430-TMB-VPP/011110
Chlamydia pneumoniae-IgG-sELISA medac
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430-TMB-VPP/011110 FABRICANTE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Fehlandtstrasse 3 D-20354 Hamburg DISTRIBUIDOR medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstrasse 6 D-22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103 / 8006 – 348 Fax: ++49/ 4103 / 8006 - 359
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430-TMB-VPP/011110 1 Chlamydia pneumoniae-IgG-sELISA medac
Imunoensaio enzimático para a detecção de anticorpos IgG anti- Chlamydia pneumoniae
Cat. no.: 430-TMB
APENAS PARA UTILIZAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VITRO
INTRODUÇÃO
As Chlamydiae são patogénios gram-negativos. Têm um ciclo de vida intracelular obrigatório nas mucosas e de acordo com dados recentes nas células endoteliais e células do músculo liso. Dependem de fosfatos ricos em energia das suas células hospedeiras e são, portanto, chamados parasitas de energia.
O género Chlamydia compreende quatro espécies: C. pneumoniae,
C. trachomatis, C. psittaci e C. pecorum. A C. pneumoniae e C. trachomatis são patogénios humanos obrigatórios. C. psittaci é
patogénico para o homem e uma variedade de espécies animais. Até agora
C. pecorum apenas foi isolada de animais.
As infecções com C. pneumoniae ocorrem em todo o Mundo. O espectro das doenças, para além das doenças tipo gripe, inclui sinusite, faringite, bronquite, doenças pulmonares obstrutivas crónicas, pneumonia e artrite reactiva. O envolvimento causal da C. pneumoniae na asma, sarcoidose, cancro do pulmão, aterosclerose, enfarte agudo do
miocárdio, infarto cerebral, esclerose múltipla e doença de Alzheimer
é ainda uma área actual de investigação.
De acordo com Grayston e Saikku (1989), que primeiro descreveram esta espécie de clamidia, quase todos estão infectados e reinfectados com
C. pneumoniae ao longo da sua vida. A sua detecção é mais difícil
devido aos seus fracos ou difusos sintomas; infecções por detectar podem conduzir a doença crónica com graves sequelas.
O diagnóstico das infecções por C. pneumoniae é baseado no isolamento do patogénio a partir de cultura celular, detecção directa do antigénio, testes de amplificação de áciods núcleicos e serologia.
O isolamneto do patogénio requer normalmente várias passagens; é moroso, restricto apenas a alguns laboratórios e apenas bem sucedido em poucos casos. Os ensaios de imunofluorescência directa (IFA) e imunoensaios enzimáticos para detecção de antigénio (EIA) não têm sido
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amplamente utilizados sendo tidos como de baixa sensibilidade e especificidade.
Para adetecção de anticorpos específicos de espécie a microimunofluorescência (MIF) tem sido considerda o „gold standard“. A MIF é muito trabalhosa, subjectiva, e requer muita experiência. Este sistema não está standardizado; a utilização de diferentes antigénios e diferentes critérios de cut-off para infecções passadas e recentes cria variações significativas de resultados de laboratório para laboratório.
O Chlamydia pneumoniae-sELISA medac utiliza um antigénio específico altamente purificado. A detecção de anticorpos IgM, IgA, e IgG permite aferir do estado da infecção e seguimento do tratamento.
O Chlamydia pneumoniae-sELISA medac vai de encontro às necessidades de standardização, objectividade, reprodutibilidade e automatização no laboratório de rotina.
430-TMB-VPP/011110 3 PRINCÍPIO DO TESTE
Incubação com TMB-substrato (*). A reacção é parada pela adição de ácido sulfúrico. A absorção é lida fotometricamente.
Os anticorpos específicos de
C. pneumoniae da amostra
ligam-se ao antigénio.
Os anticorpos IgG anti-humanos conjugados à peroxidase ligam-se aos anticorpos IgG (P = peroxidase).
A placa é revestida com uma preparação de antigénio específica de C. pneumoniae altamente purificada.
Vantagens do teste
) Elevada sensibilidade e especificidade.
430-TMB-VPP/011110 4 CONTEÚDO DO KIT
Cat. no.: 430-TMB
1. MTP
Microplaca: 12 x 8 poços, de cor rosa, (com suporte e dessecante selado no vácuo em saco de alumínio), separáveis, formato U, revestidos com antigénio específico de C. pneumoniae e FCS, pronta a usar.
2. CONTROL -
Controlo negativo: 1 frasco de 1,5 ml, soro humano, pronto a usar, azul, contém NBCS, fenol, ProClinTM 300 e sulfato de gentamicina.
3. CONTROL +
Controlo positivo: 1 frasco de 1,5 ml, soro humano, pronto a usar, azul, contém BSA, fenol, ProClinTM 300 e sulfato de gentamicina.
4. WB
Tampão de lavagem: 1 frasco de 100 ml PBS/Tween (x10), pH 7,2-7,4, contém ProClinTM 300.
5. BAC-DIL
Diluente de amostra: 1 frasco de 110 ml PBS/Tween/NBCS, pH 7,0-7,2, pronto a usar, azul, contém ProClinTM 300.
6. CON
Conjugado: 4 frascos de 4,5 ml cada, IgG anti-humana de cabra conjugada a HRP, pronto a usar, verde, contém BSA, fenol, ProClinTM 300 e sulfato de gentamicina.
7. TMB
TMB-substrato: 1 frasco de 10 ml, pronto a usar. 8. STOP
Solução stop: 2 frascos de 11 ml cada, ácido sulfúrico (H2SO4)
430-TMB-VPP/011110 5 1. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
Material/Reagente Estado Armazenamento Estabilidade
Kit fechado 2...8 °C prazo de validade
Microplaca aberta 2...8 °C no
saco c/ dissecante
12 semanas
Controlos abertos 2...8 °C 12 semanas
Tampão de lavagem diluído 2...8 °C 12 semanas
Diluente de amostra aberto 2...8 °C 12 semanas
Conjugado aberto 2...8 °C 12 semanas
TMB-substrato aberto 2...8 °C 12 semanas
Solução stop aberta 2...8 °C prazo de validade
Não utilizar os reagentes após a data do prazo de validade.
2. REAGENTES E MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
2.1. Água redestilada. A utilização de água desionizada pode afectar o procedimento do teste.
2.2. Micropipetas ajustáveis.
2.3. Recipientes de vidro ou plástico para a diluição do tampão de lavagem e das amostras.
2.4. Dispositivo adequado para a lavagem da microplaca (Multipipeta ou lavador ELISA).
2.5. Incubadora de 37 °C.
2.6. Leitor com filtros para 450 nm e 620 - 650 nm.
3. PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
Antes de iniciar o teste os reagentes devem ser colocados à temperatura ambiente.
Calcular o número de poços necessários. 3.1. Microplaca
O saco de alumínio tem de ser bem fechado juntamente com o dissecante após cada remoção de poços. As condições de armazenamento estão indicadas no ponto 1.
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3.2. Tampão de lavagem
Misturar um volume de tampão de lavagem (10x) com nove volumes de água (p. ex. 50 ml de tampão de lavagem (10x) com 450 ml de água). São necessários 10 ml de tampão de lavagem diluído para oito poços.
Os cristais no tampão de lavagem (10x) têm de ser dissolvidos aquecendo (máx. 37 °C) e/ou agitando à temperatura ambiente.
Não misturar reagentes específicos do teste (microplaca, controlos, conjugado) de diferentes lotes. Por seu lado, o diluente de amostra, tampão de lavagem, substrato TMB e solução stop são reagentes que geralmente se podem trocar entre todos os kits ELISA Chlamydia e Mycoplasma da medac.
Em geral, não se devem utilizar reagentes de outros fabricantes.
Apenas se obtêm resultados válidos e reprodutíveis quando o procedimento é rigorosamente seguido.
4. AMOSTRA
4.1. O teste é adequado para soro, mas não para plasma.
4.2. Não é necessário pré-tratamento da amostra, p. ex. inactivação. Contudo não deve estar contaminada com microorganismos nem conter glóbulos vermelhos.
4.3. As amostras têm de ser diluídas 1:50 com diluente de amostra.
5.A. PROCEDIMENTO
5.1. Cortar o saco de alumínio e retirar o número de poços necessários (ver 3.1.).
Os poços da microplaca estão prontos a usar e não têm de ser pré-lavados.
5.2. Pipetar 50 µl de diluente de amostra no poço A1 para branco (ver 6. A.). Adicionar 50 µl de controlo negativo em duplicado e respectivamente 50 µl de controlo positivo e de amostra diluída para determinação individual.
Se necessário os poços da microplaca podem ser mantidos numa câmara húmida até 30 minutos à temperatura ambiente antes de prosseguir o teste.
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5.3. Incubar a microplaca 60 minutos (± 5 min) a 37 °C (± 1 °C) numa câmara húmida ou selada com o selo.
5.4. Lavar a microplaca 3 vezes com 200 µl de tampão de lavagem por poço. Ter atenção para que todos os poços estejam preenchidos. Após lavagem absorver em papel de filtro.
Não deixar secar os poços! Continuar o teste imediatamente!
5.5. Adicionar conjugado (cor verde) a cada poço.
Se o teste for feito manualmente têm de ser pipetados 50 µl de conjugado.
Nota:
Se o teste for feito em sistema automático têm de ser pipetados 60 µl de conjugado devido à maior evaporação nas câmaras húmidas dos instrumentos.
A adequação do teste para aparelhos automáticos foi confirmada durante a avaliação do teste. Contudo, recomenda-se a verificação da compatibilidade do teste com o aparaelho utilizado no laboratório.
5.6. Incubar a microplaca 60 minutos (± 5 min) a 37°C (± 1 °C) numa câmara húmida ou selada.
5.7. Após incubação lavar novamente os poços (ver 5.4.).
5.8. Adicionar 50 µl de TMB-substrato a todos os poços e incubar 30 minutos (± 2 min) a 37 °C (± 1 °C) numa câmara húmida ou selados e no escuro. As amostras positivas ficam azuis.
5.9. Parar a reacção adicionando 100 µl de solução stop a cada poço. As amostras positivas ficam amarelas.
Limpar os poços por baixo antes da leitura fotometrica e ter atenção para que não hajam bolhas de ar nos poços.
A leitura deve ser efectuada até 15 minutos após a adição da solução stop.
430-TMB-VPP/011110 8 5.B. TABELA PARA O PROCEDIMENTO
Branco (A1) Controlo negativo Controlo positivo Amostra Diluente de amostra Controlo negativo Controlo positivo Amostra 50 µl - - - - 50 µl - - - - 50 µl - - - - 50 µl Incubar 60 minutos a 37 °C, lavar 3 × com 200 µl de tampão de lavagem
Conjugado 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*)
Incubar 60 minutos a 37 °C, lavar 3 × com 200 µl de tampão de lavagem
TMB-substrato 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl
Incubar 30 minutos a 37 °C no escuro
Solução stop 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
Leitura a 450 nm (ref. 620 - 650)
*) procedimento manual/automático (ver 5.5.)
6.A. CALCULO DOS RESULTADOS
∗ Ler os valores de D.O. a 450 nm (ref. 620 – 650 nm).
∗ Subtrair o valor de D.O. do branco (poço A1) de todos os outros
valores de D.O.
∗ O valor médio de D.O. do branco tem de ser < 0,100.
∗ O valor médio de D.O. para o controlo negativo tem de ser < 0,100. ∗ O valor médio de D.O. para o controlo positivo tem de ser > 0,800. ∗ Cut-off = valor médio da D.O. do controlo negativo + 0,380
∗ Zona cinzenta = Cut-off ± 10%
Repetir o ensaio se os resultados não estiverem dentro das especificações!
430-TMB-VPP/011110 9 6.B. AVALIAÇÃO DOS RESULATDOS
6.B.1. QUALITATIVA
Resultado Interpretação
D.O. < zona cinzenta negativo
D.O. Cut-off ± 10 % equívoco
D.O. > zona cinzenta positivo
6.B.2. SEMIQUANTITATIVO
D.O. amostra
D.O. Cut-off Interpretação
< 0,9 negativo
0,9 – 1,1 equívoco
> 1,1 positivo
∗ Amostras com valores de D.O. na zona cinzenta devem ser
retestados juntamente com uma amostra fresca obtida 14 dias mais tarde para determinação da alteração de título.
∗ Os resultados devem sempre ser interpretados em conjunto com IgG
e IgM e com dados clínicos e parâmetros adicionais de diagnóstico.
∗ Elevadas concentrações de hemoglobina, bilirrubina e lípidos no
soro não influenciam os resultados.
∗ Não são de excluir, em casos individuais, reactividades cruzadas
com anticorpos anti-nucleares, anticorpos heterófilos e anticorpos C. trachomatis e C. psittaci.
430-TMB-VPP/011110 10 6.C. INTERPRETAÇÃO ESPECÍFICA IgM/IgA/IgG
Resultados possíveis
IgM IgA IgG COI* COI COI
Interpretação
>1,1 <0,9 <0,9 + - -
1. Indicação serológica de um estado
inicial de infecção ou estimulação policlonal das células B. Retestar IgM, IgA e IgG após 14 dias.
>1,1 >1,1 <0,9 + + -
2. Indicação serológica de uma infecção aguda. Retestar IgG após 14 dias.
>1,1 <0,9 >1,1 + - +
3. Indicação serológica de uma infecção
aguda. >1,1 >1,1 >1,1
+ + +
4. Indicação serológica de uma infecção
aguda. <0,9 >1,1 >1,1
- + +
5. Indicação serológica de infecção
actual1. Retestar IgA e IgG após 14
dias. <0,9 <0,9 >1,1
- - +
6. Indicação serológica de uma infecção
passada. Em caso de suspeita clínica retestar após 14 dias para a evolução dos anticorpos IgA e IgG.
<0,9 >1,1 <0,9 - + -
7. Indicação serológica de um estado
inicial de infecção ou IgA solitária,
persistente2. Retestar IgM, IgA e IgG
após 14 dias. <0,9 <0,9 <0,9
- - -
8. Não há indicação de infecção actual
ou passada3. No caso de suspeita
clínica retestar após 14 dias para os anticorpos IgM, IgA e IgG.
* Index de Cut-off
Comentário:
Os resultados borderline podem indicar infecções em estado inicial ou em queda. Recomenda-se retestar após 14 dias.
430-TMB-VPP/011110 11 1 Uma infecção actual pode significar:
- infecção crónica com patogénios persistentes: Os valores COI dos anticorpos permanecem constantes por várias semanas.
- infeccão aguda: Os valores COI dos anticorpos aumentam
significativamente.
- concentração elevada de IgG: Não se pode excluir uma infecção aguda. De acordo com Grayston et al. (1989), títulos IgG por MIF ≥ 1:512 traduzem uma infecção aguda.
2 Em casos individuais podem persistir anticorpos IgA isolados. Este
fenómeno imunológico aparece em diferentes infecções bacterianas. A sua relevância clínica não é avaliável.
3 Nos casos de infecções C. pneumoniae agudas recentes os resultados
serológicos para anticorpos podem ser negativos apesar dos sintomas clínicos e detecção de antigénio positiva. Se se desejar uma confirmação serológica de um resultado positivo para antigénio ou um follow-up recomenda-se testar após 14 dias para a seroconversão.
430-TMB-VPP/011110 12 7. CARACTERÍSTICAS DE PERFORMANCE
Foram determinadas as seguintes características de performance durante a avaliação diagnostica.
7.A. ESPECIFICIDADE E SENSIBILIDADE
Foram testados soros de doentes sem sintomas de infecção respiratória para a determinação da especificidade. Não foram detectados anticorpos
C. pneumoniae por MIF.
Foram testados soros de doentes com suspeita de infecção respiratória para a determinação da sensibilidade. Forma detectados anticorpos C.
pneumoniae em todos os soros por MIF.
Grupo de doentes
Especificidade IgA IgG
Doentes sem infecção respiratória; sem anticorpos
C. pneumoniae por MIF
93% (n=86) 95% (n=42)
Grupo de doentes
Sensibilidade
IgA IgG
Doentes com infecção respiratória; todos os soros com anticorpos C. pneumoniae por MIF
95% (n=74) 99% (n=117)
7.B. PRECISÃO
Amostra Variação intra-ensaio Amostra Variação inter-ensaio (n = 11) DO média SD CV (%) n DO média SD CV (%) CN 0,032 0,009 28 21 CN 0,035 0,004 11 CPF 0,772 0,038 5 21 CPF 0,824 0,073 9 CP 1,990 0,062 3 21 CP 2,133 0,149 7 N° 1 1,951 0,098 5 21 N° 3 1,655 0,140 8 N° 2 0,731 0,030 4 21 N° 4 1,027 0,087 8
CN = controlo negativo; CPF = controlo positivo fraco (não incluído no kit); CP = controlo positivo
430-TMB-VPP/011110 13 CONSELHOS GERAIS DE MANIPULAÇÃO
∗ Para evitar contaminação cruzada não trocar os frascos e as suas tampas.
∗ Os reagentes têm de ser fechados imediatamente após utilização para evitar evaporação e contaminação microbiana.
∗ Após utilização, os reagentes têm de ser armazenados como indicado para garantir a validade.
∗ Após utilização todos os componentes do kit devem ser armazenados nos recipientes originais para evitar a mistura com reagentes de outros testes ou lotes (ver também 3.).
INFORMAÇÃO SOBRE SAÚDE E HIGIENE
∗ Os regulamentos de segurança e saúde locais têm de ser tidos em conta.
∗ Os reagentes de origem humana foram testados e considerados negativos para HBsAg, para anticorpos HIV-1/2 e para HCV. Contudo, recomenda-se que estes materiais, bem como os de origem animal (ver conteúdo do kit), devem ser manipulados como potencialmente infecciosos e utilizados com todas as precauções necessárias.
CONSIDERAÇÕES DE ELIMINAÇÃO
Os resíduos de químicos e preparações são geralmente considerados como desperdício contaminante. A eliminação deste tipo de desperdício é regulada através de leis e regulamentos nacionais e regionais. Contactar as autoridades locais ou companhias de gestão de lixos para saber procedimentos a tomar.
430-TMB-VPP/011110 14 BIBLIOGRAFIA
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