UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Aplicadas
NATHALIA DIAS GONÇALVES
ENCAPSULAÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE TOMILHO E AVALIAÇÃO COMO POTENCIAL INGREDIENTE FUNCIONAL TECNOLÓGICO
ENCAPSULATION THYME ESSENTIAL OIL AND EVALUATION AS POTENTIAL FUNCTIONAL INGREDIENTS TECHNOLOGICAL
LIMEIRA 2016
NATHALIA DIAS GONÇALVES
ENCAPSULAÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE TOMILHO E AVALIAÇÃO COMO POTENCIAL INGREDIENTE FUNCIONAL TECNOLÓGICO
Dissertação apresentada à
Faculdade de Ciências
Aplicadas da Unicamp para obtenção do Título de Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo na área de concentração de Nutrição
Orientadora: Profª. Drª. Ana Silvia Prata Soares
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA
NATHALIA DIAS GONÇALVES, E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. ANA SILVIA PRATA SOARES
_____________________________________ (assinatura da orientadora)
LIMEIRA 2016
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica. Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Aplicadas
Renata Eleuterio da Silva - CRB 8/9281 Gonçalves, Nathalia Dias, 1989-
G586e GonEncapsulação de óleo essencial de tomilho e avaliação como potencial ingrediente funcional tecnológico/ Nathalia Dias Gonçalves. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
Gon
Orientador: Ana Silvia Prata Soares.
GonDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas.
Gon
1. Alimentos - Conservação. 2. Alimentos - Contaminação. 3. Óleos essenciais. 4. Bactérias. 5. Fungos. I. Prata, Ana Silvia,1977-. II. Universidade
Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Aplicadas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Encapsulation thyme essential oil and evaluation potential functional ingredient technological
Palavras-chave em inglês: Food - Conservation Food - Contamination Essencial oils Bacteria Fungi
Área de concentração: Nutrição
Titulação: Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo Banca examinadora:
Ana Silvia Prata Soares [Orientador] Izabela Dutra Alvim
Rosângela Maria Neves Bezerra Data de defesa: 21-01-2016
Autora : Nathalia Dias Gonçalves
Título: Encapsulação de óleo essencial de tomilho e avaliação como potencial ingrediente funcional tecnológico
Natureza:
Instituição: Faculdade de Ciências Aplicadas - FCA Data da Defesa: 21 de janeiro, Limeira, 2016
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Ana Silvia Prata Soares (Orientadora)
Assinatura
Drª. Izabela Dutra Alvim
Assinatura
Profª. Drª. Rosângela Maria Neves Bezerra
Assinatura
“A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.”
Dedico este trabalho ao meu pai Neto e a minha mãe Sirlei, por serem meu alicerce e exemplo.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a minha orientadora (grande) Profª. Drª. Ana Silvia Prata Soares por ter me dado a oportunidade de realizar este trabalho e ter me acolhido de braços abertos, sempre disposta a vencer os desafios comigo. Agradeço à ela pela paciência e por sempre ter extraído o melhor de mim durante esses dois anos de trabalho. Sinto me imensamente grata pelo apoio profissional e pessoal.
Aos meus pais Neto e Sirlei, por me incentivarem com muito amor e nunca medirem esforços para que meus desejos e planos se realizassem, e por sempre terem acreditado em mim.
Ao meu noivo Railson pelo amor, carinho, paciência e companheirismo.
A minha tia Cleuza e a minha prima Fernanda, mãe e irmã de coração por sempre compartilharem da minha história me incentivando e ajudando, pela nossa amizade inabalável.
A Nágila, estagiária de química no laboratório de Engenharia de Processos, que se tornou uma amiga, me auxiliou no início da minha caminhada no laboratório e tornou minhas atividades mais leves.
A professora Drª. Adriane Elisabete Antunes de Moraes pela disponibilidade e ajuda de sempre, tanto no laboratório quanto na parte intelectual deste trabalho e por ter se ocupado da minha dissertação com muita vontade. Agradeço também às suas alunas Fabíola, Luciana, Priscila e Gabriela pela dedicação e empenho, os quais viabilizaram a conclusão deste estudo. A todas vocês devo o aprendizado na área da microbiologia.
A professora Drª. Marta Cristina Teixeira Duarte por ter participado da banca de qualificação e enriquecido tanto o meu trabalho, além de ter disponibilizando seu laboratório para análise microbiológica e compartilhado tantas idéias. Agradeço também à técnica de seu laboratório, Camila Delarmelina pelas análises de concentração inibitória mínima e pelas explicações sobre os métodos.
Ao Dr. Adilson Sartoratto pelo comprometimento em fazer a caracterização dos compostos do óleo de tomilho e liberação das partículas pela técnica da cromatografia gasosa.
A Profª. Drª. Ana Paula Badan pela determinação da estabilidade oxidativa do óleo e das partículas e também pela análise de fitoesteróis.
Ao Sr. Florêncio, funcionário da Unicamp, por ter contribuído para minha participação no meu primeiro congresso internacional.
A Drª. Izabela Dutra Alvim e a profª. Drª. Rosângela Maria Neves Bezerra por terem participado da banca de defesa. Vossas idéias e sugestões melhoraram este trabalho. Obrigada pela disponibilidade e pelas discussões informais que foram muito importantes na minha formação.
A equipe do laboratório Lactad – Unicamp pelas belas imagens realizadas com microscopia confocal a laser.
A FAEPEX pelo financiamento da bolsa de estudos durante todo tempo de mestrado.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ilustração esquemática para a microencapsulação de compostos. ... 27 Figura 2. Representação esquemática das etapas do processo de microencapsulação por coacervação (Suave, 2006). ... 28 Figura 3. Cromatograma (GC-MS) expandido (32,68 min) do óleo essencial de tomilho. ... 47 Figura 4. Potencial Zeta dos biopolímeros. ... 50 Figura 5. Micropartículas produzidas por coacervação complexa de GA:QUI com óleo D-limoneno (A) microscopia óptica (B, C) microscopia confocal 75 µm. ... 54 Figura 6. Micropartículas produzidas por coacervação complexa de GE:GA com óleo essencial de D-limoneno (A) microscopia óptica (B, C) microscopia confocal 75 µm. ... 55 Figura 7. Micropartículas produzidas por coacervação complexa de GE:QUI com óleo essencial de D-limoneno (A) microscopia óptica (B, C) microscopia confocal 75 µm. ... 55 Figura 8. Liberação não acumulada de timol a partir partículas de GA:GE reticuladas com tripolifosfato de sódio (TPP) e glutaraldeido (GLU). ... 59 Figura 9. Liberação não acumulada de pcimeno a partir de partículas de GA:GE reticuladas com tripolifosfato de sódio (TPP) e glutaraldeido (GLU). ... 59 Figura 10. Contagem fúngica em diferentes tempos durante a vida de prateleira do bolo, amostras com 3 unidades de bolos por tratamento. ... 69 Figura 11. Bolo sem tratamento. (A) Após 15 dias, (B) Após 30 dias. Armazenados em estufa BOD a 25 °C. ... 72 Figura 12. Bolo com tratamento de micropartículas 5 vezes o valor da MIC. Após 30 dias. Armazenado em estufa BOD a 25 °C. ... 72
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Compilação de trabalhos utilizando a técnica de coacervação complexa. 29
Tabela 2. Ingredientes para formulação da massa do bolo. ... 43
Tabela 3. Tratamentos aplicados às amostras de bolo. ... 44
Tabela 4. Analitos identificados no óleo essencial de tomilho (T. vugaris). ... 48
Tabela 5. Condições para preparação dos sistemas. ... 52
Tabela 6. Caracterízação do processo de formação e das partículas formadas. ... 53
Tabela 7. Potencial Zeta realizado durante as etapas de produção dos coacervados; na etapa de emulsão com o primeiro polímero e após a adição do segundo polímero e ajuste de pH. ... 56
Tabela 8. Tamanho das micropartículas coacervadas contendo óleo essencial de tomilho. ... 57
Tabela 9. Estabilidade oxidativa de óleo de tomilho livre, encapsulado e reticulado. 61 Tabela 10. Concentração Inibitória Mínima (MIC) do óleo de tomilho (T. vugaris) livre. ... 62
Tabela 11. Concentração Inibitória Mínima (MIC) do óleo de tomilho (T. vulgaris) encapsulado ... 66
SUMÁRIO
1. Introdução ... 15
2. Objetivo geral ... 18
2.1 Objetivos específicos ... 18
3. Revisão bibliográfica ... 19
3.1 Características gerais de óleos essenciais ... 19
3.1.1 Óleo essencial de tomilho e suas propriedades biológicas ... 21
3.2 Microencapsulação de óleo essencial ... 23
3.2.1 Coacervação complexa ... 27
3.2.1.1 Agentes encapsulantes usados para coacervação complexa ... 30
4. Material e métodos ... 32
4.1 Material ... 32
4.2 Caracterização do óleo essencial de tomilho ... 32
4.2.1 Determinação da composição química ... 32
4.2.2 Estabilidade oxidativa ... 33
4.2.3 Determinação do teor de esteróis do óleo essencial de tomilho ... 33
4.3 Preparação das micropartículas ... 34
4.3.1 Preparo das soluções ... 34
4.3.2 Potencial Zeta ... 35
4.3.3 Coacervação complexa ... 35
4.3.4 Rendimento do processo de coacervação ... 35
4.3.5 Eficiência da Encapsulação ... 37
4.3.6 Morfologia das partículas formadas ... 38
4.3.6.1 Tamanho médio das partículas e a distribuição de tamanho ... 39
4.3.7 Reticulação ... 39
4.4.1 Determinação da atividade antimicrobiana (CLSI, 2003; CLSI, 2002). .. 40
4.4.1.1 Micro-organismos ... 40
4.4.1.2 Manutenção e preservação dos microrganismos ... 41
4.4.1.3 Meios de cultivo para os testes de atividade antimicrobiana... 41
4.4.1.4 Preparo do óleo essencial para os testes de atividade antimicrobiana ... 41
4.4.1.5 Preparo de soluções de antibióticos ... 41
4.4.1.6 Preparação e padronização do inóculo para os ensaio de atividade antimicrobiana ... 42
4.4.1.7 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) pelo Método da Microdiluição ... 42
4.4.1.8 Leitura dos resultados ... 42
4.5 Aplicação de óleo de tomilho sobre a superfície de uma formulação de bolo 43 4.5.1 Preparo da massa de bolo ... 43
4.5.2 Aplicação do óleo de tomilho livre e encapsulado reticulado com tripolifosfato de sódio (TPP) na superfície do bolo ... 44
4.6 Análise de atividade de água (aw) ... 45
4.7 Análise microbiológica dos bolos ... 45
4.7.1 Determinação de bolores e leveduras ... 45
4.7.2 Determinação de Coliformes a 45 °C e Salmonella ... 45
4.8 Análise estatística ... 46
5. Resultados e discussão... 47
5.1 Caracterização do óleo essencial de tomilho ... 47
5.2 Formação de micropartículas ... 49
5.3 Avaliação do efeito protetor da partícula ... 57
5.3.1 Estudo de liberação “in vitro” ... 57
5.4 Análise antimicrobiana e antifúngica do óleo essencial de tomilho ... 61
5.4.1 Análise antimicrobiana e antifúngica do óleo essencial de tomilho encapsulado “in vitro” ... 65
5.4.2 Análise do potencial antifúngico do óleo essencial de tomilho encapsulado aplicado a uma formulação de bolo ... 68
6. Conclusões ... 74
7. SugestÂo de continuidade para trabalhos futuros ... 75
8. Nota de autor para ajuste de condutividade ... 76
RESUMO
Ao se desenvolver um ingrediente alimentício, pode-se incorporar a ele diferentes propriedades de uma única vez, possibilitando aliar propriedades funcionais a propriedades de preservação. Como preservantes, a indústria de alimentos utiliza substâncias que atuam no produto durante a estocagem, evitando o crescimento de fungos e micro-organismos patogênicos e consequentemente aumentando sua vida de prateleira, ou para torná-lo mais seguro do ponto de vista microbiológico, controlando o desenvolvimento de micro-organismos contaminantes. No entanto, muitas destas substâncias sintéticas estão sendo contestadas atualmente. Óleos essenciais são substâncias naturais extraídas de diferentes plantas e que são conhecidas por apresentarem propriedades terapêuticas, antimicrobianas, antifúngicas, anti-helmínticas e, alguns deles, inseticidas. Desta forma, estes óleos poderiam ser empregados na indústria de alimentos como substituto a aditivos sintéticos. No entanto, seus componentes bioativos são normalmente susceptíveis à degradação pela exposição à luz, calor ou oxigênio, ou pela interação com outros compostos, presentes em formulações complexas, que podem limitar sua ação biológica. A microencapsulação, como sistema de liberação controlada destas substâncias, contribui para melhorar a proteção contra a oxidação e volatilização do óleo, garantindo sua eficácia. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi projetar uma partícula ativa contra micro-organismos patogênicos comuns em alimentos, utilizando o óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris). A técnica adotada foi a coacervação complexa, e três sistemas poliméricos foram avaliados para encapsular o principio ativo. Através da manipulação da permeabilidade da parede polimérica foi possível avaliar o comportamento de liberação do principio ativo ao longo do tempo. Neste trabalho foi avaliada a atividade contra bactérias e fungos “in vitro” do óleo e realizada a aplicação destas partículas sobre bolos. A micropartícula conferiu proteção contra a volatilização do óleo encapsulado e a possibilidade de se utilizar menor quantidade de óleo para fornecer proteção microbiana.
Palavras – chave: bactérias, fungos, bolo, alimentos, aditivo sintético, preservante natural, coacervação complexa.
ABSTRACT
When developing a food ingredient can be incorporated to it different properties at one time, allowing to combine functional properties preservation properties. As preservatives, the food industry uses substances that act on the product during storage, preventing the growth of fungi and pathogenic micro-organisms and thereby increasing its shelf life, or to make it safer from a microbiological point of view, controlling growth of contaminating microorganisms. However, many of these synthetic substances are currently being challenged. Essential oils extracted from natural substances are different plants and are known to have therapeutic properties, antimicrobial, antifungal, anthelmintic, and some of them insecticides. Thus, these oils could be used in the food industry as a substitute for synthetic additives. However, their bioactive components are normally susceptible to degradation by exposure to light, heat or oxygen, or by interaction with other compounds present in complex formulations that may limit its biological action. Microencapsulation, as controlled release system of these substances helps to improve the protection against oxidation and volatilization of the oil, ensuring its effectiveness. Thus, the aim of this study was to design an active particle against common pathogenic micro-organisms in food, using the essential oil of thyme (Thymus vulgaris). The technique used was the complex coacervation, and three polymer systems were evaluated for encapsulating the active ingredient. By manipulating the permeability of the polymeric wall was possible to evaluate the release behavior of the active principle over time. It was evaluated the activity against bacteria and fungi "in vitro" Oil and accomplished the application of these particles on cakes. The microparticle confer protection against encapsulated volatilization of the oil and the possibility of using smaller amount of oil to provide microbial protection.
Keywords: bacteria, fungi, cake, food, synthetic additive, natural preservative, complex coacervation.
1. INTRODUÇÃO
Durante as variadas etapas do processamento de alimentos podem ocorrer contato com micro-organismos patogênicos decorrentes da manipulação fora dos padrões higiênicos sanitários ideais, contato com ambiente e/ou superfície de equipamento contaminado (Faustino & Passos, 2007). Além disso, os aspectos nutricionais dos compostos disponíveis no próprio alimento (carboidratos, proteínas, lipídios) e a elevada atividade de água são fatores primordiais para o desenvolvimento microbiano (Scapin, 2011).
Para evitar essa contaminação, a indústria de alimentos lança mão de conservantes, a maioria substâncias químicas capazes de fornecer alto grau de proteção contra micro-organismos patogênicos e aumentar a vida de prateleira do produto. No entanto o uso de aditivos sintéticos têm despertado a preocupação dos consumidores e, apesar da aplicação ser controlada pelos órgãos de segurança, as quantidades ingeridas pela população podem ser altas, acarretando efeitos colaterais à saúde humana (Aun et al., 2011). Assim, conservantes naturais vêm sendo cada vez mais investigados pela perspectiva de atuarem em produtos alimentícios em substituição aos conservadores sintéticos (Cansian et al., 2010).
Neste contexto, os óleos essenciais se destacam por apresentarem muitos constituintes já relatados como antimicrobianos e com propriedades terapêuticas (Nguefack et al., 2009). O eugenol, por exemplo, composto principal do óleo de cravo, possui comprovada atividade antibacteriana, antiviral, analgésica, antisséptica, fungicida e nematicida (Pina-Vaz et al., 2004). O citronelol do capim limão, é responsável por sua ação inseticida (Corrêa & Salgado, 2011). De forma geral, a maior parte dos óleos essenciais possuem funções biológicas, e muitos deles podem ser utilizados como biopreservativos para eliminar ou reduzir a população patogênica (Nguefacket al., 2009) e controlar a infestação de insetos pós-processamento (Fang et al., 2010; Tunc, Berger, Erler, & Dagli, 2000).
O óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris), contém como um de seus compostos majoritários o timol (2-isopropil-5-metifeno), que dentre os vários
identificados nos óleos essenciais, é responsável por sua ação antimicrobiana, e é relatado como estando dentre os mais eficientes (Wattanasatcha, Rengpipat, & Wanichwecharungruang, 2012).
No entanto, a incorporação de ingredientes funcionais em uma formulação apresenta desafios relacionados à interação destes compostos com os demais constituintes da mesma formulação. Além disso, em especial os óleos essenciais que possuem monoterpenos de baixa massa molecular e alta volatilidade, são mais susceptíveis à degradação pela exposição ao calor, à luz ou ao oxigênio (Nguefack et al., 2009), variáveis comuns durante o processamento e a estocagem de um produto.
Uma maneira de contornar problemas de interação indesejada e reações de degradação em formulações alimentícias, é o uso da microencapsulação. O objetivo da técnica é formar uma barreira física que pode proteger o composto encapsulado das condições do meio (interação ou reação) e, quando bem projetada, pode controlar sua liberação a taxas e locais específicos (Leimann, 2008).
Muitos trabalhos podem ser encontrados na literatura sobre encapsulação de óleos essenciais com foco na proteção e no controle da liberação. Muitos deles utilizam a técnica de atomização (spray drying) por produzir partículas secas (Beirão-da-Costa et al., 2013; Beristain, Garcı́a, & Vernon-Carter, 2001; Rodea-González et al., 2012). No entanto, o pó extremamente fino requer posterior aglomeração para instantaneizá-lo. A incorporação dos óleos em ciclodextrinas também é bastante difundida (Fang, Comino, & Bhandari, 2013; Hill, Gomes, & Taylor, 2013; Ponce Cevallos, Buera, & Elizalde, 2010), porém a principal desvantagem em se utilizar essa inclusão molecular é o lento e complexo processo de solubilização que, para liberação em alimentos, deve ser mais rápida. Uma outra opção é o uso da coacervação complexa para o desenvolvimento de formulações com ingredientes naturais. Esta técnica é muito empregada em escala industrial, e podem ser obtidas altas eficiências de encapsulação e diferentes gatilhos de liberação (Gouin, 2004). No entanto, não existe um estudo sistemático para avaliar a influência da partícula na atividade antimicrobiana e na proteção do óleo contra oxidação.
Assim, este trabalho foi realizado com o intuito de desenvolver uma partícula por coacervação complexa para veiculação do óleo de tomilho branco e avaliar seu comportamento em relação à proteção e à liberação do composto encapsulado. A parede da partícula foi reticulada para controlar a liberação do óleo essencial “in vitro” e posteriormente, a aplicação foi simulada na superfície de bolos assados. A proteção conferida pela partícula também foi investigada através da análise da estabilidade oxidativa do óleo encapsulado. A atividade antimicrobiana do óleo de tomilho branco foi determinada através da concentração inibitória mínima para micro-organismos de origem alimentar. A efetividade do óleo livre e encapsulado sobre bolos foi avaliada visualmente e através da contagem de micro-organismos desenvolvidos.
2. OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi de formular um ingrediente microencapsulado contendo óleo essencial de tomilho, para ser incorporado em diferentes produtos alimentícios.
2.1 Objetivos específicos
• Avaliar diferentes combinações de materiais de parede na formação de micropartículas por coacervação complexa, para otimizar características de eficiência de encapsulação, rendimento de produção e morfologia.
• Avaliar o efeito da reticulação da matriz polimérica na liberação do composto encapsulado, de forma a estabilizar a parede da partícula e a promover uma liberação sustentada do ativo.
• Avaliar a eficácia protetiva conferida pela partícula através da medida de estabilidade oxidativa do óleo essencial de tomilho branco.
• Determinar a ação antimicrobiana do óleo essencial de tomilho branco contra fungos e bactérias Gram-positivas e Gram-negativas comumente encontradas em alimentos.
• Avaliar a eficácia da veiculação do óleo nas micropartículas com a aplicação em bolos.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Características gerais de óleos essenciais
Óleos essenciais são frações voláteis de óleos extraídos de diversas partes das plantas (folhas, flores, madeiras, ramos, galhos, frutos, rizomas). Geralmente são constituídos de um componente principal, no entanto são mesclas de substâncias orgânicas odoríferas que se formam como subprodutos do metabolismo secundário. Eles se diferenciam de óleos vegetais graxos, como canola e girassol, principalmente por evaporarem ou volatilizarem em contato com o ar. São compostos muito importantes, pois além das características olfativas / gustativas (flavor), possuem propriedades terapêuticas e ação bactericida. Alguns podem apresentar propriedade antiviral (Probst, 2012), antimicótica (Maria, Farias, & Souza, 2006), antiparasitária (Leite et al., 2013) ou inseticida (Melo et al., 2011).
Por esta razão, a demanda de óleos essenciais é cada vez maior para aplicação na indústria alimentícia, farmacêutica e cosmética. No óleo essencial a proporção relativa de cada componente na mistura é determinada pela genética da espécie da planta, fatores ambientais e de cultivo como condição de solo e pelo modo de extração, que pode ser manipulado para otimizar a presença de certo componente (Burt, 2004). A quantidade de óleo que pode ser extraída varia de uma quantidade infinitesimal até 1-2% do peso da matéria vegetal seca (Aparecida et al., 2010).
O mercado internacional de óleos essenciais é responsável pela movimentação de US$15 milhões por ano, dos quais 40% são adquiridos por empresas dos EUA, 30% União Européia. A França é a líder em importação ao lado do Japão representando 7%, seguido da Irlanda, Alemanha, Espanha, Suíça, China, Reino Unido, Cingapura. Em relação à exportação, os EUA e a França estão nas primeiras posições e o Brasil se classifica em terceiro lugar (Souza et al., 2010). Os mercados consumidores de óleos essenciais são variados e os principais são a indústria de alimentos e bebidas, aplicações nutracêuticas, cosméticas, medicinais e
a indústria de pesticidas. Apenas 20 a 25% dos óleos essenciais são quimicamente processados para o isolamento de um composto. A maioria é usada na sua forma complexa original.
A composição dos óleos essenciais pode apresentar de 20 a 60 constituintes entre terpenóides, terpenos, alifáticos e aromáticos. Alguns óleos, no entanto podem ter cerca de 70% de sua composição atribuída a um componente majoritário (Bakkali et al., 2008).
A fragrância das plantas medicinais é consequência desses componentes onde a cada classe são normalmente atribuídas propriedades particulares. Por exemplo, na classe dos terpenóides os monoterpenos (C10) podem representar até 90% da composição dos óleos essenciais, e são principais responsáveis pela atração dos polinizadores à planta, e provavelmente são compostos que possuem a fragrância. Os sesquiterpenos (C15) são conhecidos pela proteção à planta, e por isso, a maior parte tem ação antifúngica e antibacteriana, os triterpenóides e os esteroides tem muitas variações nas suas funções, e grande parte dos diterpenídes participam do metabolismo dos hormônios de crescimento vegetal das plantas (Probst, 2012; Antunes, 2013).
Normalmente, admite-se que as propriedades de um óleo são responsabilidade do composto majoritário, mas existem evidências de que os componentes secundários têm um papel crucial na atividade antibacteriana por produzir um efeito sinergístico entre outros componentes (Marino et al., 2001).
As propriedades antibacterianas de óleos essenciais são bastante exploradas em produtos odontológicos e antissépticos (Cox et al., 2000) e alguns conservantes já estão disponíveis comercialmente. Na indústria alimentícia, muitos óleos essenciais têm demonstrado atividade contra microrganismos contaminantes de produtos alimentícios incluindo a Listeria monocytogenes, um dos cinco tipos mais agressivos de patógenos de origem alimentar (López, Sánchez, Batlle, & Nerín, 2005). Na lista de microrganismos que têm seu crescimento inibido pelo uso de óleos essenciais encontram-se os Staphylococcus aureus – que se aloja na mucosa naso-faríngea, a Escherichia coli – grande responsável por surtos de gastroenterite,
a Salmonella entérica Enteritidis, Clostridium botulinum, Enterococcus faecalis e Aspergillus spp. (Marino et al., 2001;Millezi et al., 2012; Nikolić et al., 2014).
Estudos sugerem que o grau de toxicidade dos óleos essenciais depende da dose utilizada, do nível de sensibilidade de cada pessoa e da via de administração usada. A administração pela via oral pode ser a mais nociva, principalmente se o óleo essencial estiver na sua forma pura, provocando reações alérgicas ou crises convulsivas. Os óleos essenciais são compostos químicos e a ingestão em conjunto com medicamentos diversos pode resultar em reações tóxicas (Cavaleiro, 2007).
De acordo com a estrutura química dos óleos essenciais, os que apresentam insaturação geralmente possuem efeito mais tóxico (Antunes, 2013). No caso da indústria farmacêutica, na formulação de medicamentos segue-se o protocolo das entidades reguladoras e normalmente a dose usada de óleo essencial não ultrapassa 5%, sendo assim, com o uso desse percentual é difícil um individuo desenvolver algum tipo de reação adversa. Um exemplo clássico é o óleo de quenopódio (Chenopodium ambrosioides L,) considerado altamente tóxico, se adicionado numa proporção de 5% em uma formula medicamentosa pode provocar o óbito em um individuo de 50 kg, porém para tal fenômeno é necessária uma ingestão de 250 g do suposto medicamento (Cavaleiro, 2007).
O estudo de Aparecida et al., (2008) sugere em relato que, em mulheres, o óleo essencial de tomilho pode causar alterações no ciclo menstrual, portanto deve ser consumido em pequenas doses, já durante a gestação e/ou lactação não há nenhum histórico de efeito toxico (Aparecida et al., 2008).
3.1.1 Óleo essencial de tomilho e suas propriedades biológicas
Da variedade de espécies de plantas com características odoríferas adaptadas ao clima tropical, muitas possuem componentes economicamente interessantes, como o linalol, a cânfora, o eugenol, o carvacrol e o timol, amplamente explorados por possuírem ação bactericida comprovada (Burt, 2004).
O óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris - Lamiaceae) é originário de países mediterrâneos (Nguefack et al., 2009). É uma planta que se desenvolve bem
em áreas secas, áridas e exposta aos raios solares, não se desenvolvendo bem em terras úmidas (Antunes, 2013). A maioria dos óleos de Thymus são ricos nos compostos fenólicos, timol e o carvacrol, relacionados com muitas atividades biológicas como efeito antimicrobiano, antifúngico e anti-helmíntico (Gutiérrez-Larraínzar et al., 2012; Daferera et al., 2000). Apesar da composição ser muito diferente de um local para outro, o timol pode representar de 10 a 64% do óleo e seu isômero carvacrol entre 2 a 11%. Outros compostos em concentrações relevantes, identificados e normalmente presentes são o γ-terpineno (2-31%) e o p-cimeno (10-56%) (Burt, 2004).
A ação bactericida sobre as bactérias Gram positivas e negativas do óleo de tomilho se deve à combinação de seus componentes. O mecanismo de ação do timol e de seu isômero carvacrol sobre os microrganismos é através do rompimento da membrana citoplasmática da parede das bactérias Gram negativas. Já o p-cimeno, por ser uma substância hidrofóbica, gera um inchaço exacerbado da membrana citoplasmática, fragilizando-a (Barbosa, 2010; Alves, 2014).
O mecanismo de ação antifúngica acontece de modo similar ao bacteriano, mas as substâncias químicas dos óleos essenciais podem deteriorar a célula do fungo através do rompimento da membrana plasmática, das proteínas de membrana, do curso de elétrons, ou da coagulação do citoplasma (Esper, 2011).
Os componentes fenólicos (carvacrol e timol) são responsáveis pela maior atividade antifúngica do óleo e foi confirmada sua ação contra 13 espécies de Penicillium spp., 9 de Aspergillus spp. e 17 espécies de outros fungos (Esper, 2011; Koci & Dimi, 2013).
Além disso, essas moléculas, por apresentarem grupos hidroxilas junto ao anel aromático, possuem propriedades antioxidantes, e como as células e tecidos do organismo humano são compostas por elétrons não pareados, chamados de radicais livres e responsáveis pelo estresse oxidativo que está relacionado com as alterações celulares demostradas em estudos, tais como doenças degenerativas, esse fenômeno ocorre quando há um desequilíbrio entre as moléculas oxidantes e antioxidantes. Por isso a incrementação de alimentos e bebidas com compostos antioxidantes pode favorecer o combate às espécies reativas (Lima, 2007).
Reações semelhantes ocorrem durante o processamento de alimentos industrializados com moléculas mais susceptíveis, como as de fonte lipídicas tais como as vitaminas lipossolúveis e os ácidos graxos essenciais. Essas moléculas ao sofrerem oxidação refletem no produto final, características sensoriais e organolépticas desagradáveis como: sabor, odor, coloração e consistência, inviabilizando o seu consumo (Marangoni & Fernandes, 2011).
De forma a evitar os efeitos negativos da oxidação lipídica, comumente a indústria de alimentos utiliza antioxidantes sintéticos. Entre eles os mais utilizados são BHA (2-ter-(butil-4)-metoxifenol) e BHT (2,6-di(ter-butil)-p-cresol), apesar de serem altamente tóxicos e cancerígenos (Morais & Stone, 2006).
Muitos estudos têm sugerido o uso dos óleos essenciais como antioxidantes naturais para prevenção da oxidação de lipídeos em produtos alimentícios, como uma opção aos antioxidantes sintéticos (Bertolin, 2010; Marangoni & Fernandes, 2011; Aparecida et al., 2010).
Outra propriedade comum a alguns vegetais, incluindo a madeira e as sementes, é a capacidade de síntese de fitoesterol, que são uma classe de esteróis encontrados no extrato lipossolúvel de plantas, e cuja função nas mesmas é principalmente relacionada à sua capacidade de afetar a fluidez da membrana e permeabilidade à água. Eles também atuam como hormônios vegetais e precursores hormonais. No corpo humano, por possuírem estrutura semelhante ao colesterol e não serem absorvidos, eles auxiliam a reduzir o colesterol sérico, sendo muito aplicados a dietas para hipercolesterolemia, hipertensão e doenças coronárias (Mirjana Milovanović, 2009).
Alguns óleos essenciais podem conter fitoesteróis e as espécies de plantas aromáticas domésticas mais conhecidas que os possuem são a Mentha piperita L. e o Thymus vulgaris L., descritas na literatura como fontes de ampla disseminação de fitoesteróis (Mirjana Milovanović, 2009).
3.2 Microencapsulação de óleo essencial
A microencapsulação é uma técnica utilizada para aprisionar um componente ativo em partículas de dimensões microscópicas com duas finalidades
principais: proteção e/ou liberação controlada. As microcápsulas ou micropartículas são formadas por um núcleo, líquido ou sólido, e uma parede polimérica ou não, que confina e protege o material de efeitos nocivos e libera o componente ativo sob estímulo específico. Para indústria de alimentos é usada para melhorar a estabilidade de componentes voláteis e termolábeis como óleos e vitaminas (Leimann, 2008).
Além disso, a microencapsulação pode conferir proteção a componentes com susceptibilidade a interações indesejáveis com os demais compostos das formulações e é difundida para mascarar sabor ou odor desagradável de ingredientes adicionados à formulações alimentícias (AnDrªde & Neves, 2013).
Existem muitas técnicas para produzir sistemas encapsulados e a escolha da mais apropriada consiste em reduzir as perdas das características do ativo durante o processo, otimizar a concentração do ativo na partícula e manter a estabilidade da mesma no produto final. Assim, para compostos sensíveis é necessário um processo que utilize condições brandas de temperatura e pH ideal (Matté & Rosa, 2013).
Os diferentes tipos de microcápsulas podem ser produzidos através de uma gama muito variada de materiais e métodos de encapsulação, divididas em métodos físico-químicos: coacervação simples ou complexa, envolvimento lipossômico, separação por fase orgânica, pulverização em agente de reticulação; métodos físicos: spray-drying, spray-chilling, spray-cooling, liofilização,extrusão, leito fluidizado, co-cristalização; métodos químicos: inclusão molecular, polimerização interfacial (Gibbs & Mulligan, 1999).
As partículas formadas nos diferentes métodos se diferem quanto à morfologia e o tamanho. Elas podem apresentar formatos esféricos ou irregulares e de acordo com a distribuição do principio ativo, podem ser consideradas como partículas, quando o ativo esta disperso na matriz (sistema monolítico), ou cápsula quando o núcleo se encontra definido e protegido pela parede (reservatório) (Figura 1). Além disso, são classificadas quanto ao tamanho em macro, micro e nanopartículas, as partículas com estrutura entre 1 a 100 µm se encontram na classificação micro (Soares, 2006).
A estrutura morfológica afeta as características de liberação dos compostos encapsulados. Em sistemas matriciais e não degradáveis, a liberação do composto encapsulado é controlada pela difusão do composto através de toda a matriz. Desta forma, verifica-se maior barreira à transferência nestes sistemas que em sistemas reservatórios e por isso, normalmente partículas matriciais são desenvolvidas para aplicações que necessitem de uma liberação mais sustentada (Soares, 2006).
O uso da microencapsulação com o objetivo de controlar de saída do princípio ativo, possibilita o uso otimizado do ativo, por razões de custo ação ou toxicidade (Andrade & Neves, 2013).
O controle de liberação pode adiar ou prolongar o efeito do agente ativo. Um exemplo de liberação retardada é o encapsulamento de probióticos com objetivo de liberação lenta na porção do intestino delgado sendo protegido dos danos causados pelo ambiente gástrico. No caso da liberação prolongada, as gomas de mascar necessitam que o sabor adocicado seja prolongado até o fim da mastigação (Santos, 2014).
Alguns fatores como tipo de material de parede, grau de reticulação deste material, interação ativo-material de parede, tamanho de partícula e meio de liberação são fundamentais para se projetar um sistema de liberação controlado eficiente (Devi & Maji, 2011).
Existem alguns mecanismos pelos quais a liberação do ativo pode ser controlada. A liberação controlada pela difusão, indica que o material ativo deverá atravessar a parede porosa da partícula (no caso de sistemas reservatórios) ou atravessar toda a matriz polimérica, caso a configuração da partícula seja matricial.
Na liberação controlada pelo inchamento da matriz, a matriz polimérica também não se desfaz, como no processo controlado pela difusão, mas a entrada de solvente na partícula faz com que a pressão interna aumente e expulse o componente ativo por diferença de pressão e abertura dos polos poliméricos (Pothakamury & Barbosa-Cánovas, 1995).
A liberação do ativo também pode acorrer sendo controlada pela velocidade de degradação da matriz polimérica no meio de liberação. Este sistema é exclusivo de partículas matriciais (Brasileiro, 2011; Pothakamury & Barbosa-Cánovas, 1995).
Liberação target: Neste caso não existe uma liberação sustentada, mas sim uma liberação total, que pode ser devido as condições do meio provocarem o rompimento da partícula. Os gatilhos mais utilizados são pressão, pH e temperatura (Brasileiro, 2011).
Os diferentes mecanismos que podem controlar a liberação do ativo podem ocorrer simultaneamente. Na indústria alimentícia ultiliza-se muitos ingredientes suceptíveis a ação do calor, aroma, saborizantes. A encapsulação é usada para evitar a oxidação e degradação destes produtos durante o processamento, mas também durante o consumo ou estocagem (Santos, 2014; Soares, 2006).
A reticulação é a formação de ligações químicas entre as cadeias moleculares. Um modo de ajustar a saída do ativo é através da reticulação. Ela é usada para reduzir a porosidade da membrana ou melhorar resistência mecânica. A porosidade da partícula implica em reduzir a liberação do componente ativo, o que, para algumas aplicações pode ser interessante. Como agentes reticulantes, os aldeídos (glutaraldeído, fomaldeído, etc) são muito utilizados quando a partícula não é destinada ao consumo humano. No entanto, devido a sua toxicidade, eles vêm sendo substituídos por compostos com menor toxicidade como a transglutaminase, genipina e sais iônicos como o tripolifosfato de sódio (Santos, 2014).
Figura 1. Ilustração esquemática para a microencapsulação de compostos.
3.2.1 Coacervação complexa
A coacervação complexa é uma técnica de microencapsulação que permite através da junção de dois biopolímeros a formação de um complexo insolúvel, que acontece diante de condições ideais como: pH, temperatura e proporção de cargas opostas, ocasionando a separação das fases, sendo composta pela a fase liquida (sobrenadante) e fase coloidal (massa de partícula), assim os biopolímeros complexados se fixam ao redor do principio ativo formando uma parede protetora, que fará o controle de proteção e liberação do ativo (Prata & Grosso, 2014).
As partículas produzidas por coacervação complexa apresentam elevada quantia de água, assim como a capacidade de aprisionamento de substâncias hidrofóbicas como material ativo, tornando o sistema capaz de carregar uma alta quantidade de composto ativo, esse fato possibilita a aplicação desse tipo de partícula em alimentos com teor de água elevado (Rocha-Selmi et al., (2013).
A coacervação complexa é realizada em algumas etapas: dissipação do composto ativo (núcleo) em solução polimérica; deposito do complexo em torno do núcleo; formação da camada polimérica; enrijecimento da camada de polímero (por difusão, uso de agente reticulante, mudança de pH, temperatura) (Santa, 1930), (Figura 2). A coacervação oferece alguns benefícios como: processo simples que não necessita de solventes orgânicos, utiliza temperaturas amenas, é muito aplicada
para encapsular óleos essenciais que possuem componentes que volatizam em altas temperaturas (Soares, 2006).
Figura 2. Representação esquemática das etapas do processo de microencapsulação por coacervação (Suave, 2006).
Uma das desvantagens da produção de micropartículas pelo método de coacervação é que para que a mesma ocorra, parâmetros como pH, temperatura, concentrações de colóides e suas cargas elétricas devem estar nas condições ideais ( Silva et al., 2014).
Para isso a escolha dos agentes encapsulantes, que são conhecidos também como material de parede, é muito importante, pois conferem a proteção do material ativo, e são divididos em três tipos:
• Naturais: gelatina, goma agar agar, alginato de sódio, alginato de cálcio, dextrano, quitosana, caseinato, cera e sacarose;
• Semi- sintéticos podem ser citados: acetato de celulose, nitrato de celulose, etilcelulose, hidroxipropilcelulose, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, álcool miristírico, álcool miceril mono ou dipalmitato ou mono di e triestearato de glicerl;
• Sintéticos: polímeros do ácido acrílico e co-polimeros (Brasileiro, 2011; Matté & Rosa, 2013).
O tipo de material de parede escolhido depende de alguns fatores como: características do composto encapsulado (núcleo) solubilidade, porosidade, escolha do método de produção de microcápsulas e área de aplicação (indústria de alimentos, farmácia, indústria agrônoma) (Brasileiro, 2011). Os polímeros mais utilizados para produção de partículas por coacervação complexa são os que apresentam densidades de cargas elétricas opostas e solubilidade em meio aquoso, sendo características que possibilitam a separação de fases (Li et al., 2012). A composição química e estrutural destes polímeros estão descritas nos tópicos posteriores.
A Tabela 1 resume algumas pesquisas que utilizaram a coacervação complexa para produção de micropartículas.
Tabela 1. Compilação de trabalhos utilizando a técnica de coacervação complexa.
Polimero 1 Polimero 2 pH Ativo Referencia
Gelatina Pectina 3, 3,5, 4,5 e 4 licopeno (Rocha-Selmi et
al., 2013)
Quitosana Gelatina 5.5 clofibrato,
piroxicam, sulfametoxazol (Remuñán-López & Bodmeier, 1996)
Goma arabica Gelatina 4 Oleo essencial
de vetiver ( Prata et al., 2008) Gelatina Hexametafosfato de sodio (SHMP)
4.7 Óleo de atum (Wang,
Adhikari, & Barrow, 2014)
Gelatina Quitosana 7-8 Óleo
Limonella Zanthoxylum
(Hussain & Maji, 2008)
Gelatina Goma arabica 4 Óleo de resina
de páprica
(Alvim & Grosso, 2010)
Gelatina Goma arabica 4.4 Ácido ascórbico
(Comunian et al., 2013)
Gomara arabica Gelatina 8-9 Óleo essencial
de limão
(Miro Specos et al., 2010)
Gelatina SDS / NaCMC 4.4-4.8 Óleo de peixe (Eugene et al.,
2013) Proteína isolada
de soja
Goma arabica 4 Óleo essencial
de laranja
(Jun-xia, Hai-yan, & Jian,
2011) Proteína isolada de soja Pectina 4.4 Hidrolizado de caseína (Mendanha et al., 2009) Proteína isolada de soja Pectina 5,0- 4,5 - 4,0 -3,5 Extrato de própolis (Nori et al., 2011)
Whey protein Goma arabica 4 Óleo de limão
e laranja
(Weinbreckt & Minorf, 2004)
Gelatina Quitosana 6 Oleo essencial
d-limoneno
(Prata & Grosso, 2014)
3.2.1.1 Agentes encapsulantes usados para coacervação complexa
Gelatina: é uma proteína derivada da hidrólise do colágeno proveniente de tecidos conectivos, osso e pele de bovinos e suínos, em temperaturas de 38 á 40°C é solúvel em água, o colágeno tem na sua composição cerca de 33% de glicina, 22% de hidroxiprolina e prolina (Soares, 2006).
Para aumentar a taxa de extração e a manutenção de suas propriedades físicas durante a extração do colágeno há etapas com oscilação de temperatura entre 60 e 90°C e pH-dependente. Dependendo do pH do meio a gelatina pode ter ação com base ou ácido, essa condição define o comportamento de cargas que pode ser positiva em meio ácido e negativa em meio alcalino, mas alterações nos
grupos amídicos e carboxílicos podem ocorrer e modificar os pontos isoelétricos da gelatina (Saha & Bhattacharya, 2010). Dependendo do tratamento aplicado durante o processo de hidrólise, o ponto isoelétrico da gelatina extraída pode variar entre 4,5 e 5,3 para gelatina do tipo B (pre-tratamento em meio alcalino) e de 7,0 a 9,4 em gelatina tipo A (pre-tratamento em meio ácido) (Soares, 2006).
Goma arábica: é um polímero também chamado de goma acácia, comestível extraído como exsudado de arvores, quando sofrem algum tipo de lesão, corte ou estresse e expele um liquido rico em fibras, as duas espécies de arvores, Acácia Seyal, e Acácia Senegal são as principais produtoras da goma arábica são na maioria das vezes produzidas no Sudão. O nome foi dado a esse polímero porque era exportada de portos árabes. Na indústria de alimentos, é aplicada como estabilizante e emulsionante (Montenegro & Borsarelli, 2012).
Sua composição química é formada por macromoléculas de tamanhos e composição distintas, os carboidratos e as proteínas. Na forma estrutural da goma arábica, ligações de cadeias de galactose/arabinose são unidas por uma outra cadeia chamada galactana, juntamente com os carboiDrªtos D-galactose, L-arabinose, L-ramnose e a fração proteica formada pelos ácidos urônicos D-glucurônico e 4-O-metil-D-D-glucurônico responsáveis pelo caráter emulsificante, que são solúveis em água quando estão nas proporções ideais (1:2), nessas condições devido ao meio ácido o pH é alterado, quando em pH > 2,2 e <2,2 não acontece a dissociação dos grupos carboxilas, isso a deixa com alta poder de emulsificação (Espinosa-andrews et al., 2007; Soares, 2006).
Quitosana: é um agente encapsulante natural, derivada de uma fonte renovável, biodegradável, hidrofílica e de baixa toxicidade. Essas características melhoram sua aplicabilidade tecnológica e tem sido muito explorada pelo setor industrial alimentício, como ingrediente para formulação de coberturas comestíveis protetoras para alimentos (Assis & Britto, 2014). A quitosana pode estar presente em microrganismos, principalmente do tipo Mucor, sua extração ocorre pela desacetilação da quitina que é um polímero facilmente encontrado no meio ambiente natural outra fonte é a casca de siri e camarão (Matté & Rosa, 2013).
A forma química da quitosana consiste em β–(1→4)–2–amino 2–desoxi– D–glicose e β–(1→4) – 2– acetamida 2–desoxi–D–glicose que são os copolímeros, mais o grupo amino e grupos hidroxila primário e secundário. O peso molecular, o nível de desacetilação e impurezas variam de acordo com o tipo de fonte natural da matéria prima, é solúvel apenas em meio ácido, característica que acontece devido à presença do grupo amino livre da quitosana in natura, o ácido acético é bastante usado (Matté & Rosa, 2013).
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
Foram usados como materiais formadores de parede, gelatina tipo B de pele bovina (força do gel 244 bloom, LF 21502/04, Gelita South America, São Paulo, SP, Brasil), quitosana não purificada (Polymar Ciência e Nutrição, 20100210, grau de acetilação = 89%, PM = 69.000 g mol-1, Fortaleza, CE, Brasil) e goma arábica (IRX49345, fornecido pela Colloides naturels Brasil Comercial Ltda, PM = 300.000 g mol-1, São Paulo, SP, Brasil). Como material de recheio foram usados, D-limoneno 95% oriundo do óleo essencial de laranja, da Citrosuco S/A, Bebedouro – Brasil, e óleo essencial de tomilho branco adquirido da empresa Petit Marie (Itaquaquecetuba, SP, Brasil). Todos os outros reagentes eram de grau analítico, e água deionizada foi utilizada em todos os experimentos. O glutaraldeído e o tripolifosfato de sódio foram adquiridos da Sigma (São Paulo, SP, Brasil).
4.2 Caracterização do óleo essencial de tomilho
4.2.1 Determinação da composição química
A análise dos constituintes voláteis foi realizada em um cromatógrafo a gás Agilent, modelo HP-6890 equipado com um detetor seletivo de massas Agilent, modelo HP-5975 utilizando uma coluna capilar HP-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm) nas seguintes condições: temperatura do injetor = 220 °C, coluna = 60 °C, taxa de aquecimento de 3 °C/min até 240 °C e detector = 250 °C. Hélio foi utilizado como
gás de arraste numa vazão de 1ml/min. Detector seletivo de massas operando a 70 eV, m/z = 30 a 500 u.m.a.
O óleo foi solubilizado em acetato de etila na concentração de 20 mg/ml e a identificação foi realizada através do cálculo dos índices de retenção dos analitos, utilizando-se a co-injeção de uma mistura de padrões de hidrocarbonetos (C8 a C22). Foi feita a comparação com a biblioteca eletrônica do equipamento (NIST-11) e com dados da literatura (Adams, 2007).
4.2.2 Estabilidade oxidativa
O índice de estabilidade oxidativa estima a resistência à oxidação do óleo e foi obtido em equipamento Rancimat (modelo 843, Methrom, Herisau, Suíça). Compostos orgânicos voláteis produzidos durante o processo de oxidação acelerado provocado pelo fluxo de ar de 10L/h e a 110 °C provocam modificações na condutividade elétrica da água, por isso o gás efluente é borbulhado em um vaso contendo 60 ml de água destilada, cuja condutividade é continuamente gravada. À medida que as reações de formação de compostos de oxidação (ácidos voláteis, nestas condições) são intensificadas, é verificado uma aumento da condutividade, havendo um súbito incremento no valor do período de indução (PI) (Gortzi, Lalas, Chinou, & Tsaknis, 2008).
Este método foi modificado para que o óleo essencial de tomilho pudesse ser testado. Para isso foi necessário uma readaptação das condições para o ajuste de condutividade onde 5 ml de óleo de tomilho livre e encapsulado com e sem reticulante foi adicionado a 55 ml de óleo vegetal (soja, milho e girassol), a avaliação de resposta em termo de condutividade foi elevada e assim foi definida a quantidade de 30 ml de óleo essencial de tomilho livre ou equivalente a essa quantidade quando microencapsulado, a um fluxo de ar (10 L/h) a 110 ºC.
4.2.3 Determinação do teor de esteróis do óleo essencial de tomilho
O óleo de tomilho, adicionado de α-colestanol como padrão interno, foi saponificado com hidróxido de potássio etanólico em solução e, em seguida, a fração insaponificável foi extraída com éter etílico. A fração esterol foi separada a
partir do extrato insaponificável usando uma placa de gel de sílica básica. Os esteróis recuperados a partir do gel de sílica foram transformados em éteres trimetilsilícos e analisados por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar SPB5 (30m x 0.25mm x 0.25μm), temperatura de forno: 220 ºC, 0 min 3 ºC / min até 280 ºC - 280 ºC, 7 min - 265 ºC isoterma, injetor: 300 ºC 290 ºC, detector: 300 ºC 290 ºC, tempo de análise: 30 min 30 min, gás de arraste: helio (20 a 35 cm/s) e Hidrogênio (30 a 50 cm/s).
Os resultados deste ensaio foram processados estatisticamente de acordo com as regras estabelecidas nas normas internacionais ISO 5725 Precisão (veracidade e precisão) dos métodos de medição e resultados. Outliers foram examinados através da aplicação de um teste de Cochran e de Grubbs para os resultados de laboratório para cada determinação (replica a e b) e cada amostra (“International Olive oil Council,” 2001).
4.3 Preparação das micropartículas
Inicialmente, para se escolher a partícula para veiculação do óleo essencial de tomilho, as combinações entre os polímeros gelatina, goma arábica e quitosana foram extensivamente estudadas, utilizando D-limoneno como componente ativo, devido ao custo elevado do óleo essencial de tomilho. A estimativa da faixa de complexação dos polímeros foi definida pela análise de potencial zeta, e após os ensaios preliminares com D-limoneno as partículas foram produzidas nas melhores condições com o óleo essencial de tomilho branco, as quais serão aplicadas nos testes biológicos ( Prata et al., 2008).
4.3.1 Preparo das soluções
A solução de quitosana foi preparada com diluição de 1% (m/v) em ácido acético glacial diluído (1% v/v), alterando-se seu pH com NaOH (1M) para 5,0. A solução de gelatina foi preparada a 2,5% (m/v), aquecendo-a a 40 oC para permitir
as soluções foram mantidas sob agitação constante por um período de 12 horas para garantir sua hidratação.
4.3.2 Potencial Zeta
A carga superficial das soluções poliméricas individuais foram determinadas por potencial zeta, em um equipamento modelo Zetasizer Nanon Z (Malvern Instruments Ltda, Malvern, Worcestershire, UK).
Leituras foram realizadas na faixa de pH de 3,0 a 8,0 para todas as soluções e as alterações de pH foram feitas através da adição de ácido clorídrico (0,5N) ou hidróxido de sódio NaOH (0,5N). Para a leitura, as soluções foram mantidas sob agitação durante todo o experimento.
4.3.3 Coacervação complexa
A preparação das micropartículas por coacervação complexa foi feita com adaptações baseada na metodologia descrita em Lambrecht, Schafer & Lehar (2001). As condições de proporções entre polímeros e pH de coacervação foram determinadas após análise das curvas de potencial zeta. A fase de agente emulsionante, quando gelatina, foi mantida a 50 °C e homogeneizada com a fase oleosa usando um Ultra Turrax (modelo T-18, IKA Works, Inc., EUA) a 14.000 rpm durante 3 min. Em seguida, a fase de complexação na mesma temperatura que a fase emulsificante, foi adicionada e o pH da dispersão foi ajustado para o pH de coacervação do par polimérico. Os sistemas foram mantidos em agitação magnética durante todo o processo de formação de partículas. O sistema que continha gelatina (GE:GA e GE:QUI) foi arrefecido a 10 °C (30 min). Todos os sistemas foram mantidos por cerca de 3 h sob agitação magnética, após a complexação ter ocorrido. Após a coacervação, as micropartículas produzidas foram armazenadas em geladeira a 10 °C por 16 h.
4.3.4 Rendimento do processo de coacervação
A massa total de partículas e água contida no béquer foi determinada. A fase precipitada, que corresponde às micropartículas foi cuidadosamente separada
do sobrenadante, que foi vertido e desprezado. Este processo foi repetido para que as partículas pudessem se compactar ainda mais e expulsassem mais solvente. A massa das micropartículas (fase coloidal) foi determinada em balança analítica (UX420H Marte). O conteúdo de umidade das micropartículas foi determinado em triplicata. Uma massa de aproximadamente 2 g de partículas úmidas foi pesada em placa de petri previamente taradas, e avaliou-se a massa de partículas secas após terem permanecido 24 h em estufa 100 °C. A porcentagem de umidade foi calculada como:
ܷ݉݅݀ܽ݀݁ ሺ%ሻ = ೠିೞ
ೠ ݔ 100 (1)
Onde mpu = massa das partículas úmidas; mps = massa das partículas secas.
Com estes dados, o rendimento do processo (Rend %) que representa a porcentagem de material seco precipitado em relação à massa seca inicial e que foi calculado como:
ܴ݁݊݀ ሺ%ሻ = ೞ
(ାó) ݔ 100 (2)
Onde pol = massa de polímero, em base seca; óleo = o óleo adicionado ao processo.
A eficiência do processo de complexação dos polímeros (P.C %) foi calculada como:
ܲܥ ሺ%ሻ = ೞି(ௗ∗ ೞ)
ாா∗ ݔ 100 (3)
Onde load é a massa de óleo contida em um grama de partícula úmida; e EE é a eficiência de encapsulação, ambos descritos no item 4.3.5.
A coacervação complexa foi realizada sem adicionar óleo. Neste caso, a eficiência de complexação (P.C % s/o) foi calculada como:
ܲܥ ݏ/ ሺ%ሻ = ೞ
4.3.5 Eficiência da Encapsulação
Para a determinação do teor de óleo essencial nas micropartículas, aproximadamente 3 g de micropartículas úmidas foram secas em estufa a 100 °C por 24 h. A massa seca de partículas foi cuidadosamente triturada em almofariz, utilizando pequenos volumes de álcool etílico (95%) para extrair o óleo da massa triturada. O sobrenadante foi recolhido utilizando uma seringa com um filtro (0,22 µm, Millipore) acoplado à sua ponta, para evitar que partículas sólidas estivessem no sobrenadante. Este processo foi repetido várias vezes até que o volume de sobrenadante transferido para balões volumétricos completassem 25 ml. A leitura do sobrenadante foi feita por dois métodos:
Absorbância: foi medida a um comprimento de onda de 320 nm para limoneno e 280 nm para óleo essencial de tomilho, utilizando espectrofotômetro UV-Vis (T60U PG Instruments Limited, UK). A quantidade de óleo essencial nas micropartículas foi calculada pela curva de calibração obtida com os respectivos óleos em álcool etílico (95%): (Abs = 7,0183 [conc] + 0,0517; R² = 0,998) e óleo essencial de tomilho (Abs = 48,041 [conc] + 0,0629; R² = 0,999). Cada lote de amostras foi medido em triplicata.
Eficiência de Encapsulação: indica a porcentagem de óleo dentro da massa de partícula úmida em relação à quantidade de massa de óleo colocada no processo. Foi calculada como:
EE = massa de óleo encapsulado/massa do óleo no processo
Cromatografia gasosa acoplada a detector seletivo de massas: a análise dos constituintes voláteis foi realizada, em um cromatógrafo a gás Agilent, modelo HP-6890 equipado com um detetor seletivo de massas Agilent, modelo HP-5975 utilizando uma coluna capilar HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), identicamente ao descrito no item 5.2.1. Para esta quantificação, curvas de calibração de substâncias padrão timol e p-cimeno foram construídas relacionado área do pico com concentração do componente. Assim, a área dos picos destes componentes no óleo foi quantificada e convertida em massa de óleo correspondente à injeção de 1 µl do sobrenadante. Desta forma a Eficiência de Encapsulação foi calculada como:
load úmido = (massa de timol ou p-cimeno (concentração * volume de sobrenadante)/ massa de partícula úmida usada para a extração)
EE = massa de timol ou cineol encapsulado / massa de timol ou cineol no processo
4.3.6 Morfologia das partículas formadas
Microscopia ótica: A morfologia das partículas foi observada utilizando um microscópio óptico (JENAVAL-Zeiss, Alemanha), juntamente com uma câmera digital, e as imagens foram registradas com o Image Pro Plus 4.0 Software (EDN2-Microscopia de Imagem de Sistema de Processamento) com objetivas de 20x, 25x e 40x.
Microscopia de Varredura Laser Confocal: Antes de preparar as partículas, a fase de óleo foi corada utilizando Vermelho do Nilo (1 mg/ml de óleo), com agitação, durante 30 min. A fase polimérica foi corada usando o solução de isotiocianato em dimetilsulfóxido (1 mg/ml). Cerca de 1000 µl da solução de corante foi adicionada a cada grama de polímero na fase de emulsão com a exceção de goma arábica usada no sistema GA:QUI, cuja fase da quitosana é que foi marcada. O processo de marcação de polímero foi feito a 40 °C com agitação durante 1 h com ausência total de luz. Foi usado o Microscópio confocal modelo Leica TCS SP5 II Laser Scanning (Wetzlar, Alemanha), equipado com uma câmera de árgon, helim-neônio 543 e hélio-neônio 633 íons de laser. As fotos confocal de fluorescência foram tiradas com objetivas de 10x, 20x e 63x.
O software utilizado para análise da imagem foi o LAS AF (Wetzlar, Alemanha). O laser foi ajustado no modo de fluorescência com filtro verde (para verificar a fase polimérica marcada) usando comprimentos de onda de excitação a 488 nm e filtro de emissão de 510-530 nm. O modo de fluorescência com vermelho (para avaliar a fase oleosa) usou comprimento de onda de excitação a 530 nm e de emissão de filtro de 560-600 nm foi utilizado. Imagens de fluorescência verde e vermelha foram obtidas a partir de dois canais separados, com a opção de uma terceira imagem do detector de luz transmitida. As imagens finais foram feitas a
partir de um misturador (fluorescência vermelha) e misturador (fluorescência verde) para visualizar as estruturas marcadas e também o sinal a partir de um microscópio de transmissão de luz ordinária (misturador C - luz transmitida) dentro da mesma imagem segundo Lamprecht et al., (2000) (Lamprecht, Schäfer, & Lehr, 2000).
4.3.6.1 Tamanho médio das partículas e a distribuição de tamanho
O tamanho médio das partículas úmidas foi determinado utilizando o principio de espalhamento de luz de laser (Mastersizer 2000, Malvern, Alemanha) com a unidade de suspensão de amostra onde quantidades de micropartículas foram suspensas em água destilada ajustando-se estas quantidades para um nível adequado de refração para a detecção do equipamento. Cada valor foi resultado de triplicata. Os dados de diâmetro, D(4,3) diâmetro de volume médio de micropartículas e de Span (largura de distribuição das micropartículas). Foram calculados pelo equipamento.
4.3.7 Reticulação
A reticulação foi realizada com glutaraldeído (GLU) e tripolifosfato de sódio (TPP). Ambos foram adicionados, gota a gota, à temperatura ambiente, a uma dispersão de micropartículas sob agitação constante durante 2 h. GLU (25%, w/w) foi utilizado a uma concentração de 1 mmol g/1 de solução por grama de polímero (Alvim & Grosso, 2010) e o TPP (3%, w/w) foi adicionado a 0,07 g por grama de polímero (Shu & Zhu, 2002). Após a reticulação, as partículas permaneceram armazenadas em geladeira à 10 °C por uma noite e no dia seguinte foram lavadas com água destilada pra remoção do excesso.
4.4 Estudo de liberação “in vitro”
O ensaio de liberação do óleo encapsulado foi feito em álcool de cereal durante 5 horas, colhendo-se alíquotas a 15, 30, 60, 120 e 300 min. Este ensaio foi
realizado para os sistemas de GA:GE, GA:QUI e GE:QUI, reticulados com TPP e glutaraldeído e também para os sistemas sem reticulação. Para determinação do teor de óleo essencial liberado em cada tempo foram pesadas 1 g de micropartículas úmidas e colocadas em tubo de ensaio com tampa contendo 7 ml de álcool cereal. Para cada tempo foram preparadas três replicatas. Os tubos foram mantidos sob agitação em shaker modelo G25, New Brunswick Scientifique com velocidade de 100 RPM em temperatura ambiente durante todo o processo experimental. Cada tubo representou um tempo de liberação. Em seguida o sobrenadante foi recolhido e filtrado utilizando uma seringa com um filtro acoplado (0,22 µm, Millipore) e transferido para balões volumétricos de 10 ml com tampa. A análise do sobrenadante foi feita em cromatógrafo (item 4.2.1), utilizando-se alíquotas 1µl de cada replicata. As quantidades liberadas foram calculadas levando em conta a quantidade determinada de cada tempo (em triplicatas independentes) em relação à quantidade do composto (timol) inicial no óleo essencial de tomilho, presente na quantidade de partículas usadas para cada tubo.
4.4.1 Determinação da atividade antimicrobiana (CLSI, 2003; CLSI, 2002).
4.4.1.1 Micro-organismos
A atividade antimicrobiana do óleo essencial de tomilho foi avaliada frente aos seguintes micro-organismos: Candida albicans ATCC10231, Enterococcus faecium CCT 5079, Enterococcus hirae ATCC 10541, Escherichia coli ATCC 11775, Salmonella choleraesuis ATCC 10708, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Salmonella tiphymurium ATCC 14028, Aspergillus niger ATCC 16404, Pseudomonas eruginosa ATCC 13388.
Os microrganismos foram preservados em meios de cultivo específicos, conforme indicado para cada espécie, repicados 24 h antes dos ensaios de atividade antimicrobiana e mantidos em estufa a 36 °C para crescimento.
4.4.1.2 Manutenção e preservação dos microrganismos
A manutenção foi feita em meio Nutriente ágar sólido inclinado para bactérias aeróbias e Sabouraud dextrose agar para C. albicans em ágar Agar Batata Dextrosado (PDA) para o fungo BHI suplementado com cloreto de cisteína (Brain Heart Infusion + 0,05% de cloreto de cisteína).
4.4.1.3 Meios de cultivo para os testes de atividade antimicrobiana
O meio de cultivo utilizado para os testes de atividade antimicrobiana com a levedura C. albicans foi o RPMI-1640. Para as bactérias foi utilizado o caldo de Müeller Hinton.
4.4.1.4 Preparo do óleo essencial para os testes de atividade antimicrobiana
Para uso nos testes de atividade antimicrobiana, tanto o óleo essencial livre quanto o encapsulado foram dispersos em meio Müeller – Hinton ou RPMI-1640 contendo 2,5% dimetilsulfóxido (DMSO) e solução de Tween 80 em água (0,1%). A concentração máxima testada de óleo essencial de tomilho livre foi de 1 mg/ml e para o óleo encapsulado, como não havia um padrão estipulado foram pesadas 40 mg de partículas úmidas equivalente à aproximadamente 2,4 mg/ml de óleo essencial e adicionado 5 ml de álcool de cereais totalizando 8 mg/ml (40 mg de partícula úmida/ 5 ml de álcool de cereais = 8 mg/ml), assim ao fim do processo de diluição a menor quantidade necessária para inibir os micro-organismos foi estipulada de acordo com a massa de óleo contida na massa de micropartícula necessária para inibição através do cálculo de acordo com o valor de liberação (load úmido).
4.4.1.5 Preparo de soluções de antibióticos
As soluções foram preparadas em concentrações específicas para cada tipo de ensaio, uma vez que para cada micro-organismo há uma concentração inibitória específica. Para os ensaios com as bactérias: E. faecium, E. hirae, E. Coli, S. Typhimurium e P. eruginosa. foi usado o cloranfenicol na concentração de 0,008
