SOCIEDADE EVANGÉLICA BENEFICENTE DE CURITIBA FACULDADE EVANGÉLICA DO PARANÁ
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO EVANGÉLICO DE CURITIBA INSTITUTO DE PESQUISAS MÉDICAS
OCTAVIO ANTONIO AZEVEDO DA COSTA FILHO
EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DA METALOPROTEINASE DA MATRIZ 9 (MMP-9), FATOR DE TRANSFORMAÇÃO DO CRESCIMENTO BETA (TGF- β) E
ALFA ACTINA DO MÚSCULO LISO (α-AML) NA CICATRIZAÇÃO DA APONEUROSE DA PAREDE ABDOMINAL DE RATOS COM BISTURI DE
LÂMINA FRIA E COM BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO
Tese apresentada como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor, ao Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia do Instituto de Pesquisas Médicas da
Faculdade Evangélica do Paraná. Orientador:
Prof. Dr. Jurandir Marcondes Ribas Filho Co -orientador:
Prof. Dr. Mario Augusto Cray da Costa Coordenador:
Prof. Dr. Osvaldo Malafaia
Costa-Filho, Octavio Antonio Azevedo da
c837e Expressão imuno-histoquímica da metaloproteinase da matriz 9 (mmp-9), fator de transformação beta (tgf- β) e alfa actina do músculo liso (α-aml) na cicatrização da aponeurose da parede abdominal de ratos com bisturi de lâmina fria e com bisturi harmônico ultrassônico / Octavio Antonio
Azevedo da Costa Filho – Curitiba, 2015. 96f.
Orientador(a): Dr. Jurandir Marcondes Ribas Filho
Coordenador : Dr. Osvaldo Malafaia Tese (Doutorado) Faculdade Evangélica do Paraná. Ciências
da Saúde, Programa de Pós Graduação em Princípios da Cirurgia.
1. Cicatrização. 2. Ultra-Som - Cirurgia. 3. Processo
inflamatório. 4. Ratos Wistar 5 metaloproteinase da matriz 9 (mmp-9) 6. fator de transformação beta (tgf- β) 7 alfa actina do músculo liso (α-aml) . I. Ribas Filho, Jurandir Marcondes. II. Título.
À minha querida esposa, Silvana, pelo seu amor, companheirismo, constante incentivo e indescritível presença em minha vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Prof. Dr. Jurandir Marcondes Ribas Filho, meu orientador, pelos ensinamentos, paciência, incentivo e atenção dedicados a esta tese. Muito Obrigado.
Ao Prof. Dr. Mario Augusto Cray da Costa, meu co-orientador, pelo inestimável auxílio, no momento crucial deste trabalho. Muito Obrigado
Ao Prof. Dr. Osvaldo Malafaia, coordenador do Programa, pelo acompanhamento e amizade.
À Prof. Dra. Carmen Austrália Paredes Marcondes Ribas, pela sua cooperação.
Agradeço a Sras. Geovana Nunes de Lara e Roseni Coprolato Castanho da Ethicon Endo-Surgery, que me cederam o Bisturi Harmônico Ultrassônico para realização do trabalho.
Ao Instituto de Pesquisas Médicas (IPEM), especialmente ao Sr. João Brito de Freitas, pela oportunidade de realização da etapa experimental desta tese, por sua amizade e dedicação.
Agradeço aos funcionários do IPEM, Érika Gomes da Rosa e Bruno Luiz Ariede, pela colaboração durante as diversas etapas deste trabalho.
Aos professores que lecionaram neste período, sem exclusões. Muito Obrigado.
A Minha Amiga Vilma Malaquias por todos estes anos de incentivo nos projetos da minha vida.
E principalmente, ao senhor Deus todo poderoso, criador do céu e da terra. Por essa e todas as outras oportunidades que me propiciou ao longo da minha vida. Muito obrigado.
RESUMO
Introdução: Com o avanço tecnológico, procedimentos de incisão e hemostasia são
realizados com os mais diversos tipos de aparelhos, em um vasto número de operações, com o objetivo de proporcionar hemostasia eficiente bem como um reduzido tempo cirúrgico, sem prejuízo à cicatrização tecidual. Objetivo: Avaliar a
evolução macro e microscópica do processo de cicatrização de feridas com o bisturi harmônico ultrassônico (BHU) na aponeurose média dos músculos reto abdominal de ratos e compará-la às feitas com bisturi de lâmina fria (BLF). Material e Método: Foram utilizados 80 ratos da linhagem Wistar, divididos em dois grupos, que sofreram incisões medianas em aponeurose na junção dos retos abdominais com BLF e BHU, respectivamente em cada grupo. As avaliações macro e microscópicas foram realizadas em subgrupos de 10 animais, nos 3º,7º,14º e 21º dias. Após a retirada da parede abdominal anterior de cada rato.Para análise macroscópica se utilizou a inspeção da ferida operatória antes e após a morte dos animais e a análise microscópica, utilizou-se o método imuno-histoquímico, metaloproteinase da matriz 9 (MMP-9), fator de transformação do crescimento beta (TGF- β) e alfa actina do músculo liso (α-AML) em ambas as incisões e sua evolução, nas amostras do 3º, 7º, 14º e 21º dias .E com a técnica de Sirius Red , a formação de colágeno Tipo I e III. Os dados foram submetidos a análise estatística com teste t de Student, para análise imuno-histoquímica, para o estudo de hematomas,infecções,deiscências e aderências foi realizado o teste Qui-quadrado. Para a análise da variância do tipo de colágeno e sua concentração foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney.Resultados: Á macroscopia, as complicações estudadas não apresentaram diferença estatística. A análise imuno-histoquímica pela MMP-9 , foi mais intensa no grupo BHU, aos 3º e 7º dias, sem diferença ao 14º dia, e menor ao 21º dia (p< 0,05). Em Relação a TGF β, teve sua expressão menor no grupo BHU aos 14º e 21º dias , sem diferença estatística aos 3º e 7º dias (p< 0,05). A expressão de α-AML se apresentou mais elevada, no grupo BHU ao 14º dia e se manteve semelhante ao 3º,7º e 21º dias (p< 0,05).Em relação à deposição de colágeno, não foi encontrada alteração quanto à deposição de colágeno tipo I, e uma deposição maior de colágeno tipo III nos animais submetidos ao corte com BHU, sendo esta maior ao 3°, 21° dias e no geral, ao 7º dia a deposição foi maior no grupo com BLF, ao 14° dia foi semelhante em ambos os grupos (p<0,001). Conclusões: A utilização do BHU comparado ao BLF apresenta uma maior área de lesão no momento da incisão; assim como levou ao atraso do processo de regeneração e maturação das cicatrizes.
ABSTRACT
Introduction: With technological advancement, incision procedures and hemostasis
are performed with various types of machinery, in a wide range of operations, in order to provide effective hemostasis and a reduced surgical time, without prejudice healing tissue. Objective: To assess macro and microscopic evolution of the wound healing process with ultrasonic harmonic scalpel (UHS) in the middle aponeurosis of the rectus abdominis muscle of rats and compare it to those made with cold scalpel blade (CSB). Material and Methods: 80 Wistar rats were divided into two groups, who suffered medial incisions in the aponeurosis at the junction of the rectus abdominis with the CBS and UHS, respectively in each group. The macro and microscopic ratings were performed in subgroups of 10 animals in the 3rd, 7th, 14th and 21st days. After removal of the anterior abdominal wall of each rat . For macroscopic analysis was used to inspect the wound before and after the death of animals and microscopic analysis, we used the immunohistochemical method, matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), the beta transforming growth factor (TGF-β) and alpha smooth muscle actin (α-AML) in both incisions and its evolution in the samples 3, 7, 14 and 21 days and the Sirius Red technique, formation of collagen type I and III. Data were statistically analyzed with the Student t test for immunohistochemical analysis for the study of bruising, infection, dehiscence, and adhesions was performed chi-square test. For the analysis of variance on the type of collagen and its concentration was used the nonparametric Mann-Whitney. Results: Macroscopic, complications studied showed no statistical difference. Immunohistochemical analysis for MMP-9 was more intense in UHS group at 3 and 7 days, with no difference after 14 days, and less after 21 days (p <0.05). Toward the TGF β, had his lower expression in UHS group at 14 and 21 days, with no statistical difference at 3 and 7 days (p <0.05). The α-AML expression appeared higher in UHS group after 14 days and remained similar to 3, 7 and 21 days (p <0.05) .In relation to collagen deposition, there was no change as the deposition type I collagen, and increased deposition of type III collagen in the animals submitted to the court with UHS, which is higher by 3 °, 21 days and overall, the 7th day the deposition was higher in the group with the CSB, the 14 ° day was similar in both groups (p <0.001).
Conclusions: The use of UHS compared to the CSB has a higher lesion area at the
time of the incision; as well as it led to the delay of regeneration and scar maturation process
Keywords: 1. Healing. 2. Ultrasound - Surgery. 3. inflammatory process. 4. Wistar
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO ... 31
FIGURA 2- SISTEMA BISTURI HARMÔNICO ULTRA CISION ... 31
FIGURA 3- INCISÂO COM BISTURI LÂMINA FRIA EM PELE EXPONDO A APONEUROSE ... 33
FIGURA 4- INCISÂO COM BISTURI LÂMINA FRIA NA APONEUROSE ... 34
FIGURA 5- INCISÂO COM BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO À APONEUROSE ... 34
FIGURA 6 - SÍNTESE DA APONEUROSE ... 35
FIGURA 7- SÍNTESE DE PELE ... 35
FIGURA 8- PEÇA DISSECADA ... 37
FIGURA 9 - PINÇA BIÓPSIA DE PELE – PUNCH ... 39
FIGURA 10 - BIÓPSIA COM PUNCH ... 39
FIGURA 11 - MATERIAL EM BLOCO DE PARAFINA ... 40
FIGURA 12- BLOCO RECEPTOR ... 40
FIGURA 13- BLOCO SUBGRUPO BHU14 ... 41
FIGURA 14- LEITURA IMUNO-HISTOQUÍMICA ... .44
FIGURA 15- HEMATOMA DE PAREDE ... 49
FIGURA 16- DEISCÊNCIA DE SUTURA DE PAREDE ... 49
FIGURA 17- ADERÊNCIA GRAU 1 ... 50
FIGURA 18 - FOTOMICROGRAFIA DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS IMUNOCORADAS COM MMP-9 ... 53
FIGURA 19 - FOTOMICROGRAFIA DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS IMUNOCORADAS COM TGF-β ... 55
FIGURA 20 - FOTOMICROGRAFIA DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS IMUNOCORADAS COM α-AML ... 57
FIGURA 21 - FOTOMIOGRAFIA MOSTRANDO FIBRAS COLÁGENAS ... 58
FIGURA 22- FOTOMIOGRAFIA MOSTRANDO FIBRAS COLÁGENAS ... 58
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - MÉDIA DE IMUNOEXPRESSÃO TECIDUAL (EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR CGA) DOMMP-9 EM RELAÇÃO AOS GRUPOS DE BLF E BHU, NO 3º,7º.14º E 21º DIAS ... 52 GRÁFICO 2 - MÉDIA DE IMUNOEXPRESSÃO TECIDUAL (EM MICRÔMETROS
QUADRADOS POR CGA) DO TGF-β EM RELAÇÃOAOS GRUPOS DE BLF E BHU, NO 3º,7º.14º E 21º DIAS ... 54 GRÁFICO 3 - MÉDIA DE IMUNOEXPRESSÃO TECIDUAL (EM MICRÔMETROS
QUADRADOS POR CGA) DO α-AML EM RELAÇÃOAOS GRUPOS DE BLF E BHU, NO 3º,7º.14º E 21º DIAS ... 56 GRÁFICO 4- REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA QUANTIFICAÇÂO DE
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - CRITÉRIOS PARA AVALIAÇÂO MACROSCÓPICA ... 38
QUADRO 2 - CLASSIFICAÇÂO DAS ADERÊNCIAS ABDOMINAIS ... 38
QUADRO 3 - ANTICORPOS PRIMÁRIOS UTILIZADOS ... 43
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - RESULTADO DE ÁREA IMUNOPOSITIVA PELAS 4 IMAGENS DE CADA AMOSTRA... 45 TABELA 2 - ADERÊNCIAS E ANÁLISE ESTATÍSTICA DO GRUPO BLF ... 51 TABELA 3 - ADERÊNCIAS E ANÁLISE ESTATÍSTICA DO GRUPO BHU ... 51 TABELA 4 - MÉDIA , DESVIO PADRÃO, EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR
CGA, E ANÁLISE ESTATÍSTICA NOS BISTURIS LÂMINA FRIA E HARMÔNICO ULTRASSÔNICO MMP-9 ... 52 TABELA 5 - MÉDIA , DESVIO PADRÃO, EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR
CGA, E ANÁLISE ESTATÍSTICA NOS BISTURIS LÂMINA FRIA E HARMÔNICO ULTRASSÔNICO TGF- BETA ... 54 TABELA 6 - MÉDIA,DESVIO PADRÃO, EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR
CGA, E ANÁLISE ESTATÍSTICA NOS BISTURIS LÂMINA FRIA E HARMÔNICO ULTRASSÔNICO ALFA-AML ... 56 TABELA 7 - QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE
COLÁGENO MADURO (TIPO I) NOS DOIS GRUPOS ... 59 TABELA 8 - QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE
COLÁGENO IMATURO (TIPO III) NOS DOIS GRUPOS ... 60 TABELA 9 - ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO TIPO I
LISTA DE ABREVIATURAS
BLF - bisturi com lâmina fria
BHU - bisturi harmônico ultrassônico CSB - cold scalple blade
UHS - ultrassonic harmonic scalple
SBCAL - Sociedade Brasileira de Ciências em Animais de Laboratório MMPs - metaloproteinases
MMP-9 - metaloproteinase da matriz 9
TGF-β - fator de transformação do crescimento beta α-AML - alfa actina do músculo liso
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 15
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 19
2.1 BISTUTI COM LÂMINA FRIA E BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO ... 19
2.2 METALOPROTEINASE DA MATRIZ 9 (MMP-9) ... 23
2.3 FATOR DE TRANSFORMAÇÃO DO CRESCIMENTO BETA (TGF-β) ... 24
2.4 MIOFIBROBLASTO E ALFA ACTINA DE MÚSCULO LISO (α-AML) ... 25
3 MATERIAL E MÉTODO ... 29
3.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ... 29
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ... 29
3.3 APARELHOS UTILIZADOS ... 30
3.3.1 Bistuti com lâmina fria ... 30
3.3.2 Bisturi harmônico ultrassônico ... 30
3.4 PRÉ-OPERATÓRIO ... 32
3.5 ANESTESIA ... 32
3.6 ATO OPERATÓRIO ... 33
3.7 CIRURGIA ... 33
3.8 PÓS-OPERATÓRIO ... 36
3.9 MORTE DOS ANIMAIS ... 36
3.10 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS ... 37
3.11 AVALIAÇÕES MACROSCÓPICAS DA CICATRIZAÇÃO ... 37
3.12 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA ... 39
3.12.1 Preparo das Amostras Teciduais ... 39
3.12.2 Método imuno-histoquímico ... 42
3.12.3 Leitura das lâminas de imuno-histoquímica ... 44
4.2.2 Fator de transformação do crescimento beta (tgf-β) ... 53
4.2.3 Alfa actina de músculo liso (α-aml) ... 55
4.2.4 Coloração picrosirius ... 57 5 DISCUSSÃO ... 63 5.1 MODELO EXPERIMENTAL ... 63 5.2 TÉCNICA ANESTÉSICA ... 63 5.3 TÉCNICA OPERATÓRIA ... 64 5.4 ANÁLISE MACROSCÓPICA ... 68 5.5 ANÁLISE MICROSCÓPICA ... 69
No estudo de acessos a cavidade abdominal, para uma determinada incisão cirúrgica, a mediana é na maioria das vezes a escolhida, seja pela facilidade de acesso, pela ampla exposição de suas estruturas, bem como a rapidez, fundamental, sobretudo em urgências.
Com o aumento no número de laparotomias, aumentam as complicações como as hérnias incisionais, que possuem tanto fatores locais quanto sistêmicos, em sua etiologia (VIEIRA et al., 2000).
Sabendo que o traumatismo indevido, bem como hematomas e infecções são complicações locais muitas vezes dependentes da maneira como a incisão ocorreu, ou seja, do tipo de trauma sofrido pelos tecidos a fim de ser realizado o acesso cirúrgico, e que quanto maior a agressão e destruição celular, mais deficiente se torna a cicatrização dos tecidos, com uma fase inflamatória mais longa e retardo na deposição de colágeno, que é a estrutura tecidual que possui a função de manter a mesma resistência que o tecido possuía antes,daí a importância de se comparar os diversos tipos de energia que produzem trauma danos e reparos teciduais.
Procedimentos de incisão e hemostasia são realizados com os mais diversos tipos de equipamentos, com o objetivo de proporcionar hemostasia eficiente bem como um reduzido tempo cirúrgico, sem prejuízo a cicatrização tecidual.
O bisturi com lâmina fria (BLF) foi o instrumento mais largamente utilizado para diérese nas operações, devido ao seu fácil uso e dano previsível nos tecidos. Nas incisões feitas com BLF ocorrem sangramentos, o que dificulta a visibilidade do campo operatório e exige hemostasia. Desde a introdução do eletrocautério por Bovie, em 1929 (VORE et al., 2002), vários modelos desse instrumento foram desenvolvidos, tanto para uso médico como odontológico.
INTRODUÇÃO 16
PAREDES, BORGES & COULSON, 1996; GERSTH et al., 2000; VIEIRA et al., 2000; METTERNICH et al., 2002; METTERNICH et al. 2002; GAO et al., 2003).
O BHU efetua hemostasia pela combinação de dissecção com coagulação sanguínea e consequente obstrução do vaso. O ultrassom atua como fonte de energia, pois a ponta do instrumento (lâmina) provoca vibrações unidirecionais, as quais levam à dissecção do tecido e, ao mesmo tempo, à coagulação sanguínea. Quando a lâmina vibra em 55.500 Hz de freqüência, o som é transformado em energia mecânica vibratória, e atua promovendo corte e coagulação (RAMOS et al., 2004). Proporciona melhor coagulação em função de sua lâmina apresentar ponta romba e, consequentemente, gerar um corte lento. A quantidade de energia fornecida aos tecidos e os efeitos sobre eles dependem de diferentes fatores, como: nível de potência, característica da lâmina, tensão do tecido, tipo de tecido, doença e técnica cirúrgica (METTERNICH et al., 2003). Utiliza tecnologia que permite cortar com hemostasia e coagular vasos dos tecidos moles usando baixas temperaturas, diferente das temperaturas usadas pelo laser ou eletrocautério. A energia ultrassônica permite ambos, cortar e coagular no ponto preciso de impacto com mínimo dano térmico tecidual adjacente (KOCH et al., 2003). Oferece também grande precisão em pequenos espaços e boa visibilidade no campo cirúrgico devido a mínima produção de fumaça. O BHU controla sangramento em temperaturas entre 80°C e 100° C. Os vasos são coaptados e selados devido à desnaturação das proteínas que ocorre quando a temperatura ultrapassa 63°C e logo sofre resfriamento do tecido. O laser e o eletrocautério coagulam vasos devido às altas temperaturas geradas, 300°C e 800°C respectivamente, ocasionando a formação de crostas, as quais podem se desprender do tecido e causar sangramento (METTERNICH et al., 2002).
O aquecimento do tecido provocado pelo BHU apresenta grau mínimo na profundidade em comparação ao laser,à radiofrequência e ao eletrocautério, reduzindo o dano tecidual. A profundidade de aquecimento do tecido varia de meio a um e meio milímetros, sendo recomendada uma margem de segurança de três milímetros (METTERNICH et al., 2003).
ultrassônico, com o objetivo principal de avaliar a evolução do processo de cicatrização de feridas com o bisturi ultrassônico na aponeurose média dos músculos reto abdominal de ratos e compará-la às com bisturi de lâmina fria, através dos seguintes objetivos secundários:
1) Comparação de complicações macroscópicas: formação de hematomas, infecção, deiscências de sutura e aderências.
2) Comparação da expressão imuno-histoquímica da metaloproteinase da matriz 9 (MMP-9).
3) Comparação da expressão imuno-histoquímica do fator de transformação do crescimento beta (TGF- β).
4) Comparação da expressão imuno-histoquímica alfa actina do músculo liso (α-AML) .
5) Avaliar a resposta do colágeno maduro, Tipo I pós-agressão cirúrgica e compará-lo nos dois grupos.
2.1 BISTURI LÂMINA FRIA E BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO.
Hambley et al., (1988), avaliaram a lesão e a cicatrização dos tecidos em pele de porcos, após incisões com BLF, BHU, CO2 Laser e eletrocautério, e comparam os aspectos clínicos, histopatológicos e diferenças na força tensil das feridas. De acordo com os resultados concluíram que o BLF produziu menos lesão nos tecidos e cicatrização mais rápida, mas o BHU apresentou menor lesão nos tecidos e cicatrização mais rápida que eletrocautérios e que laser.
Gertch et al., (2000) em estudo mostrando resultados de hepatectomia usando o BHU, em 16 cirurgias consecutivas mostrou que o bisturi harmônico promove dissecção eficiente do parênquima hepático, de estruturas intra-hepáticas e boa hemostasia, diminuindo o tempo cirúrgico e a utilização de outros tipos de ligadura.
Ziv et al., (2001) realizaram laparotomia mediana em 60 ratos, randomicamente distribuídos em dois grupos (bisturi de lâmina fria e eletrocautério). A incisão da fáscia e pele foram fechadas separadamente usando sutura com nylon. Analisando as propriedades mecânicas dos segmentos de fáscia seis dias após a cirurgia, não encontraram nenhuma diferença significativa entre os dois grupos.
Metternich et al., (2001) constataram que na tonsilectomia há hemostasia eficiente intra e pós-operatória de significado expressivo, com combinação de dissecção e coagulação sanguínea do vaso promovido pelo BHU, levando a uma mínima perda de sangue. Isso foi favorável para crianças e pacientes anêmicos, abreviando a duração do tratamento, mas o tempo da cicatrização não se alterou. em comparação com as tonsilectomias feitas pelo método convencional.
Kearns et al., (2001) compararam os resultados da incisão, em laparotomia mediana, realizada com eletrocautério ou bisturi a frio em 100 pacientes. Eles mostraram que pacientes que receberam incisão eletrocautério tiveram uma cicatrização mais rápida, menos sangramento importante, e um mínimo de dor no pós-operatório.
REVISÃO DE LITERATURA 20
pós-operatório, avaliados quanto à dor e sangramento, após dez dias, em média, retornaram as suas funções normais. Concluíram que o BHU foi um aparelho de fácil uso, as operações foram mais curtas e o sangramento foi mínimo. Segundo eles, os achados foram positivos, e por isso o BHU deveria ser incluído como uma alternativa nas tonsilectomias.
Metternich et al., (2002), em mostraram os benefícios da utilização do bisturi harmônico em cirurgias para tratamento de carcinoma de língua e de palato mole. Foram avaliadas a necessidade de eletrocoagulação adjuvante e a possibilidade do estudo das margens da peça cirúrgica enviada para anatomopatológico, 82% dos pacientes com tumor de palato não necessitaram eletrocoagulação ou ligadura de vasos, o mesmo ocorreu em 68% das cirurgias de língua. A peça cirúrgica mostrou-se adequada para a avaliação pelo anatomopatologista, principalmente no que se refere às margens cirúrgicas, que não mostraram lesão tecidual por calor.
Haegner, Handrock & Schade (2002) confrontaram as vantagens e as desvantagens da tonsilectomia com BHU em relação aos métodos tradicionais e constataram cirurgias mais rápidas, com menor perda de sangue, menor número de complicações intra-operatórias e menos dor no pós-operatório. A desvantagem foi o retardo da cicatrização em relação à tonsilectomia tradicional.
Gao et al., (2003) mostraram a eficácia da secção de vasos em tumores benignos de tireóide, abordados com o bisturi harmônico por via endoscópica. Foram avaliados 170 pacientes submetidos a esse procedimento. Nenhum dos pacientes apresentou sangramento ou hematoma importante no pós-operatório. Ramos dos principais vasos podem ser satisfatoriamente seccionados com o bisturi harmônico sem uso de ligadura ou hemo-clipe. O sangramento intra-operatório foi satisfatoriamente controlado com a coagulação promovida pelo bisturi harmônico. Os autores concluem que a utilização do bisturi harmônico simplifica grandemente o manejo intraoperatório da tireóide.
influenciavam no dano térmico. No nível três de graduação do BHU o dano térmico era menor, uma vez que nos níveis quatro e cinco a energia ultrassônica causou dano tecidual quando permaneceu no mesmo espaço por mais de cinco segundos.
Metternich et al., (2003) em estudo com 20 pacientes mostrou o benefício do emprego do bisturi harmônico em pacientes submetidos à parotidectomia. A hemostasia foi eficiente em 85% dos pacientes para os quais não foi necessário o uso de ligaduras ou eletrocoagulação. Não houve dano a tecidos vizinhos ou ao nervo facial.
Ishibashi & Takamatsu (2003) Relatou casos de pacientes com telangectasia hemorrágica hereditária tratados com o uso de bisturi harmônico. O uso desse equipamento evitou a carbonização e incrustação na mucosa nasal que é comum com o uso do eletrocautério ou da cauterização a laser.
Sinha e Gallagher (2003) estudaram os efeitos do BLF, BHU, laser de CO2 e eletrocautério monopolar e bipolar em cicatrização de feridas em mucosa oral de Guinea pig. Foram feitas incisões na mucosa oral, avaliada a dor pela medida de peso do animal, feitas análises histológicas e tensão nos dias 0, 7, 14, 21 e 28. Com a análise dos dados concluíram que o uso do BLF produziu cicatrizes mais resistentes em todos os tempos estudados e no final da primeira semana a epitelização era completa nas feridas feitas com BHU e BLF e incompleta no laser e eletrocautério. A evolução do processo inflamatório foi mais breve no BHU e BLF.
Ramos et al.(2004), afirmaram que o BHU é um excelente recurso para a realização de operações mais longas e com maior risco de sangramento. Relataram desvantagens como a perda da sensibilidade, alteração da temperatura dos tecidos e ausência de direção de corte. Como vantagens descreveram a simultaneidade do corte e coagulação, otimizando o tempo cirúrgico, a não utilização de corrente elétrica, a mínima carbonização tecidual e a fácil instalação e manipulação do aparelho.
REVISÃO DE LITERATURA 22
parênquima pulmonar por dispersão de calor como nos casos em que se utiliza bisturi bipolar.
Blankenship et al. (2004), em estudo retrospectivo de 42 pacientes submetidos à parotidectomia superficial por doença benigna de parótida, sendo que 19 foram submetidos à cirurgia utilizando o bisturi harmônico (grupo A) e 21 submetidos à cirurgia com bisturi convencional (grupo controle). O uso do bisturi harmônico mostrou diminuição significativa do tempo cirúrgico (grupo A- 167,5 ± 42,6min. vs 195,5 ± 37,4 min. para controle, p=0,03), e da perda sanguínea per operatória (37,5 ±25,8 vs 60 ± 37,1 ml, p=0,03). Não houve diferença significativa no pós-operatório quanto à função do nervo facial.
Westervelt et al. (2004), em relato de série de casos, com 100 pacientes submetidos à colecistectomia laparoscópica utilizando o bisturi harmônico para dissecção de ducto e artéria cística e dissecção do leito da vesícula, sem utilização de clipe. Apenas dois pacientes com cístico maior que 5 mm receberam ligadura adicional. Nenhum paciente apresentou sangramento no pós-operatório ou extravasamento de bile.
Perko et al. (2006), em estudo usando BHU em parede lateral de abdome de ratos, onde foram realizadas cauterizações por 5,10 segundos ininterruptos e por duas sequências de aplicações de 5 segundos,demonstrando que a lesão é maior quanto mais longo e mais sustentado o período de aplicação
Garcia et al. (2007), comparou a cicatrização da aponeurose da parede abdominal de ratos após incisão com bisturi de lâmina fria e eletrocautério, sendo sacrificados ao 10° dia , e concluíram que a cicatrização da parede abdominal após a diérese com bisturi de lâmina fria e eletrocautério se equivalem e não diferem.
Broek, Wibers & Goor (2011), em trabalho onde comparou a isquemia tecidual do orifício de passagem de catéter de hemodiálise em ratos , quando feita com eletrocautério e BHU, encontrou isquemia superior nos orifícios realizados com eletrocautério.
2.2 METALOPROTEINASES E METALOPROTEINASE DA MATRIZ 9 (MMP-9).
O primeiro relato sobre as metaloproteinases foi publicado em 1962, Gross e Lapiére encontraram uma enzima ativa em cultura de pele que degradava colágeno tipo I.
As metaloproteinases (MMPs) são uma família de endopeptidases zinco dependente, que promovem a degradação da matriz extracelular, podendo também ser chamadas de matrixinas. Todos os membros dessa família são secretados como proenzimas. Essas proenzimas são liberadas por neutrófilos, monócitos, macrófagos, fibroblastos e, além disso, também podem ser secretadas pelas células tumorais em resposta a uma variedade de estímulos (WOESSNER et al .,1991).
A família das MMPs inclui cerca de 25 proteínas,as quais podem ser divididas em: colagenases (MMP-1,8 e 13), gelatinases (MMP-2 e 9), estromelisinas (MMP-3, 7 e 10), matrilisinas (MMP-7 e 26), MMPs tipo membrana (MMP-14, 15, 16, 17 e 24) e outras MMPs ,que são classificadas pela especificidade ao substrato e, principalmente, de acordo a sua estrutura, (VISSE etal ., 2003).
Gelatinase B (MMP-9) e gelatinase A (MMP-2) são dois membros intimamente relacionados da família MMP que degradam colágeno desnaturado ou gelatinas, (VISSE et al ,.2003).
REVISÃO DE LITERATURA 24
quanto maior o estímulo para sua produção pelos neutrófagos, monócitos e macrófagos. As colagenases na cicatrização possuem a função de degradar o tecido lesado , para que a regeneração tecidual possa ocorrer. Sua aferição e feita pela imuno-histoquimica.
Diversos processos biológicos ocorrem com a participação das metaloproteinases, (YONG et al .,2007) como determinação da arquitetura da matriz extracelular, (LEE et al .,2004),desenvolvimento embrionário (CHEN et al.,2004), implantação do blastocisto, morfogênese dos órgãos, desenvolvimento do sistema nervoso, ovulação, dilatação cervical, regressão uterina pós-parto (NAGASE et al.,1999),desenvolvimento e remodelação do tecido oral, cicatrização, angiogênese , (CHEN et al.,2004) e apoptose, (SOUZA et al., 2002).
2.3 FATOR DE TRANSFORMAÇÃO DO CRESCIMENTO BETA (TGF-).
A superfamília dos TGF-inclui vários fatores de crescimento responsáveis pela diferenciação e morfogênese celular em diferentes células e tecidos, tanto em condições fisiológicas como patológicas, através de receptores de superfície celular.
São representadas pelas seguintes subfamílias: TGF-(-1, -2, -3, -4 e
-5); activinas e proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), (KINGSLEY.,1994 ; REDDI.,1994).
O TGF-1 é um regulador multifuncional do crescimento e diferenciação celular durante desenvolvimento e reparação, influenciando a síntese de componentes da matriz extracelular, como colágenos, fibronectina, laminina e glicosaminoglicanas, (IGNOTZ et al., 1987; BORDER e NOBLE, 1994). Além disso, é um importante modulador da síntese de receptores de membrana, as integrinas, aumentando assim a interação célula-célula e célula-matriz, (ROBERTS et al., 1988; HEINO et al.,1989).
síntese da matriz celular, sua quantificação medida pela imuno-histoquímica, é quanto maior a necessidade de composição tecidual , maior sua concentração. O TGF-1 é provavelmente o fator de crescimento mais importante na indução da α-AML (DESMOULIÉRE et al.,1993; DESMOULIÈRE.,1995 ;GREGOIRE e LIEUBEAU.,1995 ; CHAPONNIER e GABBIANI.,2004).
Desmouliére et al. (1993) demonstraram que o TGF-apresenta um importante papel na diferenciação miofibroblástica durante os fenômenos fibrocontrativos e cicatriciais, por regular a expressão de α-AML nestas células. Sabe-se que o TGF-1 induz a produção de colágeno tipo I, por regular a diferenciação de células mesenquimais indiferenciadas. (NAKASHIMA, 1992; TOYONO et al., 1997; HU et al., 1998; SHIBA et al., 1998; TZIAFAS et al., 1998; SLOAN e SMITH, 1999; MELIN et al., 2000; ABOUT e MITSIADIS, 2001; TZIAFAS, 2004).
2.4 MIOFIBROBLASTO E ALFA ACTINA DE MÚSCULO LISO (α-AML)
Durante muitos anos, propôs-se que o termo “miofibroblasto” se empregava para nominar células fibroblásticas localizadas nos tecidos de granulação que exibiam um importante aparato microfilamentoso citoplasmático (GABBIANI et al., 1971; 1976).
Os miofibroblastos são componentes importantes durante a reparação do tecido lesionado e aparecem após o término dos fenômenos inflamatórios iniciais. Na maioria dos órgãos, a lesão tecidual ativa fibrócitos locais que na presença dos fatores de crescimento derivados dos macrófagos se diferenciam em miofibroblastos contráteis, que são caracterizados pela expressão da α-actina de músculo liso. Portanto a sua produção é mediada pelo estimulo tecidual pós agressão, no caso reação inflamatória, que ativa fibrócitos e estes se diferenciam em miofibroblastos, sua quantificação pode ser feita pelo método imuno-histoquímico.
REVISÃO DE LITERATURA 26
Esta célula tem um papel fundamental no fenômeno de retração da ferida, síntese e secreção de proteínas da matriz extracelular (EYDEN, 2001).
Os principais microfilamentos que compõem o citoplasma da célula miofibroblástica contém actina e/ou desmina, e proteínas associadas a células de músculo liso, sendo principalmente caracterizada pela presença da isoforma α-actina de músculo liso, tipicamente localizada nas células musculares lisas da parede de vasos sanguíneos (DARBY et al., 1990).
As actinas são proteínas presentes somente nas células eucarióticas envolvidas em diversas funções celulares incluindo contração muscular, motilidade ,adesão e divisão celulares, bem como, manutenção da morfologia da célula,(CHAPONNIER e GABBIANI, 2004) Em vertebrados, constitui uma família de seis proteínas, expressa em padrões específicos no desenvolvimento de cada tecido (MCHUGH et al., 1991).
Existem quatro isoformas restritas a tipos teciduais, como, α-actina esqueletal, α-actina cardíaca, α-actina de músculo liso e γ-actina de músculo liso,expressas respectivamente em músculos esquelético, estriado cardíaco, musculatura lisa vascular e entérica, (CHAPONNIER e GABBIANI, 2004).
A α-actina de músculo liso é um microfilamento (5-8 nm de diâmetro) que compõe o citoesqueleto de todas as células musculares lisas de mamíferos, células mioepiteliais, e particularmente abundante em células musculares lisas de paredes de vasos, (DARBY et al., 1990; MCHUGH et al., 1991), tendo uma importante função contrátil nestas células (CASELITZ et al., 1981), sendo considerada um marcador do fenótipo miofibroblástico, (VAUGHAN et al., 2000; HINZ et al., 2007) . Está também presente em células conjuntivas como fibroblastos (DESMOULIÈRE et al., 1993; ARORA e McCULLOCH, 1999; PREMDAS et al., 2001; KINNER et al., 2002) e miofibroblastos (DARBY et al., 1990; HINZ et al., 2003, 2007).
membrana chamadas de fibronexos (SCHÜRCH et al., 1998; EYDEN, 2001, 2004) Funcionalmente, este sistema mecano-transdutor é capaz de transmitir as forças geradas na matriz extracelular (DUGINA et al., 2001), sendo importante no processo de reparação tecidual.
Ainda que controversa, a hipótese mais amplamente aceita na literatura sobre a origem dos miofibroblastos é a partir de fibroblastos quiescentes, que uma vez ativados, sintetizam abundante quantidade de cisternas de retículo endoplasmático rugoso para produção de matriz, e transdução de genes que codificam a transcrição de miofilamentos de actina de músculo liso, importantes na contratilidade celular (WELCH et al., 1990).
Alliot-Licht et al. (2001) demonstraram a presença de células positivas para
-AML em cultura mineralizada de polpas dentárias humanas. Estas células apresentavam, ultra-estruturalmente, numerosas fibras e fibronexos bem desenvolvidos, bem como núcleo edentado e conexões intercelulares do tipo “gap”,caracterizando-as de miofibroblastos. Sugeriram que alguns fatores de crescimento presentes no meio de cultivo celular, combinados ou não a proteínas da matriz extracelular, seriam responsáveis pela diferenciação de células pulpares em miofibroblastos.
Este estudo foi realizado no Instituto de Pesquisas Médicas (IPEM) do Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia da Faculdade Evangélica do Paraná – Níveis Mestrado e Doutorado.
Neste trabalho, aplicaram-se as Normas para Apresentação de Documentos Científicos da Universidade Federal do Paraná (2007), baseados na Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT); utilizou-se a Nomina Anatômica Veterinária (1997) e os princípios éticos em experimentação animal preconizados pela Sociedade Brasileira de Ciências em Animais de Laboratório (SBCAL).
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Sociedade Evangélica Beneficente de Curitiba (anexo 1).
3.1 CARACTERIZAÇÂO DA AMOSTRA
Foram utilizados 80 ratos (Rattus norvergicus albinus, Rodentia mammalia), da linhagem Wistar, machos, adultos jovens, com três meses de idade com peso variando de 250 a 300 gramas, procedentes do biotério do Instituto de Tecnologia do Paraná (TECPAR).
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Os animais foram distribuídos em dois grupos de 40 ratos. O primeiro submetido à incisão cutânea inicial com bisturi de lâmina fria e abertura da aponeurose da linha média com a mesma. O segundo grupo foi submetido à mesma incisão cutânea, porém a aponeurose foi aberta com bisturi harmônico ultrassônico.
MATERIAL E MÉTODO 30
submetidos à incisão aponeurótica com bisturi harmônico ultrassônico; e morte nos 3º, 7º, 14º e 21º dias, foram denominados BHU 3 BHU 7, BHU 14 e BHU 21, respectivamente. Os animais de cada subgrupo foram identificados pelos números 1 a 10 com caneta marcadora em cauda.
3.3 APARELHOS UTILIZADOS
3.3.1 Bisturi com Lâmina Fria
Utilizou-se um bisturi de lâmina móvel, cabo número três e lâmina número quinze.
3.3.2 Bisturi Harmônico Ultrassônico
Foi utilizado bisturi harmônico ultrassônico produzido pela Ethicon Endo Surgery®, Inc (Figura 1), modelo Gerador 300 GEN04, ano de fabricação 2001.
FIGURA 1- BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO FONTE: O autor .
Como instrumento de mão foi utilizado o Bisturi Harmônico (UltraCision® -ETHICON) (Figura 2) , que consiste em uma Lâmina Tipo Tesoura Curva (modelo CS-14C), que é utilizada tanto para corte quanto para dissecção dos tecidos.
FIGURA 2 - BISTURI HARMÔNICO ULTRA CISION NOTA: Bisturi Harmônico UltraCision ® – ETHICON
MATERIAL E MÉTODO 32
3.4 PRÉ-OPERATÓRIO
Os animais permaneceram albergados no biotério do IPEM e mantidos sob condições constantes de luz e temperatura, com doze horas de claridade e doze horas de escuridão, em sala isenta de ruídos e iluminada com lâmpadas fluorescentes.
Foram acondicionados em gaiolas-padrão, forradas com serragem, sendo alimentados com ração comercial (Nuvilab CR-1 ® -Nuvital Nutrientes S/A), com acesso para água tratada.
Os ratos foram submetidos a um jejum pré-operatório de doze horas, com oferta de água.
3.5 ANESTESIA
Num frasco estéril foi adicionado 3,75 ml de cloridrato de ketamina 10% (Ketalar® Aché) - 100mg/ml + 0,5 ml de cloridrato de xilazina 2% (Vibaxyl 2% ® Virbac) -100mg/ml + 5,75 ml de água destilada estéril.
3.6 ATO OPERATÓRIO
As cirurgias foram realizadas no laboratório do IPEM pelo autor e dois auxiliares.
Após a anestesia os animais foram posicionados em decúbito dorsal sendo fixados pelas extremidades na mesa cirúrgica. A tricotomia abdominal na parede ventral foi realizada com a utilização de aparelho de barbear, lâmina de aço (Gillette® Gillette do Brasil Ltda.) com auxílio de sabão líquido.
Foi realizada antissepsia com iodopolipovidona a 10% (Pvpi ® Geyer) seguida da colocação de campo estéril delimitando a área cirúrgica.
3.7 CIRURGIA
Realizou-se, incisão cirúrgica abdominal mediana, em pele, com bisturi lâmina nº 15 (Solidor), com 7 cm de comprimento, longitudinal e retilínea, sendo a hemostasia realizada por compressão digital, assim expondo a linha média da aponeurose da parede abdominal (Figura 3).
MATERIAL E MÉTODO 34
Feito isso, no primeiro grupo foi realizada secção da aponeurose, até atingir o peritônio com bisturi lâmina fria, no comprimento de 6 cm, e no segundo grupo o mesmo acesso utilizando o bisturi harmônico ultrassônico, gerador 300, no nível 3 de uso (Figuras 4 e 5).
FIGURA 4 – INCISÃO COM BISTURI DE LÂMINA FRIA NA APONEUROSE FONTE: O autor.
FIGURA 5 - INCISÃO COM BISTURI HARMÔNICO ULTRASSÔNICO À APONEUROSE FONTE: O autor.
FIGURA 6 - SÍNTESE DA APONEUROSE FONTE: O autor.
Após a correção da parede abdominal, revisou-se a hemostasia e realizou-se síntese da pele com fio mononylon 5-0, com pontos em sutura contínua (Figura 7).
MATERIAL E MÉTODO 36
3.8 PÓS-OPERATÓRIO
Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, aquecidos com luz artificial até a completa recuperação da anestesia, quando puderam deambular e se alimentar.
Após a recuperação os animais foram transferidos para gaiolas identificadas conforme o grupo e subgrupo, onde estavam anotadas a data do procedimento e o bisturi utilizado na cirurgia (BLF ou BHU), sendo colocados no máximo quatro ratos por gaiola.
Os animais foram identificados, com numeração na cauda, realizada com caneta retroprojetor.
Foram submetidos à analgesia pós-operatória com paracetamol 200mg/ml (Tylenol® Janssen-Cilag) via oral na dose de 40 gotas para cada 50 ml de água ofertada, nos primeiros dois dias.
A avaliação macroscópica de cada animal no pós-operatório foi diária, com observação da ferida operatória, presença ou não de infecção, hematoma, deiscência ou hérnia incisional.
3.9 MORTE DOS ANIMAIS
3.10 OBTENÇÂO DAS AMOSTRAS
Após a morte de cada animal foi analisada a parede abdominal, observando na cicatriz, a presença ou não de hematoma, infecção, deiscência de sutura, hérnia incisional.
Realizou-se a incisão na pele e tecido celular subcutâneo, no sentido craniocaudal, e feita a secção da totalidade da parede ventral (Figura 8).
FIGURA 8 – PEÇA DISSECADA – CORTE DA PAREDE ABDOMINAL
NOTA: Segmento de 8 cm de comprimento com 6 cm de largura englobando toda incisão. FONTE: O autor.
Com a remoção da parede abdominal, a cavidade peritoneal foi analisada quanto à presença ou não de hematoma, abscessos, fístulas, deiscências e aderências.
3.11 AVALIAÇÕES MACROSCÓPICAS DA CICATRIZAÇÃO
Realizou-se avaliação macroscópica das feridas, observando os seguintes critérios (Quadro 1):
MATERIAL E MÉTODO 38 Hematoma Ausente Presente Infecção Ausente Presente Deiscência de sutura Ausente Presente Fístula Ausente Presente Aderências Ausente Presente QUADRO 1 – CRITÉRIOS PARA AVALIAÇÂO MACROSCÓPICA
FONTE: O autor.
Em relação às aderências, utilizou-se os parâmetros de Gonçalves et al., 2000, que classifica estas em relação a sua intensidade, (Quadro 2).
Intensidade Parâmetros 0 Ausência completa de aderências
1 Aderência do omento maior à ferida cirúrgica
2 Aderências do omento maior e do intestino delgado à ferida cirúrgica
3 Aderências múltiplas intracavitárias
3.12 AVALIAÇÂO MICROSCÓPICA
3.12.1 Preparo das amostras teciduais
A técnica de micro arranjo tecidual (tissue microarray-TMA) foi utilizada
,
inicialmente nos blocos de parafina arquivados (bloco doador), selecionou-se a área de interesse,no caso o centro da cicatriz na linha média das aponeuroses do músculo reto abdominal. Com uma pinça para biópsia de pele - Punch ( Figura 9 e 10 ), pressionado sobre a marcação feita, retirada a amostra em toda a sua profundidade (figura 11), um cilindro de tecido de 4 mm de comprimento foi retirado das amostras.
FIGURA 9 – PINÇA DE BIÓPSIA DE PELE. FONTE: o autor
FIGURA 10 – BIÓPSIA COM PUNCH.
NOTA: Retirada de tecido cilíndrico, pós secção com Punch.
MATERIAL E MÉTODO 40
FIGURA 11 - MATERIAL EM BLOCO DE PARAFINA ANTES E APÓS PUNÇÃO FONTE : o autor
Este cilindro foi então introduzido em um novo bloco (bloco receptor) ,previamente preparado com orifícios cilíndricos vazios (Figura 12). Os cilindros dos vários casos são sucessivamente adicionados ao bloco receptor, e a posição de cada amostra foi identificada em uma planilha com referências de coluna e linha (eixos X e Y). Ao fim, um bloco receptor com 10 amostras diferentes foi conseguido. Deste bloco foram obtidos cortes histológicos seqüenciais numerados em lâminas tratadas com adesivo que permitiram a realização de múltiplas reações (TROTER, DEMETRICK & CIEZAR.,2002).
FIGURA 12 – BLOCO RECEPTOR.
Neste trabalho, cada bloco correspondeu a um subgrupo com 10 amostras cada, uma de cada rato, sendo identificados como: BLF 3, BLF 7, BLF 14 e BLF 21, que foram submetidos a incisões aponeuróticas com bisturi de lâmina fria (BLF), e numeradas com 3, 7,14 e 21, que correspondem ao dia da morte dos animais , com a mesma metodologia ,BHU 3 BHU 7, BHU 14 e BHU 21, submetidos à incisão com bisturi harmônico ultrassônico (Figura 13).
FIGURA 13 – BLOCO DO SUBGRUPO BHU 14 FONTE: O autor .
As amostras ficaram dispostas por número do animal do subgrupo, na primeira linha os animais números 1,2,3 e 4 na segunda linha os 5, 6,7 e 8, na terceira os números 9 e 10, e na última linha a amostra sinalizadora. Exemplo: subgrupo BHU 14, primeira linha BHU 14 1, BHU 14 2, BHU 14 3 e BHU 14 4 na segunda linha BHU 14 5, BHU 14 6, BHU 14 7 e BHU 14 8 , na terceira linha as amostras BHU 14 9 e BHU 14 10 (Figura 13).
MATERIAL E MÉTODO 42
3.12.2 Método Imuno-histoquímico
Para realização da técnica de imuno-histoquímica, os blocos de parafina foram cortados em micrótomo com espessura de três micrometros (μm) e distendidos em lâminas histológicas previamente preparadas com Organosilano (Sigma-Aldrich A3648) com o intuito de promover maior aderência dos cortes às lâminas, evitando a perda do material durante o procedimento imuno-histoquímico. As lâminas foram estocadas em estufa com temperatura entre 55 e 58ºC por 24 horas, e transferidas para cubas de vidro vertical para iniciar a técnica de imuno-histoquímica.
A desparafinização foi realizada com dois banhos em xilol de 30 minutos cada em temperatura ambiente. O processo de desidratação foi realizado com passagens em álcool 95º, em álcool absoluto (três vezes de três minutos), álcool 95º e álcool 85º.
O bloqueio da peroxidase endógena (bloqueio dos radicais livres provenientes do fixador) foi realizado com solução de peróxido de hidrogênio e metanol 5% (para diluir o peróxido em metanol) e lavado com água destilada. A recuperação antigênica pelo calor é a etapa que tem como objetivo a liberação dos epítopos antigênicos do tecido. As lâminas foram mergulhadas no recuperador Imuno Retriver (Dako®) à cuba de banho-maria à 99º C por 40 min. , deixado esfriar à temperatura ambiente.
Realizada lavagem em água destilada, marcou-se lâmina por lâmina com caneta hidrofóbica Dako pen (Dako®), delimitando a área do corte ,antes de pingar as alíquotas de anticorpos, foi deixado em tampão TBS tris pH 7.3, evitando que o corte secasse .
Na seqüência, pingou-se as alíquotas de anticorpos primários monoclonais MMP-9, TGF- β e α-AML (Quadro 3) e levou-se para câmara úmida por 18 hs à 4ºC (''overnight'').
QUADRO 3 - ANTICORPOS PRIMÁRIOS UTILIZADOS FONTE: O autor.
Foram lavadas as lâminas em tampão TBS tris pH 7.3 e deixado por 15 min. Novamente lavado em tampão, quando seco e pingou-se Advance link (Dako®) e aguardou-se por 30 min. Nova lavagem em tampão e pingou-se Advance enzyme (Dako®), ligante secundário (marcador) e deixado por 30 minutos.
O Advance link e o Advanced Enzyme fazem parte de uma solução que se chama polímero secundário ou de revelação e eles são responsáveis pela ligação entre o anticorpo primário e o cromógeno. O cromógeno é a solução responsável por dar cor à reação.
Lavado em tampão, após secar foi adicionado o cromógeno DAB (1:1) , marcador, até a visualização da cor castanha e lavou-se rápido em água destilada.
Contracorado com Hematoxilina de Harris por 5 min, para fundo de imagem. Lavou-se em água de torneira e aguardados 5 min. Desidratado com álcool etílico absoluto (3 x 1 min.), diafanizou-se com xilol (3 x 5 min). Realizou-se a montagem. Anticorpo primário Tipo de marcação
Clone Marca Diluição
Padronizada MMP-9 Citoplasma 15W2 Novocastra Laboratories Ltd.™ 1: 50 TGF- β1 Citoplasma 2C5 Santacruz Biotechnology ® 1: 50
α-AML Citoplasma 1A4
Dako ®
MATERIAL E MÉTODO 44
312.3 Leitura das lâminas de Imuno-histoquímica
As lâminas imunomarcadas foram submetidas à leitura, através de microscópio óptico Olympus® BX50 (Tóquio, Japão), acoplado a câmera de vídeo Dinoeye e a computador com software de análise de imagem Image Pro Plus™ (Maryland, USA). Foram capturadas quatro imagens em campo de grande aumento (CGA = 400 vezes), cuja área total de 115226,1µm2 com resolução de 1024x 768 pixels para cada caso do estudo.
O controle positivo da reação foi digitalizado e uma imagem em CGA foi escolhida como máscara, contendo a positividade adequada para o biomarcador escolhido (Figura 14 A).
A máscara foi então sobreposta às imagens digitais dos casos. Baseado na imunopositividade ideal da máscara, o software de análise Image Pro Plus (TM) encontra as áreas imunopositivas nas amostras do estudo e
transforma este dado em área imunopositiva por micrômetro quadrado (µm2) (Figura 14 B).
FIGURA 14 - LEITURA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA
LEGENDA: imuno-histoquímica pelo tgf- β subgrupo BLF 3 .
NOTA: A- lâmina submetida a método imuno-histoquímico B - área imunopositiva marcada em vermelho pós análise pelo software.
FONTE: O autor.
A área em µm2 gerada por este método foi então dividida pela constante 115.226,1 µm2 que é a área total do campo avaliado, gerando uma porcentagem de área imunopositiva por CGA. Uma porcentagem média de área em 4 CGA foi calculada para cada caso , como no exemplo abaixo (Tabela 1).
TABELA 1 - RESULTADO DE ÁREA IMUNOPOSITIVA PELAS 4 IMAGENS DE CADA AMOSTA
LEGENDA : animal do subgrupo BLF 3
NOTA: média de área de cada animal e média de área total . FONTE: O autor.
MMP 9
TMA FOTO1 FOTO2 FOTO3 FOTO4
media do animal % área positiva BLF 3 1A 2398,8635 1634,8127 5156,5708 3829,6743 3254,980325 3,32% 1B 7868,6494 6753,7031 4863,9614 4415,334 5975,411975 5,18% 1C 8057,3438 7038,5112 2989,8218 5314,2085 5849,971325 5,07% 1D 4967,1401 1939,3439 1648,2068 897,99158 2363,170595 2,05% 2A 2074,0205 1570,3446 4280,2153 1444,4991 2342,269875 2,01% 2B 6438,1328 8201,7354 4433,7324 7151,4043 6556,251225 5,68% 2C 5418,123 6656,7065 5387,8022 6749,729 6053,090175 5,25% 2D 9160,8096 3207,6594 7015,8442 6408,4014 6448,17865 5,59% 3A 3446,9866 4144,0669 4818,0391 2552,969 3740,51540 3,24% 3B 4081,9539 2637,6018 6509,9604 6032,9258 4815,610475 4,17% media geral 4739,945002 4,11% 3.12.4 Método picrosirius
Fez-se a análise do colágeno corando-se os cortes histológicos pela técnica do Sirius Red e examinando-os sob luz polarizada. As fibras colágenas tipo III, mais finas e dispersas, sob luz polarizada são fracamente birrefringentes e adquirem tonalidades que variam do amarelo ao verde, enquanto as do tipo I, mais espessas e fortemente birrefringentes, tonalidades que variam do laranja ao vermelho.
MATERIAL E MÉTODO 46
objetiva de 20x, acoplado a uma câmera DinoEye ® e a um computador. Utilizou- se o software Image Pró-Plus ® for Windows.
Inicialmente capturava-se a imagem da lâmina para o computador e, com o auxílio do programa Image Pro-Plus foi selecionada uma fotomicrografia que seriou como máscara para as medidas das áreas de interesse.
Com a ferramenta conta-gotas, na fotomicrografia identificada como máscara, selecionavam-se as cores de interesse (tonalidades que variam do amarelo ao verde para colágeno tipo III e tonalidades que variam do laranja ao vermelho para colágeno tipo I) e o programa automaticamente identificava os colágenos I e III pela sua coloração á luz polarizada, destacando-os da fotomicrografia. Esta máscara contendo a seleção de cores era sobreposta em todas as outras fotomicrografias do estudo, identificando automaticamente as áreas de colágeno I e III. Uma vez que a área total de exame era constante, o programa fornecia a área e o percentual da área ocupada pelo objeto de estudo, ou seja, o colágeno tipo I e o tipo III. Mediram-se três fotomicrografias (objetiva de 20x) por corte histológico em cada lâmina, obtendo-se, então, uma média da leitura daquele corte (JUNQUEIRA, CORSSEMELLI & BRENTANI, 1979).
3.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA
4 RESULTADOS
4.1 AVALIAÇÂO MACROSCÓPICA
Não foram registrados óbitos; um animal do subgrupo BLF 3, número 5: apresentou hematoma (Figura 15), sem significância estatística , p = 1 .
FIGURA 15 - HEMATOMA DE PAREDE FONTE: O autor.
LEGENDA: animal do subgrupo BLF 3, nº 5.
Dois animais do subgrupo BHU 3 números 1 e 7: apresentaram infecção e deiscência parcial de sutura da parede, observadas após a morte dos dois animais (Figura 16), sem significância estatística, p = 1 .
FIGURA 16 - DEISCÊNCIA DE SUTURA DE PAREDE
RESULTADOS 50
Em relação às aderências foram observadas, somente as de intensidade 1 (Figura 17): em um animal dos subgrupos BLF 3 (nº2), BHU 3 (nº 5), BLF 7 (nº4), BLF14 (nº2) e BHU 21 (nº9), em dois animais do subgrupo BHU14 (nº 3 e 6) e em três animais do subgrupo BHU 7 (nº 2, 7,10). (Quadro 4).
FIGURA 17 – ADERÊNCIA GRAU 1
LEGENDA: animal do subgrupo BLF 14 n°2. NOTA: Seta indica aderência.
FONTE: O autor .
Aderência BLF3 BHU3 BLF7 BHU7 BLF14 BHU14 BLF21 BHU21
Grau 0 9 9 9 7 9 8 10 9
Grau 1 1 1 1 3 1 2 0 1
Grau 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Grau 3 0 0 0 0 0 0 0 0
Total 10 10 10 10 10 10 10 10
QUADRO 4 - RESULTADOS DA CLASSIFICAÇÃO DE ADERÊNCIAS. NOTA: classificação em tipo e momento.
FONTE: O autor.
TABELA 2- ADERÊNCIAS E ANÁLISE ESTATÍSTICA DO GRUPO BLF Grupo: BLF Aderência BLF3 BLF7 BLF14 BLF21 Grau 0 9 (90%) 9 (90%) 9 (90%) 10(100%) Grau 1 1 (10%) 1 (10%) 1 (10%) 0 (0%) Total 10 10 10 10 Valor de p = 1 FONTE: O autor.
TABELA 3 - ADERÊNCIAS E ANÁLISE ESTATÍSTICA DO GRUPO BHU
Grupo: BHU
Aderência BHU3 BHU7 BHU14 BHU21 Grau 0 9 (90%) 7 (70%) 8 (80%) 9(90%) Grau 1 1 (10%) 3 (30%) 2 (20%) 1(10%)
Total 10 10 10 10
Valor de p = 0,592 FONTE: O autor.
Não foram observadas fístulas no presente trabalho.
4.2 ANÁLISES MICROSCÓPICAS
4.2.1 metaloproteinase da matriz 9 (MMP-9)
RESULTADOS 52
TABELA 4 : MÉDIA , DESVIO PADRÃO, EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR CGA, E ANÁLISE ESTATÍSTICA NOS BISTURIS LÂMINA FRIA E HARMÔNICO ULTRASSÔNICO MMP-9.
Bisturi Subgrupos
3 dias 7 dias 14 dias 21 dias
Lâmina Fria
4.739,95+1.676,9 6.633,82+1.867,31 10.560,1+1.653,4 11.533,89+1.161,7
Harmônico
Ultrassônico 9.185,9+1.502,61 12.036,44+1.216,7 9.104,05+2.201,6 9.171,86+1.785,63
Valor de p* < 0,001 < 0,001 0,099 0,001
(*) Teste t de Student para amostras independentes; p<0,05
FONTE: O autor.
No gráfico abaixo podem ser visualizados os resultados obtidos no estudo:
GRÁFICO 1 :Média de imunoexpressão tecidual (em micrômetros quadrados por CGA) do MMP-9 ,em relação aos grupos de BLF e BHU, no 3º,7º.14º e 21º dias.
FONTE : O autor .
A expressão de MMP-9 foi observada em todos os casos das amostras (Figura 18) variando a sua imunoexpressão tecidual entre 2,65% e 11,50% .
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
3 dias 7 dias 14 dias 21 dias
FIGURA 18- FOTOMICROGRAFIAS DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS IMUNOCORADAS COM MMP-9 .
LEGENDA : Imuno-histoquímica MMP-9 200x.
NOTA : A - Demonstra caso com 2,65 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF3 .B - Demonstra caso com 4,20 % de área de imunoexpressão tecidual média BHU14. C - Demonstra caso com 8,84 % de área de imunoexpressão tecidual média BHU21. D - Demonstra um caso com 11,50 % de área de imunoexpressão tecidual média BHU7.
FONTE : O autor
4.2.2 - fator de transformação crescimento beta (TGF- β).
Em relação ao TGF- β, sua expressão nos casos onde se realizou incisão com lâmina fria, encontrou-se um nível alto ao 3º dia , que cai ao 7º dia , voltando a subir ao 14º, com pequena queda ao 21º dia. Já na série onde foi realizada a incisão com BHU, o nível encontrado foi maior ao 3º dia, com queda progressiva, nos 7º,14º e 21º dias. A concentração ao 3º dia foi mais elevada nos casos onde se usou a lâmina fria, que na série comparada, sendo a maior concentração encontrada no presente estudo.
RESULTADOS 54
TABELA 5: MÉDIA E DESVIO PADRÃO, EM EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR CGA NOS BISTURIS LÂMINA FRIA E HARMÔNICO ULTRASSÔNICO TGF- β.
(*) Teste t de Student para amostras independentes; p<0,05.
FONTE: O autor.
No gráfico abaixo podem ser visualizados os resultados obtidos no estudo.
GRÁFICO 2 :Média de imunoexpressão tecidual (em micrômetros quadrados por CGA) do TGF- β em relação aos grupos de BLF e BHU, no 3º,7º.14º e 21º dias.
FONTE : O autor .
A expressão de TGF- β foi observada em todos os casos das amostras variando a sua imunoexpressão tecidual entre 0,03% e 2,92% (Figura 19) .
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
3 dias 7 dias 14 dias 21 dias
BLF BHU TGF-β p =0,081 p = 0,826 p = 0,010 p < 0,001 Bisturi Subgrupos
3 dias 7 dias 14 dias 21 dias
Lâmina Fria 1.878,74+1.496,4 636,02 + 879,69 1.172,74 +633,35 1.078,6 + 556,78
FIGURA 19 - FOTOMICROGRAFIAS DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS IMUNOCORADAS COM . TGF β.
LEGENDA: Imunohistoquímica TGF- β 200x.
NOTA - Demonstra caso com 0,08 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF14 B - Demonstra caso com 0,64 % de área de imunoexpressão tecidual média BHU7. C - Demonstra caso com 1,85 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF3 D - Demonstra um caso com 2,92 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF3.
FONTE: O autor.
4.2.3 - Alfa Actina do músculo liso (α-AML) .
Como resultado a expressão de α-AML apresentou níveis pouco variáveis na série onde foi realizada incisão com lâmina fria, com discreto aumento do 3º para o 7º dia, discreto decréscimo do 7º ao 14º dia e ligeiro aumento até o 21º dia, porém se mantendo constante. A séria onde utilizamos o bisturi harmônico ultrassônico, ocorreu elevação dos níveis do 3º ao 7º dias, padrão que se repetiu do 7º ao 14º dia, ocorrendo ligeiro decréscimo ao 21º dia.
A análise estatística da expressão da α-AML encontrada na comparação dos dois tipos de bisturi, considerando p < 0,05, apresentou significância estatística ao 14º dia. (Tabela 6 e Gráfico 3).
RESULTADOS 56
TABELA 6 : MÉDIA , DESVIO PADRÃO, EM EM MICRÔMETROS QUADRADOS POR CGA E ANÁLISE ESTATÍSTICA NOS BISTURIS LÂMINA FRIA E HARMÔNICO ULTRASSÔNICO α-AML
Bisturi Subgrupo
3 dias 7 dias 14 dias 21 dias
Lâmina Fria
1.836,81 +724,47 2.011,21 + 516,91 1.879,22 +721,32 2.022,17+1.007,34
Harmônico
Ultrassônico 1.975,41 +653,38 2.450,35 + 773,47 2.832,99 +893,45 2.741,54 + 699,27
Valor de p* 0,665 0,140 0,011 0,091
(*) Teste t de Student para amostras independentes; p<0,05
FONTE : O autor
No gráfico abaixo podem ser visualizados os resultados obtidos no estudo.
GRÁFICO 3 :Média de imunoexpressão tecidual (em micrômetros quadrados por CGA) do α-AML em relação aos grupos de BLF e BHU, no 3º,7º.14º e 21º dias.
FONTE: O autor . 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
3 dias 7 dias 14 dias 21 dias
A expressão de α-AML foi observada em todos os casos das amostras (Figura 20) variando a sua imunoexpressão tecidual entre 0,88 % e 3,23 % .
FIGURA 20 - FOTOMICROGRAFIAS DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS IMUNOCORADAS COM α -AML.
LEGENDA : Imunohistoquímica α -AML 200x.
NOTA - Demonstra caso com 1,39% % de área de imunoexpressão tecidual média BLF21 B - caso com 1,45 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF7. C - Demonstra caso com 2,04 % de área de imunoexpressão tecidual média BLF14. D- Demonstra um caso com 3,23 % de área de imunoexpressão tecidual média BHU3.
FONTE : O autor .
4.2.4 Coloração picrosirius
RESULTADOS 58
FIGURA 21 – FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO FIBRAS COLÁGENAS. LEGENDA: Coloração Picrosirius, aumento 20x, rato nº 1 subgrupo BLF 7.
NOTA: Predomínio misto de Fibras Tipo I (VERMELHO) e III (VERDE), setas indicando fibras. FONTE: O autor .
FIGURA 22 – FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO FIBRAS COLÁGENAS LEGENDA: Coloração Picrosirius, aumento 20x, rato nº 8 subgrupo BLF 21.
TABELA 7 : QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO MADURO (TIPO I) NOS DOIS GRUPOS.
Bisturi Subgrupo
3 dias 7 dias 14 dias 21 dias Geral
Lâmina Fria 0,38 0,38 0,43 0,39 0,40 Harmônico Ultrassônico 0,43 0,38 0,41 0,38 0,40 Valor de p* 0,153 0,622 0,761 0,603 0,906
(*) Teste Mann-Whitney para amostras independentes; p<0,001
FONTE : O autor
Quanto ao colágeno imaturo Tipo III ( Figura 23 ), no 3º dia ocorreu uma deposição maior no grupo BHU; ao 7º dia a formação foi maior no grupo BLF, ao 14º foi equivalente nos dois grupos e ao 21º dia o depósito foi maior no grupo BHU. Como escore geral, ocorreu deposição maior de colágeno Tipo III no grupo submetido à cirurgia com BHU, do que no grupo operado com BLF apresentando resultados de p < 0,001 ou 0,01 %, com significância estatística (Tabela 8).
FIGURA 23 – FOTOMICROGRAFIA DE FIBRAS COLÁGENAS.
LEGENDA: Coloração Picrosirius, aumento 20 x, rato nº 2 subgrupo BHU 21. NOTA: Predomínio de fibras tipo III (VERDE) no pós-operatório tardio, setas indicando fibras.
RESULTADOS 60
TABELA 8 : QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO MADURO (TIPO III) NOS DOIS GRUPOS.
Bisturi Subgrupo
3 dias 7 dias 14 dias 21 dias Geral
Lâmina Fria 0,88 0,93 0,94 0,93 0,92 Harmônico Ultrassônico 0,90 0,91 0,94 0,94 0,93 Valor de p* < 0,001 < 0,001 0,832 < 0,001 < 0,001
(*) Teste Mann-Whitney para amostras independentes; p<0,001
FONTE: O autor
No gráfico e tabela abaixo podem ser visualizados os resultados obtidos no estudo (Grafico 4 e Tabela 9).
GRÁFICO 4 – Representação gráfica da quantificação de colágeno maduro (tipo I) e imaturo (tipo III) e análise estatística nos dois grupos.
FONTE: O autor. 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 3 7 14 21
Observação (em dias)
Colágeno Maduro - BLF Colágeno Maduro - BHU Colágeno Imaturo - BLF Colágeno Imaturo - BHU
p < 0,001
p < 0,001 p =0,832 p < 0,001
p=0,622 p=0,603
p=0,153
TABELA 9 – ANÁLISE ESTATÍSTICA DA DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO TIPO I (MADURO) E III (IMATURO)
FONTE: O autor.
Observação (em dias) Colágeno Maduro Colágeno Imaturo
5.1 MODELO EXPERIMENTAL
O Rato Wistar foi o animal escolhido para a pesquisa por ser um animal resistente e amplamente utilizado nas pesquisas da parede abdominal, de fácil manuseio e fácil aquisição conforme referido por Souza e Merrusse,(1996).
Além disso, resistem bem às infecções, têm anatomia conhecida e podem ficar albergados em biotério. Por ser a espécie convencional de laboratório, têm técnica anestésica específica e segura. A obtenção fácil destes animais permite a formação de grupos padronizados e com número adequado para o estudo. Suas dimensões não interferem nas análises das características macroscópicas e microscópicas. De acordo com Rocha (1986), a utilização de pequenos roedores permite a avaliação comparativa de grupos com grande número de animais, padronizados e da mesma espécie, o que facilita a análise estatística.
Além de ratos, outros animais podem ser utilizados, como no estudo comparativo da cicatrização de tecidos com BLF e BHU realizado por, Hambley et al. (1988); o qual utilizou porcos, na análise de cicatrização de pele com BLF, BHU, CO2 Laser e eletrocautério. Emann e Cushieri, (2003), também utilizaram porcos em trabalho onde foi avaliado o poder de dissecção do BHU em cirurgias laparoscópicas.
5.2 TÉCNICA ANESTÉSICA
