Bioquímicadoenvelhecimento

BIOQUÍMICA DO ENVELHECIMENTO

QBQ 2001

Departamento de Bioquímica, Instituto de Química - USP

Professores

Daniela Carvalho Gonzalez (danielagonzalez@zipmail.com.br)

Daniela Gerevini Pereira (danisol@yahoo.com)

David Domingues Pavanelli (pavadd@iq.usp.br)

Eliane Virgínia Esteves da Silva (eli-esteves@hotmail.com)

Fabiana Maria de Almeida (fmeida@usp.br)

Fábio Siviero (fsiviero@iq.usp.br)

Luciana Maria Guimarães (luciana.guimaraes@poli.usp.br.)

Luis Fernando Pacheco Otalora (lotalora@iq.usp.br)

Michelle Fernanda Susin (mfsusin@iq.usp.br)

Renato Sant’Anna Filho (rsfilho@mail.ufv.br)

Ricardo De Marco (rdemarco@iq.usp.br)

Supervisores

Bayardo B. Torres (bayardo@iq.usp.br)

Denise V. de Macedo (labex@unicamp.br)

Eneida de Paula (depaula@unicamp.br)

Prof. Convidado

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Horário e Programa

Dia Horário Programa

9 h _{Teorias do Envelhecimento} Apresentação 12

14 h Análise das Teorias _{Radicais livres}

9 h Radicais livres

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14 h Reparo de DNA

9 h _{Telômeros e telomerase} Reparo de DNA 14 14 h Telômeros e telomerase 9 h Telomerase 15 14 h DNA mitocondrial 9 h Apoptose 16

Envelhecimento

De maneira geral, um organismo responde ativamente aos estímulos de seu meio adaptando-se rapidamente às novas circunstâncias. Os componentes fundamentais das células, como o DNA, as proteínas e os lipídios são protegidos para que todo o funcionamento seja garantido.

Danos moderados são tolerados: porém, quando provocam modificações severas em proteínas (oxidação é a forma mais comum de alteração), estas são degradadas e eliminadas, evitando que seu acúmulo provoque disfunção celular e até mesmo uma patologia. As mesmas disfunções teciduais podem ser evitadas quando os lipídios e o DNA são protegidos pelas defesas do organismo. No caso do DNA, alterações de bases são corrigidas, porque sua alteração desapercebida poderia implicar na produção de proteínas alteradas, oriundas da própria célula.

Quando esses processos fisiológicos entram em declínio, não necessariamente todos ao mesmo tempo, tem-se o início do envelhecimento. Embora seja difícil definir com precisão, a redução da eficiência do funcionamento do organismo após a fase reprodutiva tem sido definida como envelhecimento. Isto ocorre em todos os organismos multicelulares. Em adição, a habilidade do organismo de recuperar-se de uma agressão também diminui com a idade.

No fenômeno do envelhecimento, é necessário diferenciar o envelhecimento fisiológico do patológico. No primeiro caso, trata-se de alterações sincronizadas de todos os órgãos e tecidos; no segundo, de uma disposição para a insuficiência, fortemente ressaltada, de um órgão ou sistema. Porém, nos estudos de envelhecimento é muito comum a dificuldade de separar o envelhecimento das doenças relacionadas com a idade. De fato, às vezes, torna-se impossível.

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Alguns sinais externos são característicos do envelhecimento: Diminuição da altura;

Diminuição da mobilidade da coluna; Atrofia dos aparelhos locomotores; Alterações da pele;

Embranquecimento e queda de cabelo;

Diminuição contínua da capacidade funcional de órgãos dos sentidos

Embora, para os humanos, a expectativa de vida seja em torno de 115-120 anos, poucos são os indivíduos que atingem esta idade. Isto porque, atualmente, na maioria dos países, as pessoas são acometidas de doenças infecciosas e estão sujeitas à nutrição inadequada. Já nas sociedades ocidentais, as mortes prematuras são conseqüências de acidentes, sendo que a AIDS e o suicídio tornaram-se eventos bastante comuns. Em contraste, pessoas mais velhas, freqüentemente, morrem de câncer ou doenças cardiovasculares.

Em função, destas observações algumas questões foram levantadas:

Por que a expectativa máxima de vida do indivíduo não é geralmente atingida? Por que essa expectativa de vida pode ser alterada pelo ambiente? (Por exemplo: como a redução de temperatura de 30 para 10ºC pode aumentar a expectativa de vida de Drosophila de 14 para 120 dias?)

Como a restrição calórica (definida como ingestão uma dieta contendo 30-40% menos de calorias do que as ingeridas por animais alimentados ad libitum) aumenta a expectativa de vida?

Atualmente, a teoria genética do envelhecimento e a teoria de acúmulo de danos tentam dar explicações para essas questões.

A teoria genética do envelhecimento assume que esse fenômeno é uma continuação do processo de desenvolvimento e diferenciação, e é uma seqüência de eventos codificados pelo genoma. Em organismos como Drosophila, levedura, Neurospora crassa (fungo) e Caenorhabditis elegans (nematódio), tem sido descrita a presença de genes que regulam a expectativa de vida. Em adição, a redução da temperatura tem modulado uma ampla variedade desses genes. Neste mesmo nível, a restrição calórica tem reduzido a expressão de oncogenes, a velocidade de mutação e transformação, bem como conservado o potencial replicativo, todos esses fenômenos ligados à mudança de expressão de genes. Outro aspecto dessa teoria considera o encurtamento do telômero como o relógio molecular que dispara o processo de envelhecimento. Telômeros são estruturas encontradas no final dos cromossomos de células eucarióticas e sua presença permite a completa replicação do DNA cromossomal, além de proteger o final do cromossomo de danos. A enzima responsável pela geração dessas estruturas é a telomerase. Assim, grande atenção tem sido dada a essa enzima, uma vez que sua presença em células tumorais tem sido relacionada à inadequada replicação e crescimento das células.

A teoria de acúmulo de danos focaliza a explicação para o envelhecimento no acúmulo progressivo de danos, em função do reparo e manutenção serem menores do que os necessários para a sobrevivência indefinida. O erro de síntese e/ou a falha no reparo ou degradação de moléculas defeituosas seriam então os grandes responsáveis pela perda progressiva da função. Uma das teorias mais populares, erro-catástrofe, introduzida em 1963, sugeria que os erros na transcrição do RNA e sua tradução em proteína seriam responsáveis pelo acúmulo de proteínas alteradas não funcionais. Com a idade e com a elevada ocorrência, gerariam uma catástrofe de erros cuja conseqüência seria a perda completa da função. Atualmente, sabe-se que esta catástrofe não é apresentada com tamanha intensidade, mas que a idade traz consigo a redução da fidelidade de transcrição e

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A teoria dos radicais livres foi introduzida pela primeira vez em 1956 e propunha que o envelhecimento normal seria o resultado de danos aleatórios de tecidos por radicais livres. A mitocôndria foi apontada como geradora de radicais livres, bem como alvo de danos. Esta teoria serviu, então, de elo de ligação entre as correntes que associavam o envelhecimento às alterações codificadas pelo próprio genoma e aquelas relacionadas ao acúmulo de danos. Erros em proteínas, danos na membrana, falhas de reparo, bem como genes determinantes da longevidade poderiam direta ou indiretamente ser afetados pelo estresse oxidativo - situação em que ocorre um sério desequilíbrio entre a produção de EROs/ERNs (Espécies Reativas de Oxigênio/Espécies Reativas de Nitrogênio) e a defesa oxidante.

Quando mais nada pode ser feito para reparar a célula e mantê-la funcionando, a opção é iniciar o processo de morte celular, que pode ser de dois tipos: necrose ou apoptose (morte celular programada). Esta última pode estar associada tanto ao processo de desenvolvimento (evento fisiológico normal) como à lesão celular (eliminação silenciosa da célula). Ambos os tipos de morte podem estar relacionados com certas patologias.

Os radicais livres causam o envelhecimento? Ainda é um pouco cedo para responder, mas com o tempo ...

Atividade 1: Teorias de Envelhecimento

Completar o esquema com as palavras abaixo:

Radicais livres DNA mitocondrial e nuclear Telômeros Dano

Envelhecimento

Estresse oxidativo Disfunção tecidual Morte Necrose

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Atividade 2: Bioquímica do Envelhecimento

Atividade 3: Software Radicais Livres.

Responder ao questionário abaixo:

1- Relacione os principais mecanismos de produção de radicais livres com seu local de ocorrência:

Mecanismos de produção:

a) xantina desidrogenase/oxidase b) NADPH citocromo P450 redutase c) cadeia de transporte de elétrons

Locais de ocorrência:

( ) Membrana plasmática de células fagocíticas e mitocondriais ( ) Retículo endoplasmático de hepatócitos

( ) Endotélio de capilares da maioria dos tecidos

2- Quais os fatores que atualmente são conhecidos por potencializar a produção de radicais livres?

3- Complete as afirmações:

a) O __________________________ é toda espécie química com um elétron desemparelhado.

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b) A tendência de completar o orbital à custa de um elétron “retirado” de outras moléculas é responsável pela _______________________ do radical livre.

c) Elétrons que escapam da cadeia de transporte podem ser capturados por moléculas de ______________________ circulantes. Assim origina-se o ânion ____________________ que é um poderoso radical livre.

d) O radical _____________________ ( OH) constitui uma das espécies mais reativas conhecidas.

e) Os íons ____________ e _____________ são as principais fontes de formação de radicais hidroxila.

4- Assinale falso (F) ou verdadeiro (V):

( ) Reação em cadeia entre radicais livres provocam lesões celulares. ( ) Permeabilidade e capacidade de transporte de membranas não são

alteradas pelos radicais.

( ) À medida que a célula envelhece, o acúmulo de lesões genômicas não reparadas, aumenta a probabilidade de desenvolvimento de câncer.

( ) Radicais livres têm como única função destruir as células do próprio organismo onde foram produzidos.

( ) Antioxidantes destroem os radicais livres.

( ) Vitamina E pode ser encontrada em frutas em geral enquanto que vitamina C em peixe e frango.

Atividade 4 : Radicais Livres

Os tópicos seguintes abordam a ação de radicais livres sobre diferentes compostos no nosso organismo. Teremos 5 tópicos: (1) Peroxidação lipídica, (2) Outros oxidantes, (3) Efeitos pró-oxidantes de vitamina C e E, (4) Oxidação de proteínas e (5) Oxidação de DNA.

4.1-Peroxidação lipídica

É o processo de deterioração oxidativa de lipídios polinsaturados (PUFAs). O processo de lipoperoxidação tem sido associado a diversos mecanismos celulares que podem acarretar câncer, doenças cardíacas, inflamação e envelhecimento.

Os maiores constituintes das membranas são os lipídios e as proteínas. Danos nos PUFAs tendem a diminuir a fluidez das membranas que é essencial como propriedade funcional. A seletividade para entrada e saída de compostos também fica comprometida, em função da abertura de “buracos” na membrana.

O colesterol é uma substância gordurosa, esbranquiçada e sem odor. Ele não pode ser visto nem percebido no sabor dos alimentos. Existem dois tipos principais de lipoproteínas transportadoras de colesterol: o LDL e o HDL. Em pequenas quantidades, o colesterol é necessário para algumas funções do organismo; em excesso, causa problemas.

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O colesterol e os ésteres de colesterol são os principais lipídios depositados na parede interna das artérias, formando placas conhecidas como ateromas, tipicamente encontradas no processo de aterosclerose. Estas lesões podem levar ao estreitamento de artérias, desencadear a formação de coágulos e levar à oclusão. O bloqueio da irrigação do tecido pode levar à morte, devido à redução do aporte de oxigênio e conseqüente dificuldade para a produção de energia. A aterosclerose é a principal causa de morte nos países desenvolvidos, sendo que o endurecimento das artérias inicia-se, em média, aos 25 anos de idade.

O progresso da aterosclerose é responsável por uma série de doenças graves: 1. Ataque cardíaco (infarto): Ocorre quando a obstrução de uma artéria coronária

leva à morte parte do músculo do coração. Pode ser fatal.

2. Angina: É uma dor intensa no peito que se manifesta, mais freqüentemente, durante esforços físicos. Pode limitar seriamente as atividades do indivíduo, mas pode também alertá-lo sobre um possível avanço da aterosclerose.

3. Derrame: (Acidente Vascular Cerebral) A aterosclerose pode afetar também as artérias do cérebro. O derrame é causado pela obstrução de uma delas, provocando morte ou incapacidade física.

Embora a origem da aterosclerose não esteja bem definida, tem sido associada ao dano do endotélio vascular por infecções virais, danos mecânicos, elevados níveis de metabólitos normais. Nesse processo, os monócitos da circulação desenvolvem-se em macrófagos e podem atacar as células vizinhas por excreção de O2-• (demonstrado pela presença de xantina oxidase em lesões ateroscleróticas), H2O2, enzimas hidrolíticas e, possivelmente, NO. Espécies reativas de oxigênio possuem um papel importante no desenvolvimento ou, algumas vezes, no início da aterosclerose através de:

2. Ativação de macrófagos e seus monócitos precursores, podendo gerar mais EROs/ERNs (Espécies Reativas de Oxigênio/Espécies Reativas de Nitrogênio) nos vasos.

3. Modificação dos receptores de LDL sobre o macrófago na lipoperoxidação. 4. Peroxidase LDL que pode causar danos nas células endoteliais.

5. Produtos de oxidação LDL podem promover a calcificação em lesões avançadas e podem ser pró-coagulantes.

Paulo, 50 anos, sedentário. Basicamente não dispensava uma bela feijoada nos finais de semana acompanhada de, no mínimo, 3 horas de sono. Digamos que estava um pouquinho acima do seu peso ideal, algo como 130 Kg contidos nos seus 1,70 m. Filhos de pais um tanto quanto gordinhos, obesidade sempre foi marca em sua vida. Um belo dia acordou queixando-se de dores no braço esquerdo. Embora resistente, deu entrada no Hospital e foi diagnosticada angina pectoris. Exames mais detalhados demonstraram espessamento das veias cardíacas.

Qual processo está sendo descrito neste caso? O que poderia ser feito de forma preventiva para evitar este quadro?

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4.2-Sistemas de defesa antioxidante

A célula tem várias formas de defender-se das EROs. Há muito se conhece a enzima catalase, que funciona como catalisador da decomposição ou dismutação do peróxido de hidrogênio:

2 H2O2 2 H2O + O2

É a presença de grande quantidade de catalase no sangue que provoca um desprendimento visível de oxigênio todas as vezes que aplicamos água oxigenada em cortes e ferimentos. Assim, a ação desta enzima protege-nos do acúmulo de uma das mais perigosas EROs.

Em 1969, os bioquímicos norte-americanos Irwin Fridovich e Joe McCord descobriram uma outra enzima, a superóxido dismutase (SOD) que catalisa a dismutação do ânion superóxido:

O2-• + O2-• + H+ H2O2 + O2

Tanto SOD como catalase são encontradas em praticamente todos os organismos aeróbicos. Como a formação do radical OH• requer H2O2, esse perigoso radical é gerado em muito menor quantidade, pois SOD e catalase destroem conjuntamente O2-• e H2O2. Outras enzimas celulares, como certas peroxidases, também auxiliam na remoção de H2O2. Um exemplo é o sistema formado por glutationa (GPX) peroxidase e glutationa redutase, enzimas que catalisam as reações abaixo:

H2O2 + 2GSH GSSG + 2 H2O

GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+

Além dessas enzimas, há os antioxidantes não enzimáticos, como a glutationa reduzida (GSH), mostrada na reação acima, que protege proteínas com

grupos –SH de oxidação e podem “capturar” radicais de oxigênio ou outras espécies reativas e as vitaminas C e E que agem diretamente com as EROs, destruindo-as.

Em certas patologias, a defesa antioxidante participa de uma forma bastante interessante. Na isquemia, que pode ocorrer em diferentes tecidos, a interrupção temporária de circulação acarreta a ausência de oxigênio, gerando o acúmulo de redutores, principalmente hipoxantina. Quando a circulação é restabelecida, há intensa oxidação da hipoxantina acumulada, com produção de EROs e a destruição do tecido.

No acidente vascular cerebral (AVC), uma enfermidade que afeta as artérias do cérebro ou as que chegam até ele, as células do cérebro ficam sem oxigênio e perdem sua função.

Já a aterosclerose é caracterizada pela deposição de lipídios, especialmente colesterol e ésteres de colesterol, na parede interna de artérias. Se na zona obstruída por placas de ateromas houver acúmulo de plaquetas e a formação de coágulos (trombos), têm-se o chamado quadro de trombose. Se os trombos se soltarem e obstruírem totalmente a artéria tem-se uma embolia. Essa situação é muito grave e pode provocar o bloqueio de artérias coronarianas ou cerebrais, uma das maiores causas de morte na sociedade ocidental.

A restrição do fluxo sanguíneo pode levar à redução das concentrações de O2 a níveis menores que os normais (hipóxia). A extensão dos danos provocados pela redução do fornecimento de O2 varia com o tipo de tecido e a duração do fenômeno. Músculos são mais resistentes e o cérebro é mais sensível. Se o período de isquemia ou hipóxia é insuficientemente longo para danificar o tecido irreversivelmente, este pode ser salvo por reperfusão com sangue ou reintrodução de O2 e nutrientes. Se um tecido morto for submetido a reperfusão, este poderá liberar agentes potencialmente tóxicos, como xantina oxidase no sistema circulatório causando problemas em outros tecidos. Isquemia pode levar a

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Isto pode gerar O2-•, bem como gerar espécies citotóxicas como o ONOO -(peroxinitrito) e H2O2.

Com base no texto anterior, responda:

1. Que enzima poderia ser acionada para amenizar o problema gerado pela produção de EROs pela isquemia?

2. Sabe-se que a síndrome de Down é provocada por trissomia do cromossomo 21, no qual está localizado o gene que codifica SOD. Quais as conseqüências que um aumento na quantidade de SOD poderia acarretar?

4.3-Efeitos pró-oxidantes de vitamina C e E

As vitaminas C e E são geralmente conhecidas por sua ação antioxidante. No entanto, em altas concentrações podem agir como pró-oxidantes.

Efeitos pró-oxidantes:

a. vitamina C ou ascorbato (altas doses: excretada pela urina) b. vitamina E ou -Tocoferol (altas doses: excretada pelas fezes)

Fe III + ascorbato Fe II + Asc•

TocH + Asc• Toc• + ascorbato

Toc• + LH TocH + L•

Sendo:

Ascorbato = Vitamina C Asc• = Radical Ascorbato

TocH = Tocoferol ou Viamina E Toc• = Radical Tocoferol

LH = Lipoproteína ou Lipídio

Baseado neste relato qual seria a sua crítica em relação às pessoas que, em nome da “saúde”, consomem diariamente vitaminas sem prescrição médica?

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4.4-Oxidação de proteínas

Uma investigação histórica do banho solar entre os seres humanos traz conclusões bastante curiosas. Mesmo em uma rápida retrospectiva, verifica-se que a pele branca muitas vezes indicou posição de destaque na sociedade. Enquanto trabalhadores, servos e escravos passavam a maior parte do seu tempo ao sol, os aristocratas procuravam a sombra. Entretanto, a Revolução Industrial levou embora a palidez. A industrialização barateou o custo da sombra e aumentou o preço da luz solar. Quem tinha um bronzeado mostrava que tinha tempo livre e saúde para viajar aos locais onde pudesse tomar sol. Hoje em dia o sentido do bronzeamento está intimamente ligado a tempo de lazer e férias. Nessas ocasiões as pessoas gastam mais tempo preocupando-se com a estética.

O sol emite um amplo espectro de radiações; a maior parte delas é muito nociva aos seres humanos. No entanto, grande parte da radiação nociva - raios cósmicos, raios X, ultravioleta - é absorvida pelas camadas superiores da atmosfera, principalmente pela camada de ozônio. Da parte do espectro que atinge a superfície da Terra (UV, IV e visível), a faixa que está intimamente envolvida com o bronzeado da pele é a do ultravioleta, a mais energética das três.

Ela está dividida em sub-regiões: UV-C, UV-B, UV-A. Os raios UV-C são os de maior energia e nocivos aos tecidos vivos. O UV-B é o que está associado à vermelhidão das queimaduras solares, sendo também um dos grandes causadores de alguns tipos de câncer de pele. O UV-A é a menos energética das três sub-regiões; ele também é capaz de acionar os mecanismos de bronzeamento e também pode ser responsável por alguns efeitos nocivos na pele.

A pele humana possui diversas camadas de tecido. A camada mais externa é a epiderme, a segunda camada é a derme. Ao longo da membrana que liga a epiderme à derme encontram-se dois tipos de células especializadas, de particular interesse para os banhistas. Uma é a célula basal que reproduz células para a epiderme (chamadas queratinócitos), que ao longo da sua vida vão se aproximando

cada vez mais da superfície externa devido ao surgimento de novos queratinócitos que empurram os mais antigos. Na pele não bronzeada os queratinócitos levam de três a quatro semanas para migrar da camada basal para a superfície da epiderme. Outra célula especializada produzida ao longo da membrana que une a epiderme à derme é o melanócito. Estas células têm importante papel de proteção do corpo. Quando os raios UV-A e UV-B atingem os melanócitos, eles emitem uma resposta produzindo um pigmento da pele chamado melanina, que é capaz de absorver radiação ultravioleta.

Nascemos com diferentes quantidades de melanina. Pessoas de compleição clara têm pouca melanina, as de pele morena têm mais e as de pele escura têm muita. A melanina interage com a radiação solar em dois estágios. No primeiro, grânulos pálidos (desoxigenados) de melanina próximos à superfície da pele são transformados, pela luz UV, em cor escura (oxidada). Isto produz um bronzeamento imediato. Um bronzeamento mais duradouro é proporcionado pelo segundo estágio. Nesse processo, novas quantidades de melanina são produzidas a partir da tirosina, um aminoácido abundante na proteína da pele. Este segundo estágio de bronzeamento resiste por mais tempo. No entanto, o efeito final da radiação ultravioleta é o dano das proteínas que constituem o tecido elástico e conectivo da pele. Isso produz um irreversível envelhecimento da pele que se tornará enrugada dura e macilenta.

Analisando o gráfico hipotético abaixo, responda:

1. Como podemos relacionar a quantidade de proteínas oxidadas no organismo e o envelhecimento?

2. O que o organismo faz com essas proteínas que estão oxidadas? Ele degrada-as ou repara-as?

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4.5-Oxidação de DNA

Até recentemente, assumia-se que as principais fontes de lesão em DNA humano eram provenientes de derivados ativados de substâncias exógenas. Entretanto, cada vez mais surgem evidências que substâncias endógenas, produzidas pelo metabolismo oxidativo e durante inflamações são prováveis fontes de danos ao DNA. Lesões causadas no DNA e outras macromoléculas induzidas por espécies reativas de oxigênio (EROs) têm atraído considerável interesse nos anos recentes e gerado extensiva discussão na relevância dos danos espontâneos causados no DNA relacionados ao envelhecimento e câncer.

As EROs / ERNs podem levar a danos no DNA pelo ataque direto e por mecanismos indiretos. Um exemplo é a citosina, cujo grupo amino, com o ataque de EROs / ERNs pode gerar uma uracila no DNA.

Um dos produtos mais estudados quando falamos em danos no DNA é o produto final da oxidação da guanina por radicais hidroxila, o 8-OH-Guanina. Ele é um marcador de estresse oxidativo, isto é, sua presença no organismo indica oxidação do DNA.

Naturalmente, não só o DNA nuclear mas também o DNA mitocondrial e o de cloroplastos são lesados por EROs / ERNs. O dano no DNA mitocondrial parece ser importante em várias doenças humanas e principalmente no processo de envelhecimento.

Intermediários de peroxidação lipídica, bem como produtos finais de peroxidação, também atacam o DNA.

Oxidação de Proteínas 0 20 40 60 80 100 Idade (anos) [p or çã o ox id ad a]

Defeitos no mecanismo de reparo de DNA também podem provocar câncer. Tumor é um termo genérico e aplica-se a qualquer estrutura que esteja crescendo no organismo, como ocorre numa reação inflamatória e num abscesso. O tumor benigno é aquele que tem crescimento local, pressionando tecidos adjacentes mas não tem capacidade de colonizar outros locais. Câncer é um tipo específico de tumor maligno, cujo crescimento não obedece a certos controles. Sua principal característica é a instalação local, seguida da invasão de outras partes, como camada de gordura, músculos e ossos e/ou a capacidade de colonizar outras estruturas ou órgãos. Esta invasão é denominada metástase: algumas células originadas no local de instalação primária se desprendem e, pela corrente sangüínea atingem outro local, onde iniciam o crescimento de um novo tumor. A principal razão pela qual um câncer mata é que ele cresce sem nenhum controle, vai consumindo o aporte de energia e nutrientes, a pessoa vai perdendo as forças e reduzindo seu peso. Depois pode haver invasão de estruturas vitais, como, por exemplo, os pulmões, afetando grandes áreas e impedindo que o indivíduo respire normalmente, o que acaba provocando sua morte. No cérebro, pode ocorrer compressão de estruturas vitais, também ocasionando óbito. Há tumores em superfícies que provocam sangramentos, os quais também podem levar à morte.

Analisando o gráfico hipotético abaixo, como podemos relacionar o risco de morte por câncer com a idade do indivíduo?

Quais fatores poderiam ocasionar o aumento de probabilidade de ocorrer câncer em pessoas com mais idade?

Questões gerais

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2. Podemos usar o tratamento com antioxidantes para prevenir ou tratar doenças já existentes?

Bibliografia:

1. Halliweel,B. and Gutteridge, J. Free Radicals in Biology and Medicine. 3 ed. Oxford University Press, 1999.

2. Marzzoco, A., Torres, B.B. Bioquímica Básica. 2 ed. Guanabara Koogan, 1999. 3. Meneghini, R. A toxicidade do oxigênio – Revista Ciência Hoje - Jan/Fev 1987.

4. Silva, R. R. and Costa, M. L., Ataque à pele. Química Nova na Escola n.1, Maio, 1995. 5. Suh, Y., Park, W. Y., Park, S. C., Mechanisms of Ageing and Development, 116 (2000)

47-57.

6. Ageing, Nature Insight. Nature, vol. 408 / 9 Nov 2000. 7. Softwares Educacionais. Torres, B. Radicais Livres.

8. http://www.msd-brasil.com/msd43/pacientes/colesterol.htm

9. http://www.tuotromedico.com/temas/accidente_cerebro_vascular.htm 10. http://www.moderna.com.br/bionline/bionovo/saude598a.htm

REPARO DE DNA

Questões

1. O DNA perde espontaneamente suas bases purínicas. No genoma humano esta perda ocorre 104 vezes ao dia. Citosina sofre desaminação gerando uracila, 5-metil-citosina (uma base minoritária do DNA de animais e plantas superiores) ao ser desaminada gera timina, acarretando transversões (Pu<->Py) e transições (PuPy<->PuPy).

N N N N N H₂ O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 N N N N NH₂ 1 2 3 4 5 6 ₇ 8 9 N N CH₃ O O 1 2 3 4 5 6 N N O NH₂ 1 2 3 4 5 6 N N O O 1 2 3 4 5 6 Adenina Guanina

Timina Citosina Uracila

Ribose Desoxirribose O OH OH OH HOCH₂ O OH OH HOCH₂ H 1' 2' 3' 4' 5'

Radicais livres podem acelerar este processo, desaminando também adenina, formando hipoxantina, e guanina, formando xantina.

Qual(is) mecanismo(s) de reparo pode(m) corrigir estes erros?

25 B) A Xantina GCT

Quais os mecanismos de reparo possíveis? Seria a mesma equipe enzimática utilizada nos dois casos?

3. Apontar semelhanças e diferenças entre os mecanismos de Reparo A e B.

5' 3' U DNA glicosilase U G 3' dR G 5' AP liase 3' dR G 5' 3' G 5' AP endonuclease dR 3' 5' Pol 3' 5' Ligase 5' _U 3' G Endonuclease nick 3' ou 5' n NMP + UMP Exonuclease 3' 5' 3' 5' ou 3' G 5' 1: 29 nt 2: 300 500 nt 1 2 Excinuclease duas quebras 5' 3' U 29 nt Pol

A

B

4. Organismos aeróbios geram, durante seu metabolismo, compostos chamados EROs (Espécies Reativas de Oxigênio), que consistem em radicais livres, e são

capazes de converter dGTP e dATP em 8-hidróxi-dGTP e 8-hidróxi-dATP (como exemplifica o esquema seguinte), livres no citossol ou incorporados no DNA. Estes compostos podem ser incorporados erroneamente no DNA ou mal interpretados na replicação, gerando transversões.

N N N N N H₂ O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Guanina R N N N N N H₂ O OH H 1 2 3 4 5 6 7 9 R N N N N N H₂ O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 R 8-OH Guanina 8 OH + e- _{+ H} +

MutT é uma enzima de E. coli, com análogos em mamíferos (inclusive humanos) que degrada 8-hidróxi-dGTP no citossol.

Que tipos de alterações na estrutura do DNA podem ocorrer por falta desta enzima em um organismo aeróbio?

5. Quais as possíveis conseqüências da quebra da dupla fita de DNA?

6. A figura abaixo mostra a variação do nível de reparo de diferentes danos no DNA causados por irradiação com UV e a variação da eficiência deste reparo de acordo com a idade do individuo (barras pretas: recém-nascidos, listradas: 25-34 anos e brancas: 63 a 88 anos).

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a) Por que a porcentagem de dano remanescente diminui em função do tempo após a irradiação?

b) A que conclusão pode-se chegar em relação à eficiência do reparo em função da idade do indivíduo?

c) Sabendo-se que o padrão de expressão de proteínas em células tumorais é alterado, qual tipo de indivíduo estará mais propenso a desenvolver a câncer? d) Comparando populações que vivem em países temperados ou tropicais, qual

estará mais propensa ao desenvolvimento de tumores?

7. A figura abaixo mostra o resultado de uma experiência na qual foram medidos os níveis de expressão da proteína p53 em indivíduos antes (-) e depois (+) de sofrer irradiação por UV (neste tipo de experimento, quanto mais intensa a banda, maior é o nível de expressão).

-

-

-

|_______| |______| |_______|

Idade (anos) 0 21 88

b) Ocorre variação da expressão de p53 em função da idade do indivíduo?

c) Sabendo que p53 é uma proteína envolvida no controle do ciclo celular, formule hipóteses para explicar sua maior expressão quando da radiação por UV.

8. Um organismo diplóide teve uma fita de DNA quebrada, conforme mostra a figura:

ATCGTGTGTGTGTTG dano ATCGT TGTTG

||||||||||||||| ---> ||| |||||

TAGCACACACACAAC TAG ACACAAC

a) Quais são os tipos de reparo que poderiam ser utilizados para refazer a fita dupla?

b) Discutir as diferenças das seqüências de DNA resultantes do reparo obtido por diferentes métodos?

c) Qual seria o único mecanismo possível de reparo se o organismo fosse haplóide?

9. Uma fita de DNA sofreu um dano por raios UV e gerou um dímero de timinas. Qual o mecanismo que você imagina que seja utilizado para o reparo deste tipo de lesão? Caso este tipo de dano se localizasse em uma região que sofre transcrição, quais seriam os problemas se este dano não fosse reparado?

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10. Doenças como xeroderma pigmentosa, ataxia talangiectasia (não corrige quebras em dupla fita), e síndrome de Bloom (incapacidade de preencher lacunas no DNA) provocam efeitos em humanos tais como nanismo, retardamento mental, fotossensibilidade e propensão a diversos tipos de câncer. Elas mostram a importância dos mecanismos de reparo de DNA, mesmo em condições não estressantes, ou sob efeito de antioxidantes.

Baseado no que você aprendeu em aula, e no que você conhece de biologia molecular e evolução, descreva como você enxerga o fato do metabolismo de um organismo normal e saudável poder causar injúrias ao seu próprio DNA.

Reparo de DNA

Desde o começo da vida na terra, a evolução depende da capacidade das populações de aumentar sua resistência ao meio ambiente que as cerca ou adaptarem-se às novas condições ambientais. Estas adaptações são possíveis graças a mutações em seu código genético, provocadas por uma taxa de erro inerente ao processo de replicação (1 erro a cada 108-1010 bases) e também pela ação do ambiente sobre o material genético.

Apesar de sua estabilidade, o DNA não é inerte, e pode ser danificado por agentes endógenos e exógenos, durante a vida normal de um organismo. Apesar da evolução ser dependente de mutações, as mutações benéficas são muito raras em comparação com as danosas, o que justifica a existência de diferentes mecanismos de reparo do DNA, que muitas vezes se tornam redundantes.

Preservar o material genético é vital para qualquer organismo vivo, pois a perda de sua integridade pode acarretar falhas em suas funções, o que leva não só ao prejuízo das gerações seguintes como também pode causar doenças, como o câncer, ou a morte do indivíduo. Sistemas de reparo de DNA estão presentes em todos os organismos conhecidos.

Tipos de danos

Ao contrário do que podemos imaginar, estamos constantemente expostos a agentes nocivos ao DNA. Os danos podem ser causados por agentes presentes no meio ambiente (compostos químicos, raios-X, UV) bem como presentes no nosso organismo: o metabolismo normal de um indivíduo gera compostos (radicais livres) capazes de reagir quimicamente com o DNA.

Radiações ionizantes, como UV e Raios-X, podem provocar a formação de dímeros entre bases pirimidínicas, formando anéis de ciclobutano (dímeros de timina), ou 6-4-foto-produtos (dímeros C-C, C-T ou T-T); podem também causar

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quebra das fitas do DNA, e formar ligações entre DNA-DNA e DNA-proteína (cross-linking).

Substâncias químicas podem alquilar bases, serem incorporadas no DNA como uma base qualquer, formar complexos volumosos que distorcem a estrutura do DNA ou formar complexos de intercalação. Tais lesões “confundem” a DNA polimerase, acarretando a adição, deleção ou troca de bases no momento da replicação. Substâncias com estas propriedades são muito utilizadas na terapia contra o câncer e contra a AIDS.

Outro tipo de dano é a depurinação espontânea do DNA, que ocorre pela hidrólise da ligação entre a base e o açúcar.

Os danos acima citados podem acarretar a alteração do quadro de leitura de um gene, ou na deleção/inversão/translocação de um trecho de DNA, que poderia ter como conseqüência a perda da função de um ou mais genes.

Mecanismos de reparo

Existem diferentes respostas para corrigir eventuais danos no DNA, com diferentes mecanismos de ação:

1. Reversão direta de um dano:

1.1· Fotorreativação enzimática

·1.2 Reparo de O6-alquilguanina, O4-alquiltimina e alquilfosfotriésteres 2. Excisão do DNA danificado:

2.1 BER (Base Excision Repair) 2.2 NER (Nucleotide Excision repair) 2.3 MMR (Mismatch repair)

3. Tolerância do DNA danificado 3.1 Síntese translesão

3.2 Reparo por recombinação

Lesão Causa _{Mecanismo de reparo}

Troca de bases, estruturas em

forquilhas e em alças Falha na replicação ou em uma recombinação NER BER

Deaminação/depurinação Calor NER _BER

Oxidação de bases _{Metabolismo oxidativo} Radiação ionizante BER

Alquilação/acilação/adutos Agentes químicos NER _BER

Ligação cruzada dentro da fita Radiação ionizante _{Agentes químicos} NER Ligação cruzada entre fitas Radiação ionizante _{Agentes químicos Recombinação} NER

Quebra da dupla fita Radiação ionizante Agentes químicos Estresse oxidativo

Ligação Recombinação

Quebra em fita simples Radiação ionizante Agentes químicos

Estresse oxidativo Ligação

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Mecanismo de reparo multi-enzimático baseado na retirada de algumas bases da fita danificada em um trecho que envolva o erro, com subseqüente preenchimento e ligação da fita corrigida. Este é o tipo de reparo no caso de haver um único nucleotídeo com dano.

Geralmente o segmento de DNA retirado da fita danificada contém de 5 a 8 bases; o primeiro passo da via BER é a retirada da(s) base(s) modificada(s), mediada pelas N-glicosilases, as quais hidrolisam a ligação N-glicosídica entre a base adulterada e a desoxirribose, gerando um sítio apurínico ou apirimidínico (sítio AP). O próximo passo é a retirada do trecho abásico pela ação de AP endonucleases. Em seguida o trecho é preenchido pela DNA polimerase e ligado pela DNA ligase.

Assim, para um mecanismo BER ser viável, um organismo deve possuir DNA glicosilases (ex: 3-metiladenina DNA glicosilase, hipoxantina DNA glicosilase e uracil DNA glicosilase) e AP endonucleases (ex: E.coli endonuclease III) ou uma enzima que possua as atividades destas duas enzimas (ex: T4 endonuclease V).

NER (Nucleotide Excision Repair, reparo via excisão de nucleotídeo)

Mecanismo capaz de corrigir lesões causadas por UV, adutos e deaminações/depurinações, também envolvendo a retirada de um fragmento de DNA em torno da lesão. Este processo atua mais comumente em danos que causam distorções na hélice de DNA. A excisão elimina oligômeros que têm de 25 a 32 nucleotídeos de comprimento.

Este mecanismo é extensivamente estudado e caracterizado em bactérias, onde as enzimas UVrA, UVrB, UVrC e UVrD são responsáveis pelo processo.

O heterotrímero UVrA2B liga-se ao DNA desnaturando um trecho em torno da lesão, UVrB cliva a porção 3´ da fita lesada e UVrC a porção 5´. UVrD possui

atividade de helicase e retira o fragmento de 12 nucleotídeos; a falha é então preenchida pela DNA polimerase I e ligada pela DNA ligase.

Em eucariotos, este mecanismo é muito mais complexo, envolvendo mais de 20 enzimas, porém, de um modo geral, também envolve o reconhecimento do dano, a clivagem da fita danificada, a retirada do oligonucleotídeo, e a ressíntese da fita extraída.

Muito do que se conhece sobre NER conseguiu-se através de estudos de complementação entre diferentes células de pacientes portadores de xeroderma pigmentosa (XP), doença causada pela deficiência no reparo de DNA, ocasionando uma sensibilidade maior à luz UV.

Recombinação

Uma quebra na dupla fita de DNA ou em uma única fita pode ser reparada por recombinação. A recombinação utiliza a homologia entre fitas de DNA para

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neste processo, muitas vezes pode-se ter uma troca de segmentos entre cromossomos, ocorrendo um crossing-over.

Consiste, assim, em uma forma de assegurar a integridade genômica, pois baseia-se na regeneração de um trecho danificado baseado em outro similar, evitando a ligação entre pontas erradas de DNA, deleções e inverções. Porém é comum ocorrer recombinação entre regiões não totalmente homólogas, causando inserções de seqüências onde inicialmente elas não existiam.

Processo de recombinação do DNA danificado.

Neste processo existe a necessidade de uma outra fita dupla de DNA para servir como molde e deste modo conseguir-se uma preservação da informação original em muitos dos casos.

Ligação

A ligação é uma recombinação não homologa, ou seja, ela religa partes rompidas de DNA mas não utiliza ou utiliza muito pouca homologia entre os ligantes para guiar o processo. Este processo muitas vezes acaba recriando a fita de modo errado, gerando deleções ou preenchimento errôneo de mensagens.

Processo de ligação do DNA danificado.

Este tipo de reparo não precisa de outra fita dupla de DNA para o reparo como se pode ver na figura. Entretanto, em muitos casos, não se consegue recuperar a informação original.

37 Vias de reparo

GGR (Global Genome Repair)

Como o nome indica, este processo refere-se ao processo global de reparo de DNA, envolvendo todas as regiões do genoma. Ou seja, o genoma está constantemente sob “vigilância” por meios não muito conhecidos, porém esta vigilância é capaz de reconhecer diferentes tipos de danos e recrutar os mecanismos adequados para o reparo.

TCR (Transcription Coupled Repair)

Ocorre apenas na fita transcrita de um gene ativo e é dependente da transcrição. A ocorrência deste tipo de reparo só foi demonstrada para genes transcritos pela RNA polimerase II, pois aparentemente o sinal de reparo é disparado quando a transcrição pela RNA polimerase II é interrompida pelo defeito na fita.

A RNA polimerase II reconhece um erro no DNA molde devido às distorções causadas pelo pareamento errôneo das bases, o processo de transcrição é então interrompido, sinalizando a necessidade de reparo.

Ainda não é conhecido como a RNA polimerase II recruta a equipe enzimática para efetuar o reparo.

Associação entre reparo de DNA e envelhecimento

Existem proteínas no núcleo celular cuja função é sinalizar o estado do genoma, e estão relacionadas aos pontos de checagem do ciclo celular; se o genoma apresentar algum defeito, a célula pára na fase do ciclo em que se encontrar até o reparo ou o sinal de apoptose.

Quando ocorre o envelhecimento há a perda da capacidade de reparo de DNA de um organismo. Esta perda de reparo está associada a uma maior incidência de câncer na velhice.

Entretanto, ainda não é estabelecida uma relação direta entre perda da capacidade de reparo de DNA levando à velhice. Em outras palavras, não sabemos se a perda da capacidade de manutenção do genoma é uma causa ou um efeito do envelhecimento.

Um exemplo que pode relacionar envelhecimento e reparo de DNA é o regime de restrição calórica. Com este tipo de dieta, um indivíduo consegue viver por muito mais tempo, possivelmente por diminuir seu metabolismo e a geração de radicais livres.

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Síndromes do envelhecimento

Existem síndromes nas quais mutações em determinados genes podem causar um envelhecimento acelerado. Tais desordens podem dar pistas sobre o mecanismo normal de envelhecimento. Entretanto, temos associada a tais síndromes uma série de outros sintomas que indicam um desenvolvimento completamente anormal, não apenas em seu ritmo mas em outros aspectos. Algumas destas síndromes possuem associação com reparo de DNA, mostrando uma relação entre este processo e o envelhecimento.

Síndrome de Cockayne

Esta síndrome caracteriza-se por um defeito na via de reparo por NER na via TCR que seria causada por defeitos em dois genes. Este defeito estaria associado à não correção de defeitos em regiões transcritas e, conseqüentemente, um seqüestro da maquinaria de transcrição nestes pontos.

Os sintomas desta síndrome são a neurodegeneração, desenvolvimento sexual incompleto, retardo mental e desenvolvimento físico incompleto manifestado por microcefalia, nanismo e anormalidades esqueléticas e retinais.

Síndrome de Werner

Esta síndrome caracteriza-se por um defeito em uma helicase, que também possui uma função exonucleásica 3´ 5´. É postulado que esta enzima pode estar associada ao reparo de DNA, visto que as células de indivíduos com esta síndrome são muito sensíveis a 4-nitroquinona-1-oxido, que é um composto que produz radicais livres e adutos de DNA. Os indivíduos com esta síndrome apresentam doenças relacionadas com o envelhecimento como aterosclerose, osteoporose, diabete melitus e catarata bilateral.

Síndrome de quebra de Nijmegen

Este é um tipo de desordem rara que afeta apenas 70 famílias em todo o mundo. O defeito causador desta síndrome é do gene da família fosfatidilinositol-3 quinase, relacionado com a subunidade catalítica das proteínas quinases DNA-dependentes, que são proteínas envolvidas no reparo da quebra do DNA dupla fitas. A função do gene com defeito não seria no reparo, mas sim na sinalização do dano no DNA para p53 que então poderia ativar a parada do ciclo celular.

Os sintomas desta síndrome são microcefalia, crescimento retardado, infecções respiratórias devido à imunodeficiência e predisposição a câncer.

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TELÔMEROS E TELOMERASE

Questão 1. Considerando que a ação da DNA polimerase é sempre precedida pela atuação da RNA polimerase, há espaço físico para a atuação destas enzimas na duplicação das extremidades dos cromossomos? O problema seria o mesmo nas extremidades 5’ e 3’ do DNA?

Questão 2. Esquematize a replicação possível do DNA nas extremidades dos cromossomos.

Os extremos dos cromossomos normais são constituídos por estruturas denominadas telômeros, que desempenham um importante papel no seu comportamento, como impedir a união entre cromossomos.

Os telômeros compõem-se de seqüências curtas de nucleotídeos, repetidas centenas de vezes em leveduras e vários milhares de vezes em vertebrados. Nos cromossomos humanos a seqüência é [5' - TTAGGG - 3'], formando um segmento de DNA de aproximadamente 10kb no extremo do cromossomo. A fita complementar, rica em C, termina um pouco antes que a fita rica em G, de modo que a última forma uma fita terminal monocatenária no extremo do cromossomo. Como a síntese de DNA avança somente na direção 5' 3' e depende da presença de um iniciador, a síntese de DNA no extremo do cromossomo é interrompida. A duplicação cromossômica normal produz um progressivo encurtamento de telômeros, até que, depois de um número de divisões celulares, os cromossomos se tornam instáveis e a célula morre.

Telômeros: Seqüências repetitivas nas pontas de cromossomos eucarióticos. Em humanos são constituídos por uma média de 5000-15000 pares de bases nas repetições (TTAGGG)n e proteínas ligantes a esta seqüência.

Em cada ciclo de replicação cromossomal, os telômeros perdem tipicamente em torno de 150 pares de base da seqüência nucleotídica a 5’ da molécula de DNA; isto reflete a inabilidade das DNA polimerases convencionais de replicar a extremidade dos telômeros.

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PROPRIEDADES DO TELÔMERO

Proteção das extremidades dos cromossomos de exonucleases e ligases. Previne recombinações aberrantes e fusão dos cromossomos.

Regula reconhecimento e separação do cromossomo mitótico. Forma complexos com proteínas.

Permite a completa replicação do DNA linear.

Questão 3. A seqüência telomérica codifica alguma proteína?

HISTÓRICO

Shampay et al. demonstraram em 1984 que seqüências teloméricas de DNA de Tetrahymena, quando introduzidas em fungos, tornaram-se alongadas, com seqüências teloméricas de fungo.

Em 1985, Greider e Blackburn detectaram em extratos de Tetrahymena uma atividade que adicionava repetições teloméricas em primers formados por oligonucleotídeos de DNA telomérico de fita simples. Também mostraram que esse processo era inativado tratando-se o extrato com enzimas que degradam RNA. Tal atividade RNA-dependente foi denominada transferase terminal ou telomerase, que se mostrou ser um complexo ribonucleoproteico que utiliza seqüências de seu próprio RNA como molde para a síntese de seqüências teloméricas de DNA.

Questão 4. Proponha uma forma experimental para medir a atividade da

Questão 5. A telomerase é uma enzima capaz de alongar seqüências terminais dos

cromossomos. Observando a animação disponível no microcomputador, descreva o papel do RNA desta ribonucleoproteína no processo de alongamento telomérico.

Questão 6. A telomerase de tomate seria eficaz na replicação de DNA de

vertebrados? [Telomerase: enzima ribonucleoproteica que sintetiza seqüências repetitivas nos finais dos cromossomos (telômeros). Praticamente inativa na maioria das células somáticas.]

Estrutura das repetições teloméricas Organismos

TTAGGG

Vertebrados

Physarium polycephalum; Histoplasma capsulatum; Trypanosoma brucei

Duas espécies de Polychaeta

TTTAGGG Arabidopsis thaliana. Milho, trigo

TTAGG Bombix mori e alguns insetos

TT(T/A)AGGG Tomate

TT(C/T)AGGG Plasmodium falciparum

TTGGGG Tetrahymena thermophila

TTTTGGGG Euplotes

TTGCA Parascaris univalens

G1-8A Dictyostelium discoideum

TG2-3(TG)1-6 Saccharomyces cerevisiae

TCTGGTG e TCTGGG(TG)2-4 Saccharomyces castellii Repetições de 26 nucleotídeos Saccharomyces kluyveri

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COMPLEXO TELÔMERO-TELOMERASE

Estrutura da telomerase

1. Telomerase-RNA (TR): Varia de 159 bases em Tetrahymena, 450 bases em

humanos e 1,3 Kb em leveduras; em todos os casos os TRs contêm seqüências de repetições complementares ao DNA telomérico, sintetizadas pela enzima. Em Tetrahymena, o molde de RNA é AACCCCAAC, que se liga à terminação TGG na extremidade 3’ do DNA.

5’ (DNA) TTG – 3’

AACCCCAAC

A polimerização leva ao alongamento do DNA, terminando com a extremidade TTG com a qual pode parear novamente o RNA da telomerase, reiniciando o ciclo.

5’ (DNA) TTGGGGTTG – 3’ AACCCCAAC

2. Subunidade catalítica: A transcriptase reversa da telomerase (TRT) foi

descoberta pelo grupo de Cech resultado do isolamento de um complexo de proteínas-RNA com atividade do telomerase em Euplotes dediculatus.

As seqüências alinhadas e a figura seguintes referem-se às Questões 8 e 9

Nas seqüências acima, utilizando a técnica de alinhamento, seqüências de aminoácidos para domínios conservados de transcriptase reversa (RT) estão comparados com TRTs, de 3 diferentes espécies. “b” são aminoácidos periféricos em RT. “d” e “m” são aminoácidos importantes para a ligação de dNTP e Mg+2, para a polimerização. Estes resíduos são conservados, exceto no domínio T.

Representação esquemática dos domínios RT e TRTs:

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Questão 7. Que podemos estabelecer sobre a linha evolutiva da telomerase nestes

diferentes organismos? Que tipo de diferenças se observam na seqüência dos 7 genes dos TRTs comparados com os domínios de seqüência RT? Por que é importante seqüenciar e alinhar os genes das subunidades TRTs e por que relacioná-los com RT?

Questão 8. Na parte (b) da figura, estrutura tridimensional de HIV-RT, os

domínios da palma (Palm) e dedos (Fingers) da estrutura secundária estão coloridos igualmente aos domínios análogos de RT. Na figura está assinalado o sítio catalítico da enzima. Por que aquele local foi considerado como sítio catalítico? Como poderíamos provar essa hipótese?

MECANISMO POTENCIAL DE BLOQUEIO DA ATIVIDADE DA TELOMERASE

Questão 9. A reativação da telomerase ocorre em muitas células tumorais e

postula-se que tal reativação é responsável pela manutenção de crescimentos tumorais. É possível deter o câncer desativando a telomerase? Como seria possível determinar a atividade de telomerase nestas células?

ATIVIDADE E REGULAÇÃO DE TELOMERASE

Questão 10. A telomerase é um complexo ribonucleoprotéico contendo uma

subunidade de RNA e vários componentes protéicos. A subunidade de RNA (TR) é essencial para a atividade da telomerase, uma vez que contém a seqüência iniciadora para adição de DNA ao telômero. As subunidades protéicas incluem a TRT (telomerase reverse transcriptase) e TP1 (telomerase associated protein 1). TRT é a subunidade catalítica da telomerase. TP1 liga-se em ambas TR e TRT.

A figura acima mostra um northern blotting utilizando diversas amostras de tecidos humanos adultos. O RNA dessas células foi extraído e submetido a uma eletroforese em gel de agarose e posteriormente transferido para uma membrana de nitrocelulose; esta membrana foi incubada com uma sonda de DNA, desnaturada e marcada radioativamente que se hibridizou com o transcrito de RNA específico. Nesse caso foram utilizadas como sondas a seqüência gênica da subunidade hTP1 da telomerase. A membrana foi exposta a um filme de raio X e as bandas reveladas.

A) Utilizando essa técnica que tipo de informação pôde-se obter a respeito do

transcrito?

B) O que você pode dizer a respeito da distribuição dos transcritos do gene hTP1

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Questão 11.

A figura acima mostra um northern blotting utilizando diferentes linhagens celulares mortais (1 a 6) e imortais (7 a 12). Neste caso foram utilizadas como sondas as seqüências gênicas das subunidades hTRT e hTR da telomerase.

A) Os RNAs referentes a hTRT e hTR estão presentes em quais linhagens

celulares? Em que circunstância a hTRT passa a ser transcrita?

B) A partir da observação deste northern blotting e dos dados da questão 11,

pode-se concluir que ocorre regulação da atividade de telomerapode-se? Explique. Em que nível se dá esta regulação?

C) Embora a grande presença de hTP1 e hTR possibilite a formação de complexos,

este só se torna ativo com a incorporação de hTRT. Considerando esta informação, como você correlaciona a presença de hTRT e a imortalização?

Questão 12. O grau e o tipo de regulação da expressão gênica refletem a função do

produto protéico do gene. Alguns produtos gênicos são requeridos todo o tempo e os seus genes são expressos num nível mais ou menos constante em praticamente todas as células do organismo. Produtos gênicos cujas concentrações aumentam sob determinadas circunstâncias são referidos como induzíveis.

O proto-oncogene MYC codifica um fator de transcrição (c-MYC) que é conhecido principalmente por estar envolvido no controle da proliferação e diferenciação celular.

A) Observando o northen blotting acima, o que é possível dizer a respeito dos

níveis de RNA do gene hTRT com relação ao nível de RNA do gene MYC?

A figura acima mostra um "gel shift". Esse ensaio é extremamente sensível para detectar a ligação de proteínas a seqüências específicas de DNA. As proteínas que se ligam especificamente a um fragmento de DNA marcado radioativamente retardam a mobilidade do fragmento durante a eletroforese em gel de poliacrilamida, resultando em bandas que correspondem a complexos proteína-DNA. Essas bandas são reveladas por autoradiografia.

B) Descreva o que aconteceu no experimento de gel shift, no qual foram incubados

o promotor do gene hTRT e a proteína c-MYC.

C) Observando as duas figuras desta questão, o que é possível dizer a respeito do

controle da transcrição da hTRT?

Questão 13. A p53 é uma proteína supressora de tumor que tem como função

proteger a célula de vários tipos de estresses genotóxicos e ambientais, incluindo danos no DNA, hipóxia, depleção de nucleotídeos e sinais de crescimento celular

51

inapropriados, ativados a partir de oncogenes. A inativação da proteína p53 (através de interações específicas com proteínas oncogênicas, desfosforilação ou mutações genéticas) está envolvida no processo de imortalização celular.

A figura 1 desta questão mostra o resultado de um experimento de imunoprecipitação, utilizando extratos de células jovens e células velhas.

A) A partir dessa figura, o que foi possível observar a respeito da proteína p53 nos

extratos de células jovens e velhas?

A figura 2 desta questão mostra resultados de um experimento de gel shift, utilizando extratos de células jovens e velhas e uma sonda radioativa referente ao sítio de

ligação da p53.

B) Descreva o que aconteceu no experimento de gel shift, no qual foram incubados a

sonda e os extratos de células jovens e velhas. Compare o shift observado utilizando células jovens com o shift utilizando células velhas.

C) Observando as duas figuras desta questão, o que é possível dizer a respeito da p53

Questão 14. A proteína p53 de lisados nucleares ligou-se seletivamente a uma coluna

de afinidade acoplada com o peptídeo hTEP1. Isso não pôde ser observado utilizando colunas acopladas com hTRT. A ligação se dá com alta afinidade e a dissociação requer altas concentrações de sal ou pH baixo. Posteriormente, observou-se que a interação entre p53 e hTP1 se dá entre a região carboxi-terminal de p53 e uma região perto da amino-terminal da hTEP1, a TEIPP1 (telomerase inhibitory polypeptide 1). Também se verificou que, quando p53 interage com essa região, a atividade da telomerase é interrompida.

A partir das informações obtidas na questão 13 e a partir das informações dadas nesta questão, é possível dizer que p53 participa da regulação pós-traducional da telomerase? Como você descreveria essa regulação?

Questão 15. Embora as vias de sinalização para o envelhecimento celular induzido

pelo encurtamento do telômero permaneçam pouco definidas, tem sido proposto que telômeros curtos levam à ativação de múltiplos mecanismos de sinalização. O encurtamento dos telômeros pode deslocar proteínas que se ligam aos telômeros (TBPs) e fornecer menos sítios de ligação em novas gerações celulares. Sendo assim, o encurtamento dos telômeros está acompanhado da produção e acúmulo de TBPs livres, que interagem potencialmente com outras proteínas, atuando como sinalizadores. Um maior encurtamento pode ainda ativar a transcrição de genes adjacentes, um fenômeno chamado efeito da posição com relação ao telômero (TPE). Ocorrem, então, mudanças na expressão desses genes sensíveis ao encurtamento do telômero (TSSG), que podem também estar envolvidos em eventos de sinalização. Que informações sobre o gene da p53 seriam necessárias para supor que ele é um TSSG envolvido na regulação da parada do crescimento celular? Explique.

Questão 16. Em células de mamíferos, a dupla fita telomérica é diretamente ligada

por duas proteínas: TRF1 e TRF2, sendo que o acúmulo dessas proteínas ligadas ao telômero reflete o seu comprimento. Em telômeros muito curtos, processa-se o

53

A) Sabe-se que a subunidade p43 da telomerase, cuja função ainda é pouco

conhecida, é capaz de ligar-se às TRF1 e TRF2 ligadas ao telômero (ver a figura do complexo telômero-telomerase). É possível dizer que esta subunidade está envolvida no reconhecimento do telômero pela telomerase?

B) Qual seria a função de TRF1 e TRF2?

CICLO CELULAR

O ciclo celular é um conjunto ordenado de eventos que culmina com o crescimento de uma célula e a divisão em duas células filhas. As etapas mostradas na figura são G1-S-G2-M.

1. G1 ("gap 1"), período de crescimento antes da replicação do DNA;

2. S ("sinapse"), período em que o DNA é replicado;

3. G2 ("gap 2"), período de crescimento, após a replicação do DNA;

4. M ("mitose"), período de divisão celular.

Os elementos da regulação do ciclo celular são:

KdC (quinase dependende de ciclinas) - determina a passagem de G1 a S e G2 a M. FPM (Fator Promotor da Maturação) - inclui a KdC e ciclinas, que desencadeiam a

progressão do ciclo celular.

p53 é uma proteína que funciona bloqueando o ciclo celular se o DNA estiver

p27 é uma proteína que se une a ciclinas e KdC bloqueando a entrada em fase S. TELÔMEROS E CICLO CELULAR

1. Determinada redução do telômero produz sinal de dano de DNA ou o encurtamento do telômero altera a expressão de genes reguladores localizados na região subtelomérica da heterocromatina;

2. sinal induz p53 e p21; 3. inibição de quinases; 4. pRb não fosforilada;

5. p53, p21 e pRb levando ao M1 (limite de Hayflick).

Neste ponto a divisão celular cessa. Se este ponto for transposto por mutações, bloqueio de sinais e sinalizadores, etc:

6. continuação da divisão celular com concomitante encurtamento dos telômeros; 7. alcance do ponto M2 onde sinal disparado cessa divisão celular.

Ao redor do ponto M2 os cromossomos apresentam uma redução muito grande dos telômeros, com eventual eliminação total do telômero, gerando uma instabilidade genômica que é a provável causa da grande mortandade celular.

A mortandade celular ao redor de M2 é chamada de crise.

Se de alguma forma a célula transpuser o ponto M2, ela continuará se dividindo e a forma de saída do limite de crise poderá ser:

8. aumento da atividade da telomerase;

9. estabilização do telômero até a saída do limite de crise.

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pela telomerase, levando à saída do limite de crise e à continuação da atividade da telomerase nas divisões celulares.

Questão 17. A região telomérica não codifica proteínas, mas os sinais disparados por

proteínas ligadas a esta região são tidos como muito importantes para o controle da divisão celular. Grande número de células cancerosas apresenta atividade de telomerase e uma estabilização do comprimento do telômero, fazendo-nos supor que tenham passado por M2. Discuta a função de M1 e M2, e do encurtamento dos telômeros, nos organismos.

Questão 18. Qual poderia ser a causa da grande mortandade celular em M2? MITOCÔNDRIAS

As mitocôndrias estão presentes em quase todas as células eucarióticas como plantas, animais e na maioria dos microorganismos eucarióticos. É nessas organelas que a maior parte do ATP celular é produzido, fornecendo com isto energia para todas as reações do metabolismo. Pequenas quantidades de ATP são geradas durante a glicólise no citossol, mas a maior parte do ATP é produzida pelo processo de fosforilação oxidativa nas mitocôndrias. Além desse importante papel na manutenção da vida celular, postula-se atualmente que as mitocôndrias estejam também