ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS
METALOPROTEINASES DA MATRIZ (MMP-1, MMP-2 E
MMP-9) NA DOENÇA PERIODONTAL
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL CURSO DE DOUTORADO EM PATOLOGIA ORAL
ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS
METALOPROTEINASES DA MATRIZ (MMP-1, MMP-2 E
MMP-9) NA DOENÇA PERIODONTAL
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do Grau de Doutor em Patologia Oral.
Doutorando: Flávio Roberto Guerra Seabra
Orientadora: Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Setorial de Odontologia
Seabra, Flávio Roberto Guerra .
Análise imuno-histoquímica das metaloproteinases da matriz ( MMP-1,MMP-2 e MMP-9) na doença periodontal / Flávio Roberto Guerra Seabra. –Natal,RN,2006.
100f.
Orientador: Lélia Maria Guedes Queiroz.
Tese (Doutorado em Patologia Oral) –. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia.
1. Doença periodontal - Tese. 2.Periodontite- Tese. 3. Metaloproteinases da matriz imuno-histoquímica -Tese. I. Queiroz,Lélia Maria Guedes. II. Título.
DEDICATÓRIAS
A DEUS,
Por demonstrar tão claramente sempre estar presente nos momentos mais importantes da minha vida, não permitindo que eu Te esqueça,
A meus pais, Eduardo e Zélia,
Pelos seus exemplos de conduta que me fizeram quem eu sou
A Bárbara,
Pelo constante apoio em todos os momentos da minha vida e decisões
importantes que tomamos juntos, pela ajuda direta em vários momentos deste trabalho e pelo amor que temos um pelo outro que me faz dizer que por você...
A João Victor,
AGRADECIMENTOS
A meus sogros Nogueira e Marialba e meus cunhados Diego e Lucas pela convivência de constante amizade e respeito.
À minha orientadora Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, pela constante disposição em ajudar e orientar.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Dra. Lélia Batista de Souza, Dra. Roseana de Almeida Freitas, Dr. Leão Pereira Pinto, Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão,
À Profa. Dra. Rejane Andrade de Carvalho pelo incentivo.
Aos professores Tasso Gadelha, Lecy Fernandes e Maria Alice Fuscella, diretores do Curso de Odontologia da Universidade Potiguar durante o período deste Doutorado, por terem dado condições para que eu pudesse cursá-lo.
Aos Professores da disciplina de Periodontia da UnP, Odilon de Amorim Garcia Filho, Carlos Sarmento, Euler Dantas, José Nazareno Júnior e Janaína Lemos e da Disciplina de Cirurgia, Fernando Maia, Fernando Pinto, Maria Auxiliadora, Lourdes Arruda e José Sandro por entenderem as minhas ausências quando necessário.
Às colegas Éricka, pela ajuda de sempre não só nesse trabalho mas em vários momentos em que precisei e Ruthinéia, que cedeu material para parte da amostra utilizada neste trabalho
Aos meus colegas de turma, Simone, Manuel e Sormani.
Aos colegas de disciplinas durante o curso, Gustavo, Márcia, Márcio, Rivadávio, Rosilene, Andréa, João, Karuza, Cassiano, Danielle, George, Igor, Fernanda, Carmem, Antônio Luiz, Roberta, Marta e Claudine.
Aos funcionários da Disciplina de Patologia Oral, Gracinha, Sandra, Canindé, Hévio e Idelzuíte.
Aos colegas do CAMS-TRE-RN, Dra. Salete, Dr. Tércio, Dr. Carlos Augusto e Dr. Francisco Morais
Aos colegas da Clínica Carlos Alexandre Câmara, Dr. Carlos Alexandre, Dr. Jolber, Dra. Juliana, Dra. Tamara, Edna, Kelly, Márcia e Mônica.
RESUMO
A destruição tecidual observada na doença periodontal é causada, principalmente, por componentes do hospedeiro que têm sua produção estimulada pelos produtos liberados pelas bactérias. As Metaloproteinases da Matriz ou MMPs, enzimas relacionadas à degradação de matriz extracelular em processos tanto fisiológicos quanto patológicos são consideradas as principais responsáveis pela perda tecidual característica da doença periodontal, e o entendimento de como isso ocorre pode ter uma série de implicações benéficas em relação à prevenção, ao diagnóstico e ao tratamento desta doença. Neste trabalho foi estudada a expressão imuno-histoquímica da MMP-1, da MMP-2 e da MMP-9 em gengivas clinicamente diagnosticadas com doença periodontal. A MMP-1 teve expressão significativamente maior que as outras duas nos casos de gengivite tanto no epitélio (p=0,0008) quanto no tecido conjuntivo (p=0,0049). Na periodontite, a MMP-1 e MMP-9 tiveram expressões significativamente maiores que a MMP-2 tanto no epitélio (p<0,0001) quanto no conjuntivo (p=0,0002). A MMP-1 e MMP-9 mostraram maior expressão na periodontite que na gengivite sendo a MMP-1 apenas no tecido conjuntivo (p=0,03) e a MMP-9 no epitélio (p=0,003) e no conjuntivo (p=0,04). Concluiu-se portanto que a MMP-1 apresenta forte expressão em todos os estágios da doença peridontal, aumentando no tecido conjuntivo no caso de progressão para periodontite, podendo portanto ter um papel crucial na degradação de tecido conjuntivo e perda óssea observada na doença desde os estágios iniciais de gengivite até a progressão para periodontite. A MMP-9, é expressa mais na periodontite que na gengivite, tanto no epitélio quanto no conjuntivo significando que esta enzima pode ter importância na progressão da gengivite para a periodontite atuando na reabsorção óssea observada na doença periodontal.
ABSTRACT
The tissular destruction found in periodontal diseases is caused mainly by components of the host that have its production stimulated by the products of the microorganisms present on the plaque. Matrix Metalloproteinases (MMPs), a class of enzymes involved both in physiologic and pathologic extracellular matrix degradation are considered the main responsible for the characteristic tissular loss in periodontal disease, and the understanding of how this happens can have a series of beneficial implications for prevention, diagnosis and treatment of this illness. The aim of this work was to study the immunohistochemical expression of MMP-1, MMP-2, and MMP-9 in fragments of gingival biopsies with clinical diagnose of periodontal disease. MMP-1 has expressed significantly more than the others MMPs in gingivitis both in the epithelium (p=0,0008) and connective tissue (p=0,0049). In periodontitis, both MMP-1 and MMP-9 has expressed significantly more than MMP-2 in the epithelium (p<0,0001) and in the connective tissue (p=0,0002). MMP-1 and MMP-9 presented more expression in periodontitis than in gingivitis but MMP-1 only in the connective tissue (p=0,03) and MMP-9 in the epithelium (p=0,003) and in the connective tissue (p=0,04). In conclusion, these results indicate that the MMP-1 presents high expression in every stages of the periodontal diseases, and increases its expression in the connective tissue when the gingivitis evolves to periodontitis. Therefore, it may have an important role in connective tissue degradation and bone loss observed in disease, since early, in gingivitis, until late stages, in periodontitis, of the periodontal disease. MMP-9 has expressed more in periodontitis than in gingivitis, both in epithelium and in connective tissue. It means that this enzyme may have some importance in the progression of gingivitis to periodontitis by acting in bone resorption observed in this desease.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Quadro 1 Especificidade, recuperação antigênica, diluição e
tempo de incubação dos anticorpos utilizados 54 Figura 1 Figura 1. Localização do processo inflamatório em
espécimes com diagnóstico clínico de periodontite. Inflamação considerada perivascular e justa-epitelial (A e B) correspondendo a um quadro histológico de menor gravidade que a inflamação difusa (C e D). (H/E, 40x em A e C e H/E, 200x em B e D)
61
Figura 2 Figura 2. Caracterização do tipo celular predominante no infiltrado inflamatório em lâminas com diagnóstico clínico de periodontite, evidenciando em A um
infiltrado predominantemente Linfocitário e em B um considerado Linfo-plasmocitário. (H/E, 200x)
63
Figura 3 Figura 3. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 no tecido epitelial de revestimento, onde em A é demonstrada uma marcação
considerada forte (++) em B uma marcação
considerada fraca (+) e em C ausência de marcação (-). (SABC, 200x)
65
Figura 4 Figura 4. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 no tecido conjuntivo, onde em A é demonstrada uma marcação considerada forte (++) em B uma marcação considerada fraca (+) e em C ausência de marcação (-). (SABC, 200x)
66
Figura 5 Figura 5. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 evidenciando um neutrófilo marcado (Setas). (SABC, 200x)
68
Figura 6 Figura 6. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 evidenciando células endoteliais marcadas (Setas). (SABC, 400x)
68
Figura 7 Figura 7. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 evidenciando plasmócitos (seta verde), linfócitos (seta vermelha), fibroblastos (seta preta) e macrófagos (seta azul) marcados. (SABC, 400x)
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Total de casos analisados. Natal/ RN, 2006 60 Tabela 2. Associação entre o tipo de doença periodontal
diagnosticada e a localização da inflamação. Natal/ RN, 2006.
60
Tabela 3. Associação entre o tipo de doença periodontal diagnosticada e o tipo de infiltrado inflamatório predominante. Natal/ RN, 2006
62
Tabela 4. Gradação da marcação imuno-histoquímica para
MMP-1 no epitélio. Natal/ RN, 2006 64
Tabela 5. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-1 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006 67 Tabela 6. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celular
encontrado no tecido conjuntivo gengival para a MMP-1. Natal/ RN, 2006
67
Tabela 7. Gradação da marcação imuno-histoquímica para
MMP-2 no epitélio. Natal/ RN, MMP-2006 69
Tabela 8. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-2 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, MMP-2006 70 Tabela 9. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celular
encontrado no tecido conjuntivo gengival para a MMP-2. Natal/ RN, 2006
70
Tabela 10. Gradação da marcação imuno-histoquímica para
MMP-9 no epitélio. Natal/ RN, 2006 71
Tabela 11. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-9 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006 71 Tabela 12. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celular
encontrado no tecido conjuntivo gengival para a MMP-9. Natal/ RN, 2006
72
Tabela 13. Média dos postos e significância estatística da
marcação imuno-histoquímica para a MMP-1, MMP-2 e MMP-9 em gengivite. Natal/ RN, 2006
72
Tabela 14. Média dos postos e significância estatística da
marcação imuno-histoquímica para a MMP-1, MMP-2 e MMP-9 em periodontite. Natal/ RN, 2006
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
oC Graus Célcius
µm Micrometro
AAP American Academy of Periodontology ADAMs Adamalisinas
AE Elastase ativa
AMP Adenosina monofosfato BB-94 Batimastat
bFGF FGF básico
Ca Cálcio
cAMP AMP cíclico
CCN Fator de crescimento de tecido conjuntivo
ConA Concavalina A
Cys Cisteína
E-α-1 PI Complexo Elastase-inibidor de proteinase α-1 EGF Fator de crescimento epitelial
ELISA Enzyme-linked immunossorbent assay FGF Fator de crescimento para fibroblastos H2O2 Peróxido de hidrogênio
IFNγ Interferon-γ
IL Interleucina
kDa KiloDálton
LPS Lipopolissacarídeo MEC Matriz extracelular
ml mililitro
mm milímetro
mM milimolar
MT-MMP Metaloproteinase da matriz ligadas à membrana MT-MMPs Metaloproteinases da matriz ligadas à membrana
nm Nanômetro
OPG Osteoprotegerina
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas PGE2 Prostaglandina E2
pH Potencial hidrogeniônico PMN Polimorfonucleares
RANKL Ligante do receptor ativador do fator nuclear κB RNA Ácido ribonucléico
RNAm RNA mensageiro
RT-PCR Real-time polymerase chain reaction SABC Estreptavidina-biotina
SPARC Proteína secretada ácida rica em cisteína
TA Temperatura ambiente
TGF Fator de crescimento transformador TIMP Inibidor tecidual de metaloproteinases TIMPs Inibidores teciduais de metaloproteinases TNF Fator de Necrose Tumoral
TSP Trombospondina
VEGF Fator de crescimento vascular endotelial
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
A periodontite não é uma doença exclusiva do nosso tempo. Já foram detectadas reabsorções ósseas em fósseis de humanos que viveram na era paleolítica e em múmias da civilização egípcia que viveram há 4.000 anos. (GOLD, 1985)
Considera-se que os microorganismos presentes no biofilme dentário, principalmente os localizados no ambiente sub-gengival, constituem o principal agente etiológico extrínseco das doenças periodontais inflamatórias, pois substâncias produzidas no biofilme dentário têm a capacidade de penetrar na gengiva saudável através dos epitélios juncional e sulcular devido à relativa permeabilidade destes.
Na década de 80 os estudos sobre história natural da doença periodontal nos mostraram que apesar da periodontite sempre ter início com uma gengivite, em alguns casos a gengivite pode permanecer indefinidamente sem evoluir para a periodontite. No entanto, a periodontite, quando ocorre, não ocorre de maneira semelhante em todos os indivíduos e nem mesmo nos dentes de um mesmo indivíduo. No estabelecimento da periodontite, parecem ter importância outros fatores que, somados à ação dos microorganismos, determinam a evolução da condição de gengivite para uma doença periodontal inflamatória que atinge tecidos de suporte. Esses fatores estão relacionados aos chamados fatores etiológicos secundários da doença periodontal, assim como à resposta de defesa do hospedeiro aos agentes agressores provenientes do biofilme dentário.
distanciar-se do agente agressor, com isso tem lugar todo o processo biológico que culmina com a reabsorção do osso alveolar e perda do dente.
Isso se dá inicialmente pela destruição do tecido conjuntivo gengival, onde participam principalmente colagenases como a MMP-1, e pela migração apical do epitélio juncional, onde se acredita ser necessária a degradação da membrana basal deste epitélio, papel muito bem desempenhado pelas MMP-2 e MMP-9 semelhantemente ao que foi demonstrado em neoplasias (NABESHIMA et al.
2002).
Assim, considera-se que a destruição que tem lugar no tecido conjuntivo gengival e no osso alveolar é muito mais causada por componentes teciduais produzidos pelo próprio hospedeiro que por componentes produzidos e liberados pelas bactérias do biofilme, sendo esta uma das explicações para o fato da periodontite ocorrer de forma tão diferente entre os indivíduos.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Doença Periodontal
A doença periodontal tem uma alta prevalência na população mundial, com quase 20% das pessoas de 30 a 39 anos acometidas por periodontite nos Estados Unidos, chegando a valores próximos a 50% das pessoas na faixa etária de 50 a 59 anos. Na Europa e América do Sul, tem-se valores semelhantes e no Brasil, 1,19% dos indivíduos apresenta bolsas de 4 a 5 mm já na idade de 15 a 19 anos. (ALBANDAR, 2002; GJERMO et al. 2002; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004;
SHEIHAM; NETUVELI, 2002).
Socransky e Haffajee (2002), descrevem as infecções bacterianas em várias classes que são as infecções agudas, como os abscessos, as crônicas, como a tuberculose, as tardias, como a febre reumática e as causadas por biofilmes bacterianos como a doença periodontal.
Armitage, (1999) e Tunes et al., (2005), descreveram a atual classificação
das doenças periodontais preconizada pela Academia Americana de Periodontologia (AAP) substituindo a classificação de 1989. As doenças gengivais são consideradas em duas categorias onde a primeira abrange as doenças induzidas por biofilme dentário (ou placa bacteriana), ou seja, as gengivites, que engloba a chamada gengivite induzida exclusivamente por placa, as gengivites modificadas por fatores sistêmicos, as gengivites modificadas por medicamentos e
as gengivites modificadas por deficiências nutricionais. A segunda categoria das
doenças gengivais inclui as lesões gengivais não induzidas por placa como as de
origem viral, fúngica, genética, relacionadas a desordens sistêmicas como o líquen-plano (classificada anteriormente como gengivite descamativa) as traumáticas e outras. As periodontites são classificadas em Periodontite Crônica,
conhecida anteriormente como Periodontite do Adulto, a Periodontite Agressiva,
Manifestação de Doenças Sistêmicas, que abrange as condições que no passado
eram relacionadas no item Periodontites Pré-puberais.
Sabe-se hoje que a doença periodontal é causada principalmente por bactérias localizadas no biofilme dentário (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2002; TODESCAN, 2001; WILLIAMS et al.,1992), e que possui ainda como fatores
etiológicos secundários, várias condições locais como fatores de retenção de placa, ou sistêmicas, como hábito de fumar e presença de diabetes, que modificam o curso da doença facilitando a sua instalação e/ou acelerando a sua progressão (BEZERRA et al., 2003; MALDONADO et al., 2004; PASSANEZI et al.
2005; TODESCAN, 2001; WILLIAMS et al., 1992).
HAAKE et al. (2004), chama a atenção para o fato de que se sabe desde a
década de 70 que, segundo a hipótese da placa específica, a petogenicidade do biofilme dentário depende da presença e aumento de microorganismos específicos.
Enquanto na saúde periodontal observa-se maior proporção de bactérias Gram-positivas, na gengivite, a proporção entre Gram-positivas e Gram-negativas, assim como entre aeróbios e anaeróbios encontra-se mais equilibrada e na periodontite já se observa uma alta proporção de anaeróbios, chegando a 90%, e de Gram-negativos, chegando a 75%. As bactérias mais cultivadas em sítios com periodontites são: o Porphyromonas gingivalis, a Tannerella forsythia e o
Actinobacillus actinomycetemcomitans (HAAKE et al. 2004b).
Socransky e Haffajee (2002) associam as bactérias encontradas freqüentemente no biofilme dentário em vários grupos distintos diferenciados por cores. Os colonizadores iniciais são agrupados nos complexos azul, amarelo, verde e púrpura e correspondem a bactérias como as Actinomyces, os
componentes do gênero Streptococcus, as espécies de Capnocytophaga, o Actinobacillus actinomycetemcomitans sorotipo A e a Veilonella parvula, todas
Gram-negativas devido ao consumo do oxigênio disponível pelos colonizadores iniciais, correspondem aos chamados complexos laranja e vermelho, considerados mais patogênicas ao periodonto, principalmente as do complexo vermelho que são o
Porphyromonas gingivalis, a Tannerella forsythia, conhecida até recentemente
como Bacteroides forsythus, e a Treponema denticola.
A importância dos fatores secundários foi demonstrada por Albandar (2002) que encontrou riscos aumentados de doença periodontal em pacientes fumantes e portadores de diabetes mellitus. Bezerra et al. (2003) através da avaliação dos
prontuários odontológicos de 46 pacientes fumantes e 49 não-fumantes, observou que as médias dos índices profundidade de sondagem e recessão gengival vestibular de todos os dentes presentes foi estatisticamente maior nos pacientes fumantes. Já Maldonado et al. (2004) relataram que a maior prevalência e
severidade de doença periodontal em pacientes diabéticos dos tipos 1 e 2 é bem documentada por estudos de caráter epidemiológico e atribuída a vários mecanismos distintos.
O papel do hospedeiro em restringir a infecção aos tecidos periodontais é de extrema importância para a saúde geral do indivíduo. Mas nesse processo, a resposta do organismo, que inicialmente tem a intenção de defendê-lo contra o agressor, acaba também resultando na destruição tecidual local que se conhece como doença periodontal (GENCO, 1992; SEABRA; SEABRA; BRITO, 2005).
O papel das bactérias parece ser o de estimular células inflamatórias crônicas presentes na gengiva, assim como fibroblastos a produzirem citocinas como IL-1, TNF e IL-6, que agem estimulando osteoclastos a reabsorverem o osso. A formação e a ativação dos osteoclastos se dá pela ação destas citocinas, que agem na diferenciação dos osteoclastos a partir de seus precursores da linhagem dos monócitos. O papel da IL-1 na doença está relacionado ao aumento dos níveis de produção de prostaglandina E2 pelos fibroblastos gengivais,
Seabra, Seabra e Brito (2005) relatam que uma vez no local da agressão os leucócitos, no processo inflamatório agudo, irão executar a sua função de fagocitose. Além de degradar o conteúdo fagocitado, as enzimas proteolíticas do fagossomo acabam sendo liberadas também na matriz extracelular durante a fagocitose ou a morte do fagócito causando destruição tecidual. Se o agente agressor é suficientemente limitado para ser combatido pela inflamação aguda, ou é removido mecanicamente, os agentes quimiotáticos que atraem os neutrófilos e que também têm a capacidade de inativar os inibidores de metaloproteinases são removidos e o dano tecidual cessa. Quando a inflamação aguda não pode ser resolvida devido à persistência do agente agressor ou distúrbios nos processos normais de cura o processo evolui para uma inflamação crônica, que se caracteriza por uma duração mais longa e pela presença de células como linfócitos, plasmócitos e macrófagos. Ocorre fibrose e destruição tecidual com tentativas de reparação acontecendo simultaneamente à inflamação.
Os polimorfonucleares são as células mais freqüentemente coletadas no sulco gengival tanto em situação de saúde gengival quanto na doença periodontal. Apesar de clara função protetora contra a doença periodontal destrutiva, evidenciada pelo aparecimento de formas altamente agressivas de periodontite em pacientes com distúrbios de função e número de neutrófilos, estas células estão envolvidas no dano tecidual encontrado na periodontite, especificamente devido às proteinases neutras existentes nos chamados grânulos azurófilos que são encontrados no fluido gengival de indivíduos com doença periodontal ativa (KINANE; LINDHE, 1999; MEYER et al. 1997).
PASSANEZI et al. (2005) relatam que a reabsorção óssea resultante da
inicia após a propagação apical do “front” do biofilme, aproximando-se novamente
do epitélio junicional dando origem a nova inflamação gengival agudizada iniciando novo episódio de atividade de reabsorção.
Além de destruição tecidual demonstrada extensivamente na literatura, KARIMBUX et al. (1998), estudando a expressão de colágenos I e XII em
gengivas com periodontite observou redução da produção da cadeia α2 do colágeno tipo I e da cadeia α1 do colágeno tipo XII. O que resulta na baixa produção de colágenos dos tipos I e XII em pacientes com periodontite.
Williams (1992) e Gonçalves et al. (2005) descrevem os estágios da
patogênese da doença periodontal como descritos por Page e Schroeder, em 1976 da forma como se segue. A doença periodontal divide-se em quatro estágios, denominados de lesão inicial, lesão precoce, lesão estabelecida e lesão avançada, que são estágios que descrevem desde o início da inflamação gengival até a reabsorção óssea.
A doença periodontal se inicia realmente no estágio de lesão inicial, onde a gengiva ainda é considerada “clinicamente sadia”. Este estágio aparece após 4 dias de acúmulo de biofilme dentário e constitui basicamente uma reação inflamatória aguda. Os tecidos afetados incluem parte do epitélio juncional e a porção mais coronal do tecido conjuntivo adjacente. São observados dilatação e aumento da permeabilidade dos vasos, infiltrado inflamatório que ocupa de 5 a 10% do tecido conjuntivo, com perda de colágeno nesta área e a principal característica histológica é o aumento na migração de neutrófilos do plexo vascular gengival para o sulco gengival através do epitélio juncional (GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS, 1992).
clinicamente como uma gengivite leve (GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS,
1992).
Quando o biofilme dentário se acumula por 2 a 3 semanas, tem início o terceiro estágio, caracterizado clinicamente por uma gengivite de moderada a severa e denominado de lesão estabelecida. Ocorre aumento na extensão da área afetada e começa um aumento na proporção de plasmócitos que passam a ocupar até 30% da área afetada. Linfócitos e macrófagos são ainda detectados no tecido conjuntivo e neutrófilos no epitélio sulcular. O epitélio juncional aumenta suas projeções digitiformes em direção ao tecido conjuntivo já iniciada de forma discreta no estágio anterior, além de iniciar a sua projeção para apical, aprofundando o sulco gengival clínico (GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS, 1992).
A lesão estabelecida pode permanecer sem evoluir para o estágio seguinte ou pode evoluir dando lugar ao estágio de lesão avançada que caracteriza clinicamente a periodontite. Este último estágio é caracterizado principalmente pelo início da reabsorção óssea acompanhada por uma predominância de até 50% de plasmócitos e mudança nos linfócitos que passam a predominar os do tipo B ao invés dos do tipo T (GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS, 1992).
Smith et al. (2004) consideraram que a migração para apical do epitélio
juncional é um evento chave na formação da bolsa periodontal e que isso ocorre às custas de degradação das fibras de Sharpey localizadas mais coronalmente.
Quanto às células que participam deste processo, Lins (2003) estudou o papel do perfil da resposta imunológica em 42 espécimes teciduais emblocados em parafina diagnosticados como gengivite crônica (17 casos) e periodontite crônica (25 casos). A análise imuno-histoquímica mostrou que nos estágios que correspondem à gengivite, os macrófagos predominam, mas com a evolução da doença para uma periodontie, tendem a desaparecer sendo substituídos por linfócitos e plasmócitos. Linfócitos T helper, encontravam-se predominantemente
encontravam-se distribuídos focalmente em posição justa-epitelial ou distantes do epitélio.
2.2 Matriz Extracelular
Alberts et al. (1997) afirmaram que as células de um tecido normalmente
estão em contato com uma rede complexa de macromoléculas extracelulares denominada de matriz extracelular (MEC), que atua ajudando a manter células e tecidos unidos, fornecendo uma estrutura organizada onde as células podem migrar e interagirem entre si, além de suportar a maior parte do estresse mecânico infligido àquele tecido.
Pereira et al. (2005), conceituam matriz extracelular (MEC) como um
espaço extracelular, preenchido por um complexo de componentes fibrosos e protéicos, com proporções variadas de proteínas e polissacarídeos que fornecem um substrato adequado para o crescimento e diferenciação dos mais variados tipos celulares do organismo.
A quantidade de matriz extracelular varia grandemente de acordo com o tecido em questão, sendo mais abundante que as próprias células nos tecidos conjuntivos e escassa nos tecidos epiteliais. Nos tecidos conjuntivos os componentes da MEC são secretados por fibroblastos ou por células da família dos fibroblastos, como condroblastos nas cartilagens e osteoblastos nos ossos (ALBERTS et al., 1997; MOTT; WERB, 2004).
São duas as classes principais de macromoléculas que compõem a matriz extracelular, as glicosaminoglicanas e as proteínas (ALBERTS et al., 1997; MOTT;
WERB, 2004).
têm a capacidade de atrair água formando géis que ocupam grandes volumes e resistem bem às forças compressoras exercidas sobre a matriz, assim como permitem fácil difusão de moléculas hidrossolúveis e migração celular. Quatro grupos compõem as glicosaminoglicanas, são eles: a hialurona, o mais simples e
os sulfatos de condroitina e de dermatana, o sulfato de heparana e o sulfato de queratana, que são encontrados ligados covalentemente às proteínas na forma de proteoglicanas, que então recebem nomes como agrecana, betaglicana, decorina, perlecana, serglicana e sindecana. Além de fornecer um espaço hidratado, as
proteoglicanas podem servir como filtros bioquímicos para moléculas de tamanhos diferentes e fornecerem ligação para moléculas sinalizadoras exercerem sua função e para regulação da ação de algumas proteases. Algumas proteoglicanas como as sindecanas apresentam seus núcleos protéicos atravessando a membrana celular atuando como receptores para proteínas estruturais da MEC ou como co-receptores para moléculas sinalizadoras como FGF e TGF-β (ALBERTS
et al., 1997, BORNSTEIN ; SAGE, 2002).
Os componentes protéicos da matriz extracelular, para Alberts et al. (1997)
são classificados ainda em estruturais, como o colágeno e a elastina, e adesivos
como a fibronectina e a laminina.
superfícies das fibrilas, ligando-as entre si e a outros componentes da MEC. Há ainda os colágenos formadores de rede, dos tipos IV e VII. O do tipo IV agrupa-se em uma camada como um feltro formando a parte principal da lâmina basal e o do tipo VII forma um dímero que se agrupa em estruturas chamadas fibras ancoradouras que fazem a ligação da lâmina basal ao conjuntivo subjacente. A elastina é uma proteína hidrofóbica que corresponde ao principal componente das fibras elásticas. Estas fornecem elasticidade à matriz extracelular de modo que os tecidos possam voltar à forma original após uma distensão temporária (ALBERTS
et al., 1997; MOTT; WERB, 2004; van den STEEN et al. 2002).
KARIMBUX et al. (1998), relatam que o tecido conjuntivo periodontal é
composto basicamente de colágenos fibrilares dos tipos I e III e do colágeno associado a fibrilas do tipo XII sendo que os primeiros são observados já durante o desenvolvimento do ligamento periodontal e o do tipo XII apenas no ligamento periodontal e tecido conjuntivo gengival maduros.
Ainda de acordo com Alberts et al. (1997), as proteínas adesivas exercem
papel tanto na organização da matriz como na ligação das células a ela. A fibronectina é uma glicoproteína encontrada em todos os vertebrados e corresponde a um dímero composto de duas subunidades cada uma, com vários domínios funcionalmente diferentes separados por regiões flexíveis. Cada um dos domínios liga-se a componentes diferentes da própria matriz ou das células como colágeno e heparana, sendo esta proteína importante para a adesão célula-matriz e para a migração celular.
Bornstein e Sage (2002) afirmam que formas especializadas de matriz extracelular, chamadas de membrana basal ou lâmina basal, possuem propriedades estruturais, mas sem perder a ação de influenciar a função das células.
A lâmina basal, segundo Aberts et al. (1997) e Smith et al. (2004), é uma
adiposas e células de Schwann separando-os do tecido conjuntivo adjacente. Além de determinar a polaridade das células, a lamina basal influencia o metabolismo celular, organiza as proteínas da membrana celular adjacente, induz a diferenciação e favorece a migração celular. A lamina basal é sintetizada pelas células que nela repousam e em alguns tecidos ela é ancorada ao tecido conjuntivo subjacente através das fibras ancoradouras. A maioria das lâminas basais contém colágeno tipo IV, a proteoglicana perlecana e as glicoproteínas laminina e entacina.
Para Bornstein e Sage (2002) um grupo de proteínas extracelulares que não contribuem diretamente para formação de elementos estruturais da matriz extracelular, mas agem como moduladores das funções celulares e das interações célula-matriz extracelular são chamadas de “matricelular”. O termo matriz pericelular se refere a um compartimento da matriz extracelular, adjacente à célula, que contém fatores de crescimento, citocinas, proteases e outras moléculas bioativas que interagem com a superfície celular e, junto com outros elementos como proteoglicanos, influenciam propriedades das células como motilidade, proliferação, diferenciação e predisposição a apoptose. As proteínas matricelulares são a trombospondina-1 e -2 (TSP-1 e TSP-2), a proteína secretada ácida e rica em cisteína (SPARC) que também é conhecida como osteonectina, a tenascina-C, a tenascina-X e o fator de crescimento de tecido conjuntivo (CCN).
2.3 Metaloproteinases da Matriz (MMPs)
Segundo Birkedal-Hansen (1993) a degradação da matriz extracelular envolve mecanismos distintos sendo iniciada pela dissolução mediada por metaloproteinases da matriz (MMPs) ou pela plasmina.
A regulação do turnover das macromoléculas da matriz extracelular é crítica
proteolíticas extracelulares excretadas localmente pelas células que pertencem a uma de duas classes: as metaloproteases ou as serinoproteases (ALBERTS et al.,
1997; GRENIER; MAYRAND, 2001; PEREIRA et al., 2005; SORSA;
TJÄDERHANE; SALO, 2004).
Sternlicht e Werb (2001) explicam que as enzimas proteolíticas são classificadas em exopeptidases e endopeptidases quando clivam,
respectivamente, ligações terminais ou internas dos peptídios.
As metaloproteinases são um grupo de endopeptidases, dependentes de Ca++ ou Zn++ ligados no sítio ativo para possuírem atividade (ALBERTS et al.
1997) classificadas em 5 superfamílias, sendo uma delas a superfamília metzincin
que contém um domínio com 3 histidinas que se ligam ao zinco no sítio catalítico. A superfamília metzincin é subdividida em 4 famílias: as serralisinas, as astacinas,
as ADAMs (adamalisinas) e as metaloproteinases da matriz (MMPs) (MOTT; WERB, 2004; STERNLICHT; WERB, 2001).
As MMPs são uma família de enzimas proteolíticas que degradam os componentes da matriz extracelular como o colágeno, a gelatina e a elastina (HAAKE et al., 2004). As MMPs dos vertebrados atuam em diversos substratos,
sendo capazes de degradar virtualmente todos os componentes da matriz extracelular (De SOUZA et al., 2005; STERNLICHT; WERB, 2001).
Como a cada momento são descobertos novos membros da família das MMPs, é difícil dizer com segurança quantas enzimas existem. Birkedal-Hansen (1993) afirma que a família dos genes MMP codificam pelo menos nove endopeptidases metal-dependentes.
Rundhaug (2003) afirma que as MMPs são uma família de mais de 20 endopeptidases que contém zinco capazes de degradar vários componentes da matriz extracelular. Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) afirmam que as MMPs correspondem a uma família 23 de enzimas que degradam componentes da matriz extracelular, incluindo as membrana basais.
Todas as MMPs são derivadas de um protótipo estrutural com cinco domínios onde pela adição ou deleção de um ou mais domínios tem-se as variadas formas de MMP com suas particularidades. Todas as formas contêm um sítio de ligação para um Zn++ que se acredita que constitua o sítio ativo da enzima (BIRKEDAL-HANSEN, 1993; De SOUZA et al., 2005; PEREIRA et al., 2005;
REYNOLDS; MEIKLE, 1997; RUNDHAUG, 2003; STERNLICHT; WERB, 2001).
As metaloproteinases são referidas de acordo com nomes específicos ou por uma numeração e agrupadas de acordo com a sua estrutura (NABESHIMA et
al., 2002).
Cotrim et al., em 2002, as classificam em 4 grupos principais, o das
colagenases intersticiais, o das colagenases tipo IV, o das estromelisinas e o das MMPs ligadas à membrana.
Segundo Rundhaug (2003) as MMPs existem na forma solúvel (MMP-1, -3, -8, -10, -12, -13, -19 e -20, por exemplo) e na forma ligada à membrana, com um domínio trans-membrana e uma curta cauda citoplasmática, sendo então chamadas de MT-MMPs (MT1-, MT2-, MT3-, MT4- e MT5-MMP).
De Souza e Line (2002) e Pereira et al. (2005) listam algumas das MMPs
humanas catalogadas, de acordo com o substrato em que atuam, como colagenases (MMP-1, -8 e -13), gelatinases (MMP-2 e -9), estromelisinas (MMP-3 e -10), metaloelastase (MMP-12), enamelisina (MMP-20) e metaloproteinases ligadas à membrana plasmática (MMP-14, -15, -16, -24, -17, -25 e -23).
pró-enzimas ou zimogênios, a ação de inibidores teciduais de metaloproteases (TIMPs) e os inibidores de serinoproteases (serpinas) (ALBERTS et al. 1997).
Na maioria dos casos as MMPs não são sintetizadas até serem necessárias e a sua transcrição pode ser induzida por sinais como citocinas, fatores de crescimento e estresse mecânico. A ativação das MMPs ocorre por ação de proteases séricas como plasmina e funina e, como acontece com algumas MMPs, por ação de outras MMPs que podem ativar outros membros da família como a já conhecida ativação da MMP-2 pela MT1-MMP que se dá pela remoção de um pró-domínio resultando em uma forma ativa, geralmente de peso molecular menor (RUNDHAUG, 2003; SORSA; TJÄDERHANE; SALO, 2004).
Regulação adicional da atividade das MMPs é exercida por inibidores endógenos como a α2-macroglobulina e os inibidores teciduais de
metaloproteinases (TIMPs). As TIMPs são em número de 4 (TIMP-1, -2, -3 e -4) e sabe-se que além de exercer atividade de inibição das MMPs, também participam, em alguns casos, no processo de sua ativação como no caso da TIMP-2 que é necessária para a ativação da pró-MMP-2 pela MT1-MMP (RUNDHAUG, 2003, SORSA; TJÄDERHANE; SALO, em 2004).
A inibição das MMPs é também possível através de produtos sintéticos como os quelantes do íon Zn2+, como batimastat e marimastat, e através do uso
de tetraciclinas que possuem o potencial de inibir as MMPs por mecanismos como inibição da expressão do RNAm para MMPs, interferir com o processo de ativação da pró-enzima e tornar a MMP ativada mais susceptível à degradação (SORSA; TJÄDERHANE; SALO, 2004).
microbianos como os LPS e lectinas possuem também a capacidade estimular a transcrição de certos tipos de colagenases. A regulação através da ativação de precursores se dá pela ruptura da ligação de um resíduo Cys do propeptídio do sítio ativo contendo o Zn++. Alguns inibidores têm também a capacidade de regular a ação das MMPs, são eles as α-macroglobulinas e os Inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs). As α-macroglobulinas têm a capacidade de capturar as moléculas de MMP através de ligações específicas. Os TIMPs, formam complexos bimoleculares não covalentes com formas ativas ou latentes de MMPs. Diferentes células produzem e liberam MMPs de diferentes maneiras. O padrão de resposta da MMP dos PMNs é singular devido ao armazenamento em grânulos e liberação rápida levando a um substancial aumento nos níveis destas enzimas em questão de minutos, mantendo a resposta pelo recrutamento de novas células se o estímulo permanece.
Reynolds e Meikle (1997) relatam que a ativação das MMPs é mediada por fatores como a plasmina, capaz de ativar a colagenase e a estromelisina-1. A estromelisina também pode participar da ativação de outras MMPs como a MMP-9 (gelatinase-B) e a colagenase. Alguns produtos exógenos como os lipopolissacarídeos (LPS) liberados pelas bactérias do biofilme dentário podem ativar colagenases. A MMP ligada a membrana (MT1-MMP ou MMP-14) também participa no processo de ativação de colagenases.
armazenadas em grânulos dos neutrófilos circulantes e liberadas quando estes são ativados por mediadores inflamatórios.
Segundo Birkedal-Hansen (1993) a colagenase dos PMN são liberadas de grânulos específicos existentes nestas células quando estas são ativadas enquanto que as dos fibroblastos são transcritas de acordo com a demanda. O grupo das estromelisinas atuam em diversos substratos como a proteína núcleo das proteoglicanas, colágeno tipos IV e V, fibronectina e laminina e é expressada por células estromais mediante estímulos por citocinas como o IL-1, o EGF e o TNF-α. As gelatinases são talvez as mais distribuídas das MMPs e podem ser produzidas por fibroblastos, queratinócitos, células endoteliais, monócitos/ macrófagos, osteoblastos e condrócitos. Algumas formas de gelatinases podem ser expressas por PMNs. Além da proteína gelatina, estas enzimas podem clivar elastina e colágeno dos tipos IV, V, VII e X.
Segundo Wahl e Corcoran (1993) as lesões inflamatórias crônicas são povoadas por células mononucleares como monócitos e macrófagos, portanto estas células podem ser importantes fontes de mediadores da destruição tecidual. Já foi demonstrado que estas células são capazes de produzir várias metaloproteinases da matriz como colagenases que degradam colágenos I, II e III, colagenase de 92 kDa capazes de degradar gelatina e colágenos tipo IV e V e estromelisina que degrada a fibronectina, as proteoglicanas, e a laminina e os colágenos IV e V. A produção de metaloproteinases por estas células é dependente de ativação primária por substâncias como lipopolissacarídeos bacterianos (LPS), concanavalina A (Con A) e linfocinas que levam à produção de prostaglandina E2 (PGE2) e AMP cíclico (cAMP) intracelular.
Tanto a MMP-1 quanto a MMP-8 são colagenases, sendo que a MMP-8 é liberada por neutrófilos infiltrados enquanto a MMP-1 é expressada por fibroblastos, monócitos, macrófagos e células epiteliais (HAAKE et al. 2004a).
A MMP-1, ou colagenase 1, é uma enzima com 52 kDa na forma inativa e 41 kDa na forma ativa que é expressa in vivo em áreas de rápida remodelação
tecidual fisiológica ou patológica. É expressa por fibroblastos, ceratinócitos, condrócitos, monócitos, macrófagos, hepatócitos e uma variedade de células tumorais. Os substratos já identificados desta enzima são os colágenos dos tipos I, II, III, VII, VIII e X, além de agrecana, serpins e α2-macroglobulina (NABESHIMA
et al., 2002; WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999). Lynch e Matrisian (2002) relatam
que além destes substratos a MMP-1 ainda degrada o colágeno tipo XI, gelatina, entacina, fibronectina, laminina, tenacina e vitronectina.
A MMP-1 cliva o colágeno tipo I, que é posteriormente degradado por outras enzimas (De SOUZA; LINE, 2002), pois após clivado, o colágeno I desnatura-se formando a gelatina que é degradada pela MMP-2 e MMP-9 (COTRIM et al. 2002; STAMENKOVIC, 2000).
A MMP-8 é uma colagenase que já teve a sua produção atribuída exclusivamente aos neutrófilos, no entanto sabe-se hoje que outras células têm a capacidade de produzi-la.
De acordo com Kubota, T. et al. (1996), a MMP-1 e a MMP-8 têm
capacidade de degradar o colágeno tecidual pela clivagem da molécula no domínio da tripla hélice resistente à proteinase. A MMP-3, ou estromelisina-1 é um membro da família das metaloproteinases com a capacidade de degradar vários tipos de substratos como proteoglicanas, fibronectina, laminina e colágenos tipo IV e XI.
A MMP-2 é expressa por uma variedade de células normais ou tumorais (WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999) e tem a capacidade de degradar gelatina, colágenos dos tipos IV, V e X na sua forma nativa, além de laminina, TGF-β, e colágenos dos tipos I, II e III desnaturados (KUBOTA, Y. et al., 2002;
STAMENKOVIC, 2000).
A produção de MMP-2 ocorre na sua forma inativa, ou Pró-MMP-2 e é necessário para que ocorra a sua ativação a ação da MT1-MMP, com a participação de uma molécula de TIMP-2 como ponte, formando um complexo trimolecular (KUBOTA, Y. et al., 2002; NABESHIMA et al., 2002; PATTAMAPUN et
al. 2003).
Kubota, Y. et al. (2002) estudando o efeito da IL-1α na ativação de MMP-2
em fibroblastos isolados de ceratocistos, mostraram que esta citocina tem a capacidade de aumentar a produção de MT1-MMP nos fibroblastos, fazendo com que a ativação de MMP-2 seja aumentada. Foi sugerido então neste estudo que a IL-1α, através do aumento da produção de MT1-MMP com maior ativação de MMP-2 desempenha um papel crucial no crescimento intra-ósseo do ceratocisto.
De Souza et al. (2005) descrevem a MMP-9, ou gelatinase B como uma
enzima expressa por leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, ceratinócitos e células endoteliais que atua nos colágenos do tipo IV, V e IX, em proteoglicanas e na elastina e tem sua expressão controlada por fatores como o TNF-α, a IL-1, o PDGF e o EGF.
Stamenkovic (2000), relata que a MMP-9 tem a capacidade de degradar gelatina, colágenos do tipo I, IV, V e X, além de TGF-β na forma latente.
A MMP-9 atua na biologia óssea de maneira a participar na regulação do
turnover ósseo mas quando desregulada na sua síntese, secreção ou ativação
resulta em reabsorção óssea patológica (Van Den STEEN et al., 2002).
Kubota, Y. et al. (2000) estudaram o mecanismo de expansão dos cistos
odontogênicos enfocando os efeitos da IL-1α na secreção e ativação de MMP-9. A análise zimográfica mostrou a presença da gelatinase de 92 kDa, a forma inativa da MMP-9 em fluidos coletados de cistos dentígeros e cistos radiculares e de 83 kDa, a MMP-9, ativa principalmente em ceratocistos. Fragmentos cultivados dos cistos coletados mostraram produção de MMP-9, além de MMP-2, quando incubados com IL-1α além de ativação de Pró-MMP-9 em MMP-9.
Chang et al. (2002) publicaram trabalho que teve o objetivo de determinar
os efeitos das bactérias Porphyromonas endodontalis e Porphyromonas gingivalis
na produção e secreção de metaloproteinases da matriz em culturas de células do ligamento periodontal. Células de polpas dentárias e de ligamento periodontal humanos foram obtidas de terceiros molares retidos e então cultivadas. A análise zimográfica mostrou que a enzima MMP-2 começou a aumentar a partir do quarto dia de cultura de células pulpares com P. endodontalis e P. gingivalis e continuou
aumentando até o oitavo dia de forma dose-dependente. A MMP-9 também foi detectada na análise zimográfica mas em pequena quantidade. Na cultura de células do ligamento periodontal ocorreu efeito semelhante. Este estudo mostra que o P. endodontalis e o P. gingivalis, desempenham um importante papel na
destruição tecidual e desintegração da matriz extracelular em lesões pulpares e periapicais através da indução das células residentes locais a produzirem MMPs.
Shin et al. (2002) realizaram um trabalho com o objetivo de verificar se as
resultados mostraram que nas polpas com pulpite aguda, a MMP-1 e a MMP-3 se localizaram predominantemente nos neutrófilos e macrófagos, assim como na matriz extracelular. As células inflamatórias típicas da inflamação crônica marcaram fracamente. A MMP-2 expressou fracamente nas células inflamatórias e fibroblastos de todos os grupos experimentais. A MMP-1, -2 e -3 marcaram em plasmócitos, linfócitos e macrófagos. Estes resultados sugeriram que a MMP-1 e a MMP-3 podem ser produzidas por neutrófilos, macrófagos, plasmócitos e linfócitos. A produção de MMPs foi maior nas pulpites agudas que nos grupos controle o que pode significar que elas participam na progressão da inflamação pulpar.
Franchi et al. (2002) avaliaram, em carcinomas de cabeça e pescoço, a
expressão imuno-histoquímica da MMP-1, MMP-2 e MMP-9 correlacionando estes dados com o estado do gene p53, a atividade da enzima óxido nítrico sintetase e
com a angiogênese. Fragmentos do front de invasão de tumores foram obtidos de
43 pacientes e usados para análise imuno-histoquímica e molecular. Os resultados mostraram que a expressão das MMPs foi variável e envolveu além das células neoplásicas as células endoteliais e inflamatórias. A expressão da MMP-1 foi evidente em 97,6% dos espécimes, com 74,5% demonstrando distribuição moderada ou difusa nas células neoplásicas. A expressão da MMP-2 foi evidente em 79% com marcação considerada moderada ou difusa em 39,5% e da MMP-9 foi evidente em 65% com 39,5% mostrando marcação moderada ou difusa. Tumores com superexpressão de MMP-9 foram associados a maior freqüência de metástases em linfonodos embora não tenha sido estatisticamente significante. A densidade vascular correlacionou-se positivamente com a presença de metástases em linfonodos, com tumores primários de maior tamanho e com superexpressão de MMP-9. Tumores com mutação de p53 apresentaram maiores
correlação entre a expressão de MMP-9, a mutação do gene p53 e a
angiogênese.
O papel das MMPs na angiogênese foi discutido por Haas e Madri (1999). A angiogênese é dependente da ativação de células endoteliais dando início a proliferação celular e proteólise das membranas basais permitindo a invasão e migração das células endoteliais através da matriz extracelular para formar novos vasos. A degradação da matriz extracelular ocorre pela ação de uma série de enzimas, incluindo as MMPs. Células endoteliais já demonstraram ser produtoras de MMP-1, MMP-13, MMP-3, MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP provavelmente tendo grande importância na angiogênese.
Segundo Rundhaug (2003) as MMPs são importantes no processo de angiogênese já que o primeiro passo da angiogênese é a degradação da membrana basal de um vaso pré-existente. Mas as MMPs não contribuem com a angiogênese somente pela degradação da membrana basal e de outros componentes da matriz extracelular. Atuam também na liberação de fatores pró-angiogênicos ligados à matriz extracelular como bFGF, VEGF e TGFβ. Componentes da matriz extracelular degradados pelas MMPs tormam acessíveis sítios de ligação para determinadas integrinas como a αvβ3, que podem iniciar uma sinalização que contribui para a sobrevivência e proliferação endotelial.
Kumamoto et al. (2003) avaliaram a expressão imunohistoquímica das
odontogênicos tanto normais quanto neoplásicos atuando no processo de invasividade dos ameloblastomas e em processos desenvolvimentais nos germes dentários.
Ao exercerem sua atividade na degradação da matriz extracelular, as MMPs liberam fragmentos escondidos e neo-epítopos das macromoléculas. As MMP-2 e -9, por exemplo, ao degradarem a membrana basal expõem um epítopo escondido na molécula do colágeno IV capaz de promover angiogênese. A degradação da laminina-5, outro componente da membrana basal, pela MT1-MMP libera um fragmento escondido da sua cadeia γ2 que é capaz de induzir migração epitelial. Também já foi demonstrado que a MMP-9 e, em menor grau a MMP-2, ao degradarem a matriz extracelular aumentam a biodisponibilidade da VEGF, um importante fator de crescimento no processo de angiogênese, e do fator de crescimento TGF-β (MOTT; WERB, 2004).
2.4 MMPs na Doença Periodontal
Segundo Reynolds e Meikle (1997) e Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) a destruição tecidual característica da periodontite, outrora considerada efeito direto das bactérias e seus produtos é hoje considerada efeito principalmente dos produtos do hospedeiro, liberados no local devido à invasão de produtos bacterianos. Os produtos liberados pelas bactérias são capazes de estimular respostas inflamatórias e imunológicas altamente ricas em mediadores como prostaglandinas, IL-1, TNF e outros que por sua vez estão ligados à ativação das formas latentes em formas ativas de MMPs.
De Souza e Line (2002) afirmam que os altos níveis de MMPs nos tecidos periodontais são os responsáveis pelo desequilíbrio entre produção e degradação de colágeno causando destruição periodontal.
Fibroblastos, queratinócitos, macrófagos e células endoteliais respondem de maneira parecida, produzindo e liberando MMPs mediante estímulos de mediadores catabólicos como IL-1, TNF-α, TGF-α, EGF, bFGF e PDGF e inflamatórios como a PGE2 (BIRKEDAL-HANSEN 1993; Van DYKE; LESTER;
SHAPIRA, 1993; WAHL; CORCORAN, 1993).
Nishikawa et al. (2002) estudaram o efeito da TNFα e da PGE2 na produção
de MMPs por fibrobastos do ligamento periodontal mantidos em cultura. As culturas foram tratadas com TNFα e PGE2 e tiveram posteriormente o RNAm
extraído e examinado pelas técnicas do RT-PCR, zimografia e Western blot. Foi detectada produção de MMP-1, MMP-3 e MMP-13 de forma dose-dependente da adição de TNFα e aumento da produção das 3 MMPs com o passar do tempo.
Alvares et al. (1995) estudaram a produção de MMP-1 e TIMP-1 por
fibroblastos do ligamento periodontal mediante estímulos de IL-1β, PDGF e TGF-β. Culturas de fibroblastos do ligamento periodontal foram obtidas e tratadas com as citocinas e fatores de crescimento citados e então o RNAm produzido na cultura foi extraído e estudado pela técnica RT-PCR para detecção de RNAm para MMP-1 e TIMP-1. A IL-1β causou grande aumento na produção de RNAm para MMP-1, um aumento menos expressivo foi detectado com o PDGF enquanto que o TGF-β, ao contrário, provocou inibição. Não houve nenhum efeito significativo em relação à TIMP-1.
severidade aumentada da doença. As MMPs mais comumente detectadas são a colagenase-2 ou MMP-8, acompanhada da MMP-9.
De acordo com Genco (1992) a degradação do tecido mole na doença periodontal ocorre devido à ação de enzimas bacterianas e enzimas do hospedeiro como a plasmina e as metaloproteinases da matriz (MMPs). Haake et al. (2004) afirmam que as MMPs são consideradas as proteinases primárias
envolvidas na degradação dos tecidos periodontais.
Smith et al. (2004) estudaram a expressão da MMP-9 no epitélio gengival
de indivíduos com doença periodontal para determinar a participação desta na degradação da membrana basal e inferir sua participação na migração do epitélio juncional para apical na formação da bolsa periodontal. Uma análise zimográfica em biópsias gengivais demonstrou que tanto o epitélio quanto o tecido conjuntivo de amostras de periodontite expressaram capacidade colagenolítica correspondente à expressão de MMP-2 e MMP-9. Altos níveis de pró-MMP-9 foram encontrados no epitélio da bolsa quando comparados ao epitélio sulcular normal. A mesma diferença não pôde ser detectada para a pró-MMP-2. A MMP-9 mostrou-se distribuída por todas as camadas epiteliais tanto do epitélio juncional quanto do epitélio da bolsa e fraca expressão e distribuição no tecido conjuntivo gengival. Forte marcação para MMP-9 foi detectada em leucócitos polimorfonucleares. Os ceratinócitos do epitélio gengival foram identificados como fonte importante de MMP-9 no epitélio gengival inflamado.
Conforme Grenier e Mayrand (2001) na inflamação periodontal causada por periodontopatógenos, as MMPs são produzidas de maneira descontrolada e ocorre um desequilíbrio entre a atividade de MMPs e de TIMPs resultando em degradação tecidual.
Segundo Genco (1992) está claro que as bactérias do biofilme são capazes de ativar diretamente MMPs ou inibir a ação dos TIMPs, bem como indiretamente através da estimulação de células do hospedeiro a produzirem citocinas que por sua vez induzem outras células como fibroblastos e ceratinócitos a produzirem colagenases.
Enzimas bacterianas, como a protease semelhante à quimiotripsina produzida pela bactéria Treponema denticola, e outras substâncias liberadas pelas
bactérias Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans e
Fusobacterium nucleatum são capazes de ativar as MMPs assim como as células
do próprio hospedeiro estimuladas por citocinas (BIRKEDAL-HANSEN, 1993; HAAKE et al., 2004a; HAAKE et al., 2004b; GENCO, 1992; MALDONADO et al.,
2004; WAHL; CORCORAN, 1993).
Nakaya et al. (1997) estudaram em culturas de células de ligamento
periodontal a indução de MMP-3, ou estromelisina-1, pela IL-1β. Foi encontrado que as células cultivadas apresentaram aumento da produção de MMP-3 na presença de IL-1β de forma dependente da concentração desta última.
Grenier e Mayrand (2001) realizaram um estudo com o objetivo de determinar se o Porphyromonas gingivalis possui a capacidade de degradar e/ou
inativar a TIMP-1. A análise em eletroforese mostrou que a Porphyromonas gingivalis foi capaz de degradar a TIMP-1 em vários fragmentos. Foi demonstrada
inibição de MMP-9 quando adicionada no ensaio TIMP-1 tratada com bactérias previamente aquecidas para inativação das proteases. A mesma inibição da MMP-9 não foi observada quando a TIMP-1 adicionada havia sido tratada com bactérias proteoliticamente ativas, significando que inibição da TIMP-1 pelo P. gingivalis tem
extracelular. Os autores concluem que a degradação periodontal pode ser favorecida pelo aumento significante de MMPs ativas, causada pela redução dos seus inibidores (TIMPs), nos sítios onde existe a presença de P. gingivalis.
O Porphyromonas gingivalis, também foi investigado por Pattamapun et al.
(2002) com relação à sua capacidade de induzir ativação de MMP-2 em células do ligamento periodontal. Culturas de fibroblastos do ligamento periodontal foram obtidas e então sofreram a adição de sobrenadantes de culturas de P. gingivalis.
Foi demonstrado que o P. gingivalis possui a capacidade de induzir ativação de
MMP-2 em células do ligamento periodontal além de aumentar a expressão de MT1-MMP detectados pelas técnicas de RT-PCR e Western.
Wahl e Corcoran (1993) demonstraram que, devido à capacidade do interferon γ (IFNγ) e da interleucina-4 (IL-4) de suprimirem a produção de PGE2
que é um mediador inflamatório envolvido na estimulação de produção de MMPs, estas citocinas apresentaram-se capazes de reduzir a produção de PGE2 no meio
de cultura, levando à redução da produção de colagenase intersticial e colagenase/gelatinase 92kDa.
De acordo com Kubota, T. et al. (1996), as principais colagenases
presentes no tecido gengival podem ser a MMP-1 e a MMP-8, tendo a primeira sido mais relacionada à Periodontite Juvenil e a segunda à Periodontite do Adulto. Estes autores detectaram níveis de RNAm para MMP-1, MMP-3, MMP-8 e TIMP-1 maiores em gengivas afetadas pela periodontite que em indivíduos saudáveis mas não os de RNAm para TIMP-2. Fatores como o TGF- e o FGF básico mostraram-se capazes de aumentar a produção de TIMP-1. Concluíram que o aumento sinérgico da produção de MMP-1, MMP-3 e MMP-8 é importante para a destruição tecidual encontrada na doença periodontal e que o aumento da TIMP-1 pode ser uma tentativa do organismo de compensar o aumento das metaloproteinases.
Chang et al. (2002) estudaram a influência de IL-1α, TGF-β, e produtos das
bactérias P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans na expressão das MMPs em
presença de MMP-2 e MMP-9 nos meios de cultura adicionados com extratos de
P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans. A IL-1α elevou a produção de MMP-2
ao longo do tempo enquanto a TGF-β causou redução.
A MMP-8 foi demonstrada ser produzida por neutrófilos e por fibroblastos periodontais em pacientes com síndrome de Down com diagnóstico de gengivite e periodontite em quantidades maiores que em pacientes com a mesma síndrome sem doença periodontal (HALINEN et al., 1996).
A MMP-8, foi estudada por Figueredo et al. (2004) em relação à sua
atividade detectada no fluido gengival após tratamento periodontal não cirúrgico. Em pacientes com periodontite que receberam tratamento periodontal composto de procedimentos básicos, foi coletado fluido gengival antes do início do tratamento e no trigésimo dia após o término. Além de melhorias significativas nos parâmetros clínicos observados, foi observada redução significativa nos níveis de MMP-8 nos sítios com gengivite e com periodontite de pacientes com diagnóstico de periodontite.
Meyer et al. (1997) realizaram um estudo que teve como objetivo comparar
os níveis de elastase ativa (AE), um componente dos grânulos primários dos neutrófilos que causam destruição tecidual (KINANE; LINDHE, 1999), e do complexo elastase-inibidor de proteinase α-1 (E-α-1 PI) no fluido gengival entre pacientes com periodontite de progressão rápida e periodontite do adulto. Os resultados de coleta de fluido gengival demonstraram que os níveis de AE e E-α-1 PI foram considerados insignificantes nos pacientes controle (sulco gengival de pacientes sem periodontite). Nos pacientes com periodontite, níveis significativamente aumentados de AE, mas não do complexo E-α-1 PI, foi encontrado, independentemente do tipo de periodontite, razão pela qual os autores consideraram esta enzima como um marcador de doença.
Garlet et al. (2004) estudaram a expressão de MMPs e TIMPs, do fator
técnica RT-PCR em relação à expressão para MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, RANKL, OPG, TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10. Foi constatado que a expressão para as MMPs e as TIMPs analisadas no estudo foi significativamente maior nos casos de periodontite, tanto crônica quanto agressiva, que nos pacientes controle, sem periodontite, sem diferença significante entre o tipo de periodontite exceto para a TIMP-1 e TIMP-3 que foram mais expressas em periodontite agressiva que em periodontite crônica.
Soell, Elkaim e Tenenbaum (2002) estudaram em biópsias gengivais e fluido do sulco gengival de 11 pacientes com periodontite e 5 pacientes saudáveis os níveis de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2, além da enzima Catepsina C. As enzimas e os inibidores em questão foram quantificados e tiveram suas atividades mensuradas através das técnicas ELISA, Western blot e análise zimográfica. Todas as MMPs estudadas mostraram níveis maiores em pacientes com periodontite que nos pacientes controle tanto nas biópsias quanto no fluido do sulco gengival. As TIMP-1 e TIMP-2 mostraram-se reduzidas nos pacientes com periodontite. As atividades das MMPs também estavam aumetadas nos casos de periodontite.
Maldonado et al. (2004) considerando a já conhecida maior prevalência de
periodontite em diabéticos, realizaram um trabalho com o objetivo de estudar a produção de MMP-1 estimulada por lipopolissacarídeos, em histiócitos previamente expostos a altas concentrações de glicose. Histiócitos e fibroblastos gengivais foram cultivados e expostos a concentrações de 5 e 25 mM de glicose, tidas como normal e excessiva respectivamente e então tratados com lipopolissacarídeos isolados de Escherichia coli. Os resultados mostraram que a
previamente. Isso significa que a pré-exposição prolongada à glicose em altas concentrações é necessária para que a secreção de MMP-1 seja superestimulada pelo LPS. Foi observado então que a glicose em excesso aumenta a produção de MMP-1 estimulada por lipopolissacarídeos mais que a expressão de TIMP-1 nos histiócitos. A expressão de RNAm para MMP-1, MMP-7, MMP-8 e MMP-9 foi considerada maior nas células expostas a glicose em altas concentrações que em células com glicose normal, fato encontrado também nas células expostas a lipopolissacarídeos. O aumento na produção de MMPs nesses casos é devido ao aumento da expressão do RNAm.
O estudo acima citado conclui então que a pré-exposição de fagócitos mononucleares a altos níveis de glicose aumentam a expressão de MMP-1 estimulada por lipopolissacarídeos, levando a crer que pacientes diabéticos com hiperglicemia têm maior susceptibilidade dos seus fagócitos à liberação de substancias responsáveis pela degradação de tecido periodontal frente à presença dos principais patógenos periodontais.
Existe um grande potencial clínico nos campos do diagnóstico e tratamento da doença periodontal com a evolução do entendimento do papel das MMPs nesse processo (GENCO, 1992; Van DYKE; LESTER; SHAPIRA, 1993).
De Souza et al. (2005) realizaram um estudo com o objetivo de
correlacionar o polimorfismo na região promotora dos genes MMP-9 e TIMP-2 com
a doença periodontal, o que representaria um importante achado na busca pelo diagnóstico precoce de indivíduos de risco. Os resultados demonstraram que pacientes diagnosticados com periodontite crônica não apresentaram associação com o polimorfismo no gene MMP-9. O genótipo T/T, considerado o de maior
transcrição de MMP-9, não foi encontrado em nenhum paciente com periodontite. A análise de polimorfismo para o gene TIMP-2 mostrou que 99% dos indivíduos
tinham o mesmo genótipo, não sendo possível fazer qualquer tipo de inferência.
Para Björnsson et al. (2004) uma vez que a associação entre MMPs e
progressão da doença periodontal está estabelecida, esforços devem ser feitos para inibir estas enzimas. Neste trabalho, os autores fazem uso de um inibidor sintético das MMPs, o Batimastat (BB-94), que age de forma competitiva, inibindo
3 PROPOSIÇÃO
O presente estudo tem como objetivo estudar através de análise imuno-histoquímica a expressão das enzimas MMP-1, MMP-2 e MMP-9 no tecido gengival acometido por Gengivite Induzida por Placa e por Periodontite Crônica
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1. CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
Este estudo caracteriza-se como uma pesquisa descritiva observacional baseada na análise e registro do padrão de distribuição e localização das células imunomarcadas pelos anticorpos anti-MMP-1, anti-MMP-2 e anti-MMP-9 em uma série de espécimes de gengivite induzida por placa e periodontite crônica.
4.2. POPULAÇÃO
A população deste trabalho consiste de espécimes de tecido gengival com diagnóstico clínico de doença periodontal registrados e emblocados em parafina, constantes nos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN.
4.3. AMOSTRA
Foram utilizados 26 espécimes de tecido gengival diagnosticados clinicamente como gengivite induzida por placa (13 casos) e periodontite crônica (13 casos).
