Desgravações das Aulas de Biologia Molecular 1º semestre 2006/2007

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Desgravações

das Aulas de

Biologia

Molecular

1º semestre

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Nós ficámos a avaliar as curvas de fusão de DNA em que é possível seguir a absorvância a 250 nm em função de um factor, que pode ser um factor como é a questão da temperatura. E portanto tínhamos verificado que o comportamento das moléculas de DNA sujeitas a esta variação de temperatura era desta natureza (ver acetatos). Tínhamos visto que se tratava neste caso de moléculas de DNA sob a forma de cadeia dupla, que implica um determinado valor de temperatura crescente. E tínhamos um segundo patamar em que tínhamos moléculas de DNA de cadeia simples, resultado da desnaturação de quebra das pontes de hidrogénio que ligam duas cadeias complementares.

Tínhamos também já definido um ponto que é a temperatura de melting ou de fusão, que é encontrado com este ponto de inflexão entre estes dois patamares, em que 50% da cadeia de DNA está sob a forma de cadeia simples e outros 50% sob a forma de cadeia dupla.

Portanto, é um teste in vitro que pode ser feito com moléculas de DNA e que tem uma representação igual a esta mesma representação para uma determinada molécula de DNA. Se nós representarmos uma segunda molécula de DNA, eventualmente esta curva pode vir deslocada ou mais para a direita (o que implica um TM maior valor de temperatura) ou mais deslocada para a esquerda (que implica um TM menor valor de temperatura).

Tínhamos inclusivamente dito que esta variação cromossoma a cromossoma ou DNA a DNA estava intrinsecamente ligada à quantidade de citosinas e guaninas que existem em cada uma destas moléculas. Portanto o tal conteúdo CG, a percentagem de guaninas e citosinas no total dos 4 nucleótidos, se for maior ou se for menor implica directamente maior ou menor presença de pontes de hidrogénio triplas do que duplas, o que implica maiores valores de temperatura para desnaturar a molécula ou menores valores de temperatura. Portanto, a temperatura de melting é de facto um valor muito importante que caracteriza uma molécula de DNA.

O quê que acontece se estas mesmas moléculas de DNA forem sujeitas a um decréscimo de valor de temperatura? Se descermos o valor de temperatura isto de facto volta a uma situação normal, à situação inicial, porque de facto é assim que as moléculas encontram a sua estabilização máxima em termos energéticos.

Portanto, se elas são complementares, elas vão de novo encontrar essa complementaridade estabelecendo novamente ligações por pontes de hidrogénio. Isto inclusivamente pode sofrer ciclos de aquecimento/arrefecimento, aquecimento/arrefecimento… em que há abertura e nova hibridação das moléculas de DNA. Surgiram estes dois nomes: desnaturação da molécula de DNA que rompe qualquer das pontes de hidrogénio e hibridação dessas mesmas moléculas de DNA que implicou o encontrar novamente complementaridade dessas sequências.

Como é que comportava neste tipo de experiência uma molécula de RNA? Como é que vai variar a sua absorvância com o aumento de temperatura? Uma molécula de RNA é uma hélice, mas não tem cadeia dupla. Como é que faço a distribuição de uma molécula desta natureza?

Existem pontes de hidrogénio que vão ser necessariamente desnaturadas. E portanto esta curva vai ter este declive. Isto é válido para moléculas de RNA e para molécula de DNA de cadeia simples.

Na realidade existem 3 tipo de RNA: mensageiro, ribossomal e de transferência. E portanto, as características e tipo de estrutura são completamente

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variáveis. E então, a resposta a uma curva desta natureza vai também ser variável pela acção do calor. É importante ter isso em conta e apesar de haver o aumento deste declive, por não ser uma hélice em cadeia dupla nunca teremos uma curva deste tipo, de natureza sigmoidal, com dois patamares, pontos de inflexão, com a possibilidade de definir um valor de TM. Mas não temos uma curva direitinha, temos uma curva desta natureza. Isto algures aqui vai também ter um patamar, quando atingir um máximo.

O que nós estivemos a ver é uma curva desta natureza, curvas de fusão. Temos uma variação de temperatura, mas podemos ter a variação da molaridade de um átomo, ou de uma base, e iria corresponder ao mesmo tipo de comportamento. Temos o ponto de inflexão, a temperatura de melting e aqui temos por exemplo a representação de uma cadeia simples de DNA que terá exactamente a mesma natureza que se representarmos uma cadeia de RNA.

O que temos aqui neste gráfico de baixo permite-nos fazer esta relação que existe entre temperatura de melting e conteúdo GT. Quanto maior for o conteúdo GT de um dado organismo, de um dado cromossoma, maior é o seu valor de temperatura de melting, com uma relação desta natureza que aqui está. Se vocês tiverem 3 cromossomas diferentes distribuídos ao longo de uma curva de fusão, podem perceber exacta e automaticamente qual é o conteúdo GT desses três cromossomas, maior ou menor de acordo com a curva estar mais deslocada para a esquerda ou mais deslocada para a direita. Ainda relativamente a estes CM’s e a estes conteúdos GT, convêm dizer o seguinte: o conteúdo GT tem aquilo a que nós chamamos valor taxonómico. Funciona como bilhete de identidade para um dado cromossoma.

Se vocês forem a um livro que faça descrição das espécies bacterianas, vocês vão ter várias indicações relativamente a essas mesmas espécies, e uma das indicações é exactamente o seu conteúdo GT. Portanto o conteúdo GT é tipo o bilhete de identidade daquele organismo e reparem que numa determinada curva que aqui está é perfeitamente possível definir que estivemos a falar de um bacteriófago – o seu conteúdo GT tem um determinado valor, se estivermos a falar de leveduras, tem outro valor, se falarmos em e-coli, tem outro valor, ou seja, são valores perfeitamente definidos e portanto diz-se que têm valor taxonómico.

Valor taxonómico permite-nos descriminar o seguinte: imaginem que têm uma bactéria X, que vocês não conhecem. Se sujeitarem o cromossoma, o DNA dessa molécula X a uma curva de fusão e determinarem o seu conteúdo GT, e se o conteúdo GT for 50% dessa bactéria X, só com os 50% não conseguem definir qual é a espécie da bactéria. Mas conseguem pelo menos descartar uma série de bactérias que por terem conteúdo GT 60 ou 65% nunca poderão ser da espécie dessa bactéria X que vocês têm nas mãos. Portanto, há uma descriminação que é possível fazer olhando apenas para o conteúdo GT desse dado organismo. E por isso diz-se que o conteúdo GT tem de facto perfil taxonómico, tem essa identidade, tem essas características.

Vamos agora introduzir um tipo de elemento genético que tem uma série de características muito particulares e que vão trabalhar nas aulas de laboratório e que irão ouvir falar muito ao longo destes anos seguintes. O que vocês têm aqui é uma cadeia dupla de DNA circular e representa um elemento genético. Poderia ser um cromossoma de uma bactéria.

O cromossoma de uma bactéria é circular, contrariamente aos cromossomas dos organismos superiores que são lineares. Uma diferença considerável entre organismos trata-se de facto de um ser circular e de outro ser linear e ainda pelo facto de que nos

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organismos superiores não existe um único cromossoma, existem ‘n’ cromossomas, um número variável dependendo da espécie.

Isto é uma diferença considerável. De qualquer das maneiras o que vocês têm aqui não é um cromossoma bacteriano. É aquilo a que nós designamos como um plasmídeo. Vamos introduzir esta noção de plasmídeo: é um elemento genético em cadeia dupla, exactamente como o cromossoma. A grande diferença que estaria aqui com um cromossoma bacteriano é a sua dimensão. Quando nós falamos de um plasmídeo, estamos a falar de moléculas que normalmente não ultrapassam 1% daquilo que é o peso molecular de um cromossoma. São moléculas muito pequeninas relativamente ao tamanho de um dado cromossoma.

Mas o que acontece é que nas bactérias, principalmente nas bactérias, é muito comum existirem plasmídeos. Ou seja, a bactéria tem para além do cromossoma, a presença de elementos genéticos extra-cromossomais. E esses elementos genéticos são designados plasmídeos. Isso é muito comum existir nos micro-organismos. E nós podemos perguntar eventualmente porque é que as bactérias têm estes elementos genéticos. Vocês imaginem uma célula com o seu cromossoma que corresponde a um plamídeo, que corresponde a uma bactéria. Imaginemos uma célula eucariótica, com um núcleo; dentro do núcleo tem os cromossomas, o que é uma diferença considerável entre bactérias e células eucarióticas. A presença de núcleo e dentro deste os cromossomas (célula eucariótica) e aqui não há núcleo e um único cromossoma (bactéria). Para além disso este cromossoma é circular.

O que eu estou a dizer é que existem bactérias que têm esta informação que é essencial, mas existem outras que, para além do cromossoma, possuem elementos genéticos extra-cromossomais que se designam plasmídeos. Pode existir as duas condições (com e sem plasmídeo), mas não podem existir bactérias sem cromossoma, como é lógico. Então que tipo de informação genética é que este plasmídeo tem? Eles são extra-cromossomais (independentes do cromossoma), têm produto genético com determinadas funções associadas, e essas funções são normalmente particulares. Ou seja, as bactérias têm por exemplo a capacidade de resistir à presença de um determinado antibiótico, degradam o antibiótico. São por exemplo capazes de produzir um determinado antibiótico, capazes de resistir a metais pesados, capazes de degradar substâncias altamente tóxicas. Normalmente, essas capacidades são-lhe conferidas pela presença destas informações genéticas contidas nos plasmídeos.

Então isto quer dizer que em termos de selecção natural, se tivermos um ambiente em que a bactéria está sujeita à presença de um antibiótico, se a bactéria tiver estes plasmídeos, ela cresce, desenvolve-se e eventualmente causa uma infecção. Se não tivermos plasmídeos, ela vai morrer. É uma questão de selecção natural.

Outra característica dos plasmídeos é que eles têm muita facilidade de se mobilizarem de célula para célula. Uma determinada célula que não tenha plasmídeo, pode vir a ganhá-lo rapidamente. Esta possibilidade fez com que esta bactéria que aqui estava tinha imunidade a este antibiótico mas esta bactéria não tinha, embora depois tenha passado a ter esta mesma resistência porque ganhou esta informação genética.

Estes plasmídeos conferem à célula determinadas vantagens, em determinadas condições. Hoje em dia existem problemas graves de microbiologia médica, na tentativa de resolver problemas de multi-resistência a diversos antibióticos. Existem muitas bactérias multi resistentes. Estas multi-resistências são conferidas por elementos extra-cromossómicos, os plasmídeos. Pelo facto de serem facilmente

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mobilizáveis de espécie para espécie, entre organismos que possam estar num determinado habitat, facilmente fazem aquisição de resistências.

Se nós tivermos uma determinada célula que se está a dividir e essa mesma célula tem estes elementos genéticos, quando se dá a divisão desta célula em duas células filhas, é claro que estas células filhas têm que ter uma cópia exactamente igual do cromossoma. Mas podem ter ou não adquirido estes mesmos plasmídeos. Imaginemos que destas duas, uma delas perdeu a possibilidade dessa informação passar. Se estas duas células estiverem num ambiente em que a selecção dá vantagem à presença dos plasmídeos, então esta célula vai eventualmente morrer e esta vai crescer, vai-se dividir. Há esta vantagem nesse sentido.

Estes são os chamados plasmídeos naturais, plasmídeos que existem dentro das células que os investigadores há cerca de 20 ou 30 anos perceberam de facto que existem. O que aconteceu foi que a partir de dado momento começou-se a extrair esta informação genética e usá-la em laboratório. Hoje em dia os plasmídeos são uma ferramenta essencial à biologia molecular, à biologia genética. Se nós tivermos um gene, uma informação genética que queremos transferir de um organismo para outro, que queremos manipular, temos de ter qualquer coisa que sirva de veículo para este tipo de manipulação.

O veículo de excelência para fazer este tipo de manipulação genética são pequenas moléculas circulares de DNA que servem exactamente para fazer este tipo de transporte, e essas moléculas são os plasmídeos. Existe hoje em dia um mercado de plasmídeos que se adquirem nas empresas que se usam como veículo para fazer clonagem, para se fazer introdução de genes, entre outro tipo de coisas.

Aquilo que têm aqui nesta folha na realidade não se trata de um plasmídeo natural, acabado de extrair de uma bactéria que não se identificou, mas trata-se de um plasmídeo já manipulado pelo investigador no sentido de poder agora ser utilizado como veículo de transporte. Estão aqui basicamente definidas 3 regiões importantes neste plasmídeo, mas para já queria que ficassem com esta ideia: a presença ou não de plasmídeo na molécula e o facto de poder ser natural ou já modificado. A probabilidade de irem a um solo de jardim e fazerem uma análise para encontrarem plasmídeos é muito elevada. Existem com muita frequência nos micro-organismos.

Neste plasmideo temos o DNA que é de facto a sua composição, temos aqui uma região com designação de ‘ori’, que significa origem, a origem de replicação. Reparem, os plasmídeos têm que se dividir, têm que se replicar para que a célula se divida, para que se mantenham nas células filhas. Essa replicação é iniciada a partir daquela região. Inclusivamente temos que dizer que qualquer organismo genético que seja auto-replicativo tem que ter esta origem de replicação, não só para um plasmídeo como também para um cromossoma. Há uma diferença muito considerável: se falarmos num cromossoma de um organismo procariota só tem uma única origem de replicação; toda a replicação do cromossoma vai ser feita a partir de um único local. Se falarmos na replicação de um cromossoma de um organismo eucariota, vai ter ‘n’ origens de replicação. Como se trata de um plasmídeo, basta ter uma única origem de replicação porque o material é pequeno. Esta zona, esta formação genética que aqui está é essencial a qualquer material genético, é essencial a este plasmídeo.

Temos aqui outra região, aqui indicada com esta caixa, designada por ante-air. Corresponde a um gene que codifica uma enzima que é capaz de degradar o antibiótico

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anti-silina. Quer dizer que este plasmídeo se for introduzido dentro duma célula, esta célula ganha imunidade ao antibiótico anti-silina. É aquilo a que chamamos marca de selecção, e normalmente os plasmídeos têm marcas de selecção; essas marcas de selecção podem ser uma, podem ser duas, podem ser várias, normalmente para antibióticos. Neste caso concreto o antibiótico é a anti-silina. É conferida por esta informação, esta capacidade que um organismo venha a adquirir se estiver na informação deste mesmo DNA.

Temos aqui outra região, que vem salientada com informação de uma série de códigos. São nomes de enzimas. Na realidade estas designações correspondem a uma classe de enzimas que são chamadas enzimas de restrição do tipo II. Também conhecidas por endonucleases de restrição. Restrição porque fazem um corte. Endonucleases porque o fazem dentro da cadeia de DNA. Em contraponto com exonucleases, que cortam DNA não dentro da cadeia mas a partir dos seus terminais.

E porque é que são enzimas de restrição do ‘tipo II’? Porque têm esta característica particular: apenas cortam sequências de DNA quando identificam uma dada sequência alvo, têm um alvo de corte. Então o alvo de corte é assim: se a enzima encontrar a sequência, corte nesse local; se não encontrar não corta. Essas sequências alvo podem ser de 4, de 6 ou de 8 nucleótidos. Depende da enzima.

Existem enzimas para 3 tipos de alvos; 3 tipos de alvos de acordo com o número de nucleótidos que constituem esse alvo. O corte destas enzimas é nas duas cadeias. Vocês imaginem este plasmídeo que aqui está, tem esta informação toda. Se eu sujeitar este DNA à acção da enzima de restrição ECO-R1, o que vai acontecer é que este plasmídeo que estava circular, vai ser cortado nesta posição e torna-se linear. De circular passou a linear. Mas imaginem que esta enzima de corte tem uma sequência alvo, não só aqui mas também aqui, algures. Se eu sujeitar a esta enzima eu vou ficar com o resultado de dois fragmentos de DNA, um que vai daqui até aqui, e outro que vai daqui até ao outro lado. Se a enzima cortar 3 vezes, o resultado são 3 fragmentos. Eu chamo de fragmentos de restrição porque me cortam aquele DNA em diferentes locais. Reparem que não é por acaso que neste local que aqui está, estas enzimas que cortam aqui não cortam noutro lado qualquer. Só cortam ali. A única coisa que vai acontecer se este DNA for sujeito a estas enzimas é ser linearizado.

Ora, enzimas de restrição do tipo II. De onde é que elas vêm? Elas são produzidas exactamente pelos micro-organismos, em determinados condições. E a indicação que elas têm aqui é exactamente de acordo com o organismo que as produz. Primeira letra é o género, o resto é a espécie. Iremos ver porque é que as bactérias produzem estas enzimas. A acção é digerir moléculas de DNA. Nós acabámos de introduzir aqui duas das principais ferramentas para fazer a tal clonagem e a manipulação genética. Usar um veículo, que é o plasmídeo, e usar enzimas de restrição que me cortam o DNA. Se eu juntar a estes dois componentes um terceiro, que é uma enzima que em vez de cortar liga, os DNA-ligases, eu tenho tudo para construir moléculas de DNA. Tenho o veículo, tenho enzimas que me cortam num sítio e outras que me ligam noutro sítio. Corte e costura de moléculas de DNA, engenharia genética. Reparem que nesta descrição que está aqui, qualquer destes cortes destas enzimas de restrição estão estrategicamente colocados, se eu tiver um local de corte em cima da origem de replicação, este plasmídeo não me vai servir de nada. Se eu usar esta enzima de restrição eu vou dar cabo do mais importante no plasmídeo, a origem de replicação. A origem de replicação tem de estar muito bem conservadinha sem nada que possa influenciá-la. O que eu quero é manipular aquele DNA em todo o sítio menos a origem de replicação.

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O que temos aqui é um plasmídeo e quero fazer esta diferença em termos de nomenclatura: quando vocês ouvirem falar em plasmídeos naturais, estamos a falar de plasmídeos isolados de micro-organismos que são realmente deles; se nós falarmos de plasmídeos vectores de clonagem, são plasmídeos que foram alterados por alguém, que foram manipulados, e estão digamos preparados para ser utilizados em laboratório como veículos. Normalmente aparece aqui um ‘p’ pequeno (exemplo: DNAp) de plasmídeo e depois aparece a indicação de que foi alguém que o preparou e manipulou. Por baixo do plasmídeo aparece normalmente a indicação do seu peso molecular. Uma kilobase são mil pares de bases. Plasmídeo recombinado, fui eu que construí com este ou com aquele objectivo. Estas trocas e estas manipulações é possível de fazer.

E as enzimas de restrição são produzidas porquê? Por uma questão de protecção celular. Temos aqui uma célula, um cromossoma circular e imaginem que esta bactéria está a ser infectada por um bacteriófago, por um vírus. O que o vírus fez foi injectar o seu material genéticos nesta bactéria e eventualmente vai esperar que material genético entre no genoma o que leva à morte da bactéria.

Qual é a primeira capacidade de resposta que a bactéria vai ter? Vai produzir enzimas de restrição, com a ideia de que ao produzir enzimas de restrição pode encontrar alvos fora deste DNA que acabou de entrar e pode aniquilá-lo, quebrar aos bocadinhos. É uma protecção anti-viral. Mas a segundo esta definição, a probabilidade de encontrar alvos aqui, também é elevada de encontrar alvos no seu próprio DNA. Se fosse assim, ela automaticamente se auto-destruíria. Então o que acontece é que antes de produzir enzimas de restrição a molécula digamos que se prepara, com grupos metil. Se tivermos uma sequência alvo de uma enzima, mas se um desses grupos estiver metilado, a enzima já não é capaz de cortar. Ela metila o seu próprio DNA para não ser atacado pela acção destas enzimas de restrição. Tem de haver uma enzima específica para metilar.

Desgravada por Ângela Chan

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Vamos só terminar algumas considerações que estávamos a ter acerca das enzimas de restrição. Depois de falarmos da sequência primária de DNA, introduzimos aqui na última aula uns elementos particulares que são os plasmídeos, portanto acabamos por dar algumas características dos plasmídeos e associada às características dos plasmídeos introduzimos também as enzimas de restrição e portanto foi basicamente ai que nós ficamos quando demos algumas das características das enzimas de restrição que nós consideramos como do tipo II ou endonucleases de restrição exactamente por cortarem dentro da cadeia de DNA e como nós dissemos e mostra aqui neste acetato (título: “endonucleases do tipo II”), são sequências capazes de reconhecer algo especifico na cadeia de DNA, a esses alvos, dissemos nós, podiam ser de 4, 6 ou 2 nucleótidos, portanto falamos sobre isso.

Inclusivamente dissemos depois, julgo eu que dissemos, que o corte que se dá sobre estas cadeias duplas de DNA pode ser de dois modos diferentes. Portanto pode haver um corte em que algumas enzimas cortam exactamente a cadeia em dois, no mesmo local, através de ligações fosfodiéster, aqui são cortáveis exactamente no mesmo local e portanto isto dá origem a extremidades cegas ou extremidades rombas e depois existem enzimas que cortam as duas cadeias de DNA em pontos diferentes, e portanto este corte origina necessariamente extremidades diferentes no produto desse mesmo corte e portanto estas são extremidades ditas coesivas.

Portanto existem dois tipos de corte, naquilo que nós dissemos também, ter um conjunto superior a 100 enzimas de restrição diferentes, que são conhecidas hoje em dia. Estas enzimas, como nós dissemos, são produzidas pelos microorganismos com principal função: protecção celular. Demos o exemplo de um bacteriófago a infectar um microorganismo onde ejecta o seu DNA e portanto um modo de resposta da bactéria à presença desse DNA estranho é exactamente tentar digeri-lo tornando-o ineficaz pela porção de enzimas de restrição. E dissemos ao mesmo tempo que essa síntese dessas enzimas para digerirem esse DNA acompanhavam a necessária protecção do seu próprio DNA, neste caso por mutilação, portanto uma mutilação das bases alvo dessas sequências relativas às enzimas de restrição implicavam que o DNA do organismo não era degradado, enquanto que o DNA viral se não viesse preparado para isso sofria portanto essa degradação e então estava dado o primeiro passo de protecção celular. Portanto uma imensidão de enzimas de restrição deste tipo produzidas por variadíssimos microorganismos em que têm de facto como principal função protecção celular, o que nós tentámos puxar foi que a partir do momento em que os investigadores perceberam que existiam essas enzimas na natureza produzidas pelos microorganismos, começaram a tentar usá-las com outros fins completamente diferentes e assim é manipulação genética. É corte de moléculas de DNA invitro, num tubo de ensaio.

Portanto estamos a construir aqui duas grandes indústrias a partir de dois elementos que são naturais e que são produzidos por microorganismos. Por um lado plasmídeos, ditos plasmídeos naturais, que existem dentro dos organismos, variadíssimos organismos, demos algumas funções para esses plasmídeos. Por outro lado, as enzimas de restrição também produzidas pelos microorganismos. Por exemplo, desenvolveram-se empresas que trabalham com esses plasmídeos de maneira que os possam depois vender em catálogo, bem como as enzimas de restrição que se compram nessas empresas especializadas, vêm purificadas e nós usamos sobre um determinado DNA e portanto aqui temos capacidade de cortar o DNA nas posições que essas mesmas enzimas reconhecem.

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Acabámos por introduzir aquilo que são as ferramentas principais da engenharia genética, portanto para fazer engenharia genética nós precisamos ter um veículo/vector para fazer clonagem – plasmídeos - e por outro lado enzimas de restrição que permitem cortar em locais específicos essas moléculas de DNA. Depois, como 3º componente, são enzimas exactamente contrárias às enzimas de restrição, são DNA ligases. Nós temos composto aquilo que é necessário para fazer a clonagem de genes.

Neste acetato (título: “Clonagem do gene da insulina”) mostra de forma muito rápida e simples aquilo que é um exemplo, e o primeiro processo biotecnológico desenvolvido por uma empresa americana em 1978 que levou à possibilidade de produzir por engenharia genética a partir de um microorganismo insulina e portanto como vocês sabem, a insulina é de facto uma proteína com muita importância - muita gente no mundo precisa diariamente que lhe seja administrada e se nós considerássemos que a insulina seria apenas proveniente ou de bases de porcos ou de cadáveres humanos, isso eventualmente chegaria para 1% ou menos de 1% das necessidades de insulina da população mundial e portanto a insulina é de facto produzida pela engenharia genética por um processo que basicamente implica ter um vector de clonagem, imaginemos um vector de clonagem aqui designado por este plasmídeo e agora basicamente o que se fez? Foi clonar/remover do genoma humano o gene da insulina com enzimas de restrição e foi ligar nesse mesmo plasmídeo (vector de clonagem) esse mesmo gene, ligar pela acção de enzimas - DNA ligases e portanto é possível construir aquilo que nós designamos como um plasmídeo recombinado, que é usando um determinado vector, ligar-lhe um determinado fragmento de DNA, um gene, vários genes, aquilo que for, portanto construímos um plasmídeo novo e agora este plasmídeo tem uma origem de replicação, é capaz de se replicar, mas para isso precisa de um hospedeiro e portanto normalmente o hospedeiro de eleição é uma E.coli, portanto estirpe de laboratório, e portanto se nós introduzirmos dentro da E.coli este plasmídeo, que é muito fácil esta introdução, pode ser com umas descarga eléctrica, pode ser com uma solução com cálcio. Fica-se com uma E.coli que para além do seu cromossoma tem uma informação extra que lhe adicionei, que tem esse mesmo plasmídeo no qual está clonado um gene que nem lhe diz nada, que é um gene da insulina humano, mas que agora obrigo, digamos, que aquela E.coli, quando for crescer que vá replicar, que vá traduzir a informação que lá está contemplada, e essa informação é o gene e a respectiva proteína da insulina, e portanto em grandes experimentadores numa indústria é possível pôr grandes quantidades de cultura de E.coli a crescer a produzirem insulina que depois é recuperada das células por lise celular, as células são rebentadas e a proteína é de facto recuperada, purificada, liofilizada e vendida. E portanto de uma forma muito prática, muito simples, resolve-se um problema extremamente grave para a humanidade e portanto em engenharia genética simples, existem variadíssimos outros produtos hoje em dia que são produtos de engenharia genética, produzidos por processos relativamente semelhantes, portanto implicam a clonagem de um determinado gene, de uma determinada informação num hospedeiro adequado, num veículo adequado, e depois pôr então essa mesma estirpe a produzir uma proteína de nosso interesse. E reparem como é possível fazer processos destes que nós entendemos como processos heterólogos. Reparem que é um gene de um eucariota a ser expresso num hospedeiro dum procariota, portanto há compatibilidade - é claro que há aqui algumas regras que têm depois de ser tidas em conta, mas não é nada de especial, portanto consegue-se exprimir uma informação de um organismo proveniente de um outro que lhe é taxinomicamente muito distante, neste caso, a espécie humana numa E.coli.

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E portanto isto é hoje em dia feito com variadíssimos produtos e também aqui para introduzir uma questão que hoje em dia está muito na moda que é a questão dos transgênicos, dos organismos geneticamente manipulados. O que é que a gente entende por organismo geneticamente manipulado? Isto é um organismo geneticamente manipulado, portanto dando origem a um produto que neste caso é a insulina. Outra coisa são organismos geneticamente manipulados em que a sua utilização é como tal, como organismo completo, o milho transgênico, por exemplo. Aqui não, aqui nós queremos usar a estirpe como hospedeiro para exprimir uma informação que não tem nada a ver com ela mas que permite resolver neste caso um problema à escala mundial.

Existem variadíssimos exemplos destes de utilização de três componentes fundamentais que vocês já conhecem: enzimas de restrição, plasmídeos e as outras enzimas que nós introduzimos que são as DNA ligases, que permitem fazer o contrário das enzimas de restrição.

No laboratório, vão ter contacto com as técnicas de rotina para extrair DNA de células. Portanto vamos usar E.coli e vão extrair DNA cromossómico e DNA plasmídico. Portanto vão fazer dois tipos de extracções. Vão ver as diferenças, como é que a técnica funciona para se extrair um tipo de DNA, outro tipo de DNA, que são receitas, basicamente, para se fazer a extracção do DNA. É claro que reparem que o tamanho da molécula de DNA cromossómico relativamente ao tamanho do plasmídeo são tamanhos completamente diferentes. Isso tem também repercussão na técnica de extracção e na própria recuperação do material que se vai ter.

A ideia das aulas é vocês fazerem extracção de DNA dos dois tipos e depois sujeitarem esses mesmos DNA’s a enzimas de restrição e depois vão usar numa segunda aula aquilo que é a técnica de rotina para visualizar as moléculas de DNA. Portanto vocês quando forem extrair o DNA não vão ver grande coisa, vão eventualmente no DNA cromossómico ver um novelo branco que se vai formar no fim. Na segunda aula então vocês vão ter a possibilidade de usar uma técnica de electroforese horizontal onde vão aplicar as vossas amostras, vão sujeitar a uma corrente eléctrica, e vão ter então as amostras separadas e vão ver o tipo de técnica que normalmente é usada.

Portanto aquilo que vocês vão fazer no laboratório no caso do DNA plasmídico está aqui mais ou menos descrito (acetato com um esquema do trabalho laboratorial). Vocês vão partir de uma cultura de células de E.coli, que vão recuperar e aquilo que vocês têm de fazer, reparem que o DNA que vocês querem extrair está dentro das células, portanto vocês vão ter que lisar, rebentar as células – essa lise das células é feita com enzimas e com detergentes, portanto vocês vão rebentar as células, vão ficar com um cocktail celular e no meio desse cocktail celular vão ter tudo o que é conteúdo celular e necessariamente também o DNA. E portanto depois o que vocês fazem é que o vosso DNA pode ser facilmente separado de todo o outro material celular por uma precipitação com álcool. E no final, o que vocês vão fazer é conservar o DNA que acabaram de extrair, DNA plasmídico, no frio, a -20ºC, para que posteriormente lhe possam aplicar enzimas de restrição e as enzimas vão funcionar sobre esse DNA cortando-o em locais específicos, que são locais de corte dessas mesmas enzimas.

Este tipo de estratégia vai permitir que se tiverem um determinado plasmídeo, neste caso, aqui no exemplo, um plasmídeo que tem 10,5 kb (verso do acetato anterior), portanto tem 10500 pares de bases. Este plasmídeo, se for sujeito a três enzimas de restrição, três restrições diferentes com enzimas diferentes. As enzimas vão cortar em locais diferentes e vão dar origem aquilo a que nós chamamos fragmentos de restrição de tamanho diferente necessariamente. Se tivermos um plasmídeo e usarmos

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uma enzima que corta algures aqui e aqui, vamos ter um fragmento que é o resultado deste DNA mais este DNA noutro fragmento. Se usarmos uma enzima de restrição que corta três vezes vamos ter 3 fragmentos de restrição. Se cortar 4 ou 5 vezes o resultado é exactamente o número de cortes que essa mesma enzima reconhecer num dado DNA. Vocês aqui têm (acetato que começa com “Key to results: In case of…”), não um esquema mas uma fotografia daquilo que vocês vão obter se usarem e se extraírem convenientemente DNA plasmídico. Vocês têm o vosso DNA, o DNA é extraído, como eu disse, com uma receita própria, no final o DNA é sujeito a enzimas de restrição e depois o que vocês têm que fazer na segunda aula, é aplicar as vossas amostras num gel que vai ser sujeito a um processo de electroforese.

O DNA tem cargas negativas devido à presença dos grupos fosfato, portanto vai separar-se de acordo com essas cargas negativas, dirigindo-se para o pólo positivo. E vai separar-se de acordo com o seu peso molecular (se estiver digerido). Portanto, migra de acordo com o seu peso molecular. O que vocês vão ver é uma fluorescência a laranja, que resulta do seguinte: quando o vosso gel migra, vocês não vêm nada, o DNA não se vê aqui a olho nu. Vocês aplicam as amostras e esperam uma hora ou uma hora e meia que a electroforese tenha lugar. Depois o que vocês vão fazer é colocar o vosso gel que resultou dessa separação numa solução com brometo de etídeo. Portanto o brometo de etídeo, é uma substância que se intercala entre as bases do DNA. Intercala-se entre as cadeias duplas do DNA. E após essa incorporação do brometo de etídeo entre as bases do DNA, se vocês sujeitarem o gel a uma radiação ultravioleta ele emite uma fluorescência, e dai surge uma cor. E é ai que vocês vão ter a possibilidade de ver as moléculas de DNA.

Portanto é separação por electroforese seguido de aplicação de brometo de etídeo, que depois por raios UV permite uma fluorescência e essa fluorescência pode ser registada numa fotografia que é o que aqui está. Portanto na aula nós vamos fazer a aplicação do gel, correr o gel, depois temos de ir para a câmara escura para tirar uma fotografia com luz ultravioleta, depois de o gel estar tratado com brometo de etídeo. E portanto aquilo que vocês têm aqui são fragmentos de DNA em que estes fragmentos de DNA estão na presença de brometo de etídeo, que origina a possibilidade de ver esta cor que é uma fluorescência laranja.

Isto que está aqui no poço número 1 é aquilo que nós designamos normalmente como DNA padrão. É um DNA que nós vamos comprar, vamos adquirir no mercado e quando nós compramos este DNA padrão vem com uma referência que nos diz que existem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 fragmentos depois de separado em gel e diz-nos exactamente qual é que é o peso molecular de cada fragmento. Normalmente este DNA padrão é o DNA de um vírus, que é comercializado digerido com uma determinada enzima. Eu sei assim que este primeiro fragmento pesa vinte mil pares de bases, imaginemos que este segundo aqui pesa 15000, que este terceiro pesa 10000, ou seja, quanto mais afastado da origem, menor é o seu peso molecular. E agora imaginem que da linha número 2 para a frente é sempre o mesmo DNA que é um plasmídeo qualquer em que eu estou interessado em trabalhar só que o que variou nas condições de linhas 2, 3, 4, 5 , 6 , 7 por ai fora, foi uma enzima de restrição que eu usei, que eu apliquei aquele DNA. E então é claro que conforme a enzima de restrição ou a combinação de enzimas de restrição, assim o padrão de restrição que eu vou ali obter vai ser diferente, porque o DNA vai cortar num determinado sítio ou noutro. Mas para além disso, aquilo que eu posso fazer e o que vocês vão fazer sobre os vossos resultados é usar este DNA padrão. Vocês podem estabelecer uma relação entre o logaritmo de pares de bases do vosso DNA e a distância percorrida.

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Então, de acordo com esta relação vocês vão fazer o seguinte: vão à vossa fotografia e na vossa fotografia vocês vão calcular esta distância que aqui está e para esta distância vocês sabem qual é que é o peso molecular deste fragmento. Trata-se do DNA padrão. A mesma coisa para o fragmento número 2, para o fragmento número 3 e por ai fora. E portanto vão fazer uma recta de calibração do vosso gel. Portanto esta recta de calibração relaciona-nos então a distância percorrida com o peso molecular respectivo de cada fragmento. Ora, com esta recta de calibração, vocês agora podem chegar ao vosso plasmídeo e se vocês medirem esta distância que vai daqui até aqui e extrapolarem nesta recta, sabem a distância, podem extrapolar o peso molecular daquele fragmento. Ora se vocês têm dois fragmentos de restrição para um dado plasmídeo fazem o mesmo exactamente ao outro fragmento e a soma dos 2 valores irá dar-vos o valor de um dado plasmídeo com que vocês estão a trabalhar e que podem até não saber qual é a dimensão. E é claro que se isto bater certo, a soma destes 2 valores que aqui estão há-de ser igual ao valor que este outro fragmento dá. Porque neste caso está ali a enzima que só cortou uma vez-dá um fragmento. Vão calcular esta distância e extrapolar na recta. Neste caso têm 2 fragmentos, vão ter de fazer a soma destes 2 valores, dado que se trata do mesmo plasmídeo. Ora se aqui der 11kb, ali vai dar também um valor semelhante, a soma dos fragmentos, tratando-se do mesmo DNA.

Portanto de uma forma muito simples vocês podem rapidamente em 4/5horas fazer uma estimativa do peso molecular de um determinado plasmídeo, usando esta técnica que implica extracção de DNA, aplicação de enzimas de restrição e utilização de electroforese em gel de agarose. São as técnicas de rotina para a avaliação de moléculas de DNA. Estas três conjuntamente permitem fazer então uma avaliação das moléculas.

Portanto o vosso resultado, o vosso relatório destas duas próximas aulas, será obterem uma fotografia com os DNA’s que vocês vão extrair e portanto é possível então, usando esta técnica rapidamente no vosso relatório vocês terem uma ideia da qualidade, e também uma análise quantitativa das vossas moléculas de DNA. Reparem que eu estou a falar que neste gel o que vocês estão aqui a reparar são moléculas de DNA plasmídico. Se eu eventualmente tentasse ali aplicar uma molécula de DNA cromossómico, sujeitada previamente a uma enzima de restrição, esperariam encontrar uma restrição daquela natureza, com 2 ou 3 fragmentos? Não. Iriam ver uma imensidade de fragmentos de restrição que vocês nem conseguem distinguir uns dos outros. Portanto lá está, estamos a falar em moléculas com pesos moleculares completamente diferentes. E para dar um tipo de restrição desta natureza, quer dizer que a enzima que vocês usaram foi encontrar n locais de corte naquele DNA, e foi cortar aquele DNA por ali fora. Reparem noutra situação. Enquanto que sobre o DNA plasmídico, que aqui está, vocês podem fazer esta avaliação qualitativa e olharem para aqui - vêm se digeriu, se não digeriu, se está bonito … e quantitativa - saber exactamente o valor do peso molecular. Reparem que com o DNA cromossómico, vocês são incapazes de chegar aqui a este perfil e ir discriminar fragmentos para poderem extrapolar valores, ou seja, medir distâncias, aqui vocês não conseguem fazer isso portanto, um DNA cromossómico, separado num gel desta natureza, permite-nos apenas uma avaliação qualitativa, mas é impossível calcularem o tamanho do DNA cromossómico neste tipo de técnica.

Vamos então usar três técnicas nas aulas: extracção de DNA, aplicação de enzimas de restrição sobre esse DNA extraído, aplicação do DNA em gel de agarose - separação, visualização desse mesmo DNA.

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Todo este DNA que aqui está, pelo facto de estar sujeito previamente a enzimas de restrição, migra de acordo com o seu peso molecular. Quanto mais afastados os fragmentos estão da origem, menor o seu peso molecular. Quanto mais próximo da origem, maior o seu peso molecular. Posso para além disso, se tiver um padrão e se tiver uma recta de calibração, estimar esses valores do DNA. Mas o que é que acontece agora se eu extrair DNA, não sujeitar a enzimas de restrição, e logo de seguida aplicar-lhe um gel? O DNA vai também separar-se, mas agora a separação não foi previamente antecedida por acção de enzimas de restrição, portanto o DNA vai separar-se. Por exemplo, vocês têm um plasmídeo, que vocês aplicam num gel após digestão e esse plasmídeo dá 3 fragmentos. E depois se tiverem um DNA padrão, podem determinar o peso molecular deste plasmídeo. Imaginemos que o vosso plasmídeo pesa 10kb.- 10000 pares de bases. Agora, a esse mesmo plasmídeo, foram aplicar sem digestão - sem enzimas de restrição aplicadas anteriormente – dá 2 fragmentos. É o mesmo DNA. A única diferença é que num caso foi previamente sujeito a enzimas de restrição e noutro não teve acção de enzimas de restrição. Reparem que a dimensão é completamente diferente. Ou seja, quando vocês aplicam enzimas de restrição ao DNA, vocês passam o DNA todo para uma única forma - a forma linear. Mas este DNA que aqui está não foi sujeito a enzimas de restrição. Não está sob a forma linear. Então estes 2 fragmentos que vocês aqui têm são, não formas lineares, mas sim as formas como o DNA existe na célula, super enrolado. Ele pode estar mais ou menos enrolado. Ora, esses enrolamentos, dão migrações diferentes também no gel. Ou seja, conforme o DNA estiver mais relaxado ou mais super enrolado, assim migra no gel.

O que é que é o gel? É uma matriz que tem uma determinada porosidade. Se o DNA tiver muito super enrolado migra mais facilmente pelos poros dessa matriz. Se tiver mais relaxado migra com mais dificuldade. Então se vocês tiverem aqui 2 fragmentos, isto é o mesmo DNA, pesa exactamente 10kb como este, só que corresponde a duas formas diferentes. Uma mais super enrolada, porque migrou mais. Uma mais relaxada porque ficou mais para trás. Se o utilizador não estiver atento desata a fazer cálculos de acordo com uma recta de calibração para este DNA que aqui está ao lado. Não pode de todo, porque não posso usar uma recta de calibração feita com DNA linear com DNA que não foi sujeito a enzimas de restrição. Imaginem que fazem uma electroforese com 2 DNA’s. O DNA é exactamente o mesmo, a única diferença é a forma com que ele está. Está mais super enrolado ou está mais relaxado. O que vai acontecer é que quando vocês aplicam uma corrente eléctrica, o DNA vai separar-se, vai entrar naqueles poros da matriz de agarose, mas vai ficar mais afastado ou menos afastado da origem, porque entrou mais facilmente ou não entrou. E portanto vocês têm 2 fragmentos diferentes, mas estes 2 fragmentos diferentes que aqui estão não correspondem de todo à possibilidade de serem dois fragmentos de restrição - não houve enzimas de restrição aqui. Portanto, no vosso gel, se vocês tiverem uma linha em que fazem uma aplicação do DNA plasmídico em que previamente foi sujeito a enzimas de restrição, os fragmentos que vocês obtêm podem estimar na recta de calibração, mas se ao lado vocês tiverem um DNA que não foi sujeito a enzimas de restrição, vocês vão ver formas de DNA, não vão ver fragmentos de restrição. Não podem extrapolar numa recta de calibração.

É impossível também calcular pesos sob um DNA cromossómico mesmo que sujeito a uma enzima de restrição.

Vamos nas próximas aulas, entender os mecanismos moleculares todos que estão descritos aqui neste acetato (título: “Figure 4.1, T-019”). É o dogma central da biologia. O fluxo de informação genética desde DNA a proteína, envolve

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variadíssimos processos e nós vamos estudar 1 a 1. O processo que vamos iniciar na próxima aula é DNA a dar DNA, ou seja, vocês têm uma célula com o seu cromossoma, esta célula vai dividir-se em duas células iguais, e cada uma delas vai ter uma cópia fiel do DNA da célula mãe. Portanto estamos a falar na replicação do DNA.

Posteriormente, é possível uma molécula de DNA, ou uma porção de uma determinada molécula de DNA dar origem a uma molécula de RNA, portanto este processo que eu vou designar número 2, é o processo de transcrição, em concreto estes RNA’s que aqui estão, são RNA’s mensageiros - mRNA, RNA’s transferência - tRNA, RNA ribossomal - rRNA.

Este é o processo de transcrição que iremos posteriormente estudar. E finalmente, o processo de tradução, que envolve a síntese de uma determinada proteína. Há também uma 4ª classe de RNA’s chamados de pequenos RNA’s que estão na actualidade a ser descobertos, e portanto a constituir razão de muito interesse.

Existe aqui nitidamente um confronto que em termos evolutivos os organismos tiveram necessidade de resolver. E este confronto é um confronto de linguagens e portanto em concreto o que nós temos aqui é a linguagem do DNA sob a forma de nucleótidos e a linguagem das proteínas sob a forma de aminoácidos. Portanto estes dois tipos de moléculas têm de facto uma incompatibilidade, não se conseguem directamente representar umas pelas outras, e portanto houve necessidade de arranjar maneira de ler correctamente as moléculas de DNA que constituem o repositório de toda a informação genética para se poder traduzir a informação de proteínas. As proteínas têm 20 aa fundamentais na sua constituição, os nucleótidos são só 4, que representam a sequência de DNA.

Muito provavelmente aquilo que é hoje em dia este dito dogma, este fluxo de informação genética, eventualmente no inicio da origem da vida, a molécula que existiu 1º foi o RNA. Este fluxo de informação genética teve outro tipo de orientação em que o RNA era a molécula principal e isso basicamente é suportado por variadíssimas hipóteses. Uma delas é que por exemplo existem ainda muitos organismos como é o caso dos vírus, que são vírus de RNA, não têm DNA, e não precisam de ter DNA para desempenharem este papel que nós estamos aqui a começar a desenvolver.

Portanto aquilo que vocês têm aqui é uma célula eucariótica, que tem um núcleo, dentro do núcleo passam-se alguns dos processos que estão aqui descritos neste esquema. No citoplasma da célula passam-se outros processos, portanto nós iremos ver passo a passo como é que estes processos se vão levar a cabo. Vamos usar como modelo uma bactéria, portanto isto quer dizer que vamos sempre que for caso disso chamar à atenção para as diferenças que existem entre bactérias e organismos eucariontes, que são bastantes. Mas o modelo de replicação, o modelo de transcrição ou de tradução que vamos estudar é um modelo procarionte, portanto é de bactérias, e depois iremos ver as respectivas diferenças.

Desgravada por Ana Carapeto

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Hoje vamos falar sobre a replicação do DNA. Recordam-se que naquela ultima figura que nós colocámos no quadro na última aula, nós entendemos como o fluxo de informação genética, em que acabámos dividir 3 processos. O primeiro processo é o processo de replicação, portanto cópia de uma molécula de DNA. Isto tanto serve para um cromossoma de uma bactéria, com um dos vários cromossomas de um eucariota, como para um plasmídeo que esteja por exemplo numa célula. Implica a replicação fidedigna igual à cópia mãe, quando uma célula se divide em duas a preceder essa divisão, o material genético tem de duplicar. Inclusivamente por essa razão a célula tem momentaneamente uma cópia dupla desse material genético. Nós hoje vamos ver alguns pormenores e entrar em alguns detalhes relativamente ao processo de replicação das moléculas de DNA.

Nós já falámos em cromossomas lineares, como é o caso dos cromossomas dos eucariotas, já falámos em cromossomas circulares, como é o caso dos cromossomas bacterianos, e já falámos também em elementos genéticos extra-cromossomais que são plasmídeos, os quais são também moléculas circulares. Portanto aquilo que nós vamos ver adapta-se a qualquer destes tipos de moléculas e diz respeito aos mecanismos, às enzimas, aos processos que estão na base da divisão.

Se nós tivermos uma célula, esta célula divide-se em duas células filhas, e o que nós vamos estudar é o mecanismo que está na base da presença nas células filhas do cromossoma da célula mãe. Isto quer dizer que momentaneamente, antes desta célula se dividir em duas, esta célula acaba por ter 2 cromossomas, que por uma divisão binária desta célula dá origem a 2 células filhas exactamente iguais, nas quais se mantêm a informação genética proveniente da célula mãe. Vamos ver como é que isto começa, evolui e acaba.

Quando nós falámos nos plasmídeos, e definimos um mapa de um plasmídeo como um vector de clonagem, definimos uma região desse plasmídeo como a sua origem de replicação. Portanto a ori é exactamente o local onde se vai iniciar o processo de duplicação do material genético. Isso é válido quer para o plasmídeo, quer para o cromossoma. Se eu tiver um cromossoma bacteriano, portanto o DNA cromossómico de uma bactéria, eu tenho de definir também uma origem de replicação, e vai ser aí que as enzimas vão encontrar afinidade para se ligar e dar inicio ao processo de divisão.

E se falarmos no cromossoma de um eucariota, este DNA também vai ter origem de replicação. A grande diferença entre estes materiais genéticos é que neste último não existe só uma, mas variadíssimas origens de replicação ao longo do cromossoma. Esta é uma diferença considerável entre moléculas provenientes de organismos procariotas e organismos eucariotas. Isto quer dizer que quando o processo de replicação se inicia, ele inicia-se de forma sincronizada a partir de todas estas origens de replicação, e portanto dá-se início ao processo a partir de variadíssimos pontos no caso dos eucariotas e a partir de um único ponto no caso dos procariotas. Isto tem algum significado porque no DNA dos eucariotas, para além de serem vários os cromossomas, a totalidade daquela componente de nucleótidos é muito superior àquilo que falamos no caso dos procariotas.

Por exemplo uma célula de Escherichia coli para se dividir em duas leva cerca de 40 a 50 minutos, o que quer dizer que num intervalo de tempo que é inferior a este valor, o cromossoma tem de se dividir em 2, dado que isto tem de acontecer

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previamente. Nos procariotas acontece de facto nessa natureza, 1 hora ou menos, mas no caso dos eucariotas, por exemplo uma célula do nosso epitélio demora 6 ou 7 horas a dividir, porque temos uma quantidade de material genético a dividir muito superior, estamos a falar num numero de cromossomas muito superior. Mas este intervalo de tempo é 6 ou 7 horas e não dias porque o processo se inicia em vários pontos ao mesmo tempo, portanto há varias origens de replicação que permitem que o processo se dê de forma mais rápida. Esta é uma condição importante, e também podemos dar aqui alguma característica temporal: 5, 6, 7horas, dias ou então nunca se dividem em células eucariotas (que se especializaram nesse modo), ou então bactérias que em menos de 1 hora, ou entre 1 e 2 horas se dividem rapidamente. Isso implica que a maquinaria celular pronta para este processo de replicação é de facto diferente, mas desde logo é diferente aquilo que é o seu princípio como aqui está considerado.

Outro ponto que gostava de focar antes dos processos e enzimas envolvidas, é que nós estamos a considerar que existem então determinadas zonas bem definidas onde o processo vai ter inicio, portanto estão aqui certas regiões que tem uma determinada sequencia nucleotídica que dá origem a este início de replicação. Mas se vocês se recordarem, quer no caso dos procariotas, quer no caso do material eucariota que tem um núcleo, os cromossomas estão super-enrolados entre si, ora o primeiro ponto é como as tais enzimas que existem dentro destas células vão descobrir dentro deste emaranhado todo onde é que existem exactamente estas porções, que são aquelas que dão origem ao processo de replicação. Isto implica que a tal noção que temos de super-enrolamento de DNA, vamos ter que entende-la como super-enrolamento mas em determinadas condições há alguma descompactação, que faz com que as zonas fiquem de facto susceptíveis à ligação das enzimas que vão dar origem ao processo.

O que nós vamos agora entender é o seguinte, vocês imaginem um DNA, eu vou representar algures aqui… portanto 5´ a 3´ e algures aqui a origem de replicação. Portanto vamos focar o nosso interesse nesta região. Para se duplicar uma molécula de DNA neste caso concreto, a molécula não é só o que está compactada que não está em condições de ser usada, é também pelo facto de ser cadeia dupla de DNA. Uma está emparelhada com a outra e portanto não há aqui disponibilidade para haver um molde, e o molde para a replicação é a cadeia simples de DNA. Ora tem que haver alguma coisa que faça com que isto seja obrigado a abrir nesta região para que se disponibilizem das duas cadeias que estão complementares, duas cadeias simples de DNA. A maquinaria celular que é responsável por este processo são enzimas que são capazes de quebrar as pontes de hidrogénio que existem entre as duas cadeias. As regiões de origem de replicação são regiões ricas em adeninas e timinas, o que faz algum sentido porque predominam ligações duplas contrariamente a ligações triplas, o que eventualmente possibilita uma maior facilidade de abertura destas mesmas moléculas.

Imaginemos que eu vou abrir esta cadeia, e imaginem que estou a fazer aqui um zoom de uma determinada região que foi origem de replicação. Então eu vou acumular aqui algures um complexo enzimático que teve como característica reconhecer a origem de replicação, o qual é formado por enzimas chamadas de helicases. Estas enzimas reconhecem origens de replicação, ligam-se naquele local e vão forçar a que a cadeia de DNA quebre as pontes de hidrogénio que existem entre as cadeias complementares.

Eu vou propor uma direcção, que é esta direcção aqui de cima. Vai haver um deslocamento destas enzimas que são helicases neste sentido (?), portanto elas ligam-se

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na origem e vão obrigar a cadeia de DNA a abrir. Imaginem dois donuts, cada um a ligar uma cadeia de DNA simples, e agora eles irem por aí fora e obrigam a que as ligações duplas e triplas das pontes de hidrogénio se vão de facto quebrar. Depois disto, as cadeias que aqui estão em baixo tinham tendência a voltar a complementar, porque é assim que elas encontram a sua maximização. Vamos então colocar aqui um complexo de proteínas, que se chamam proteínas SSB. Estas proteínas não deixam que algures naquela posição, as duas cadeias que estão simples pela acção das helicases se voltem a ligar.

Imaginem agora que temos uma corda que se pode abrir em duplas, tipo uma hélice de DNA, e quando começam a desfazer as cordas, ao abrirem aquilo assim para cima, começam a criar possibilidade de aquilo tudo se emaranhar e às tantas vocês querem abrir e aquilo não vai mais. È exactamente assim que surge nas moléculas de DNA: nesta parte aqui de cima há uma série de estruturas que podem ser de difícil resolução e às tantas a cadeia quer abrir por si e não vai abrir. Portanto vamos colocar aqui uma enzima que vai destorcer a molécula, e estas enzimas chamam-se DNA girases. Elas fazem a distorção da cadeia para que não haja a possibilidade das helicases quererem ir num sentido e não conseguirem abrir aquela cadeia.

Estamos aqui a falar num complexo de 3 tipos de proteinas/enzimas que não têm uma participação directa na replicação. Elas não duplicação cadeias de DNA, são auxiliares de replicação, mas sem elas a replicação não acontece. Elas funcionam no sentido de disponibilizar cadeias simples de DNA.

Vocês agora imaginem que isto que estou a representar neste sentido, composto por este conjunto de enzimas, acontece exactamente da mesma maneira mas no sentido contrário, então temos um processo bidireccional. Num determinado local, temos aquilo a que chamamos uma bolha de replicação, em que têm estas duas forcas, uma em cada sentido. Portanto uma origem de replicação e duas forcas de replicação, em que há um processo provocado pelo complexo falado anteriormente num determinado sentido, e outro no sentido oposto. Por isso nós estamos em condições de dizer que a replicação de DNA tem uma origem de replicação, duas forcas de replicação, e é bidireccional.

Mas para facilitar o funcionamento do processo das enzimas envolvidas, vamos simplificar isto à observação de apenas um dos lados. Temos aqui uma cadeia simples de DNA, e aqui outra cadeia simples de DNA, disponível para servir de molde. O que vai acontecer é que nesta cadeia de DNA vou representar uma nova cadeia em construção, a qual resultou da complementaridade que sabemos que existe (A-T, C-G). Este processo desenrola-se da seguinte forma: imaginem que temos aqui um A, ora esta molécula vai crescer por adição de um novo nucleótido, o qual vai ser um T. Qual o estado deste T? Recordam-se que nós falámos nos dNTP, isto quer dizer o seguinte: d pequeno de desoxi (são nucleótidos de DNA), o N representa as 4 possibilidades dos nucleótidos. A célula para preencher esta cadeia tem de ter disponíveis os 4 tipos de nucleótidos. Neste caso concreto, aquilo que ela vai precisar é um dTTP, portanto vai pegar num dTTP e vai introduzir na posição que está ali a ser pedida. Por cada uma destas reacções, liberta-se um pirofosfato, dois grupos fosfato, reparem que temos um dTTP. Depois de se libertarem estes 2 grupos fosfato, este novo nucleótido que agora já faz parte da cadeia está sob a forma de dTMP, monofosfato. Portanto é possível fazer a equação geral do processo de replicação, que pode ser representada da seguinte maneira: temos um DNA molde que tem cadeia simples, tem que ter agora mais dNTP´s e agora cada vez que se dá uma adição nesta reacção, eu tenho uma cadeia de

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DNA nova que ganhou um nucleótido, e por cada reacção liberta-se um pirofosfato. (na reacção aparece DNA+1 porque ganha um nucleótido de cada vez).

Para que tal aconteça, isto é feito um a um neste sentido que aqui está, e é preciso uma enzima, que se chama DNA polimerase. Portanto esta pode ser de facto a reacção típica do processo de replicação. Mas na realidade as coisas não acontecem realmente assim, há uma série de limitações que temos de ter em conta. Ponto número 1: as enzimas que fazem este processo de polimerização são DNA polimerases, mas as DNA polimerases são incapazes de colocar o primeiro nucleótido, portanto a evolução não resolveu este problema. O problema foi resolvido da seguinte forma: contrariamente à DNA polimerase, uma RNA polimerase é capaz de começar o processo do zero. Os princípios da replicação não são possíveis de ser iniciados por DNA, portanto vai haver aqui um bocadinho de RNA (chamado primer ou iniciador), e a partir do momento em que se fazem 15 ou 16 nucleótidos, vem a possibilidade de haver aqui DNA. Este bocadinho foi posto por uma RNA polimerase e depois teve continuidade por acção de uma DNA polimerase. A reacção descrita para as DNA polimerases pode ser encarada para as RNA polimerases, só que em vez de ser dNTP´s vão ser apenas NTP´s, também são trifosfato e também se forma um pirofosfato em cada ligação.

Já percebemos que este bocadinho tem de ter RNA e também já percebemos que vai ser lido de 5´ para 3´. Imaginem isto a ser obrigado a abrir, e conforme se vai abrindo esta cadeia, vai-se disponibilizando cadeia simples e isto vai crescendo. Esta replicação é dita replicação continua, porque cresce por ali fora com a pequena limitação de precisar de RNA no principio. Vai por ali fora porque esta enzima ditas para já DNA polimerases, para além da limitação de não colocarem os primeiros nucleótidos, só fazem síntese de DNA num único sentido, sentido 5´para 3´.

A questão que se levanta é a seguinte: esta cadeia que aqui está é 5´, quer dizer que a cadeia complementar é 3´, quer dizer que a cadeia neste sentido é 3´ 5´ e a enzima não funciona. A única maneira da enzima fazer é ir nessa cadeia de 5´ 3´ mas só pode fazer um bocadinho, e quando isto abrir outra vez pode fazer outro bocadinho. Enquanto numa cadeia faz de forma contínua porque está no sentido certo, aqui para fazer neste sentido tem de fazer aos bocadinhos. Então a replicação de DNA na realidade funciona com 2 tipos de replicação: uma replicação contínua num sentido em que a enzima funciona sempre, no lado contrário a replicação é dita descontínua. Os fragmentos descontínuos são chamados fragmentos de Okazaki, que são a junção de um bocadinho de RNA com DNA e depois outra vez a mesma coisa, descontínuos uns dos outros. No entanto ainda não acabámos esta explicação porque a nossa molécula de DNA está supostamente a replicar mas tem bocadinhos de RNA misturados pelo meio. Na realidade a Escherichia coli é o nosso modelo e existem 3 DNA polimerases diferentes, as quais se representam por DNA Pol I, II e III, não tem nada a ver com a sua importância mas pelo facto de umas terem sido descobertas primeiro do que as outras. Este processo que é aquilo que eu chamo o grosso da replicação, que é toda a replicação continua e todos os fragmentos de Okazaki, são polimerizados por acção da DNA polimerase III. É então uma enzima que funciona 5´ 3´ e que não é capaz de colocar os primeiros nucleótidos.

A replicação de DNA é chamada de semi-conservativa porque nas cadeias filhas está contemplada cada uma das cópias da cadeia mãe. O passo seguinte é que necessariamente estas moléculas não estão terminadas, para além de haver fragmentos

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de RNA, existem fragmentos interrompidos na cadeia descontinua. Quem vai dar o aspecto final a estas moléculas é a DNA polimerase I, que vai compor de forma correcta estas moléculas. Ela faz isto porque estas enzimas ditas polimerases, tem de facto a capacidade de por nucleótidos, mas para além disso tem também a propriedade contrária, que é tirar nucleótidos. Portanto estas enzimas tem também a actividade de exonuclease, e a DNA polimerase I, que tem actividade de polimerase 5´ 3´, tem também actividade de exopolimerase em ambos os sentidos. Vocês imaginem uma cadeia de DNA a crescer à conta de um molde que aqui está, incorporam-se novos nucleótidos, um a seguir ao outro de 5´ para 3´. Isto para a própria DNA polimerase III, que é aquela que fez o grosso deste processo todo, tem actividade polimerase de 5´para 3´ e tem actividade de exonuclease de 3´para 5´.

Imaginem esta situação: temos uma cadeia de DNA molde, e está aqui um A, o que quer dizer que a DNA polimerase tem de por aqui um T. Mas ela enganou-se e pôs um C, ora ela tem logo naquele instante a possibilidade de corrigir aquilo que acabou de pôr mal, ou seja, em vez de pôr o C, como tem actividade de exonuclease de 3´para 5´, ela tira o C que acabou de pôr mal e corrige pelo T que está certo, e continua. Mas imaginem que, embora essa correcção in situ possa funcionar, pode haver a possibilidade de haver erros, ou seja, a DNA polimerase III cometer erros que não os corrigiu na altura. Essa cadeia não está por causa disso perdida, porque a seguir a DNA polimerase I vai fazer um check total à cadeia, e vai ver o que está bem e o que está mal. E a primeira coisa que ela vai ver que está mal é que vai encontrar fragmentos de RNA. Ora como tem actividade dupla nos dois sentidos de exonuclease, ela vai tirar esses fragmentos de RNA e vai substitui-los por DNA.

Enquanto que a DNA polimerase III tem como papel principal o grosso da replicação, a DNA polimerase I tem como papel principal a correcção daquela composição, a qual é feita em dois sentidos: removendo os fragmentos de RNA e substituindo-os por DNA e eventuais erros que possam existir na própria cadeia que a DNA polimerase III deixou passar. A única coisa que ainda continua por fazer é que a DNA polimerase I foi incapaz de ligar os fragmentos de Okazaki, então o que vai acontecer para que isto termine é que uma DNA ligase vai ligar o que está por ligar. Quando isto acontecer o processo está terminado.

Só para terminar, eu posso dizer-vos que em condições normais em que a célula esteja a funcionar em pleno, a possibilidade haver um erro depois deste processo todo feito é da ordem dos 109, portanto o processo de replicação é extremamente fiável. É claro que, por exemplo se uma célula estiver sujeita a um agente mutagénico (pode ser um agente físico ou um agente químico), então aí provavelmente estes números podem passar para a ordem dos 104. Ora a probabilidade de introduzir mutações nessas cadeias são muito maiores e então temos uma célula com uma mutação, e essa mutação leva a uma alteração, o que leva a um desequilíbrio da célula.

Para acabar reparem que na Escherichia coli existem 3 DNA polimerases, mas não incorporámos em todo o processo de replicação que aqui falámos a DNA polimerase II. De facto na replicação apenas tem participação a DNA polimerase I e III, a II está relacionado com mecanismo de correcção em determinadas situações de stress.