TÍTULO: AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DA PASTA MEDICAMENTOSA PROHEAL TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Odontologia SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): MARIANA NEDER TSUBOUCHI AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): ALEXANDRE CAVALCANTE QUEIROZ ORIENTADOR(ES):
1 Vice-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
UNIVERSIDADE PAULISTA
VICE-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
INICIAÇÃO CIENTÍFICA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA
PASTA MEDICAMENTOSA PROHEAL
AUTOR: Mariana Neder Tsubouchi
CURSO: Odontologia
CAMPUS: Indianópolis
ORIENTADOR: Alexandre Cavalcante de Queiroz
TÍTULO: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA PASTA
MEDICAMENTOSA PROHEAL
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AUTOR: Mariana Neder Tsubouchi
RESUMO
Falhas na osseointegração podem ocorrer no ato cirúrgico ou tardiamente com o implante em função. Estudos in vitro e in vivo demonstraram que a contaminação da câmara interna do implante por bactérias associadas à peri-implantite é a causa principal da perda. A junção do componente protético com o implante deixa uma micro-fenda (gap) por onde bactérias penetram e se alojam no interior do implante levando à formação de um infiltrado de células inflamatórias ao redor do tecido peri-implantar. Por isso, a busca de mecanismo para controlar ou impedir a penetração de bactérias nestas microfendas pode tornar-se a forma de se evitar a peri-implantite. Nesse contexto, nosso objetivo foi avaliar in vitro a atividade antimicrobiana do aditivo medicamentoso Proheal ao componente protético em implantes. Utilizamos um suporte feito de seringa de 5 mL, onde o conjunto implante-componente foi instalado em sua extremidade mantendo o implante imóvel e centralizado no meio de cultura bacteriano à uma altura de 7,1cm evitando-se a contaminação pelo parafuso de acesso do munhão. Nossos resultados mostraram que a pasta iodoformada Proheal é capaz de reduzir aproximadamente em 4 vezes o número de colônias de bactérias de Escherichia coli comparativamente ao controle positivo sem a utilização da pasta.
Palavras chaves: Implante dentário endósseo, Pasta iodoformada, Proheal®, Peri-implantite, Escherichia coli.
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ABSTRACT
Failures in osseointegration can occur in the surgical act or late with the implant in function. In vitro and in vivo studies have shown that contamination of the implant's inner chamber with bacteria associated with peri-implantitis is the main cause of the loss. The junction of the prosthetic component with the implant leaves a micro slit where bacteria penetrate and lodge inside the implant leading to the formation of an infiltrate of inflammatory cells around the peri-implant tissue. So the search for a mechanism to control or prevent the penetration of bacteria into these micro slit may become the way to avoid peri-implantitis. In this context, our objective was to evaluate in vitro the antimicrobial activity of the drug additive Proheal to the prosthetic component in implants. We used a 5 mL syringe holder where the implant-component assembly was installed at its end, keeping the implant still and centralized in the bacterial culture medium at a height of 7.1 cm, avoiding contamination by the trunnion access screw . Our results showed that the Proheal iodoform paste is able to reduce approximately 4 times the number of Escherichia coli bacteria colonies compared to the positive control without the use of the paste.
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SUMÁRIO
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INTRODUÇÃO
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·
MÉTODO
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·
RESULTADOS
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DISCUSSÃO
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CONCLUSÃO 20
·
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Introdução
Atualmente, com a evolução da implantodontia dentro da odontologia, as técnicas cirúrgicas estão cada vez mais aprimoradas e constituem-se de primeira opção terapêutica para reabilitação bucal, tanto de um elemento quanto de vários elementos dentários. Por esse motivo, os estudos que avaliam a ocorrência e a história de doenças periimplantares são muito importantes, afinal, a partir deste, pode-se ter noção das variáveis de risco para a susceptibilidade e evolução, tendo condição de planejar ações preventivas e terapêuticas (Martinez ST, 2011)
O sucesso do tratamento depende principalmente de dois fatores; o primeiro deles é a quantidade de osso disponível para que ocorra a osseointegração. O segundo, e não menos importante, é a não proliferação de bactérias no interior do mesmo. Esses fatores são importantes para que não haja falhas na fase inicial, porém, a combinação de uma infecção bacteriana e uma sobrecarga física pode levar a uma falha pós osseointegração.(Queiroz, 2011)
Já o insucesso pode ser percebido quando há uma inflamação seguida de perda óssea. A esse ocorrido, damos o nome de doença perimplantar. Tal doença faz com que a osseointegração não ocorra e, consequentemente, seja inviável a reabilitação desta maneira (Benfattii,C. A. M. 2006)
Quando ocorre a contaminação em implantes, temos um quadro de perimplantite e mucosite; ela pode acontecer durante a cirurgia para instalação do implante, durante a cicatrização da ferida cirugica ou ainda, quando acontece uma micro perfuração na mucosa, ocorrendo mais facilmente se há o afrouxamento do parafuso de proteção (Cruz G, et al 2011)
Entretanto, há meios para evitar a contaminação na parte interna do implante e uma futura reabsorção óssea ao redor deste, sem que o tecido mucoso seja alterado. Estamos falando da utilização da pasta de iodofórmio, introduzido na terapêutica por BUCHARDAT(1839), sendo considerado um anestésico,
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sifilético e antisséptico que, segundo AGOSTINI (1934) inibe o crescimento bacteriano e age sobre as toxinas (Cruz G, et al 2011)
Quando falamos das características do iodofórmio, podemos observar que se trata de uma substancia amarelo- claro, altamente radiopaco, pouco solúvel em agua, porém solúvel em álcool sendo solúvel também em contato com líquidos orgânicos. Daí vem a capacidade de ação antisséptica, persistente e suave (Carneiro CAL, 2006“).
HELD (1964) afirmou que o iodofórmio não age diretamente sobre os germes, mas sim nos tecidos, amenizando as condições de crescimento dos germes.Segundo PERSON et al. a microbiota interna dos implantes constituem principalmente de Estreptococos facultativos e anaeróbicos, bacilos gran positivos anaeróbicos e bacilos gran negativos (Cruz G, et al 2011)
Segundo estudos realizados, o uso do Proheal só tras benefícios para o paciente, ele é efetivo contra inflamação na mucosa e odor ao remover o pilar, apresenta baixíssimo ou quase nada de crescimento bacteriano além da mucosite estar ausente naqueles que fazem o uso, portanto, este medicamento se destacou, por obter um melhor desempenho quando falamos em eliminar colônias de bactérias nas conexões dos implantes. (Gustavo Cruz). Silvia Junior et al (2006) relatou que ao inserir a pasta de iodofórmio proheal no momento da instalação do implante trouxe uma diminuição e inibição na formação de micro-fístulas no tecido mucoso superficial além de não tem influencia na maturação celular.
7 OBJETIVO
OBJETIVO PRIMÁRIO
Avaliar in vitro a atividade antimicrobiana do aditivo medicamentoso Proheal® na junção conexão protética e plataforma do implante.
1.8.2 OBJETIVO SECUNDÁRIO
- Produção e caracterização de colônias puras e isoladas das cepas de bactérias Escherichia coli.
- Verificar o grau de contaminação do conjunto implante e componente protético na ausência e na presença dos agentes antimicrobianos Proheal®.
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2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 MATERIAIS PARA ESTUDO MICROBIOLÓGICO
Foram utilizados 12 implantes cônicos com plataforma em hexágono interno (HI) da marca Implacil De Bortoli®. Para o estudo microbiológico todos os cuidados com assepsia e desinfecção foram tomados. Cepas de Escherichia coli isoladas foram utilizadas e mantidas no laboratório de Microbiologia da Universidade Paulista – UNIP. As cepas de Escherichia coli, foram crescidas sobre Agar Braian Heart Infusion (BHI), por 48 horas a 37о C em estufa bacteriológica. Para este estudo utilizamos os seguintes dispositivos medicamentosas: Pasta Proheal® (Triiodo Metano (Iodofórmio) 15,5%; Óleo de Calêndula 0,5%; Lanolina Anidra 74%; Cera de Abelha 10%; Nipazol 10,05%) que no ato da instalação do componente protético em cada implante do grupo teste experimental, foram colocadas 0,025 mL dos medicamentos no interior da câmara interna e em seguida rosqueado e torqueado o componente protético no implante.
2.2 PRODUÇÃO DAS COLÔNIAS BACTERIANAS EM MEIO LÍQUIDO
Para obter o caldo contendo Brain heart Infusion estéril, foi preparado 6,44 g de BHI (pesados em uma balança de precisão) para 700 mL de água destilada, quantidade suficiente para 70 tubos de ensaio, já que em cada tubo foi utilizada a quantia de10 mL do meio de cultura. O frasco utilizado foi o Tubo de Ensaio Pyrex sem Tampa, na medida de 13 x 100 mm.
A distribuição dos 10 mL de BHI nos tubos de ensaio foi feita dentro do fluxo laminar, com o auxílio de uma Micropipeta Digital (NICHIPET EX II) com volume ajustável de 100 mL a 1000 mL, com as ponteiras descartáveis estéreis em tubos de ensaio, Pyrex e Falcon.
Posteriormente, os tubos foram vedados com papel Craft e autoclavados por 15 minutos a uma temperatura de 121o C; a seguir foi realizado o teste de
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esterilidade, onde os mesmos permaneceram por 24h em uma estufa de cultura a 37o C.
As amostras bacterianas foram removidas do freezer e descongeladas a temperatura ambiente, tendo sido, revertida em um dos tubos de ensaio contendo BHI estéril, este procedimento foi realizado em Câmara de Fluxo Laminar. A seguir foi levada à estufa a uma temperatura de 37o C por um período de 48h. Após, os tubos foram retirados da estufa e observado se houve crescimento bacteriano. O indicativo do crescimento bacteriano se deu através da turvação do meio de cultura.
Foi realizado um esfregaço com a finalidade de observar se a cultura utilizada era pura ou não. Este esfregaço foi realizado com o auxílio de uma alça de platina previamente flambada na chama do bico de Busen e uma lâmina de vidro, na Câmera de Fluxo Laminar. Com a alça de platina após ser flambada até ficar rubra removeu-se uma pequena quantia do caldo turvo (BHI + amostra bacteriana) e feito o esfregaço na lâmina, do centro para as bordas que foram fixadas na chama por três vezes, com o cuidado de deixar o esfregaço para cima. Com isso há uma desnaturação das proteínas que se aderem à lâmina de vidro. Após a utilização do meio de cultura, o mesmo foi levado para a geladeira a uma temperatura de 7o C a 8o C por 24h.
O segundo passo foi a realização da tipagem de coloração Gram dos meios de cultura em que houve turbidez: uma gota de meio de cultura e uma gota de Cristal de Violeta foram adicionados em lâmina histológica e aguardado o tempo de 1min de reação; o excesso de material foi escorrido e uma gota de Lugol (Mordente que intensifica o Cristal Violeta) adicionada e aguardado o tempo de um minuto e novamente escorrido o material em excesso; logo após foi feita a fixação com solução Álcool/Cetona mergulhando a lâmina por oito vezes na solução. O excesso de material foi escorrido e lavado em água corrente. Em seguida, uma gota de fucsina foi adicionada e aguardado 1minuto. A lâmina foi lavada em água corrente e seca cuidadosamente em papel absorvente.
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2.3 ENSAIOS DE CONTAMINAÇÃO DOS CONJUNTOS IMPLANTE E COMPONENTE PROTÉTICO
Durante a execução das etapas experimentais, vários cuidados foram tomados para evitar a contaminação do campo de trabalho. Todo o instrumental neste experimento foi previamente autoclavado em autoclave a vapor (121 oC por 15 minutos) e todas as etapas foram realizadas com a utilização de luvas estéreis. Antes de iniciar o procedimento, o instrumental foi colocado dentro do fluxo laminar onde foi realizada a esterilização da superfície através da luz ultravioleta (UV) que permaneceu ligada por 20 minutos.
Antes de entrar na câmara de fluxo laminar, o operador fez a assepsia tripla das mãos com álcool 77% e colocação de luvas estéreis para realizar os experimentos.
2.4 CONSTRUÇÃO DO SUPORTE DE IMPLANTE
Cada implante é retirado de sua embalagem estéril e instalado na ponta de uma seringa de 5 mL, cortada da seguinte forma: corpo com 45 mm e ponta 3 mm. A parte interna da ponta é preparada com uma ponta diamantada cônica, para facilitar a instalação do implante, também dois furos são feitos ao lado da ponta, para possibilitar o escoamento do meio de cultura dentro do tubo de ensaio. O implante medindo 14 mm, o munhão 11 mm, portanto o conjunto montado ficou com 71 mm, sendo que 3 mm da ponta do implante ficando dentro da ponta da seringa.
Após a instalação dos implantes nas plataformas, foi realizada a colocação de 0,025 mL das medicações, quantidade suficiente para preencher toda a câmara interna, na conexão implante componente protético utilizando micropipetas esterilizadas, sendo 10 implantes contendo Proheal®. A ativação destes componentes foi realizada por chave e aparafusamento nos implantes com hexágono interno, torque 30N.
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introduzidos em tubos de ensaio, contendo o meio de cultura bacteriana em BHI. Foram utilizados 10 implantes com medicação Proheal®, imersos em meio contendo
Escherichia coli, 01 controle positivo Escherichia coli e 01 controle negativo. Apenas um implante foi colocado em cada tubo ficando submerso no meio de cultura líquido até a altura de 2/3 do munhão de preparo, para evitar contaminações pelo acesso do parafuso de cobertura.
Após isso, os 12 tubos contendo os implantes foram identificados e levados a estufa bacteriológica a 37o C por 48h. Decorrido o tempo de incubação, a superfície externa dos implantes foram descontaminadas através da aplicação de agente antisséptico (Solução de clorexidina 2%) e para constatar se esta assepsia externa foi eficiente, com um swab estéril na superfície externa, foi colhida amostra dos implantes para teste de verificação de possível contaminação externa pós-assepsia.
Posteriormente foi coletado de dentro da câmara interna dos 12 implantes (10 com Proheal®, 01 controle positivo Escherichia coli e 01 controle negativo), através de swab estéril, o material para análise de crescimento microbiano, onde foi realizada a semeadura em placa com meio ágar sólido com a finalidade de observar a eficácia do medicamento. A placa foi então levada a estufa por 48h a 37o C, para se verificar após este tempo o crescimento da cultura.
Como controle negativo utilizou-se meio de cultura estéril e implante sem medicação em seu interior, e como controle positivo utilizou-se meio de cultura bacteriano e implante sem medicação.
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Seqüências de materiais utilizados no experimento
Figura 1 – Fluxo laminar
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Figura 3 - Munhão reto antirrotacional modelo HI 4.0 e parafuso hexagonal externo
Figura 4 – Montagem do suporte
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Figura 6 – Meio de cultura liquido BHI contendo bactéria e implante
Figura 7 - Assepsia do implante em clorexidina 2% (Periogard) após incubação em meio
de cultura contendo bactérias e coleta de material do interior do implante (A e B); semeadura (C); placa de ágar (D)
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Figura 8 - Ensaios de contaminação e de controles controle positivo e negativo
Figura 9 – Lâmina com colônias de Escherichia coli (A); Lâmina com colônias de
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3 RESULTADOS
Os ensaios iniciais de esterilidade foram eficientes e após 24h de incubação dos meios de cultura em estufa bacteriológica não apresentaram crescimento bacteriano, dessa forma tínhamos um meio nutritivo estéril para evitar contaminação cruzada com outros micro-organismos que não fossem os estabelecidos em nossos experimentos.
Na continuidade dos experimentos de produção das colônias bacterianas, após descongelamento das cepas e adição de clones no meio nutritivo, previamente definido como estéril, foi verificado o crescimento bacteriano em função do aparecimento de turbidez no meio nutritivo.
Para estabelecer a pureza de nossa amostra bacteriana, no experimento de coloração Gram, mostraram tratar-se de amostras puras sem contaminação.
Em relação à detecção de micro-organismos na porção externa dos implantes, após exposição em meio contaminado com bactérias Gram negativas, verificamos que o procedimento de descontaminação externa por imersão em solução de Clorexidina 2% foi suficiente para remoção de micro-organismos. Dessa forma, tínhamos um ambiente na parte externa do implante asséptico. Assim, ao efetuar a exposição da câmara interna do implante, não teríamos contaminação cruzada, após imersão ao meio contaminado e caso houvesse crescimento de colônias do material proveniente da câmara interna, esse contaminante devia ser oriundo do tempo de imersão e não posterior.
Nas análises das câmaras internas dos implantes, após contaminação por imersão em meio com Escherichia coli (10 tubos) foram estabelecidos dois controles. O controle negativo (01 tubos) correspondendo ao implante sem aplicação de medicação na câmara interna e imersão em meio de cultura estéril, e Escherichia coli (01 tubos) sendo o implante sem medicação, mas imerso em meio com cultura com os micro-organismos.
Os resultados dos controles mostraram que de fato os implantes não apresentavam contaminação cruzada, além disso, o controle positivo definiu que os micro-organismos eram capazes de penetrar na câmara interna dos implantes, mesmo após o fechamento desta com torque de 30N.
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Dos 10 implantes imersos em meio de cultura Escherichia coli, submetidos à análise microbiológica, do material coletado do interior da câmara dos implantes, as UFC que cresceram em placas de ágar foram contadas utilizando uma lupa estereoscópica, onde foi totalizadas o número delas).
A contagem das Unidades Formadoras de Colônias (UFC) foi realizada utilizando-se uma lupa de contagem dividida em quatro quadrantes. Realizou-se a contagem de colônias de um quadrante e posteriormente o valor foi multiplicando por quatro obtendo-se o número total de UFCs por placa.
Nas análises dos resultados das placas de cultura em meio sólido para os implantes imersos em meio líquido contendo Escherichia coli, foram obtidos a média de 978,1 UFC e o controle negativo não teve crescimento bacteriano. Verificou uma média de 218,9 Unidades Formadora de Colônia para os implantes aos quais foram colocados Proheal .
Tabela 1 - Unidade formadora de colônia de Escherichia coli nos grupos controle negativo,
controle positivo, Phoheal®
Implante Controle negativo Controle positivo Proheal ® 1 0 918 220 2 0 1060 227 3 0 1102 214 4 0 932 210 5 0 946 225 6 0 927 232 7 0 1015 209 8 0 975 205 9 0 942 231 10 0 964 216 Média (DP) 0 978,1 (68,46) 218,9 (9,57) Mediana 0 943,5 218
Também foi realizado o teste de Krushal-Walls para comparar os grupos controle negativo, controle positivo, Proheal no meio de cultura com Escherichia coli. Neste teste foi possível verificar que houve diferença significante entre os grupos. O grupo controle positivo teve um maior número de UFC em relação aos demais grupos. Entretanto, quando comparado os grupos Proheal, foi possível observar que o Proheal teve crescimento de UFC.
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DISCUSSÃO
Utilizamos a bactérias do género E. coli por ser uma bactéria Gram-negativas que pertence à família Enterobacteriaceae. Uma vez que são amplamente estudadas devidos sua relação com diversas patologias na espécie humana.
Estudos mostraram que pasta a base de iodofórmio associada a óxido de zinco e eugenol ou hidróxido de cálcio promoviam necrose óssea inicialmente e que os fragmentos da pasta eram rapidamente circundados por neutrófilos e posteriormente removidos por macrófagos (MURAZABAL et al.; 1966). O extravasamento de pasta iodoformada em região periapical pode se espalhar até o segundo molar, porém sem causar alterações na área nem a sintomatologia dolorosa do paciente, sendo a pasta rapidamente absorvida (MANISALI et al.; 1989).
Além do efeito antisséptico, o iodofórmio tem efeito analgésico suave ao ser aplicado diretamente na lesão (BAZERQUE, 1976).
O grau de citotoxidade do iodormórmio varia de acordo com sua aplicação e sua associação com outros produtos (DANIEL, 1998 e 1999) e que a pasta Proheal não apresenta alto nível de citotoxidade, pois não promove alteração significativa na mucosa sobre o implante, diminui a formação de micro-fístulas na mucosa e não influencia a maturação celular após seis meses (SILVA JR. et al., 2006).
Implantes com a pasta Proheal® tiveram uma acentuada diminuição no crescimento das colônias de bactérias na câmara interna dos implantes (CARNEIRO, 2005).
As pastas iodoformadas KRI I (80,8% iodofórmio, 4,86 canfora, 2,025% para-clorofenol, 1,215% mentol) e WALKHOFF estudadas por meio de difusão em ágar apresentaram ser eficientes na inibição do crescimento de culturas puras de Staphylococcus aureus, Staphylococsus albus, Streptococcus não-hemolíticos e hemolíticos (CASTAGNOLA; ORLAY, 1952). Esses dados estão em acordo com nossos resultados com relação ao Staphylococcus aureus uma vez que a pasta Proheal foi eficiente na redução do número de colônias nas placas aproximadamente quatro vezes comparativamente ao controle positivo. Contudo, é possível que a pasta KRI seja mais eficiente do que a Proheal uma vez que a primeira é constituída de 80,8% de iodofórmio e a segunda por 15,5%.
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Em contato com líquidos orgânicos, o iodofórmio libera lentamente iodo (BAZERQUE, 1976). O iodo em estado nascente é um potente antisséptico (PRINZ; DOBBS, 1941). Além disso, é capaz de reduzir as fístulas em casos de instalação do parafuso de cobertura com pasta com iodofórmio (SILVA JR. et al., 2006). Em nossos experimentos, a pasta Proheal não sofreu ação de contato com os líquidos orgânicos justificando dessa forma os resultados menos efetivos na redução da formação de colônias de bactérias em comparação à clorexidina.
Contudo, há pesquisas mostrando que iodofórmio não exerce ação direta sobre os germes, mas sim sobre os tecidos ou líquido intracelular atenuando as condições de crescimento dos germes por meio de ação secante diminuindo o escoamento de sangue, linfa e exsudatos (HELD, 1964), ou seja, reduzindo o infiltrado celular. Em estudo comparativo de atividade antimicrobiana e citotóxica entre pasta à base de iodofórmio e óxido de zinco pelo método de difusão em ágar da cepa de Streptococcus faecalis verificou-se que óxido de zinco é mais efetivo na inibição que o iodofórmio (WRIGHT et al., 1994). Esses dados de literatura poderiam explicar os resultados da baixa efetividade da pasta de iodofórmio Proheal em meio de cultura uma vez que os micro-organismos não estão sujeitos aos meios de atenuação de crescimento, pois não está ocorrendo a ação secante.
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5 CONCLUSÃO
É possível concluir que o aditivo medicamentoso Proheal® não foi capaz de impedir a colonização das bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus na interface implante componente protética, contudo reduziu a proliferação de micro-organismos em relação ao controle positivo. Por outro lado, a Clorexidina gel 2% foi eficaz em impedir completamente a colonização desses micro-organismos no interior dos implantes comparativamente ao controle positivo.
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