a la cabecera del enfermo ron sangre total y que muestra si hay o no aglutininas a título significativo. Esta prueba pre- liminar puede ser corroborada fácilmente por medio de la “fijación en superficie”, prueba que ha revelado notable especificidad, y que suminis- tra a la vez idea aproximada del contenido de anticuerpos. Además, se dispone de una prueba cutánea hecha con un antígeno cuya caapacidad para estimular la formación de anticuerpos es escasa o nula.
Siempre que sea posible conviene referir el enfermo a laboratorios es- pecializados para confirmar el diagnóstico por aislamiento de brucelas o por pruebas estándar de aglutinación.
REFERENCIAS
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Octubre 19531 BRUCELOSIS 395 (2) Castañeda, M. R.: Spot test for clinieal brucellosis, WHO/Bruc./3&, 1951. (3) Spink, W. W., y Anderson, D.: Correlation of a rapid slide-agglutination
test (Castañeda) with a tube-agglutination test in screening suspected cases of human brucellosis, Jour. Lab. & Ch. Med., 40:593-600, 1952. (4) Castañeda, M. R.: Surface fixation: A new method of detecting certain im- munological reactions, Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 73:4649, 1950. (5) Castañeda, M. R.: Treatment of brucellosis by means of water-soluble ex-
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(6) Castañeda, M. R.: A practica1 method for routine blood cultures in brucel- losis, Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 64:114~115, 1947.
(7) Castañeda, M. R.: Surface fixation as a practica1 method for diagnosis of brucellosis in man and animals, Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 83:36-39, 1953.
THE EVALUATION OF RAPID TESTS IN HUMAN BRUCELLOSIS
