ROSARIA DI GANGI
―AÇÃO IN VITRO DO LASER HÉLIO-NEÔNIO SOBRE O FUNGO
PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS”
CAMPINAS 2012
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Imunopatologia do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da UNICAMP, Campinas, São Paulo, com apoio financeiro da FAPESP (Processos #2010/08485-5 e #2010/02239-2).
Aos meus pais,
Ignazio e Maria Lúcia,
Por toda luta, trabalho e amor constantes para nos dar sempre o melhor em tudo. E por me inspirarem a seguir carreira na área de Ciências Biológicas.
AGRADECIMENTOS
A minha família, Pai, Mãe, Jú e Dô, cães e gatos; fontes de inspiração e admiração, pelo carinho, apoio, motivação e momentos de paz e alegria. Pelas lições sobre valores e também pelas broncas, essenciais ao meu aprendizado! Sem isso, não seria quem hoje sou!
À Teh Federighi, amiga e companheira de quarto, quem admiro muito e tenho grande orgulho; por todo apoio, incentivo, paciência, confiança e pelos momentos de grande alegria.
À Carol Francelin, amiga e companheira de laboratório, por sua ajuda e paciência, fundamentais no desenvolvimento deste trabalho, tanto em experimentos como em dicas, conselhos, incentivos e sobre tudo na convivência alegre diária.
Ao curso de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular, área de concentração em Imunologia do Instituto de Biologia, UNICAMP por ter me recebido como aluna.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pela concessão da bolsa.
A minha orientadora Profª. Drª. Liana Maria Cardoso Verinaud, pela oportunidade e confiança concedidas, pelo incentivo e por toda dedicação empenhada na minha formação.
A minha co-orientadora Profª. Drª. Luciana Campos Paulino, pelo constante apoio, incentivo e pela orientação, importantes na minha formação.
Aos amigos do coração Mariella Eltink, Helena Fabbri, Thiago Mendes, Bruna Iglézias e Laís Ribeiro, por todos os nossos momentos de grandes alegrias, viagens, ensinamentos, conselhos, risadas, e apoio constantes.
Aos amigos Marcos Meneghetti e Thiago A. da Costa, por toda ajuda nos momentos sérios e descontraídos, pelas risadas, conversas sobre carros, futebol, motos, filmes, culinária, pelas risadas e convivência alegre diária.
À PhD. Georgia Porto, pela ajuda com alguns experimentos, pelo apoio e confiança em meu trabalho, pelos ensinamentos e descontrações.
À Profª. Drª Dagmar Ruth Stach Machado, pelo empréstimo de equipamentos para eletroforese de DNA e do biofreezer.
À Profª Drª Elza Costa Cruz Vasconcellos, pelo empréstimo do laser HeNe.
Aos docentes e funcionários do Departamento de Microbiologia e Imunologia – IB/UNICAMP, por me auxiliarem no aprimoramento das atividades acadêmicas e científicas.
Ao Prof. Dr. Aureo Tatsumi Yamada, pela ajuda com o processamento para microscopia eletrônica de transmissão e varredura, por me permitir utilizar seu laboratório e à Stephanie pelo apoio técnico. Ao Msc. Silvio Roberto Consonni, em especial, por me acompanhar no ultramicrótomo e microscópios de transmissão e varredura, dedicando seu tempo com empenho.
Às funcionárias do Laboratório de Microscopia Eletrônica, pelo auxílio na utilização dos equipamentos e predisposição a sempre ajudar.
Ao Prof. Dr. Ronei Luciano Mamoni e à Msc. Maria Carolina Ferreira por nos ceder os anticorpos para Western Blotting e pelo auxílio na revelação da membrana de Western blotting por quimioluminescência
Aos integrantes da Banca de qualificação, Prof. Dr. Marcelo Palma, Prof. Dr. Andres Yunes e Profª. Drª. Irma H. G. Rivera, pelo valioso apoio, conselhos e orientações.
Aos integrantes da Pré-banca, Prof. Dr. Ronei Luciano Mamoni e Profª. Drª. Clarice Weis Arns, pelos valorosos conselhos.
Aos integrantes da Banca, Prof. Dr. Edmilson R. Gonçalves e Profª. Drª Dagmar Ruth Stach Machado, pelos valiosos conselhos e apoio.
Resumo
Di Gangi, R. Ação in vitro do laser Hélio-Neônio sobre o fungo Paracoccidioides brasiliensis. 2012. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular – Imunologia) – Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, 2012.
A paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, cujo agente etiológico é o fungo
Paracoccidioides brasiliensis, acomete primariamente os pulmões e pode causar lesões secundárias na
pele e mucosas, que são extremamente dolorosas e de difícil tratamento por métodos convencionais com drogas anti-fúngicas. Estudos anteriores, conduzidos em nosso laboratório, usando modelos experimentais para PCM, mostraram a capacidade do laser HeNe em aumentar a produção de citocinas pró-inflamatórias e a síntese de fibras colágenas, reticulina e de elementos de matriz extracelular, como laminina e fibronectina. Estes eventos levaram a uma cicatrização tecidual mais rápida e eficaz das lesões. Além disso, as células fúngicas recuperados a partir das lesões após tratamento com laser mostrou nenhuma capacidade de crescimento, quando cultivadas in vitro. Neste trabalho foi avaliada a ação direta do laser HeNe sobre o fungo com o objetivo de fornecer suporte para o uso desta terapia durante a infecção PCM. Os resultados mostraram que o tratamento com laser de HeNe reduziu a capacidade de crescimento e a viabilidade de células fúngicas em 90% e 30%, respectivamente. Ademais, as células tratadas apresentaram núcleo mais eletrondenso, sugerindo que a irradiação com laser induz alterações ultra-estruturais que podem afetar a viabilidade e/ou a virulência do fungo. Entretanto, a patogenicidade do fungo não foi afetada, uma vez que nenhuma diferença foi observada no pulmão de animais infectados com o fungo tratado e não tratado. Além dos efeitos sobre a resposta inflamatória, acreditamos que o
laser de HeNe modifica, ou mesmo destrói, estruturas que são usadas pelo patógeno como mecanismos de
resistência. Certamente, esta atividade fungistática/fungicida do laser também desempenha um papel importante na aceleração da cicatrização de feridas e, deste modo, a terapia com o laser de HeNe pode ser considerada como um tratamento adjuvante na cura de lesões da pele observados durante PCM.
Abstract
Di Gangi, R. Effects of helium-neon (HeNe) laser on Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. 2012. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular – Imunologia) – Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, 2012.
Paracoccidioidomycosis (PMC), caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb), mainly affects the lungs and also causes painful lesions in the skin and mucous membranes that can remain active for months even after the beginning of antifungal treatment.
In this work, we evaluated the effects of laser treatment on fungal cells, aiming to provide support for the use of this therapy during PCM.
Pb yeast cells were exposed to laser for three consecutive days and then analyzed for growth
inhibition, viability, 43-kDa glycoprotein (gp43) expression, infectivity, and ultra-structural alterations.
HeNe laser treatment reduced the growth capacity and the viability of fungal cells, and increased gp43 expression. Laser-treated cells also showed pronounced structural alterations, since they were collapsed and presented deep folds. Additionally, remarkable changes were observed in the nucleus that presented a very electrondense form. The pathogenicity of P. brasiliensis after laser treatment was also evaluated, and no differences were observed in pulmonary lesions comparing animals infected with laser-treated and non-treated yeast cells.
Possibly HeNe laser is able to modify fungal structures involved in resistance and virulence mechanisms and therefore can be considered as an adjunctive therapy in the treatment of skin lesions observed during PCM.
Lista de Figuras
Figura 1. Gráfico representativo do número de colônias formadas ―in vitro‖ a partir de células obtidas de colônias não tratadas e tratadas com laser HeNe. Observa-se redução no número de UFCs formadas pelo fungo tratado pelo laser. Resultados expressos como número absoluto de UFC com, n=5. p<0,01.
Figura 2. Teste de viabilidade celular por coloração com azul de Trypan. Porcentagens obtidas antes do início do tratamento, e em placas não tratadas e tratadas com o laser. Resultados expressos como média ± EM com, n=5 de três experimentos independentes. *p < 0,05.
Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura de culturas de P. brasiliensis. (A) Células fúngicas sem tratamento pelo laser HeNe. (B) Células fúngicas coletadas após duas horas do tratamento como laser HeNe . (C) Células fúngicas coletadas após três dias do tratamento com o laser. Figura 4. Microscopia eletrônica de transmissão de uma célula de P. brasiliensis sem tratamento (A) e após tratamento pelo laser HeNe (B).Notar em (A) as características ultra estruturais gerais de uma levedura de P. brasiliensis e em (B) núcleo muito eletro denso. N – núcleo, V – vacúolo, M – mitocôndrias, MP – Membrana Plasmática, P – Parede Celular.
Figura 5. Microscopia eletrônica de transmissão de uma célula de P. brasiliensis sem tratamento (A) e após tratamento pelo laser HeNe (B). Notar em (A) o brotamento de uma levedura de P.
brasiliensis e seu núcleo e em (B) grande número de células mortas, com pouco ou ausente
conteúdo citoplasmático.
Figura 6. Western blotting para detecção do antígeno gp43 de CFA de culturas tratadas (T) e não tratadas (NT) de P. brasiliensis. PM, padrão de peso molecular.
Figura 7. Eletroforese de DNA extraído de culturas tratado (T) e não tratado (NT). P, padrão das bandas 25 a 700 pares de base.
Figura 8. Análise histopatológica de pulmão de animais inoculados com suspensão fúngica não tratada com o laser HeNe e sacrificada sete, quatorze e trinta dias após a infecção(A,C e E) e tratada com o laser HeNe e sacrificados sete, quatorze e trinta dias após a infecção (B, D e F). Figura 9. Análise histopatológica de pulmão de animais infectados com P. brasiliensis, sacrificados sete dias após infecção. (A e B) Inóculo de cultura não tratada. Notar presença de macrófagos recém-recrutados identificados por (*). (C-E) Inóculo de cultura tratada. Observa-se a presença de macrófagos epitelióides identificados por (*). As setas indicam células fúngicas encontradas no tecido. Aumento: 100x (A C); 400x (B e D); 1000x (E).
Figura 10. Análise histopatológica de pulmão de animais infectados com P. brasiliensis originados de culturas não tratadas com o laser HeNe e sacrificados quatorze dias após a infecção (A) Tecido pulmonar com infiltrado inflamatório. (B) Observa-se formação de granuloma com macrófagos, células gigantes e presença de células fúngicas; (C) granuloma em maior aumento. As setas indicam células fúngicas encontradas no tecido. Aumento: (A) 100x, (B) 400 e (C) 1000x.
Figura 11. Análise histopatológica de pulmão de animais inoculados com fungo após tratamento com o laser e sacrificados quatorze dias após a infecção. (A) Tecido pulmonar com infiltrado inflamatório. Aumento: 100x; (B e C) Observa-se a presença de macrófago vacuolizado representado por (*) e células fúngicas indicadas por setas. Aumento: 1000x.
Figura 12. Análise histopatológica de pulmão de animais sacrificados trinta dias após a infecção. (A e C) Tecido pulmonar com infiltrado inflamatório de inóculo de fungo não tratado. Aumento: 100x e 1000x; (B e D) Tecido pulmonar com infiltrado inflamatório de inóculo de fungo tratado. Aumento: 100x e 1000x.
Lista de Abreviaturas
BHI: do inglês Brain Heart Infusion BSA: Soro Albumina Bovino
cAMP: Monofosfato cíclico de Adenosina CFA: do ingles Cell-free Antigen
gp43: glicoproteína de 43 quilodalton HE: Hematoxilina e Eosina
HeNe: Hélio-Neônio IFN-γ: Interferon-gama IgG: Imunoglobulina G IL-17: Interleucina 17 IL1-β: Interleucina 1-beta
LBI: Laserterapia de Baixa Intensidade
MAP quinase: Proteína Quinase Ativada por Mitógeno Pb 192: Paracoccidioides brasiliensis isolado virulento 192 PBS: Solução Fostato/Salina Tamponada
PCM: Paracoccidioidomicose
SDS-PAGE: do inglês Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis TBS: Solução Tris/Salina Tamponada
TEMED: Tetrametiletilenodiamina TNF-α: Fator de Necrose Tumoral-alfa UFC: Unidade Formadora de Colônia
SUMÁRIO
RESUMO ...IX ABSTRACT ...XI LISTA DE FIGURAS ...XI LISTA DE ABREVIATURAS ... XII
INTRODUÇÃO... 15 OBJETIVOS ... 24 MATERIAIS E MÉTODOS ... 25 RESULTADOS ... 33 DISCUSSÃO ... 47 CONCLUSÃO... 52 REFERÊNCIAS ... 53 ANEXOS ... 61
1. Introdução
A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica crônica causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis e amplamente disseminada nos países da América Latina, sendo endêmica no Brasil, Argentina, Venezuela e Colômbia onde a infecção prevalece em populações carentes, principalmente de áreas rurais (Lacaz, 2002).
O estudo da paracocciodioidomicose no Brasil foi iniciado com Adolpho Lutz em 1908, seguido por Alfonso Splendore e Floriano Paulo de Almeida, os quais foram responsáveis pela denominação Paracoccidioiddes brasiliensis para o fungo causador desta doença. Lutz, em 1908, foi o primeiro a realizar o isolamento do Paracoccidioides brasiliensis utilizando ágar-Sabouraud, à temperatura ambiente (Lacaz, 2002).
Mesmo com pouco conhecimento sobre o hábitat natural do P. brasiliensis, acredita-se que este seja o reino vegetal e o solo; preferencialmente de lugares úmidos, ricos em matéria orgânica e nos quais a temperatura se mantenha constante (Lacaz, 2002).
Vários autores obtiveram dados que corroboram com esta hipótese, dentre eles, Bagagli e colegas (1998) que isolaram Paracoccidioides brasiliensis de tatus silvestres (Dazypus
novemcinctus), que vivem em contato com o solo e plantas, na zona rural de Botucatu, no Estado
de São Paulo. Nos tatus foram encontrados granulomas epitelióides contendo células de levedura similares às de Paracoccidioides brasiliensis confirmando a paracoccidioidomicose doença e não somente a infecção. Tatus silvestres infectados também foram encontrados em áreas não-endêmicas para paracoccidioidomicose, como Pará (Bagagli et al., 1998; Naiff et al., 1986).
O Paracoccidioides brasiliensis (Pb) sofre um complexo processo de transformação in
vivo devido à sua característica termodimórfica que consiste na apresentação de dois fenótipos, os
quais são determinados pela temperatura e o modo de crescimento saprofítico ou parasitário do fungo. À temperatura ambiente (25º), o fungo é encontrado na forma de estruturas filamentosas conhecidas como hifas ou micélio, principalmente no solo e na vegetação. Já à 37ºC, temperatura encontrada no trato respiratório do hospedeiro, e nas condições de cultura in vitro, o fungo cresce na forma de levedura, composta por células ovais com múltiplos brotamentos (Lacaz, et al., 1991). Concomitantemente com as mudanças morfológicas, observam-se alterações nas estruturas dos polímeros de carboidratos que fazem parte da composição da parede celular (Lavery et al., 1998; Toledo et al., 2011).
As mudanças morfológicas ocorridas na transição das formas do Pb são controladas por vias de sinalização intracelular com participação de proteína G, subunidades alfa e beta, as quais interagem com a adelinato ciclase (Chen, 2007). Três vias de sinalização são encontradas no Pb: MAP quinase, para integridade celular e de parede celular, reprodução e regulação osmótica; AMP cíclico, para regulação de desenvolvimento fúngico e virulência e,
cálcio-calmodulina-calcineurina, para controle de crescimento em altas temperaturas (Felipe, 2005). A via do AMP
cíclico é importante para manter a forma patogênica em levedura, pois o AMP cíclico exógeno inibe a transição da forma levedura para a forma de micélio (Borges-Walmsley, 2000).
À respeito das mudanças morfológicas na parede celular, há aumento no conteúdo de quitina e mudança conformacional de um polímero de glucana de β-1,3-glucana para α-1,3-glucana, o qual só está presente na parede celular de formas em levedura. Como nem quitina ou
glucana estão presentes nos mamíferos, estas, são utilizadas como alvos de agentes farmacológicos com ação antifúngica (San Blas, G & San Blas, F, 1993).
O P. brasiliensis infecta naturalmente as vias aéreas de um individuo que inala os propágulos fúngicos. Estes, uma vez nas vias aéreas superiores, migram e se instalam nos pulmões nos quais se desenvolvem em leveduras. Neste estágio, o fungo é capaz de viver no organismo parasitado por anos, caracterizando a infecção latente. Os sintomas clínicos da infecção ocorrem quando o fungo se dissemina, infectando outros órgãos, através da via linfática ou da corrente sanguínea, como o fígado, o baço, as glândulas adrenais, a pele e a mucosa, entre outros, formando lesões graves, que permanecem viáveis até mesmo após o tratamento com antifúngicos (Severo et al. 1979, revisto por Brummer et al., 1993). A partir do parasitismo de células epiteliais, o fungo é capaz de alcançar tecidos mais profundos agravando ainda mais o estado infeccioso. A presença do fungo em células epiteliais sugere fortemente o uso de receptores celulares ou ainda elementos de matriz extracelular das células do hospedeiro pelo fungo, favorecendo o reconhecimento celular e então a infecção do hospedeiro. O que é conhecido de fato, é que a capacidade de adesão do fungo às células do hospedeiro está diretamente ligada a sua capacidade de promover doença, ou seja, à virulência do P. brasiliensis. Seguindo este raciocínio, foi demonstrado que a cepa Pb18 apresenta-se mais virulenta em relação às outras cepas devido à presença de proteínas de membrana fúngica, a GP-43. Por ensaios in vitro foi demonstrado que a presença de anticorpos contra a GP-43 em cultura epitelial inibe a adesão do Pb à estas células, corroborando com a ideia de que existe um receptor específico para a infecção e sobrevida do Pb in vivo (Hanna; Silva; Giannini, 2000).
A glicoproteína de 43kDa, um dos antígenos do Paracoccidioides brasiliensis, é um importante marcador sorológico presente no soro de pacientes com infecção em atividade. Mendes-Giannini e colaboradores em 1990 demonstraram que a gp-43 desaparece do sangue circulante à medida que há evolução clínica mediante tratamento com medicação antifúngica.
A PCM acomete em sua maioria indivíduos do sexo masculino na quarta década de vida e que trabalham na agricultura (Restrepo, et al., 1997). Acredita-se que há essa prevalência no gênero masculino por provavelmente, nas mulheres, haver regulação hormonal do mecanismo de infecção; neste caso, o estrógeno não permite a transição da estrutura infectante para a forma de levedura (Restrepo, et al., 1984, Salazar, et al., 1988, Clemons, et al., 1989).
As lesões provocadas na pele são muito dolorosas, com aspecto de um pequeno edema avermelhado que progride até a formação de lesões ulcerativas, e que freqüentemente resultam em uma infecção bacteriana secundária. Histologicamente, observam-se granulomas frouxos, neutrofílicos e com muitos fungos, que mesmo após a cicatrização da lesão podem permanecer viáveis e, portanto, constituir novo foco da doença e/ou inflamação local crônica (Del Negro et
al.1982).
Nesta infecção fúngica o alvo dos tratamentos de rotina é o controle da disseminação do fungo pelo hospedeiro bem como o tratamento da micose. Tais ações se dão através do uso de potentes antifúngicos como Anfotericina B, Sulfonamida, Cetoconazol, Fluconazol e Itraconazol. Tendo conhecimento dos efeitos colaterais destes medicamentos, da lentidão para eliminar o patógeno e do fato de alguns fármacos apresentarem como alvo estruturas compartilhadas entre o fungo e humanos, médicos e cientistas vêm buscando novas terapias para reduzir o desconforto
provocado pela lesão, bem como para acelerar o processo de cicatrização da ferida. Outra dificuldade quanto ao uso desses medicamentos é o custo benefício, já que alguns órgãos de saúde pública no Brasil não fornecem financiamento adequado para o longo tratamento com azóis (Yasuda, 2005).
Nos últimos anos novas estratégias inócuas, isto é, que não causam agressões; têm sido estudadas no intuito de ser utilizadas como adjuvantes, ou ainda como terapia alternativa, para erradicação do patógeno e aceleração da cicatrização das lesões muco-cutâneas. Nesse sentido, os
lasers de baixa potência podem configurar-se como adjuvantes terapêuticos com propriedades
microbicidas e cicatrizantes, uma vez que têm se mostrado potentes aceleradores de processos de cicatrização no tratamento de lesões cutâneas, como as causadas pelo herpes (Jovanovic et al. 1998), e, experimentalmente, na cura de queimaduras. A terapia com lasers de baixa potência também pode ser aplicada para remodelação óssea pós-fratura, contribuindo para deposição de matriz óssea e formação de novos vasos sanguíneos (Garavello et al. 2004).
O comportamento de lasers como anteparos biológicos pode ser explicado pela primeira lei da fotoquímica, na qual a luz deve ser absorvida pelo tecido para que um efeito clínico aconteça; a luz transmitida ou refletida, ao contrário, não tem nenhum efeito. Para que as respostas ao uso de lasers aconteçam é necessária a presença de um cromóforo aceptor inicial de energia com espectro de absorção do comprimento de onda igual ao da fonte de emissão do laser. Assim, ao utilizar laser com comprimento de onda adequado para o tecido alvo ou cromóforo, somente a lesão será atingida preservando assim a integridade dos tecidos saudáveis vizinhos à lesão (Tanzi et al., 2003).
A laserterapia de baixa intensidade (LBI) faz com que células ou tecidos sejam expostos a baixos níveis de luz vermelha e de luz perto de infravermelha, e tem esse nome devido ao seu uso em intensidades de energia baixas quando comparadas a outras formas de laserterapia, usadas para ablação, corte e coagulação térmica do tecido. A LBI é também conhecida como laserterapia a frio, pois as potências utilizadas para este fim são menores do que aquelas necessárias para levar ao aquecimento do tecido (Chung et al., 2011).
A LBI, ou fotobiomodulação, passou a ser utilizada após a invenção do laser de rubi em 1960 e do laser de hélio-neônio (HeNe) em 1961. Endre Mester e colaboradores em 1967, ao irradiarem laser no dorso de camundongos que tiveram seus pelos raspados, notaram que os pelos puderam crescer mais rápido. Além, demonstraram que o laser pôde estimular a cicatrização tecidual em camundongos (Mester et al., 1971).
Atualmente, a laserterapia de baixa intensidade vem sendo usada em três principais propósitos: para reduzir inflamação, edema e desordens articulares crônicas (Bjordal, et al., 2003; Christie, et al., 2007; Jamtvedt, et al., 2008) para promover cicatrização de lesões, tecidos profundos e nervos (Gigo-Benato, et al., 2005; Posten, et al., 2005), e para tratar desordens neurológicas e dor (Chow, et al., 2009).
Apesar de a laserterapia ter várias aplicações, seu uso como terapia ainda é controverso por duas principais razões: primeira, ainda se tem poucos estudos referentes à seus mecanismos bioquímicos, alguns autores alegam que seu efeito seja totalmente empírico. Segunda, para cada tratamento um grande número de parâmetros deve ser padronizado como comprimento de onda, fluência, potência, característica da luz (pulsada ou não) e tempo da luz aplicada. Se este cuidado
não for tomado, uma má escolha resultará em efeito do tratamento reduzido ou negativo. Assim, muitas publicações que resultaram negativamente para laserterapia provavelmente tiveram seus parâmetros escolhidos inapropriadamente, como fonte de luz e dose. Cada aplicação tem uma dose de luz ótima, sendo que doses mais altas ou baixas podem não ter nenhum efeito terapêutico. A laserterapia de baixa intensidade é caracterizada por dose resposta bifásica, doses baixas de luz são frequentemente mais benéficas do que doses altas (Huang, et al., 2011; Pereira,
et al., 2002; Sommer, et al., 2001; Sutherland, et al., 2002).
Estudos in vitro mostraram que lasers de baixa energia induzem efeitos bio-estimulatórios em culturas de células e estimulam macrófagos a produzirem citocinas indutoras da proliferação de fibroblastos. Notou-se também, aumento de produção de pró-colágeno, colágeno, fatores de crescimento de fibroblastos e proliferação de fibroblastos após exposição à exposição à irradiação de laser de baixa energia. Além de serem fortes estimuladores da síntese de outros componentes da matriz extracelular como fibras elásticas (Yu et al., 2003; Pugliese et al., 2003).
Ainda, o tratamento com laser de baixa energia, como a irradiação por hélio/neônio (HeNe) vem demonstrando bons resultados devido à sua atividade não térmica e não prejudicial ao metabolismo celular. Também, a aplicação de laser tem-se mostrado satisfatória em lesões tegumentares por apresentarem propriedades microbicidas, analgésicas e cicatrizantes, além de se mostrarem potentes aceleradores de processos de cicatrização no tratamento de lesões cutâneas, sendo assim promissores no tratamento não invasivo à infecção por P.brasiliensis (Jovanovic et
Nosso laboratório vem estudando os efeitos do laser HeNe no tratamento de lesões cutâneas induzidas pela infecção por Pb. Estudos conduzidos por nosso grupo, demonstraram que o laser HeNe é capaz de acelerar a cicatrização de lesões mucosas provocadas pelo P.
brasiliensis. Este fenômeno parece estar diretamente relacionado com a modulação da produção
de citocinas como Interferon-gama (IFN-γ), Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e Interleucina-1 beta (IL1-β), além da produção de elementos da matriz extracelular, como colágeno, importantes para a remodelação tecidual (Ferreira et al., 2006). Verificou-se ainda que com o tratamento com
laser ocorre maior produção de proteína induzida por interferon gama (CXCL10), fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF), fibras colágenas e reticulina, moléculas as quais aceleram o processo de cicatrização tecidual. Observou-se menor produção de IL-1β e fator induzível por hipóxia (HIF) em animais tratados, verificando-se eficiência do laser na resposta inflamatória (Ferreira et al., 2009).
A análise da expressão gênica de citocinas pró- e anti-inflamatórias por PCR tempo real revelou queda nos níveis de IL-17, TNF-alfa e IL-10, em lesões de camundongos infectados por
Pb tratados com laser HeNe quando comparados com o grupo não tratado, evidenciando
cicatrização tecidual acelerada induzida pela ação do laser. Este padrão de queda na expressão citocinas inflamatórias indica fim do processo inflamatório. A ação do laser está associada a propriedades fotoquímicas e fotomecânicas capazes de estimular fatores biológicos essenciais para reparo tecidual acelerado. Dados do nosso grupo oferecem suporte a este já obtido, mostrando que as lesões de animais tratados com o laser HeNe apresentaram, uma queda na expressão gênica de quimiocinas inflamatórias e um aumento na deposição de fibronectina e laminina (Nagib et al., 2009). Estudos preliminares de nosso grupo também mostraram que o
laser HeNe é capaz de agir sobre o fungo, apresentando ação fungicida e/ou fungistática (Ferreira et al., 2006).
Assim, no presente projeto investigamos uma possível ação direta do laser HeNe sobre o
Paracoccidioides brasiliensis com o intuito de agregar novos subsídios à proposta de utilização
deste tipo de terapia como adjuvante no tratamento das lesões cutâneas observadas neste tipo de infecção.
2. Objetivos
Avaliar o efeito fungicida/fungistático in vitro do laser HeNe sobre o fungo P.
brasiliensis, analisando as possíveis alterações morfológicas, ultraestruturais e genéticas das
células fúngicas após tratamento.
Para tanto, as seguintes análises foram realizadas:
1. Inibição do crescimento in vitro;
2. Viabilidade do fungo;
3. Alterações estruturais e ultraestruturas;
4. Avaliação da integridade de DNA e expressão de proteínas, e
3. Materiais e Métodos
3.1 Fungo
Para a realização dos experimentos foi utilizado o isolado virulento de P. brasiliensis, denominado Pb18, gentilmente cedido pela Profª Drª Vera L. G. Calich do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (USP). O isolado tem sido mantido, em nosso laboratório, na fase levedura Y em meio de cultivo Fava Netto a 37ºC, sendo repicado a cada sete dias. Para manutenção da virulência da cepa, a cada seis meses, foi feita inoculação do fungo em animais resistentes, dos quais foram retirados fígado e baço. Posteriormente os orgãos foram semeados em meio sólido ágar BHI (do inglês, Brain Heart Infusion) suplementado com soro normal equino, fator de crescimento obtido de cultura de Pb 192 e gentamicina.
3.2Tratamento da cultura de Paracoccidioides brasiliensis com laser HeNe
As culturas de P. brasiliensis após sete dias de cultivo em placas de Petri e em meio Fava
Netto foram irradiadas no interior de fluxo laminar com laser HeNe de potência 3 J/cm2 durante
três dias consecutivos por 110 segundos.
3.3 Estudo da inibição do crescimento após tratamento com laser HeNe
Após três dias de tratamento, as colônias foram coletadas individualmente e ressuspensas em 1 ml de PBS, lavadas e contadas em câmara de Neubauer. Inóculos de concentrações variando de 103 a 107 foram plaqueados, incubados por sete dias a 37ºC, e as unidades formadoras de colônias (UFCs) foram contadas. O meio utilizado para o plaqueamento foi o meio sólido ágar BHI suplementado com 4% de soro fetal bovino e 5% de extrato de P.
brasiliensis. Para preparação do extrato, 5 mL de pellet de cultura, de 5 dias de crescimento,
foram transferidos para 45 mL de água destilada e autoclavados por 15 minutos a 121°C. O material foi deixado 3 dias em repouso. Após este período o material foi centrifugado a 1000 rpm a 4°C, por 15 minutos e o sobrenadante recolhido.
3.4 Teste de viabilidade celular
A solução de células obtida a partir das culturas do fungo tratadas e não tratadas com o laser HeNe (20μL) foi incubada com 20μL da solução do corante Azul de Trypan 0,2%. Logo
após, a proporção de células viáveis foi determinada por contagem em câmera de Neubauer. Por este método as células viáveis permanecem descoradas e as células mortas se coram em azul.
3.5 Alterações estruturais e ultraestruturais
3.5.1 Microscopia Eletrônica de Transmissão
As culturas fúngicas tratadas e não tratadas, ainda nas placas de Petri foram lavadas por três vezes em Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) 0,1M pH 7,4. Após, foram fixadas com solução fixadora composta por paraformaldeído 2% e glutaraldeído 1,5% em PBS 0,1M durante 12h à 4ºC. Foi procedida a lavagem do material, para isso foram feitas três lavagens de 15 minutos com PBS 0,1M pH 7,4. A partir das lavagens o material na placa de Petri foi recoberto com ágar Técnico 1,6%, após endurecimento, cortado em fragmentos, fixado novamente com a solução fixadora por 30 minutos, lavado três vezes de 15 minutos com PBS 0,1M pH 7,4 e pós-fixado com tetróxido de Ósmio 1%, PBS 0,1M pH 7,4 por 1h30min. Após tratamento com Ósmio os materiais foram lavados, PBS 0,1M pH 7,4 por quatro lavagens de 15
minutos. Prosseguida a lavagem foi feita desidratação dos materiais em bateria crescente de etanol prosseguida de bateria crescente de óxido de propileno com etanol (1:1 e 2:1) até óxido de propileno absoluto. Após, os fragmentos foram infiltrados em mistura óxido de propileno/Epon (1:1) por 1h em agitação e em Epon puro por 12h em agitação. Após polimerização em Epon por 72h foram feitos cortes semifinos para verificação de que o material está apto a ser cortado no micrótomo ultrafino. Os cortes ultrafinos foram contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo e visualizados em microscópio eletrônico LEO 906 do Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia da Unicamp. Todo o processamento dos materiais foi feito no Laboratório de Citoquímica e Imunocitoquímica do Departamento de Histologia e Embriologia, IB, Unicamp, sob a supervisão do Prof. Dr. Áureo T. Yamada.
3.5.2 Microscopia Eletrônica de Varredura
As placas de petri contendo as culturas irradiadas e não-irradiadas foram fixadas em
solução contendo paraformaldeído 2% e glutaraldeído 1,5%. O material foi deixado no fixador durante 12 horas, e em pós-fixadas com tetróxido de ósmio 1% diluído em água destilada durante 12 horas overnight. Após esta etapa os fragmentos foram lavados em PBS e subsequentemente cortados e desidratados em uma série de etanol. Primeiramente os fragmentos foram desidratados durante 30 minutos em concentrações crescentes de 70% a 90%, e finalmente desidratados por 3 vezes na concentração de 100% durante 15 minutos. Após essas desidratações os fragmentos
foram secos no aparelho de ponto crítico com CO2 líquido (Balzers CPD 030). Os espécimes
obtidos foram montados em suportes de alumínio (stubs), com a ajuda de uma fita de carbono colocada sobre uma película de papel alumínio, recobertos com ouro-paládio (Sputer Coater Balzers SCD 050), e observados em microscópio eletrônico de varredura JEOL 5800LV do
Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia da Unicamp, com aceleração de voltagem de 10Kv. Todo o processamento dos materiais foi feito no Laboratório de Citoquímica e Imunocitoquímica do Departamento de Histologia e Embriologia, IB, Unicamp, sob a supervisão do Prof. Dr. Áureo T. Yamada.
3.6 Avaliação da Integridade do DNA
3.6. 1. Eletroforese de DNA
Após o tratamento, o DNA genômico das culturas não tratada e tratada foi extraído pelo método do Fenol – Clorofórmio (Invitrogen), segundo as instruções do fabricante. A pureza das amostras foi determinada pela razão das absorbâncias com leitura a 260nm e 280nm em nanodrop. Em seguida, foi feita corrida eletroforética em gel de agarose 3% corado com brometo de etídeo a 100V por 40min em tamão TBE, constituído de Tris base, ácido bórico e EDTA. Após a eletroforese, o gel foi visualizado em transiluminador com luz ultravioleta.
3.7 Alterações na expressão de gp43
3.7.1 Preparo do CFA (do inglês, Cell Free Antigen)
A partir do cultivo de P. brasiliensis foram coletados 300 mg de peso úmido. A massa foi
ressuspendida em 1mL de PBS 0,15M pH7,4, misturada em Vortex e centrifugada a 10.000 x g por 60 segundos. O sobrenadante contendo os antígenos liberados (CFA) foi submetido à dosagem protéica pelo método de Bradford e depois foi usado nos ensaios de SDS-PAGE e
3.7.2 Bradford
Foi utilizado soro albumina bovina (BSA), em concentrações entre 1,6 e 0mg/mL, como solução padrão de proteínas. Alíquotas de 20μL da proteína pradrão e de amostras do CFA obtidas foram distribuídas em placas de poliestireno com 96 poços, seguida da adição de 200 μL
do reativo de Bradford. A ligação corante-proteínas será estimada pela mudança de coloração do corante através da leitura da absorbância em espectrofotômetro com filtro de 590nm. Os valores obtidos serão submetidos a regressão linear, utilizando o programa GrafhPad Prism 3.0, para a obtenção da curva padrão.
3.7.3 SDS-PAGE
O SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) foi realizado de acordo com o descrito na literatura (Laemmli, 1970). CFA obtido foi misturado com o tampão de amostra redutor por 10 minutos a 100ºC (1,25mL de Tris-HCl 0,5M, pH 6.8, 2mL de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 10%, 2,5mL de glicerol, 0,5mL de 2-mercaptoetanol, 0,2mL de azul de bromofenol e 3,55mL de água mili-Q). Os polipeptídeos foram separados por eletroforese em gel de SDS – poliacrilamida com 12,5% de concentração de acrilamida. O gel de separação foi preparado, contendo 8mL de acrilamida (30%), 0,2mL de SDS (10%), 5mL de Tris-HCl 1,5 M (pH 8.8), 6,8mL de água destilada, 0,2mL de persulfato de amônio (10%) e 16μL de TEMED.
Logo após a polimerização deste, o gel de empacotamento foi preparado, constituído de 1,36mL de poliacrilamida (30%), 0,08mL de SDS (10%), 2mL de Tris-HCl 0,5 M (pH 6.8), 4,6mL de água destilada, 0,1mL de persulfato de amônio (10%) e 10μL TEMED. Após a polimerização do
foi feita utilizando-se o tampão de corrida constituído de Tris (0,025 M), glicina (0,192 M) e SDS (0,1%), pH 8.3 em uma voltagem constante de 80 V, por aproximadamente 90 minutos.
3.7.4 Western Blotting
A técnica de immunobloting foi realizada conforme descrito por Towbin et al., 1979. Após a eletroforese em SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose por três horas a 40V em uma câmara de transferência. O tampão de transferência contém 25mM de Tris, 192mM de glicina e 20% de metanol, pH8,3. O bloqueio de antígenos livres foi feito com soro albumina bovina (BSA) a 1%, molico a 5% em tampão TBS Tween 20 0,01%, pH7,4, por 1h. A membrana foi incubada overnight à temperatura ambiente com pool de soro de pacientes com PCM diluído 1:500 em TBS-BSA 1%-Molico 5%, gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Ronei Luciano Mamoni da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp. A membrana foi lavada quatro vezes por 5 min em TBS-Tween 20 0,01% e incubada por duas horas, com anticorpo secundário de mouse anti-IgG de humano conjugado com peroxidase diluído 1:3000 em TBS-BSA 1%-Molico 5%. Para revelação e observação foram utilizados Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate e ImageQuant 350 TL, GE, respectivamente.
3.8 Estudo da infectividade do fungo
3.8.1 Animais
Camundongos machos, da linhagem C57BI/10, com 8 semanas de idade, foram obtidos
do CEMIB-UNICAMP a partir de colônias livres de patógenos específicos (SPF). Os animais foram mantidos, durante todo o período experimental, em micro isoladores acondicionados em
racks ventiladas, com água e ração estéreis, fornecidas em livre demanda, e com um ciclo de
foto-período de 12h/12h. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas propostas pela Sociedade Brasileira para Ciência de Animais de Laboratório (SBCAL) e aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Instituto de Biologia da Unicamp (CEUA/Unicamp), protocolo nº 2117-1.
3.8.2 Preparo do Inóculo e Infecção
Para o preparo da suspensão fúngica, a cepa de P. brasiliensis tratada e não tratada foi coletada. As células fúngicas foram ressuspensas em 5mL de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) estéril, 0,1M pH 7.4, agitadas em agitador tipo Vortex, em três ciclos de 30 segundos cada com intervalos de 60 segundos, a suspensão foi, novamente, ressuspensa em 10mL de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) estéril, 0,1M pH 7.4, centrifugada por 10 minutos a 280g e o pellet ressuspenso em 1mL de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) estéril, 0,1M pH 7.4. O número total de células fúngicas presentes na suspensão foi determinado por contagem em câmara de Neubauer, sendo a viabilidade determinada pela
coloração por azul de Trypan, e a suspensão final ajustada para 1x108 células/mL. Com seringa
de 1mL, 500μL de suspensão fúngica de cultura tratada ou não tratada foram inoculados por via
peritoneal.
3.8.3 Análise Histopatológica
Após 7 dias de infecção os animais foram anestesiados com os anestésicos Quetamina e Xilazina, sendo 80mg/kg e 10mg/kg, e sacrificados por deslocamento cervical. Os pulmões esquerdos foram retirados, fixados por 12h em paraformaldeído tamponado 4%, lavados em
Tampão Fosfato de Sódio 0,2M pH7,4, desidratados em gradiente de etanol e xilol, e incluídos em parafina histológica. Após a inclusão em parafina, o material foi submetido a microtomia
para obtenção de cortes finos (5 m) que foram então desparafinizados, hidratados em gradiente de álcool, corados por hematoxilina-eosina (HE) e fixados com resina tipo Permount. As micrografias foram obtidas no laboratório do Prof Áureo T. Yamada, Departamento de Histologia e Embriologia, IB, Unicamp.
3.9. Análise Estatística
A comparação entre os grupos tratados e não tratados foi realizada através do teste ANOVA e teste T Student pelo software GraphPad Prism. Resultados com valores de p≤0,05 e
4. Resultados
4.1 Estudo da inibição do crescimento fúngico após tratamento com laser
A reprodutibilidade das colônias tratadas com o laser HeNe foi avaliada por sua capacidade em formar colônias em meio sólido com alta eficiência de plaqueamento. O
plaqueamento de diferentes diluições com concentração inicial de 107 células/mL, obtidas a partir
de suspensão de culturas tratadas e não tratadas do fungo foi realizado, e após sete dias de crescimento em estufa à 37ºC foi feita a contagem das UFCs.
É possível observar diminuição significativa da capacidade de reprodução no plaqueamento de culturas tratadas com o laser quando comparada ao número de colônias formadas pelo fungo não tratado (Figura 1).
Figura 1: Gráfico representativo do número de colônias formadas ―in vitro‖ a partir de células obtidas de colônias não tratadas e tratadas com laser HeNe. Observa-se redução no número de UFCs formadas pelo fungo tratado pelo laser. Resultados expressos como número absoluto de UFC com, n=5. p<0,01.
**
**
Estes dados sugerem que as células de P. brasiliensis sofrem ação direta da irradiação pelo laser de HeNe evidenciadas na redução significativa na capacidade destas células formar novas colônia..
4.2 Teste de viabilidade
Para analisar a viabilidade das células irradiadas foi utilizado o corante azul de Trypan (Figura 2). O azul de Trypan cora células em azul as quais se encontram com sua membrana plasmática danificada, quando esta se encontra intacta as células permanecem descoradas.
É possível observar que, as células de colônia tratada apresentaram crescimento celular continuado após os três dias, enquanto que as células tratadas por três sessões de laser apresentaram redução significativa do número de células vivas quando comparadas ao grupo não tratado.
Diante dos resultados acima observados é possível inferir que o laser apresenta uma ação fungicida, alterando tanto a capacidade de plaqueamento das células quanto a sobrevida destas. A fim de avaliar a estrutura fúngica diante da irradiação, as colônias foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura e de transmissão.
Figura 2: Teste de viabilidade celular por coloração com azul de Trypan. Porcentagens obtidas antes do início do tratamento, e em placas não tratadas e tratadas com o laser. Resultados expressos como média ± EM com, n=5 de três experimentos independentes. *p < 0,05.
4.3 Alterações estruturais e ultra-estruturais 4.3.1 Microscopia Eletrônica de Varredura
Culturas tratadas e não tratadas de P. brasiliensis foram processadas para microscopia eletrônica de varredura. A Figura 3A apresenta o aspecto da cultura não tratada pelo laser HeNe, através da qual é possível de se observar total integridade estrutural das células que se apresentam alongadas e com brotamentos.
Nota-se mudança conformacional nas células de levedura analisadas duas horas após o tratamento (Figura 3B), quando se observa depressões em sua superfície. As alterações também são evidentes após três dias consecutivos de tratamento (Figura 3C).
Figure 3. Microscopia eletrônica de varredura de culturas de P. brasiliensis. (A) Células fúngicas sem tratamento pelo laser HeNe. (B) Células fúngicas coletadas após duas horas do tratamento como laser HeNe . (C) Células fúngicas coletadas após três dias do tratamento com o laser.
A B C A B C 10um A C 1um B 10um
4.3.2 Microscopia Eletrônica de Transmissão
Culturas tratadas e não tratadas de P. brasiliensis foram processadas para microscopia eletrônica de transmissão. A Figura 3A apresenta o aspecto de uma levedura de P. brasiliensis sem tratamento pelo laser HeNe. São observados parece celular, membrana plasmática, mitocôndrias em grande quantidade, vacúolo e núcleo.
A análise das imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou que apesar de se ter observado alteração na morfologia celular por MEV, constatou-se integridade da parede celular e membrana plasmática nas células tratadas (Figuras 4 e 5). O aspecto geral de uma levedura após tratamento com o laser pode ser observado pela Figura 4B. A parede celular e a membrana plasmática parecem estar preservadas. Após o tratamento, as células apresentaram um núcleo bem eletrondenso em comparação às células não tratadas indicando elevado grau de condensação de cromatina (Figura 4B), podendo-se supor que há lesões no DNA (Demicheli et
al., 2007). Houve um maior número de células mortas após o tratamento que se apresentaram
Figura 4. Microscopia eletrônica de transmissão de uma célula de P. brasiliensis sem tratamento (A) e após tratamento pelo laser HeNe (B).Notar em (A) as características ultra estruturais gerais de uma levedura de P. brasiliensis e em (B) núcleo muito eletro denso. N – núcleo, V – vacúolo, M – mitocôndrias, MP – Membrana Plasmática, P – Parede Celular.
Figura 5. Microscopia eletrônica de transmissão de uma célula de P. brasiliensis sem tratamento (A) e após tratamento pelo laser HeNe (B). Notar em (A) o brotamento de uma levedura de P.
brasiliensis e seu núcleo e em (B) grande número de células mortas, com pouco ou ausente
conteúdo citoplasmático. 10um N V P MP M N MP P M A B N 10um
4.4 Eletroforese de DNA
Um possível dano no DNA na amostra tratada com o laser foi sugerido, após corrida eletroforética em gel de agarose de DNA extraído de P. brasiliensis tratado e não tratado pelo
laser HeNe. A Figura 6 mostra o bandeamento entre os grupos não tratado e tratado.
Figura 6. Eletroforese de DNA extraído de culturas tratado (T) e não tratado (NT). P, padrão das bandas 25 a 700 pares de base. Gel 3% de agarose.
4.5 Avaliação da expressão de gp43.
4.5.1 Immunobloting para detecção do antígeno gp43.
Neste experimento foram utilizados soro de pacientes com paracoccidioidomicose como anticorpo primário, gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Ronei Luciano Mamoni. A Figura 7 mostra
que as leveduras irradiadas apresentam maior expressão da glicoproteína de 43kDa, um importante antígeno do P. brasiliensis. É possível pressupor que o tratamento com laser leva o fungo a aumentar expressão da gp43 como mecanismo de defesa, devido à agressão causada pelo tratamento com o laser. O padrão de peso molecular (BioRad Low Range Catalog 161-0305) utilizado neste experimento não é quimioluminescente e devido à isto, não pode ser observado da mesma forma que as amostras.
Figura 7. Western blotting para detecção do antígeno gp43 de CFA de culturas tratadas (T) e não tratadas (NT) de P. brasiliensis. PM, padrão de peso molecular.
4.6 Estudo da infectividade do fungo
5.6.1 Análise Histopatológica
sete, quatorze e trinta dias de infecção foram sacrificados e seus pulmões foram coletados e processados rotineiramente para histologia.
As células de P. brasiliensis inoculadas em camundongos C57Bl/10 após tratamento com
laser HeNe se mostraram capazes de produzir infecção já a partir de sete dias do inóculo com
presença de múltiplos focos de inflamação granulomatosa com células fúngicas. A celularidade foi predominantemente composta por componentes linfocitário e mononuclear em relação às células polimorfonucleares, uma vez que estes aparecem nos estágios inicias da doença, tanto no inóculo de cultura não tratada como de cultura tratada.
A partir de sete dias do inóculo com células não tratadas com o laser, o tecido pulmonar apresenta-se com grande infiltrado inflamatório sem presença de formação de granuloma ao se comparar com o grupo tratado. Esta diferença não é encontrada nos pulmões coletados quatorze e trinta dias após o inóculo, os quais apresentam padrão similar de inflamação, com formação de granulomas com células gigantes fagocitando as células fúngicas (Figura 8).
Em animais com sete dias de infecção (Figura 9 é possível evidenciar o predomínio de macrófagos jovens, provavelmente recém-recrutados, nos animais que receberam inóculo de fungos não tratados (Figura 9A e 9B), enquanto que nos animais que receberam inóculo de fungos tratados com o laser há presença de macrófagos epitelióides (Figura 9C, 9D e 9E).
Figura 8. Análise histopatológica de pulmão de animais inoculados com suspensão fúngica não tratada com o laser HeNe (painel esquerdo) e tratada com o laser HeNe (painel direito) e sacrificados aos sete (A e B), quatorze (C e D) e trinta dias (E e F) após a infecção. Nota-se maior infiltrado inflamatório na Figura A, o qual se apresenta com padrões similares aos quatorze e trinta dias após o inóculo. Aumento: 100x.
A B
C
F E
Figura 9: Análise histopatológica de pulmão de animais infectados com P. brasiliensis, sacrificados sete dias após infecção. (A e B) Inóculo de cultura não tratada. Notar presença de macrófagos recém-recrutados identificados por (*). (C-E) Inóculo de cultura tratada. Observa-se a presença de macrófagos epitelióides identificados por (*). As setas indicam células fúngicas encontradas no tecido. Aumento: 100x (A C); 400x (B e D); 1000x (E).
A B C
*
*
D EA Figura 10 mostra o tecido pulmonar de animais que receberam inóculo de cultura não tratada com o laser, após quatorze dias de infecção. Observa-se o tecido organizado para formação de granulomas, composto por macrófagos maduros, células epitelióides e células gigantes. Também é sugestiva a mobilização monocitária na periferia, provavelmente na tentativa de impedir a disseminação das células fúngicas.
Figura 10. Análise histopatológica de pulmão de animais infectados com P. brasiliensis originados de culturas não tratadas com o laser HeNe e sacrificados quatorze dias após a infecção (A) Tecido pulmonar com infiltrado inflamatório. (B) Observa-se formação de granuloma com macrófagos, células gigantes e presença de células fúngicas; (C) granuloma em maior aumento. As setas indicam células fúngicas encontradas no tecido. Aumento: (A) 100x, (B) 400 e (C) 1000x.
A
B
A Figura 11 mostra o tecido pulmonar de animais inoculados com cultura de fungos tratada com o laser, após 14 dias de infecção. Não é possível evidenciar alterações em relação às micrografias de sete dias, porém observam-se macrófagos vacuolizados e células gigantes multinucleadas com fungos fagocitados (Figura 11B e 11C).
Figura 11. Análise histopatológica de pulmão de animais inoculados com fungo após tratamento com o laser e sacrificados quatorze dias após a infecção. (A) Tecido pulmonar com infiltrado inflamatório. Aumento: 100x; (B e C) Observa-se a presença de macrófago vacuolizado representado por (*) e células fúngicas indicadas por setas. Aumento: 1000x.
A
B
C
Na figura 12 são apresentadas micrografias de pulmões retirados de animais que receberam inóculo de culturas não tratadas e tratadas pelo laser HeNe, e que foram sacrificados trinta dias após a inoculação. Observa-se que o tecido pulmonar está bastante infiltrado (Figura 12 A e B), com grande número de células fúngicas no granuloma, com presença de células gigantes, células fúngicas fagocitadas e mobilização monocitária na periferia (Figura 12 C e D).
Figura 12. Análise histopatológica de pulmão de animais sacrificados trinta dias após a infecção.
(A e C) Tecido pulmonar com infiltrado inflamatório de inóculo de fungo não tratado. Aumento: 100x e 1000x; (B e D) Tecido pulmonar com infiltrado inflamatório de inóculo de fungo tratado. Aumento: 100x e 1000x.
A B
5. Discussão
A paracoccidioidomicose é uma micose comum no Brasil e em algumas outras áreas endêmicas da América Latina (Lacaz, 2002). Os pulmões são os primeiros órgãos a serem infectados, por causa da inalação de propágulos infectantes, mas a disseminação, através da corrente sanguínea e linfática, para outros órgãos é frequentemente observada. A pele e mucosas podem ser também afetadas levando ao aparecimento de lesões sensíveis e extremamente dolorosas que causam grande desconforto ao paciente. Além disso, estas lesões podem progredir para feridas ulcerativas que predispõem o indivíduo a infecções secundárias (Severo et al. 1979, revisto por Brummer et al., 1993).
Atualmente, o tratamento da PCM está baseado no uso oral de anti-fúngicos, principalmente o itraconazol, o fluconazol e o cetoconazol. Esta terapia, entretanto, é de longa duração e acarreta sérios efeitos colaterais ao paciente. Ademais, sua eficácia tem sido questionada (Yasuda, 2005). Assim, a busca por tratamentos alternativos e/ou complementares, que possam minimizar o desconforto causado pela infecção e pelo tratamento convencional, tem se intensificado nos últimos anos.
Nesse sentido, a terapia com lasers de baixa intensidade tem despertado grande interesse devido às suas propriedades microbicidas e cicatrizantes, além de não causarem desconforto e efeitos colaterais. Embora o mecanismo exato de ação dos lasers de baixa intensidade não seja totalmente conhecido, é sabido que ele é capaz de acelerar a cicatrização e o processo inflamatório, providenciando alivio da dor, através da estimulação de eventos celulares (Christie,
et al., 2007; Jamtvedt, et al., 2008; Gigo-Benato, et al., 2005; Posten, et al., 2005; Chow, et al., 2009).
O uso do laser HeNe em lesões cutâneas causadas por P.brasiliensis vem sendo estudado já há algum tempo por nosso grupo, e resultados importantes relacionados com diminuição da inflamação e, da área lesionada, bem como aceleração do processo de cicatrização tecidual (Ferreira et al., 2006 e 2009; Nagib et al., 2010).
Com o objetivo de complementar estes dados, o tratamento com laser HeNe diretamente na cultura de células fúngicas foi, então, proposto.
O tratamento com laser HeNe mostrou-se capaz de inibir o crescimento do fungo e reduzir sua viabilidade. A literatura mostra que o uso de laser de baixa intensidade com finalidade microbicida vem trazendo resultados positivos. Nussbaum et al (2002), relatam que a irradiação de bactérias Pseudomonas aeruginosa, com comprimento de onda de 810nm e fluência
de 5 J/cm2, leva à diminuição de seu crescimento Resultados semelhantes também foram obtidos
com Escherichia coli e Psedomonas aeruginosa quando os autores utilizaram irradiação com
comprimento de onda de 630nm e fluência de 1 J/cm2. Estes mesmos autores, entretanto,
observaram que a irradiação com comprimento de onda de 810nm em Escherichia coli levava ao aumento significativo na taxa de proliferação.
Pacientes com estomatite causada por infecção com Candida albicans e portadores de
dentadura tiveram seus palatos e dentaduras tratados com laser diodo com fluência de 3 J/cm2 e
No entanto, muitos pesquisadores alegam que microrganismos não são afetados pela irradiação produzida por lasers de baixa potência (Sarkar, S. & Wilson, M., 1993). Para estes autores, as células deveriam primeiramente ser sensibilizadas quimicamente por corantes, como azul de metileno, os quais seriam capazes então de absorver a luz no comprimento de onda produzido pelo laser e então produzir um estado de excitação celular. Essa terapia é chamada de terapia fotodinâmica. A energia transferida para as moléculas vizinhas resulta na formação de espécies reativas de oxigênio, como moléculas de oxigênio, íons superóxido, hidroxilas e outros radicais que podem danificar e por fim destruir a célula (Dobson, J & Wilson, M., 1992).
Vários autores analisaram os efeitos da terapia fotodinânimca em Candida albicans tanto
in vitro quanto in vivo com resultados positivos para o tratamento com corante sensibilizador
associado a um diodo emissor de luz, como arsenieto de gálio e alumínio (Teichert et al., 2002; Munin et al., 2007, Souza et al., 2006).
Porém, tanto na laserterapia como na terapia fotodinâmica é necessário o estabelecimento de protocolos viáveis de acordo com o microrganismo estudado, quanto à dose, potência, tempo, comprimento de onda e concentração do sensibilizador, no caso da terapia fotodinâmica, para que se obtenham resultados favoráveis (Sommer, et al,. 2001).
A irradiação de células fúngicas de diversos gêneros com laser pode resultar em significativas alterações citoplasmáticas, relatadas em poucas publicações, as quais descrevem efeitos ultraestruturais da irradiação em células fúngicas de diversos gêneros. Dentre elas, aumento da mitocôndria (Aist & Berns, 1981), degeneração da mitocondria (Miessel et al., 1966), alterações na membrana citoplasmática (Pachev et al., 1966), vacuolização do citoplasma
(Miessel et al., 1966) e distorção do vacúolo (Koehler, 1961). Em relação ao núcleo, a irradiação de P. brasiliensis por raios gama, resultou em danos na cromatina e núcleo apoptótico (Demicheli
et al., 2007). Já na irradiação de Fusarium solani com laser de comprimento de onda 532nm,
apesar dos efeitos em organelas citoplasmáticas, o núcleo mostrou-se capaz de continuar em divisão mitótica e o crescimento e multiplicação celular ficaram inalterados (Aist & Berns, 1981).
Nossos resultados mostram alteração morfológica das células fúngicas tratadas pelo laser HeNe, dado que, similarmente, também foi encontrado por Demicheli et al., 2007 com radioatenuação de cultura de P. brasiliensis por raios gama. Entretanto, o tratamento pelo laser não foi capaz de causar danos na parede celular e membrana plasmática das células fúngicas quando nossas amostras tratadas foram analisadas por microscopia eletrônica de transmissão. Entretanto, foi possível a observação de um maior número de células mortas e de danos ao núcleo da célula fúngica.
Mesmo com a diferença obtida em nível nuclear por microscopia eletrônica de transmissão nas células fúngicas tratadas pelo laser, somente a análise por eletroforese das amostras de DNA extraídas de P. brasiliensis tratado e não tratado, não nos dá suporte para afirmar se houve ou não danos no DNA. No P. brasiliensis é provável que haja um mecanismo eficiente de reparo de DNA de possíveis danos causados pela exposição ao laser.
Nossos resultados também mostram que o tratamento com o laser HeNe não inibiu a expressão da glicoproteína gp43, o principal antígeno conhecido do P. brasiliensis (Travassos et
al., 2003). Pelo contrário, observou-se aumento na expressão desta molécula, possivelmente
moléculas presentes na superfície celular do P. brasiliensis e receptores homólogos na membrana celular de macrófagos modulam a fagocitose (Gordon, et al., 1988; Ohman et al., 1988). Almeida e colaboradores demonstraram o envolvimento do receptor de manose na modulação da endocitose de P. brasiliensis por macrófagos, assim como da gp43, um importante antígeno sorológico de pacientes com a micose em atividade, no processo de endocitose do fungo por macrófagos (Almeida et al., 1998). De acordo com os resultados obtidos por Popi e colaboradores, também estudando a fagocitose de P. brasiliensis, a gp43 está envolvida no mecanismo de evasão do fungo o que facilitaria sua permanência no hospedeiro em infecções primárias (Popi, et al. 2002).
De fato, os resultados in vivo obtidos neste trabalho mostram que o infiltrado inflamatório no tecido pulmonar e a presença de células fúngicas eram similares tanto nos animais que receberam fungo tratado como naqueles que receberam o fungo não tratado com o laser.
Assim, nossos resultados apontam que o laser HeNe é capaz de agir diretamente sobre o fungo, visto que há diminuição de sua viabilidade e de seu crescimento, mas não é capaz de induzir perda de sua infectividade, uma vez que o fungo foi capaz de estabelecer a infecção eficaz
in vivo. O aumento na expressão do antígeno imuno-dominante do fungo, a gp43, é um forte
indicativo da manutenção de sua virulência. Neste sentido, certamente, o tratamento do Pb com o laser HeNe não deve ser considerado para o desenvolvimento de uma vacina. Entretanto, se levarmos em consideração os dados in vivo obtidos anteriormente em nosso laboratório demonstrando uma ação do laser também sobre células do sistema imune, principalmente macrófagos, com aceleração do processo de cicatrização tecidual e melhora clínica da lesão, é
bastante plausível a consideração da terapia com o laser HeNe como uma estratégia benéfica a ser utilizada como adjuvante no tratamento de lesões cutâneas paracoccidioidomicóticas.
6. Conclusão
Diante dos resultados apresentados neste trabalho é possível concluir que o tratamento com o laser HeNe exerce uma ação direta sobre o fungo. Tal ação pôde ser verificada pela diminuição da viabilidade e do crescimento das células fúngicas, e pelas alterações ultraestruturas induzidas tanto na membrana plasmática do fungo como em estruturas citoplasmáticas. O aumento na expressão da gp43, entretanto, é forte indicativo da manutenção da virulência das células fúngicas, o que, certamente, afasta a possibilidade de desenvolvimento de uma vacina através do tratamento das células fúngicas com o laser HeNe. Por outro lado, se tomarmos os resultados obtidos neste trabalho em conjunto com os dados obtidos anteriormente, através do tratamento in vivo das lesões paracoccidioidomicóticas com o laser, é possível considerar esta terapia, em associação com a terapia anti-fúngica convencional, para alívio da dor e desconforto dos pacientes.
7. Referências
Aist, J.R. and Berns, M. W. Mechanics of Chromosome Separation during Mitosis in Fusarium (Fungi imperfecti): New Evidence from Ultrastructural and Laser Microbeam Experiments.
The Journal Of Cell Biology, v. 91 p. 446-458, 1981.
Bagagli, E. et al. Isolation of Paracoccidioides brasiliensis from armadillos (Dasypus
noveminctus) captured in an endemic area of paracoccidioidomycosis. American Journal of Tropical Medicine and Hygene, v. 58, n. 4, p. 505–512, 1998.
Brummer, E.; Castaneda, E.; Restrepo, A. Paracoccidioidomycosis: an update. Clinical
Microbiology Reviews, v. 6, n. 2, p. 89-117, 1993.
Bjordal, J. M., C. Couppe, R. T. Chow, J. Tuner, and E. A. Ljunggren. A systematic review of low level laser therapy with location-specific doses for pain from chronic joint disorders.
Aust. J. Physiother. v. 49 n. 107, p. 116, 2003.
Borges-Walmsley, M. I.; Chen, D.; Shu, X.; Walmsley, A. R. The pathology of Paracoccidioides
brasiliensis. Trends in Microbiology Reviews, London, UK, v.10 n. 2, p. 80-87, 2002.
Borges-Walmsley, M. I.; Walmsley, A. R. cAMP signaling in pathogenic fungi: control of dimorphic switchin and pathogenicity. Trends in Microbiology, v. 8, n.3, p. 133-141, 2000.
