M I C R O P R O P A G A Ç Ã O D E Eucalyptus citriodora E Eucalyptus tereticornis
Dissertação apresentada ao Curso de Pós- Graduação em Engenharia Florestal do Se- tor de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial à obtenção do título de "Mestre em Ciên- cias Florestais".
CURITIBA 19 8 9
M I N I S T É R I O DA E D U C A Ç S O U N I V E R S I D A D E F E D E R A L D O P A R A N A
SETOR DE C I Ê N C I A S A G R A R I A S
C O O R D E N A Ç Ã O DO C U R S O DE P O S - G R A D U A Ç A O EM E N G E N H A R I A F L O R E S T A L
P A R E C E R
Os m e m b r o s da B a n c a E x a m i n a d o r a d e s i g n a d a p e l o C o l e g i a d o do C u r s o d e P ó s - G r a d u a ç ã o em E n g e n h a r i a F l o r e s t a l p a r a r e a l i z a r a a r g u i ç ã o da D i s s e r t a ç ã o d e M e s t r a d o a p r e s e n t a d a p e l o c a n d i d a t o D A V I D N I C O L A S H E R R E R A 'PINEDO , sob o t f t u l o " M I C R O P R O P A G A Ç X O D E EuCâlyptllS CÍÍCÍQSÍQC3 e fiUCaliiíptllS
t e c e t i C Q C n i a " p a r a o b t e n ç ã o do g r a u d e M e s t r e em C i ê n c i a s F l o r e s t a i s íCurso de P ó s - G r a d u a ç ã o em E n g e n h a r i a F l o r e s t a l do Setor d e C i ê n c i a s A g r á r i a s tia U n i v e r s i d a d e Federal do P a r a n á . Area d e c o n c e n t r a ç ã o : S I L V I C U L T U R A , após
haver a n a l i s a d o o r e f e r i d o t r a b a l h o e a r g u i d o o c a n d i d a t o , s ã o d e p a r e c e r pela
" A P R O V A Ç K O " da D i s s e r t a ç ã o c o m p l e t a n d o assim o s r e q u i s i t o s n e c e s s á r i o s para r e c e b e r o g r a u e o D i p l o m a de M e s t r e em C i ê n c i a s F l o r e s t a i s .
O b s e r v a ç ã o :
0 c r i t é r i o d e a p r o v a ç ã o da D i s s e r t a ç ã o e D e f e s a da m e s m a a p a r t i r d e n o v e m - b r o de 1980 é apenas, A P R O V A D A ou N A O A P R O V A D A .
C u r i t i b a , 0 5 de m a i o d e 1989
P r o f a . D r a . M a ^ i a E l i s a C o r t e z z i G r a ç a P r i m e i r a E x a m i n a d o r a
P r o f . D r . F r a n k l i n G a l v ã o S e g u n d o E x a m i n a d o r
P r o f . D r . M P r e s i dent
m^m Bf -Mo
Ain ci a
A m e u s irmãos m m i n h a esposa
A meus -Filhos,
d e d i c o o t r a b a l h o
BIOGRAFIA DO AUTOR
D A V I D N I C O L A S HERRERA P I N E D O , -filho de Pablo H e r r e r a Lobaton e D o n a t a Pinedo de Herrera, n a s c e u em Quillacollo, C o c h a b a m b a , Boi i via, no dia i® de s e t e m b r o de Í956.
Em Í978, ingressou na F a c u l d a d e de C i ê n c i a s A g r á r i a s do Pará (FCAP) e, em í9Si, o b t e v e o d i p l o m a de E n g e n h e i r o F1orestai .
Foi c o n t r a t a d o , em 1.932, pelo "Ministério de A s u n t o s C a m p e s i n o s y Agropecuários" da B o l í v i a , para trabalhar no projeto de p e s q u i s a s florestais no a l t i p l a n o boliviano, em La Paz, 13 ol i v i a .
Em Í98S, iniciou o Mestrado em C i ê n c i a s Florestais, no C u r s o de P ó s - G r a d u a ç a o em E n g e n h a r i a 1-1 orestal , do Setor de C i ê n c i a s A g r á r i a s da U n i v e r s i d a d e Federal cio Paraná.
A o IDRC-International Development R e s e a r c h Centre do G o v e r n o do Canadá, pela c o n c e s s ã o da bolsa de estudos.
Ao Curso de P ó s - G r a d u a ç ã o em E n g e n h a r i a Florestal, da U n i v e r s i d a d e Federal do Paraná, pela o p o r t u n i d a d e de reali- z a ç ã o do curso.
Ao Centro Nacional de Pesquisa de F 1 o r e s t a s - E M B R A P A , por ter p a t r o c i n a d o a real i zação da p e s q u i s a .
Ao Professor Dr. A n t o n i o José de A r a u j o , pela orienta- ção, ap o i o e c on f i an ç a.
A Dra. Maria Elisa Cortezzi Graça, pela co~orientação, ap o i o e c on f i an ç a.
Ao Professor D r . M a r i o Takao Inoue, p e l a co-orienta- ç ã o .
Ao Pesquisador M . S c . Edilson Batista de O l i v e i r a , pela o r i e n t a ç a o nas a n á l i s e s e s t a t í s t i c a s .
à Vera Lúcia Beirrutti Eifler, pela idealização e con- fecção d a s Fotos (FIGURAS 4, 7, í3 e Í5) e também ao Dr.
J a r b a s Yukio Shimizu (FIGURAS 9, Í0 e íí>.
À Delia M e r c e d e s B u r g o s O l i v e r a , p e l o t r a b a l h o dati- 1ográf ico.
h Marta de F á t i m a Lima, p e l o a u x i l i o na impressão do t ext o.
Ao Pesquisador M . S c . A n t o n i o A p a r e c i d o C a r p a n e z z i , en- tão chefe do C N P F , por ter p e r m i t i d o a r e a l i z a ç ã o da pesqui- sa .
Ao S i l v i n o M e n d e s , p e l o a p o i o e a j u d a .
Ao C o l e g a e a m i g o Edmar R a m o s de S i q u e i r a , p e l o apoio, ajuda e as v a l i o s a s informações no t r a b a l h o .
Ao R o b e r t o Dávi1 a H e r r e r a e familia, p e l o incentivo, amizade e a p o i o .
k minha e s p o s a M e r c e d e s , p e l o incentivo, apoio, com- p r e e n s ã o e a j u d a .
à minha inãe e irmãos, pelo incentivo e a p o i o .
A todos que d i r e t a ou indiretamente c o n t r i b u í r a m para a realização do t r a b a l h o .
i v
ABREVIAÇoES.. v u LISTA DE ILUSTRAÇÕES viii
LISTA DE TABELAS . x
RESUMO xii ABSTR ACT x i i i
1 INTRODUÇÃO
2 R E V I S £ 0 DA LITERATURA 05 2 . 1 Eucalyptus citr iodara. 05
2 .2 Euca 1'jptus tsmt icorn is . <ò6
2.3 SISTEMA DE GEMAS DOS Eucalyptus &7
2.4 MELHORAMENTO GENÉTICO 08 2.5 PROPAGAÇÃO VEGETATIVA 09 2.5.1 Técnicas de Cultura "in vitro" ... 09
2.5.1.1 Tipos de Expiantes e Estágio Fisio-
lógico 10 2.5.1.2 Meios de Cultura 12
2.5.1.3 Rendimento 14 3 MATERIAIS E MÉTODOS 15 3.1 CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO 15
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ES-
TAT ÍTICA 16
3.3 ORIGEM DOS EXPLANTES E P R é - D E S I N F E S T A -
ÇÃO Í7 3.4 DESINFESTAÇÃO DOS EXPLANTES i7
3.5 M E I O S DE CULTURA . Í9
3.5. i Meio Básico 19 3.5.2 Meio para Indução das B r o t a ç o e s ... 2 $
3.5.3 Me i o para Mui t i p 1 i cação ,2<ò 3.5.4 Meio para Elongação 2 1 3.5.5 Meio para Enraizamento 2 2 4 , RESULTADOS E DISCUSSÃO ... .... .... 23
4. í DESINFESTAÇSO DOS EXPLANTES 23 4.Í.Í Explantes de Eucalaptus c i tr iodara .. 23
4.Í.2 Explantes de Eucalyptus teret icorn is . . 25
4.2 INDUÇÃO DE BROTAÇoES 27 4.2. i Eucalaptus c itr iodora 27 4.2.2 Euca I'jp tus tsmt icorn is 3<ò 4.3 MULTIPLICAÇÃO DAS BROTAÇoES 32
4.3. í Eucalyptus citriodora .32 4.3.2 Eucalyptus tcreticorn is 36 4.4 ELONGAÇSO DAS BROTAÇoES ... 43
4.5 ENRAIZAMENTO 49 4 .5. í Euca I'jptus c i tr iodara 49
4.5.2 Euca I<jp tus teret icorn is 49
5 C O N C L U S Õ E S 57 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 59
v I
í AIA - Á c i d o indoI-3-acético
2 AIB - Á c i d o i n d o l b u t Y i c o
3 ANA - Á c i d o n a f t a l e n o a c é t i c o
4 2,4-d - Á c i d o 2 , 4 - d i c l o r o f e n o x i a c é t i c o
5 BAP - N 6 ~ b e n z i 1 am i nopur i na
6 CA - C a r v ã o a t i v a d o
7 Ü A 3 - Á c i d o g i b e r é l i c o
8 MSS - liurashige & SUoog
9 p/v - P e s o por v o l u m e
í0 v/v - V o l u m e por v o l u m e
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA
í • ESQUEMA DA OBTENÇÃO DOS EXPLANTES E DOS PRé-TRA-
TAMENTOS DE DESINFESTAÇÃO 18
2 EFEITOS DE N Í V E I S DE BAP E AIA, NA MULTIPLICAÇÃO DAS BROTAÇÕES DE £". c itr iodara, APÓS 30 DIAS DE CULTURA (GRÁFICO a> E 6<d DIAS DE CULTURA (GRÁ-
FICO b ) 33
3 PROCESSO DE MULTIPLICAÇÃO DAS BROTACõES DE E.
c itr iodara 35
4 EFEITOS DE N Í V E I S DE BAP E AIA, NA MULTIPLICAÇÃO DAS B ROTAÇÕES DE £". úeret icornis, APÓS 30 Di AS DE CULTURA (GRÁFICO a ) E 60 DIAS DE CULTURA
(GRÁFICO b> 38
EFEITOS DE NÍVEIS DE BAP E ANA, NA MULTIPLICAÇÃO . DAS B R O T A C õ E S DE E. t eret t com / s, A P Ó S 30 DIAS DE CULTURA (GRÁFICO a ) E 60 DIAS DE CULTURA
(GRÁFICO b > 40
ter st icorn is 4 2
7 EFEITOS DE NÍVEIS DO ÁCIDO GIBERÉLICO E CARVÃO ATIVADO, NA ELONGACÃO DAS B R O T A C o E S DE £". tere-
t icorn is. . . 4ó
8 ' ASPECTO DAS BROTACoES E L O N G A D A S DE E. tereticor- n is, NA AUSÊNCIA DE CARVÃO ATIVADO E ÁCIDO GIBE-
RÉLICO E NA PRESENÇA DO CARVÃO ATIVADO «f/r
9 EFEITOS DE NÍVEIS DE CARVÃO ATIVADO E ÁCIDO GI- BERÉLICO, NO ASPECTO DÁS B R O T A C o E S E L O N G A D A S DE
E. teret icorn is 48
í® EFEITOS DE NÍVEIS DE AIB E ANA, NO NÚMERO DE
RAÍZES DE £". c itr iodora 52
ii PROCESSO DE ENRAIZAMENTO DE E. citriodora 53
í2 EFEITOS DE NÍVEIS DE AIB E ANA, NO NÚMERO DE
RAÍZES DE £". teret icorn is 55
13 PROCESSO DE ENRAIZAMENTO DE E. teret icorn is 56
LISTA DE TABELAS
í EFEITO DO H I P O C L O R I T O DE SoDIO E PERÍODO DE EX- POSIÇÃO, NA D E S I N F E S T A Ç Ã O DOS E X P L A N T E S DE E.
citriodara, A P o S 21 DIAS DE ISOLAMENTO 24
2 EFEITO DO H I P O C L O R I T O DE SoDIO E P E R Í O D O DE EX- POSIÇÃO, NA D E S I N F E S T A Ç Ã O DOS E X P L A N T E S DE £.
temt icorn is, APÓS 2Í DIAS DE I S O L A M E N T O . . . 26
3 EFEITOS DE N Í V E I S DE BAP E AIA, NA INDUÇÃO DAS B R O T A Ç o E S DE £". c / tr i odora , APÓS 2í DIAS DE
CULTURA 29
4 EFEITOS DE N Í V E I S DE BAP E AIA, NA INDUÇÃO DAS BROTAÇoES DE E. tereticornis, APÓS 21 DIAS DE
CULTURA • 31
B R O T A C o E S M U L T I P L I C A D A S DE £". citriodora , APÓS 30 DIAS DE CULTURA (TABELA a ) E 6 0 DIAS DE CUL-
TURA <TABELA b ) ...» 34
6 E F E I T O S DE N Í V E I S DE BAP E AIA NA ALTURA DAS B R O T A C o E S M U L T I P L I C A D A S DE £". teret icornis.
APÓS 3Ô DIAS DE CULTURA (TABELA a ) E 60 DIAS DE
CULTURA (TABELA b ) . . 39
7 EFEITOS DE N Í V E I S DE BAP E ANA, NA ALTURA DAS B R O T A C o E S M U L T I P L I C A D A S DE £". teret icorn is, APÓS 30 DIAS DE CULTURA (TABELA a ) E 60 DIAS DE
CULTURA (TABELA b ) 4i
8 E F E I T O S DE N Í V E I S DE AIB E ANA, NO ENRAIZAMENTO DE £". citr iodora, APÓS 7, Í4 E 2í D I A S DE CUL-
TURA 5í
9 E F E I T O S DE N Í V E I S DE AIB E ANA, NO ENRAIZAMENTO DE E. teret icornis, APÓS 7, Í4 E 2i DIAS DE
CULTURA 54
RESUMO
Considerando a necessidade de se a p e r f e i c o a r técnicas apropriadas de p r o p a g a ç ã o vegetativa p a r a m u l t i p l i c a ç ã o cio- nal, a pesquisa teve por objetivo, o d e s e n v o l v i m e n t o de uma metodologia de micropropagação, via s e g m e n t o s nodais de plantas jovens de £". citr iodara e £. t&ret icorn is. As fases contempladas foram, desinfestação dos exp 1 antes, indução, multiplicação e elongação das brotações. e ainda o enraiza- mento. Foi utilizado o i»e i o básido de M U R A S H I G E & SKOQG, su- plementado com sacarose a 2 % (p/v) e s o l i d i f i c a d o com agar a 0,8 % (p/v). Para a d es i n fest ação d o s exp 1 a n t e s foram tes- tadas diferentes concentrações de h ipoclor i to de sódio (NaÜ- Cl) em d i f e r e n t e s p e r í o d o s de e x p o s i ç ã o . Na indução e multi- plicação u t i l i z a r a m - s e diferentes c o n c e n t r a ç õ e s de BAP (Nó~
b e n z i I a m i n o p u r i n a ) e AIA (Ácido i n d o l - 3 - a c é t i c o ) e, para a multiplicação de £". temticarnis incluiram-se diferentes concentrações de ANA (Ácido naftalenoacét ico) . Utilizaram-se na elongação das brotações diferentes c o n c e n t r a ç õ e s de GA3
(Ácido g i b e r é l i c o ) e CA (Carvão a t i v a d o ) , no meio básico de M&S, suplementado com BAP a <ò, í mg/l e ANA a 0, i mg/l . No enraizamento, foram usadas c o n c e n t r a ç õ e s de ANA e A.113 (Ácido
indolbutírico) separadamente . A menor p o r c e n t a g e m de conta- minação, foi obtida com o uso de 0,5 % de NaÜCl por Í0 minu- tos. Explantes de £. citr iodara e £". teret icorn is apresenta- ram uma maior indução e desenvolvimento, com o uso de BAP a 0,25 mg/l e AIA a 0,i mg/l e BAP a 0 , 2 5 mg/l e AIA a 0,0í mg/1 r e s p e c t i v a m e n t e . As maiores t a x a s de multiplicação de brotações para £". citr iodara foram o b t i d a s com BAP a í,0 mg/l e AIA a 0,í mg/l e, 0,5 mg/l de BAP p a r a £. tsrsticor- nis. Para a elongação das brotações de £'. teret icom is, a redução da c o n c e n t r a ç ã o de BAP para 0,í mg/l e ANA a 0,i mg/l foi a melhor combinação. A e l o n g a ç ã o não foi necessário para o £". citriodora. 0 uso de AIB e ANA a 0 , 5 mg/l resulta- ram em um maior número de brotações para £. citriodara e £.
tsrsticornis r e s p e c t i v a m e n t e . Neste e s t u d o a micropropagação de plantas jovens, resultou em uma taxa m é d i a de multiplica- ção de 24, í brotações/exp Ian te para £". citr iodara e de 5,0 br ot ações/exp 1 an t e para £". terct i com i s , com uma porcentagem de enraizamento de 8 6 , 7 7. e Í00 "A r e s p e c t i v a m e n t e .
An improved micropropagation procedure -For massal clo- nal p r op ag at i on o f Euca 1 ifp tus c i t r i a dor a and Euca 1 up t us t e- reticorn is was obtained. Exp 1 ants were s u r f a c e sterilized
with 0.5 or 1.0 7. (v/v) sodium hypochlorite for various pe- riods of exposure and aseptically transferred on MURASHIGE S SKQOG basal medium supplemented with 2 % (p/v) sucrose, 0.8
% (p/v) agar. In the growth induction and multiplication stages, various c o n c e n t r a t i o n s of BAP (benzylaminopurine) and IAA ( indole-3-acetic a c i d ) were used. For the multipli- cation stage of E. tereticornis, different c o n c e n t r a t i o n s of NAA (I-naphthalene acetic a c i d ) were included. At elongation stage, combinations of different concent rat i oris of GA3 (gib- berellic a c i d ) and CA (activated c h a r c o a l ) w e r e added basal medium containing 0.i mg/1 BAP and NAA. Elongated shoots we- re rooted on media containing various c o n c e n t r a t i o n s of NAA and IBA (indole-3-butyric acid). Highest multiplication ra- tes For En citriodora w e r e obtained with i »0 mg/1 BAP and 0,1 mg/1 l'AA whereas 0.5 mg/1 was the best for E. teret icor- nis. Shoots of E. teret icorn is elongated more on a moid i a containing 0.1 mg/1 of BAP and NAA. The elongation stage was not necessary For E. citriodora. The greatest number of roo- ted shoots occurred in medium containing 0.5 mg/1 IBA and NAA for E. citriodora and E. tereticornis. In this work, multiplication rates of 24.1 and 5.0 shoots/expI ant and roo- ting of 86.7 and 100 % for E. citriodora and E. teret icot—
nis, respectively were o b t a i n e d .
í INTRODUÇÃO
Entre as espécies florestais de rápido crescimento, os eucaliptos tem se destacado devido a multiplicidade de usos que apresentam, podendo ser e m p r e g a d o s para fins de produção de matéria prima flor estai , p Ian t i os de proteção, quebra- ventos e ornamentação. Proporcionam também madeiras de den- sidade baixa, media e alta, variando o seu uso desde a fa- bricação de caixas, móveis, carvão vegetal, papel até dor- mentes de estrada de ferro (MANGIERI & D I M I T R I2 7) . Por todas essas características e além de se desenvolverem em uma va- riedade de t i p o s de clima e solo, a p r e s e n t a m - s e como uma das espécies florestais mais produtivas (BONGA & D U R Z A N6) .
Euca lifptu-5 citriodora, possui c a r a c t e r í s t i c a s impor- tantes tanto pela madeira como pelo c o n t e ú d o de óleo na sua folhagem. S e g u n d o STURIGN et. al.^^, de doze espécies de eu- caliptos estudadas, E. citriodora, apresentou madeira de maior densidade, sendo a mais a d e q u a d a para a produção de energia e para usos que requerem r e s i s t ê n c i a mecânica das peças. Além desses usos, sua m a d e i r a é também ótima para
ções e também, pela sua flexibilidade, pode ser utilizada em curvaturas. Ainda, as suas folhas possuem um óleo essencial, usado com fins medicinais, industriais e de perfumaria (MAN- GIERI & D I M I T R I2 7) .
No Brasil, Eucalaptus citriodora é muito conhecido, tendo sido plantado no norte de São Paulo e Triângulo Minei- ro. .Esta espécie está entre as primeiras introduzidas no Brasil por Navarro de Andrade e, por cruzar somente com £".
niaculata e £". torci 1 iana, conservou sua pureza genética (GUIMARÃES et. al . í 8> .
Uma outra espécie importante pelo seu uso e que começa a despontar como potencial para o Brasil, é o Eucal'jptus te- ret icornis. Além de sua madeira ser úti1 para serraria, es-
r
truturas, construções e postes, é também usada para compen- sados, conglomerados, papel, lenha e carvão vegetal. Esta espécie florestal, vem revelando ser resistente a pragas e doenças e a deficiência hídrica (FERREIRA*®>.
No Brasil Eucalyptus tereticornis é bastante conheci- do, embora sejam r a r o s os plantios puros. Nos plantios rea- lizados com sementes de origem de Rio Claro, é comum a pre- sença de híbridos, principalmente com £'. grandis e E.
urophiflla. As pesquisas realizadas com esta espécie indicam- na como adequada para a região do cerrado e da mata, em áreas com solos arenosos, quentes e úmidos no verão, e com seca de 4 a 5 meses no inverno (GUIMARÃES e t . a l .i 8) .
3
A p r o p a g a ç ã o dos Eu calyptus é r e a l i z a d a principalmente por s e m e n t e s (I3GNGA & D U R Z A M6) „ Porém a maioria das espécies dos e u c a l i p t o s podem também ser p r o p a g a d a s vegetativamente
(HAR TNEY'-*) . Segundo a FAO*7', a p r o p a g a ç ã o vegetativa de in- divíduos, é promissora para a u t i l i z a ç ã o direta e em grande escala dos g a n h o s obtidos por meio de programas de melhora- mento g e n é t i c o .
Os p r i n c i p a i s métodos c l á s s i c o s de propagação vegeta- tiva u s a d o s com eucaliptos são'- e s t a q u i a , enxertia e alpor- quia. A e s t a q u i a , apresenta o p r o b l e m a da dificuldade de en- raizamento, principalmente a medi d a . que aumenta a idade da planta, d e v i d o aparentemente a p r e s e n ç a de substâncias ini- bidoras (PATON et. a l .3 2) . Ainda , s e g u n d o ANEJA & A T A L2, tentativas de multiplicar plantas de Eacal'jptu-3 c itr iodara,
<
com alto c o n t e ú d o de óleo essencial, por meio da estaquia, não tiveram s u c e s s o .
Por outro lado, a enxertia e a aTporquia em Eucalup- tu-5, são o n e r o s a s e só se aplicam p a r a fins especiais, tais como e s t a b e l e c i m e n t o de pomares de s e m e n t e , jardim clonal e outros (CRESSWELL & F O S S A R D8) . A d i c i o n a l m e n t e , ao baixo rendimento d e s s e s dois métodos de p r o p a g a ç ã o vegetativa, a enxertia a p r e s e n t a o problema de incompatibilidade entre en- xerto e p o r t a - e n x e r t o (HARTNEY2^>.
Uma outra técnica alternativa de propagação vegetati- va, é a m i c r o p r o p a g a ç ã o . Esta t é c n i c a é r e c o m e n d a d a para a propagação de espécies que, quando p r o p a g a d a s pelos métodos convenc iona is, apresentam uma d i f íc i 1 ou demorada mult ipl i- cação ou para variedades ae grande valor comercial (CI-liáE'7).
Ainda, esta técnica oferece as v a n t a g e n s de requerer pouco espaço, propagar indivíduos livres de d o e n ç a s e principal- mente obter altas taxas de m u l t i p l i c a ç ã o (HARTNEY1-'-) . A mi~
cropropagação possibilitaria também, realizar programas de
N
melhoramento genético em menor espaço de t e m p o (McKEAND &
U)EIRr-í3) e a produção de plantas durante o ano todo, indepen- dente cio clima, tempo, e com pequeno e s p a ç o físico (CHi=E7).
Até o presente momento, foram d i v e r s o s os estudos rea- lizados com m i c r o p r o p a g a ç ã o para as d i f e r e n t e s espécies de EucaIyptus. Especificamente para Euca1yptus citriodara, fo- ram determinados meios pára indução e m u l t i p l i c a ç ã o de b ro- tações. Entretanto, não det erm i.naram os m e i o s para enraiza- mento ( S I T A3 4; GREWALL et. a l .í 7> . Por o u t r o lado, GUPTA et.
al.*^, trabalhando com plantas adultas, c o n s e g u i r a m enraizar brotações só na quarta sub-cultura, e a p o r c e n t a g e m conse- guida foi baixa (35% a 40%).
Considerando a necessidade de se aperfeiçoar técnicas de propagação vegetativa para m u l t i p l i c a ç ã o clonal, ó pre- sente trabalho teve por finalidade, a o b t e n ç ã o de uma meto- dologia de m i c r o p r o p a g a ç ã o de plantas J o v e n s de Eucal'jptus c i tr iodora e Euca 1 'jp tus terct icom is.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.Í £uca lifp tus citriadora
Euca lifptus citriodara tem sua d. itribuiçao natural na parte oriental do estado de Q u e e n s l a n d - A u s t r á l i a , entre as
latitudes i72 á 262 S. Existem duas áreas principais de ocorrência: entre Maclo.y e Maryborough (222 a 262 S), e na região próxima a Atherton (í/s a 192 S>. A primeira popula- ção se encontra a uma altitude de 75 a 300 metros, e a se- gunda de 6 0 0 a 800 metros (HILLIS & B R O W N2 4) . ' E s t a espécie, ocorre também associada com p o p u l a ç õ e s de Eucalyptus ter&ti- corn i s, t r i a n tha , £". s i derop hlo ia, £. p a n i cu 1 a t a, Eu p ro- pinqua, £". maculata e Araucar ia cunn ingham i i (MANGIERI & DI- M I T R I2 7) .
Quanto as exigências e d a f o c 1 i m á t i c a s , esta espécie ocorre em regiões tropicais, com precipitação pluviométrica anual de 600 a 1000 mm. Os tipos de solo onde melhor se de- senvolvem são argilo-arenosos, a v e r m e l h a d o s , podzólicos e lateríticos, bem drenados e p r o f u n d o s , podendo também se
adaptar aos solos pobres (MANGIERI & D I M I T R I2 7) .
No Brasil é uma das espécies de maior plasticidade, en- contrando-se plantações desde o Estado do Rio Grande do Sul até a região amazônica. Entretanto, devido a sua sensibili- dade às geadas e sua elevada tolerância à c o n d i ç õ e s de seca, sao recomendados para quase a totalidade da região norte e central do Brasil, incluindo os E s t a d o s do Piauí, Ceará, quase a totalidade dos Estados do Rio Grande do Norte, Pa- raíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia, a totalidade do Estado de Minas Gerais e parte do Espírito Santo (GOLFARI &
PINHEIRO N E T 0í 5) .
2.2 Eue a lyptus t ere t i com i s
Árvore cónica de porte médio, sendo que às vezes pode- se encontrar indivíduos de grande t a m a n h o (MANGIERI & DIMI- T R I2 7) . Na Austrália, a altura das p l a n t a s desta espécie chega a 45 m ou mais, com tronco reto e copa bastante densa.
A casca é lisa, branca ou pigmentada ( F A O9) . A sua distri- buição natural ocorre entre as latitudes de a 38s S, com- preendendo os estados de Queensland, New Wale, Victoria, chegando até Papua-Nova Guiné (FERREIRA*®).
Em relação às exigências e d a f o c 1 i m á t i c a s , suporta uma variedade de tipos de solo, de p r e f e r ê n c i a solos profundos, bem drenados, aluviais, limo e argi1 o - a r e n o s o s . As condições ótimas de precipitação pluviométrica anual se situam entre 800 mm e 1500 mm, com regimes de chuva predominante no ve-
7
rão, com uma estação seca m o d e r a d a a bastante rigorosa.
Apresenta-se mais tolerante à seca que Eucalyptus granrfis, mas ligeiramente menos tolerante que o £". cama Iiiu I&ns is
( F A O9) .
Esta espécie é amplamente difundida no Brasil, sendo que no Estado de São Paulo se e n c o n t r a extensamente cultiva- da e, ainda, é também indicada como potencialmente apta, pa- ra quase a totalidade da região norte e central do Brasil,
incluindo os Estados de Piauí, Ceará, quase a t o t a l i d a d e dos Estados de Alagoas, Sergipe, B a h i a , parte dos E s t a d o s de Pernambuco, Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro e P ar an á (GOLFAR I & PINHEIR 0 N E T O1 5) .
2.3 SISTEMA DE GEMAS DOS Eucalyptus
Os eucaliptos, por não possuírem gemas latentes, apre- sentam um crescimento continuo, sendo que, o ápice principal produz continuamente pares de Folhas a intervalos r e g u l a r e s , constituindo um "broto de crescimento indefinido". Ainda, na axila de cada folha existe uma gema pedunculada, que por não possuir proteção de escamas é denominada de gema nua. As ge- mas nuas p r ó x i m a s ao ápice, d e s e n v o l v e m - s e s i m u l t a n e a m e n t e a estas dando origem aos ramos de primeira ordem ou, caso o ápice principal é destruído, esta assume a função do ápice em questão de dias ( F A O9) .
Os e u c a l i p t o s p o s s u e m também sob a s gemas n u a s , p o n t o s de tecido m e r i s t e m á t i c o c a p a z de p r o d u z i r novas g e m a s a x i l a - res. 0 d e s e n v o l v i m e n t o d e s s e t e c i d o m e r i s t e m á t i c o é inibido devido à c o n c e n t r a ç ã o hormonal p r o d u z i d a na gema nua ou na brotação s u p e r i o r , e quando uma ou o u t r a é d e s t r u í d a e s s a inibição é r e m o v i d a , p o s s i b i l i t a n d o o s u r g i m e n t o d a s g e m a s acessor i a s < F A Ov) .
2.4 M E L H O R A M E N T O G E N É T I C O
As v a r i a ç õ e s intrínsecas d a s e s p é c i e s do g ê n e r o Eu- càl'jp£us, podem ser t a n t o c l i n a i s c o m o e c o t í p i c a s . A v a r i a - ção clinal é e n c o n t r a d a nas e s p é c i e s de e u c a l i p t o s m a i s am- plamente d i s t r i b u í d a s , e x p r e s s a - s e t a n t o em c a r a c t e r e s m o r - fológicos c o m o nos Fisiológicos. 0 e s t u d o de t a i s m o d o s de variação é e s s e n c i a l para resolver m u i t o s p r o b l e m a s de no- menclatura e p a r a determinar as m e l h o r e s -Fontes de s e m e n t e s
( P R Y O R3 3) . As e c o t í p i c a s tem uma d i s t r i b u i ç ã o mais limitada, caracter izádo p e l a o c o r r ê n c i a à s v e z e s de p r o c e d ê n c i a s iso-
1 ad as , a d ap t ad as a c on d i ç õ e s ec o 1 óg i c as espec í -F i c as ( F A O9 ) . S e g u n d o a F A O9, na a t u a l i d a d e os p r o g r a m a s de m e l h o r a -
mento g e n é t i c o m a i s p r o m i s s o r i o s , s ã o a q u e l e s que utilizam os p r o g r e s s o s c o n s e g u i d o s com a p r o p a g a ç ã o v e g e t a t i v a , para a p r o d u ç ã o massal de material g e n e t i c a m e n t e m e l h o r a d o . As possíveis estratégias' para o m e l h o r a m e n t o g e n é t i c o de euca- liptos são: s e l e ç ã o de e s p é c i e s e de p r o c e d ê n c i a s / s e l e ç ã o e ordenação d o s p o m a r e s de s e m e n t e s ; s e l e ç ã o individual; teste
9
de p r o g é n i e e c l o n a l ; e s t a b e l e c i m e n t o de p o m a r e s de semen- tes; c r u z a m e n t o c o n t r o l a d o ; p r o d u ç ã o massal por propagação v e g e t a t i v a de material g e n e t i c a m e n t e m e l h o r a d o .
2.5 P R O P A G A Ç Ã O V E G E T A T I V A
•A p r o p a g a ç ã o v e g e t a t i v a , é de muita importância quando a c o m p o s i ç ã o g e n é t i c a ( g e n ó t i p o ) é a m p l a m e n t e h e t e r o z i g o t a e suas c a r a c t e r í s t i c a s i m p o r t a n t e s se perdem ao ser p r o p a g a d a s por "sementes (HARTMANN & K E S T E R2 < ò ) .
Além dos d.iferentes m é t o d o s c l á s s i c o s de p r o p a g a ç ã o ve~
*
g e t a t i v a d o s e u c a l i p t o s , t a i s c o m o e s t a q u i a , e n x e r t i a e al~
p o r q u i a , existe outra t é c n i c a a l t e r n a t i v a , que é a micropro-
<
P ag aç ão (IH AR TNE Y2 1 ) .
2.5. í T é c n i c a s de C u l t u r a *in vitro"
A mi cr op r op ag aç ão o u c u11 ur a "in v i t r o " , é uma t éc n i- ca pela qual p e q u e n a s p a r t e s de tecido ou o r g ã o são removi- d o s de uma p l a n t a d o a d o r a e c u l t i v a d o s a s s e p t i c a m e n t e num m e i o de c u l t u r a (BQNGA^). A i n d a CHiáE7, d e f i n i u a m i c r o p r o p a - gação c o m o um método r á p i d o de p r o p a g a ç ã o v e g e t a t i v a , basea- do na m u l t i p l i c a ç ã o a s s e x u a d a de uma p l a n t a c u l t i v a d a "in v i t r o " .
R e f e r e n t e aos c u s t o s , de m o d o geral t o d o s os métodos de p r o p a g a ç ã o v e g e t a t i v a s ã o m a i s o n e r o s o s do que a propaga- ção s e x u a d a (CRESSWELL & F Q S S A R D8) . Porém, a u t i l i z a ç ã o de
técnicas de m i cr o p r o p a g a ç ã o em programas de melhoramento, levaram ao consenso de que compensam os c u s t o s necessários
(BQNGA5). Num estudo de produção massai de e u c a l i p t o s tole- rantes à geadas, d e t e r m i n o u - s e que o custo é aproximadamente o dobro do que por s e m e n t e s , mas que é c o m p e n s a d o pelo de- sempenho consequente da planta <FRANCLET & B G U L A Y1 4) .
2.5.í.i Tipos de E x p l a n t e e Estágio F i s i o l ó g i c o
Para as t é c n i c a s de cultura "in v i t r o " , diversas partes da planta podem ser usadas como -fontes de expiantes, tais como lignotuber, h i p o c ó t i l o e c o t i l é d o n e , estâmes, seg- mentos nodais ou g e m a s terminais e axiais, caule e raiz
(ANEJA S A T A L2; BARKER et . a l .3; BENNETT & M c C Q M B4; FQSSARD Ã B Û U R N E1 2; FOSSARD e t . a l .í 3; FRANCLET & BOULAY *4; GREWAL
<
et. a l .i 7; GUPTA et. a l .í 9; HARTNEY S B A R R E R2 3; KITAHARA 8 C A L D A S2 5; LEE S F O S S A R D2 0; M E H R A - P A L T A2 9; OKA et. a l .3 í; SI- T A3 4) .
BENNETT Ã M c C O M B4, usando d i f e r e n t e s explantes de Eucalyptus marginata, verificaram que s e g m e n t o s nodais apre- sentaram altas taxas de contaminação, em c o m p a r a ç ã o com a cultura de filamentos de e s t â m e s que n ã o se contaminaram.
Por outro lado, FOSSARD Ã B O U R N E1 2, o b s e r v a r a m que a conta- minação de expiantes p r o v e n i e n t e s de s e g m e n t o s nodais foi em média 30%, enquanto que os da gema apical foi em torno de ó%.
Com relação ao e s t á g i o fisiológico, foi observado que influe na r e g e n e r a ç ã o de plântuias. E s t u d o s experimen- tais indicam que a m i c r O p r o p a g a ç ã o de p l a n t a s adultas é mais
í í
difícil. Ass i m, BENNETT & M c C O M B4, observaram que a porcen- tagem de enraizamento de e x p l a n t e s de plantas a d u l t a s de Eu~
calyptus marginata era mais baixo do que de p l a n t a s jovens.
Da mesma forma, C R E S S W E L L &. FOSSAR D3, u s a n d o seg- mentos nodais de plantas j o v e n s de Eu calyptus grandis, obti- ver am enra i zamento ma i s fac i1mente do que com p 1 a n t a s adu1- tas. Entretanto, com e s s a mesma espécie FOSSARD e t . ai.-'-3, trabalhando com plantas que tinham mais do que 50 entrenós, conseguiram iniciação de e n r a i z a m e n t o e d e s e n v o l v i m e n t o de plântulas a partir de e x p l a n t e s consideravelmente mais altos do que o í52 entrenó.
Ainda, GUPTA e t . a l . *9, usando g e m a s t e r m i n a i s e axiais de plantas com 20 anos dé idade de Eucalyptus c(trio- dara , obtiveram de 30% a 40% de enraizamento d a s brotações
<
na quarta sub-cultura, e 45% a 50% na quinta e subsequente sub-cult ura.
Adicionalmente ao e s t á g i o fisiológico, outro pro- blema encontrado na m i c r o p r o p a g a ç ã o de p l a n t a s a d u l t a s é a 'contaminação. Trabalhando com quatro espécies de Eucalyptus,
I3ARKER et. a l .J, observaram que E. fiei foi ia e £". polyòrac- tsa produziram brotações m ú l t i p l a s a partir de s e g m e n t o s no- dais de plantas adultas, enquanto que E. grandis e E. rcg~
nans foram afetados peia c o n t a m i n a ç ã o .
2»5 i1.2 Hei os de Cultura
Os requerimentos dos c o n s t i t u i n t e s dos meios pará a cultura °in vitro" variam com a e s p é c i e e com o tipo de ex- plante. Entretanto, existem d i f e r e n t e s m e i o s de cultura de constituição definida, tais c o m o . d e . M & S (MURASHIGE & SKG~
O G3® ) , WHITE3 , 7 e outros, os quais serviram como meios bási- cos ,• principaimente com relação aos s a i s inorgânicos e vita- minas, para muitas espécies de Eucalyptus.
Assim, um primeiro trabalho bem sucedido foi com lignotuber de Eu ca lyptus c itriodora < A N E J A & A T A L2) . Entre- tanto, nesse trabalho não foram d e s c r i t o s com detalhes os meios usados. Em outro trabalho com essa m e s m a espécie, SI- T A3 4, conseguiu induzir organogênese no meio básico de M&S.
<
Entretanto, devido à alta c o n t a m i n a ç ã o , a p e n a s três brota- ções sobreviveram.
Por outro lado, a partir de e x p l a n t e s obtidos de h ipocót i los de Eucal-jptus alba, no meio de W H I T E , contendo AIA (Ácido indol-3-acético) ou 2,4~d (Ácido 2,4~dic1orofeno- x i acético) e água de coco, KITAHARA & CALDAS--5 obtiveram a
formação de calo e subsequente e n r a i z a m e n t o . As brotações só ocorreram após dois meses, num jiie i o c o n t e n d o água de coco e AIA.
Segundo FQSSARD**, a adição de água de coco no meio
i
tem sido muito efetiva na indução em v á r i a s espécies em cultura de tecidos, mas devido a sua n a t u r e z a química inde-
finida e por sua origem biológica, introduz a possibilidade de obter resultados difíceis de serem r e p r o d u z i d o s e por is-
13
so p r e i e r e - s e sub st i t u í-1 a p or sub st ân c i a s qu í m i c a s d eF i n i- das.
Em outro t r a b a l h o OKA e t . a l .3 i, a partir de seg- mentos de hipocótilo de Eucalyptus globulus, obtiveram a re- generação de plântulas num meio com BAP (Nó-benzi1 arainopuri- na) e ANA (ácido n a f t a l e n o a c é t i c o ) . Por outro lado, na ten- tativa de induzir a r e g e n e r a ç ã o de orgãos, á partir de calos de tecido de caule e lignotuber de £"„ bancroft s i, LEE & FOS- SARD'-^, utilizando v á r i a s c o n c e n t r a ç õ e s de d i f e r e n t e s auxi- lias e citocininas, não o b t i v e r a m sucesso.
GREWAL et. al.i / 7, u s a n d o brotações a p i c a i s de Eu~
califptws citriodora, o b s e r v a r a m que o ácido a s c ó r b i c o favo- receu a iniciação das b r o t a ç õ e s e seu d e s e n v o l v i m e n t o . De- tectaram também que, r e d u z i n d o as fontes de n i t r o g ê n i o (KNO3
<
950 mg/l e NH4 N.U3 825 mg/l ) e a u m e n t a n d o a c o n c e n t r a ç ã o de cálcio (Ca Cl 2 880 m g / l ) do meio MSS, a taxa de multiplica- ção era maior do que com as c o n c e n t r a ç õ e s n o r m a i s . A adição de ácido ascórbico controla a p r o d u ç ã o de o x i d a ç ã o e produz efeitos auxiliares na iniciação e m u l t i p l i c a ç ã o de brota- ções. Entretanto, a c a u s a da e f i c i ê n c i a de b a i x o s níveis de nitrogênio e altos níveis de c á l c i o não foi d e t e r m i n a d a .
Com relação ao CA (Carvão Ativado), quando usado num meio de cultura de Euca lypt us c i tr ('odora , favoreceu a elongação das brotações e t a m a n h o das folhas. A altura va- riou de 5 a 8 cm e de 0 , 2 a í,0 cm, com e sem uso de CA res- pectivamente. Entretanto, o n ú m e r o de b r o t a ç õ e s reduziu sig- nificativamente. A e x s u d a ç a o fenólica na c u l t u r a de tecidos é possivelmente uma das c a u s a s que inibe as b r o t a ç õ e s . A
adição de CA absorveria essas s u b s t â n c i a s provocando efeitos satisfatórios para o desenvolvimento de brotações (AHUJA*).
Por outro lado, FQSSARD & B G U R N E1 2 detectaram que os meios com agar foram superiores aos m e i o s líquidos, tanto para d e s e n v o l v i m e n t o das brotações como para as raízes, e
que os meios sem citocinina eram m e l h o r e s para o enraizamen- to.
2.5.1.3 Rendimento
Sob o ponto de vista de produção massal, a partir de uma gema s i m p l e s de Eucal^ptus ei t r i a d o r a, GUPTA et.
a l . *9 estimaram que em média plantas/ano poderiam ser p r o d u z i d a s . A propagação cIonal "in vitro" de plantas de diferentes idades e populações de t. urophtflla, foi em média
<
7,5 }< 1 0í 3 plantas/ano < G O N C A L V E Sí ó> . HARTNEY & BARK E R2 3, obtiveram uma taxa de multiplicação de brotações, de no mí- nimo três v e z e s em três semanas, r e p r e s e n t a n d o uma taxa de produção teórica aproximadamente de 1,3 x 10® brotações/ano a partir de um único segmento nodal, para várias espécies de Ojealuptus.
3- M A T E R I A I S E MÉTODOS
3.í CONDIÇoES 'DE INCUBACÃO
Os experimentos foram conduzidos sob c o n d i ç õ e s contro- ladas de temperatura e luz. A temperatura para t o d o s os ex-
f
perimentos foi de 25s + 2s C.
Com relaçao à luminosidade, os e x p e r i m e n t o s de indução, mu11 i p1i c aç ao e elon g aç ao das b r ot aç Ões for am c ond u z i d os sob
intensidade luminosa de i<ò<ò<ò Lux, obtidas com lampadas fluo- r esc en t es "s i1van ia" (1uz tipo br an c a-fr ia), no regi me f ot o- periódico de íó horas, sendo que, o e x p e r i m e n t o de indução de brotações foi incubado inicialmente por 7 d i a s sem luz.
Por outro lado, as condições de incubaçao do experimento de enraizamento, foi na escuridão total.
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE E S T A T Í S T I C A
O delineamento utilizado para todos os experimentos, foi completamente casualizado»
Com relação à análise dos resultados, foram utilizados vários testes estatísticos para os d i f e r e n t e s experimentos.
Os resultados de explantes sadios, b r o t a ç õ e s induzidas e presença de raízes, dos e x p e r i m e n t o s de d e s i n f e s t a ç ã o , indu- ção e enraizamento respectivamente, por se distribuirem de acordo a distribuição binomial, o desvio p a d r ã o para cada experimento foi calculado pela fórmula dã binomial e o teste estatístico utilizado foi do O u i - q u a d r a d o , com e x c e ç ã o dos resultados de enraizamento de Lucalyptus terst icom is, que por ter apresentado o cálculo da frequência e s p e r a d a menor que 5, foi utilizado o teste exato de F i s c h e r . 0 nível de probabilidade para os dois testes foi de 5 %.
Por outro lado, os resultados da taxa de m u l t i p l i c a ç ã o , incremento em altura e número de r a í z e s , d o s e x p e r i m e n t o s de multiplicação, elongação e enraizamento r e s p e c t i v a m e n t e , fo- ram apresentados em gráficos ilustrativos, que possibi1ita- ram observar o comportamento e a tendência, dos diferentes níveis de reguladores de c r e s c i m e n t o . A i n d a , nos gráficos foi apresentado o intervalo de confiança para cada média, ao nível de probabilidade de '5"Á.
1 7
3.3 ORIGEM DOS E X P L A N T E S E PRé-DESINFESTAÇÃO
Foram utilizados, explantes oriundos de segmentos no- dais de plantas j o v e n s a partir de 1 ano até 2,5 anos de
idade, de £uca 1 yp t u s c i t r i adora e Luca 1 <jp tus t are t i corn i s . As plantas jovens foram produzidas a partir de s e m e n t e s e cultivadas em casa de vegetação do Centro Nacional de Pes- quisas de Florestas.
Para a obtenção dos explantes foram removidos • ramos apicais de v a r i a s p l a n t a s das duas espécies, p o s t e r i o r m e n t e desfolhados e c o l o c a d o s num recipiente com água e transpor- tados para o laboratório. No laboratório, foram r e m o v i d o s os segmentos nodais dos ramos desfolhados e colocados numa so-
lução do detergente comercial "odd" a 1,5% <v/'v) por 3<d mi-
<
nutos e posteriormente lavados com água c o r r e n t e . Logo após, foram m e r g u l h a d o s numa solução do fungicida comercial °ben- late ° (met i1-i-(but i1carbamo i1)-2-benzam i dazol carbamat o), na concentração de 5<&0 mg/l por 5 minutos, em seguida "lava- dos com água bidestilada (ESQUEMA DA FIGURA 1).
.3.4 DESINFESTAÇÃO DOS EXPLANTES
Os expiantes após receber os pré-trat amentos com deter- gente comercial e fungicida, foram t r a n s p o r t a d o s para a câ- mara asséptica, onde foram submetidos aos seguintes trata- mentos :
FIGURA i.. ESQUEMA DA OB TENÇÃO D O S E X P L A N T E S E D O S P R É - T R A T A - MENTOS DE D E S I N F E S T A Ç Ã O .
desinfestado e inoculação no raeio de cuitura
A - Ramo removido da planta
B - Transporte ea água p/ laboratório, ramo desfolhado C - Remoção dos segmentos nodais
D - Pré-trataaento ea detergente coaercial E - Lavagem em água corrente
F - Pré-trataaento eis fungicida 6 - Lavagem em água bidestilada
í 9
(í) hi poclor i to de sód i o (0, 5 7.) por í 0 m i n ; (2) h i poc1or i to de sód i o (0, 5 %) por 20 m i n ; (3) h i poclor i to de sód i o (0, cr vJ 7.) por 30 m i n ; (4) h i poc1or i to de sód i o (0, 5 %> por 40 m i n;
(5) hi poc1or ito de sód i o ti, 0 %) por 0 5 m i n i (6) h i poc1or i to de sód i o (i, 0 %> por i 0 m i n i (7) t est e m u n h a (seiv i h i p o c l o r i t O de S' id i o )
T o d o s os t r a t a m e n t o s com e x c e ç ã o da t e s t e m u n h a , incluí- ram o ad sor v e n t e TWEEN--20.
A p ó s r e c e b e r os t r a t a m e n t o s , os e x p l a n t e s -foram lavados por t r ê s v e z e s em água b i d e s t i l a d a e e s t e r i l i z a d a e, poste- r i o r m e n t e inoculados v e r t i c a l m e n t e no m e i o de c u l t u r a .
A a v a l i a ç ã o foi r e a l i z a d a a o s 2í d i a s e a s v a r i á v e i s foram, c o n t a m i n a ç ã o , o x i d a ç ã o e- e x p l a n t e s s a d i o s . Cada tra- t a m e n t o foi r e p e t i d o 6 0 v e z e s .
3.5 M E I O S DE CULTURA
3.5.í M e i o B á s i c o
Foi u t i l i z a d o o m e i o b á s i c o de M U R A S H I G E & S K O Q G3 4, s u p l e m e n t a d o com s a c a r o s e a 2 "A (p/v) e s o l i d i f i c a d o com agar a 0 , 8 7. (p/v). 0 pH foi a j u s t a d o em 5 , 8 a n t e s da este- r i1i z a ç ã o .
Os m e i o s de c u l t u r a foram d i s t r i b u í d o s em d o i s tipos de r e c i p i e n t e s de v i d r o ; p a r a as fases de indução d a s b r o t a - ções e e n r a i z a m e n t o , -foram u t i l i z a d o s r e c i p i e n t e s de 3 cm de d i â m e t r o por 8 cm de a l t u r a , com c a p a c i d a d e de 4 0 ml e, a
quantidade de m e i o d i s t r i b u í d o por r e c i p i e n t e foi de 7 ml e í0 ml r e s p e c t i v a m e n t e . Para as fases de m u l t i p l i c a r ã o e e i o n g a ç ã o d a s b r o t a ç õ e s , foram u s a d o s r e c i p i e n t e s de & cm de d i â m e t r o por 6 , 8 cm de altura, com c a p a c i d a d e de i20 ml e a q u a n t i d a d e de m e i o d i s t r i b u í d o por r e c i p i e n t e , em a m b a s fa- ses, foi de 25 ml. Os r e c i p i e n t e s foram f e c h a d o s com papel a l u m í n i o e logo a p ó s e s t e r i l i z a d o s em a u t o c l a v e a 1202 Q por 10 m i n u t o s .
3 . 5 . 2 Meio para Indução das B r o t a ç õ e s
Para a indução d a s brot a ç õ e s os- t r a t a m e n t o s consti- tuíram da c o m b i n a ç ã o de d i f e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s de BAP (0,1 mg/l e 0 , 2 5 m g / l ) e AIA (0,01 mg/l e 0,1 mg/l ) além da tes- t e m u n h a .
A a v a l i a ç ã o foi r e a l i z a d a a o s 21 d i a s e as variáveis
•Foram, brot a ç õ e s induzidas e d e s e n v o l v i m e n t o . O s c r i t é r i o s a d o t a d o s para a a v a l i a ç ã o do d e s e n v o l v i m e n t o d a s brotações foram de a c o r d o com o n ú m e r o de p a r e s de f o l h a s lançadas.
A d o t a r a m - s e quatro c l a s s e s de d e s e n v o l v i m e n t o p a r a avaliá- los: F F (brotações com folhas fechadas); 1 P F A (brotações com um par de folhas abertas); 2 P F A ( b r o t a ç õ e s com dois p a r e s de folhas a b e r t a s ) ; t-3 P F A ( b r o t a ç õ e s com três ou mais p a r e s de f o l h a s a b e r t a s ) .
3 . 5 . 3 Meio para M u l t i p l i c a ç ã o
Nesta fase, para as d u a s e s p é c i e s , foram u t i l i z a d o s a c o m b i n a ç ã o d a s d i f e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s de BAP (0,5 mg/l;
1,0 mg/l e 2 , 0 m g / l ) e AIA (0,01 mg/l e 0,1 m g / l ) e a teste-
munha. Porém, devido ao r e d u z i d o número de r e p e t i ç õ e s res- tantes da espécie Eacalyptus tereticarnis, não foi possível avaliá-la, razão pela qual foi r e a l i z a d o um outro experimen- to incluindo uma concentração menor de BAP (0,1 m g / l ) e au- sência de AIA, resultando na seguinte combinação: BAP (0,1 mg/1; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l e 2,0 m g / l ) e AIA (0; 0,0i mg/l e 0,1 m g / l ) e a testemunha.
Por causa da baixa taxa de multiplicação das brota- ções de Eacalyptas ter et icorn is,' no e x p e r i m e n t o anterior,
foi realizado mais um e x p e r i m e n t o constituido de BAP (0,5 mg/l; 1,0 mg/l e 2,0 m g / l ) e ANA (0; 0,01 mg/l e 0,1 m g / l ) e a testemunha (BAP a 0,5 mg/l e AIA a 0,1 mg/l).
A avaliação dos e x p e r i m e n t o s foi r e a l i z a d a aos 30 e 60 dias e as var iáveis foram, a taxa de m u l t i p l i c a ç ã o e a
<
altura d a s brotações.
3.5.4 Meio para Eiongação
Esta fase não foi necessária para o Eu ca iyptus ci~
triodara por apresentar suas b r o t a ç õ e s m u l t i p l i c a d a s uma al- tura adequada ao enraizamento.
Para a eiongação das brotações de Eucaiyptus ter eti - cornis, foi utilizado como meio b á s i c o o meio M&S, suplemen- tado com BAP a 0,1 mg/1 e ANA a 0,1 mg/l. 0 experimento re- sultou da combinação das d i f e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s de GA3
(Ácido G i b e r é l i c o ) (0; 0,i mg/l e 1,0 m g / l ) e CA (0; 0,5 % e 1,0 %) e a testemunha.
foram, incremento em a l t u r a e a s p e c t o . D e v i d o à impossibili- dade de se medir o a s p e c t o , o p t o u - s e por avaliar na forma d e s c r i t i v a , c o n s i d e r a n d o a c o l o r a ç ã o , o x i d a ç ã o na base, ex- s u d a ç ã o n a s f o l h a s (gotí.culas, tipo c a l o , p r e s e n t e na su- p e r f í c i e d a s folhas, de c o n s t i t u i ç ã o d e s c o n h e c i d a , que cau- sam a morte a partir do ápice p a r a b a s e ) , m o r f o l o g i a , d e t e - rioração e m o r t e .
3 . 5 . 5 H e i o p a r a E n r a i z a m e n t o
Nesta fase foram t e s t a d a s d i f e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s de AIS (Ácido i ndolbut ír ico) (0,5 mg/l; í,0.mg/'l e 2 , 0 m g / l ) e ANA (0,5 mg/l e . í , 0 m g / l ) , s e p a r a d a m e n t e e a t e s t e m u n h a (sem regulador de c r e s c i m e n t o ) . 0 ANA por ser u m a a u x i n a m a i s po- tente, não foi u t i l i z a d a a c o n c e n t r a ç ã o de 2 , 0 mg/l, c o m o para A113.
As a v a l i a ç õ e s foram r e a l i z a d a s a o s 7, 14 e 21 dias de c u l t u r a e as v a r i á v e i s foram, p r e s e n ç a e n ú m e r o de r a í z e s .
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 D E S I N F E S T A D O DOS E X P L A N T E S
4.1.1 E x p l a n t e s de Eucalyptus citriadora
r
Como pode-se observar na TABELA 1, todos os tratamen- tos utilizados para a d e s i n f e s t a ç ã o dos expiantes, foram me- lhores no controle da c o n t a m i n a ç ã o em relação a testemunha, que ap r esen t ou 100 "À d e c on t am i n aç ã o .
Embora os t r a t a m e n t o s 1, 5 e 6 não diferiram estatis- ticamente, o tratamento 1 foi o que apresentou maior porcen- tagem de expiantes sadios.
Com relação à oxidação, o tratamento 1 a p r e s e n t o u a menor porcentagem de oxidação, s e g u i d o p e l o s t r a t a m e n t o s 5 e ó.
0 per iodo de e x p o s i ç ã o mostrou ser fundamental na oxidação d.os. exp lantes. Q u a n t o maior foi o tempo de exposi- ção dos explantes no hipoclorito de sódio, maior foi a por- centagem de oxidação. Como pode-se observar, embora os tra-
triodara, APÓS 2 1 DIAS DE ISOLAMENTO.
TRATAMENTOS NaOCl
(X)
PERs.
EXPO.
< m i ri)
CONT.
(%)
OXID.
(%)
EXPLANTES SADIOS
(X)
S
í. 0,5 Í0 í > 7 2Í, 7 76,7 a 5,4
2. 0,5 20 i,7 56,7 4Í,7 cd 6,3
3. 0,5 30 1,7 66,7 3Í, 7 d 6,0
4. 0,5 40 í < 7 45,0 53,3 bc 6,4
5. í,0 5 3,3 35,0 6í,7 ab 6,3
6. í,0 í 0 í,7 35,0 63,7 ab 6,2
7. testemunha í 00,0 0 0 0
Valores seguidos pela raesiaa "letra nlo difere® pelo teste Qui-quadrado (P > 0,85).
Pers. Expo. - Período de Exposição Cont. - Contaminação
Üxid. - Oxidação S - Desvio-padrao
tamentos 5 e 6, sejam constituídos de í % de hipoclorito de sódio, devido ao período de exposição dos explantes, apre- sentaram menor porcentagem de oxidação, que os tratamentos com 0,5 Z de hipoclorito de sódio por 20, 30 e 40 minutos.
Isso possivelmente é devido, a que exista uma maior penetra- ção de hipoclorito de sódio nos tecidos dos explantes, a me- dida que aumenta o tempo de exposição, p r o m o v e n d o uma maior liberação de fenóis pela injuria nos tecidos, que causam a ox i dação.
Pelos r e s u l t a d o s obtidos, para a desinfest ação dos expiantes desta espécie, pode-se indicar uma baixa concen- tração de hipoclorito de sódio (0,5 %) por Í0 minutos de ex- posição, como a mei-ior para a desinfestação dos explantes.
4. í . 2 £ plantes de Eue a 1 yp t u s t sre t i com i s
Como pode-se observar na TABELA 2, todos os tratamen- tos utilizados para a desinfestação dos expiantes, foram eficientes no controle da contaminação em r e l a ç ã o a testemu- nha, que apresentou 98,3 7. de contaminação.
Nos r e s u l t a d o s de e x p i a n t e s sadios, t o d o s os trata- mentos com exceção da testemunha não apresentaram diferenças estât íst i cas.
Com relação a oxidação, todos os trament os com hipo- clorito de "sódio, apresentaram oxidação acima de 3 0 % e, co- mo aconteceu com Eucalyptus citriodara, a oxidação foi o fa- tor que influenciou na diminuição dos expiantes sadios. Com
com ! , APÓS 2i DIAS DE ! ISOLAME NTO.
TRATAMENTOS NaOCl
<%)
PERs.
EXPO, (min)
CONT.
(7.)
OXID.
(%)
EXPLANTES SADIOS
<%> S
í. 0,5 Í0 5,0 33,3 6Í, 7 a 6,3
2. 0,5 20 0 35,0 65,0 a 6,2
3. 0,5 30 í,7 46,7 5í, 7 a 6,4
4. 0,5 40 0 35,0 65,0 a 6,2
5. í,0 05 0 38,0 6í ,7 a 6,3
6. í,0 Í0 5,0 30,0 65,0 a 6,2
7. testemunha 98,3 0 í, 7 b í,7
Valores seguidos pela mesma letra não difereai pelo teste üui-quadrado (P ) 0,05).
PERü. EXPO. - Período de Exposição CÜNT. - Contaminação
OXID. - Oxidação S - Desvio-padrão
esta espécie, não. ocorreu a mesma t e n d ê n c i a definida, do au- mento da oxidação a medida que aumenta o tempo de exposição.
Embora, os tratamentos com 0,5 "Á de h i p o c l o r i t o de sódio te- nham apresentado um aumento na porcentagem de oxidação, quando o período de exposição foi a u m e n t a d o até 30 minutos, mas aos 40 minutos ao contrário dé continuar aumentando, houve uma diminuição da oxidação. P o r " o u t r o lado, nos trata- mentos constituídos de í % de h i p o c l o r i t o de sódio, ocorreu t ambém uma•d i mi n u i ção da ox i d ação, quan d o aumen t ou a per í od o de e x p o s i ç ã o de 5 para Í0 minutos.
4.2 INDUQÃO DAS BROTAÇÕES
4.2.í tu caluptus c itriodora
Todos os tratamentos, inclusive a testemunha., conse- guiram induzir as brotações e não diferem estatisticamente
(TABELA 3).
Com relação ao desenvolvimento, os t r a t a m e n t o s í e 4 são os que apresentaram p o r c e n t a g e n s acima de 5 0 7. de brota- ções com dois a mais pares de folhas a b e r t a s .
0 estado de desenvolvimento d a s b r o t a ç õ e s é importan- te para poder prosseguir com a fase posterior, que é a mul- tiplicação das brotações. Quando foram u t i l i z a d a s brotações pouco desenvolvidas, principalmente b r o t a ç õ e s com um par de folhas a b e r t a s ou brotações sem folhas abertas, para a fase de multiplicação, essas brotações não se adaptaram aos meios dessa fase, Já que não conseguiram nem m u l t i p l i c a r - s e e fi~
caram com b a i x o n ú m e r o de r e p e t i ç õ e s , na aval i aça o a o s 30 dias, que impossibilitou sua a n á l i s e e s t a t í s t i c a . Isso devi- do p o s s i v e l m e n t e , à n e c e s s i d a d e de que a s b r o t a ç o e s induzi- das atinjam p r i m e i r a m e n t e um d e s e n v o l v i m e n t o a d e q u a d o , nos meios com b a i x a s c o n c e n t r a ç õ e s de BAP, que p e r m i t a a h a b i - tuação das b r o t a ç o e s aos m e i o s cie m u l t i p l i c a ç ã o (meios cons- t i t u í d o s de" c o n c e n t r a ç õ e s m a i o r e s de B A P ) . C a s o c o n t r á r i o , as c o n c e n t r a ç õ e s mais altas de BAP p o s s i v e l m e n t e sejam tóxi- cas para esse tipo de b r o t a ç o e s p o u c o d e s e n v o l v i d a s .
C o n s i d e r a n d o a p o r c e n t a g e m de b r o t a ç o e s induzidas, c o n j u n t a m e n t e com seu d e s e n v o l v i m e n t o , p a r a e s t a e s p é c i e foi mais r e c o m e n d a d o o t r a t a m e n t o com BAP a 0 , 2 5 mg/l e AIA a 0,1 m g / l .
2 9
TABELA 3. EFEITOS DE BROTAÇoES DE RA.
NÍVEIS
£T. c i t r
DE BAP E AIA," NA iodara, APÓS 21
INDUÇÃO DAS DIAS DE CULTU-
TRATAMENTOS N£ DESEVOLVÏMENTO
BAP AIA -mg/1-
REP. BROT.IND (%)
F F {'/.) 1 PFA (7.)
2 PFA
{•/.) +3 PFA {'/.) i „ 0,1 0,01 52 71,1 a 35,1 13,5 29,7 21,6 2. 0,1 0,1 48 72,9 a 31,4 25,7 28,6 14,3 3. ' 0,25 0,0i 50 74,0 a 37,8 45,9 8,1 8,1 4. 0,25 0,1 74,5 a 14,3 28,5 25,6 31,4 5. testemunha 48 68,8 a 33,4 45,4 21,2 0 Valores seguidos pela uesraa letra nao diferes pelo teste do Qui-quadrado (P > 0,05)
N! REP. - Número de Repeti Ses BROT.IND. - Brotaçoes Induzidas
FF - Brotaçoes com Folhas Fechadas
í PFA - Brotaçoes cos um Par de Folhas Abertas 2 PFA - Brotaçoes com dois Pares de Folhas Abertas
+3 PFA - Brotaçoes cora três ou aais Pares de Folhas Abertas
4 = 2.2 Eu cs lyptus tereticorais
O tratamento 3, embora não seja diferente estatisti- camente dos t r a t a m e n t o s í, 4 e 5, é o tratamento que apre- sentou maior porcentagem de brotações induzidas e o único d i ferente estat i'st i camente do t r a t a m e n t o 2, que apresentou a menor porcentagem de brotações induzidas (TABELA 4).
Com relação ao d e s e n v o l v i m e n t o das brotações, a tes- temunha foi a que apresentou o menor desenvolvimento das brotações. Por outro lado, os t r a t a m e n t o s í, 2 e 3 foram os
que conseguiram as maiores p o r c e n t a g e n s de brotações com dois ou mais p a r e s de folhas a b e r t a s .
Para esta espécie, é também importante o estado de desenvolvimento das b r o t a ç õ e s , n e s t a fase do processo. Quan- do foram utilizadas, na fase de multiplicação, brotações com um par de folhas a b e r t a s ou sem folhas abertas; e s s a s brota- ções não se adaptaram aos m e i o s dessa fase, ocorrendo uma redução do número de r e p e t i ç õ e s por morte das brotações, im- possibilitando sua anal i se. est at íst i ca.
A h i p ó t e s e levantada para o Eucaliptais c i tr iodara , - de que as brotações pouco d e s e n v o l v i d a s , quando sub-cultivadas aos -meios de m u l t i p l i c a ç ã o que contem maiores concentrações de BAP, sejam tóxicos para e s s a s brotações, é também válida para esta espécie.
3 i
TAB ELA 4. EFEITOS DE BROTAÇSES DE TUR A.
N Í V E I S DE BAP E
£". t&rst icarn is ,
AIA, NA APoS 21
INDUQSO-- DAS DIAS DE CUL-
TRATAMENTOS N 2 DESENVOLVIMENTO BAP AIA
-mg/1-
REP. BROT.IND. F F
<%)
í PFA (X)
2 PFA +3 PFA (X) (X) í. 0,1 0,01 49 85,7 ab 2,4 7,2 30,9 59,5 2. 0,1 0,1 57 78,9 b 2,2 6,7 17,7 73,2 3, 0,25 0,0í 53 92,4 a 2,0 8, 1 32,6 57,1
4 . 0,25 0,í 59 88,i ab 11, 5 17,3 21,5 50,0
cr •
J . testemunha 59 84,7 ab 36,0 38,0 18,0 8,0 Valores seguidos pela raesiaa letra nao diferem pelo teste do Qui-quadrado (P > 0,65).
N2 REP. - Número de Repetições BRÜT.IND. - Brotaçoes Induzidas
FF - Brotaçoes com Folhas Fechadas
í PFA - Brotaçoes cora ua Par de Folhas Abertas 2 PFA - Brotaçoes com dois Pares de Folhas Abertas
+3 PFA - Brotaçoes cora três ou aais Pares de Folhas Abertas
4.3. í £'aca 1 yptu-5 c i t r i odora
Como pode-se observar nos gráficos das FIGURAS 2a e 2b, aos 30 e 60 dias de cultura respectivamente, existe uma tendência de melhor multiplicação nas concentrações de BAP a 1,0 mg/l e AIA a 0,i mg/l. Por outro lado, quando foi aumen- tada a concentração de BAP para 2,0 mg/l, nas diferentes, concentrações de AIA, houve uma diminuição da taxa de multi- plicação das brotações. Isso possivelmente devido a que o BAP nessa e em concentrações mais altas seja tóxico para es- ta espécie., provocando uma baixa taxa de multiplicação.
Com relação à altura das brotações, todos os trata- mentos, com exceção da testemunha, aos 30 dias de cultura,
<
apresentaram em torno de 35 % a 40 % das brotações com altu- ra superior a í cm (TABELA 5a>. Aos 60 dias de cultura, os tratamentos com as menores c o n c e n t r a ç õ e s de BAP (0,5 mg/'l e í, 0 mg/1), apresentaram em torno de 37 "í a 70 % das brota- ções com altura superior a i cm (TABELA 5b). Ainda na FIGURA 3, observa-se as brotações multiplicadas e a altura conse- guida com e s s a s brotações. A altura foi adequada para sub~
cultivar as brotações no meio de enraizamento, não sendo, portanto necessária a fase de e l o n g a ç ã o .
Em comparação com os resultados obtidos por outros trabalhos, S I T A3 4, obteve uma multiplicação de 100 brota- ções/exp1ante em 4 meses, enquanto que neste trabalho pela taxa de multiplicação obtida, é possível obter 580,81 brota- ções/explante nesse mesmo período de tempo. Por outro lado,
3 3
l-IGURA 2. EFEITOS DE NÍVEIS DE B AP E AIA, NA MULTIPLICAÇÃO DAS BROTACoES DE £". citriodara, APÓS 30 DIAS DE CULTURA (GRÁFICO a ) E 60 DIAS DE CULTURA (GRÁFICO b > .
2 3 2 0
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(b) 3 0
t e s t . 0 . 0 1 0 . 1 A I A < M ç r / 1 >
As linhas verticais representam o intervalo de confiança a 5 X de probabilidade
TABELA 5. EFEITOS DE N Í V E I S DE BAP E AIA NA ALTURA DAS BRO- TACoES M U L T I P L I C A D A S DE f. citriodara, APÓS 30 DIAS DE CULTURA (TABELA a) E 60 DIAS DE CULTURA
(TABELA b).
(a)
TRATAME BAP
•-mg/l NTOS
AIA
N£
REP . ... âi_I'JU£
1 y
(••/ \
o
1. 0,5 0,01 20 65,8 21 , 9 12,2
e. • 0,5 0, i 17 60,6 30 , 8 8,5
O m i ,0 0, 0 i 18 6i ,2 34, 3 4,5
4. 1,0 0,1 1? 66,7 24,2 9,1
ir •_> * 2,0 0,01 15 66,7 3 0 , 2 3 , 0
6. 2,0 0 , 1 i 8 65 , 6 31,2 3,1
7» testeinun ha 17 í 00 , 0 0 0
(b >
TRATAME BAP
-mg/l NTOS
AIA
N ~
REP . -iàLIÜEA-JDiifí 1
L_.MmAC.oES.
'I? __-jL^tLx—
1 . 0,5 0,01 12 47,0 47,0 6 , 0
2. 0,5 0,1 10 29,9 53,5 16,7"
3 m 1
, 0
0 , 0 i 12 59,2 35, 0 5,74. 0,1 15 62,4 34 , 5 3,1
5. 2, 0 0 , 0 i ii 69,2 26, 1 4,6
6. 2,0 0,1 9 73 , 5 26,5 0
7. testemunha 17 í 0 0 , 0 0 0
Ní REP. - Número de Repetições Critérios:
í = < í cm 2 =' l cm - 2 cm 3 = > 2
35
FIGUR A
3 .PROCESSO DE
MULTIPLICAC~ODAS BROTAC8ES DE
E. c i- triodora ..GREWAL et. a i . *7 obtiveram 150 b r o t a ç õ e s / e x p l a n t e , mas não relataram o tempo de cultivo.
4.3.2 Eaca lyptus t eret icom i s
Para esta espécie, -foram r e a l i z a d o s <
tos, na tentativa de aumentar a taxa de m u l t i p l i c a ç ã o , das brot ações.
No primeiro experimento, após 6<d dias de cultura, a maior taxa de multiplicação, foi em m é d i a 2 , 6 2 brotaçoes/ex- plante. Nesse experimento o b s e r v o u - s e , que aos 30 dias de cultura, não existia uma tendencia d e f i n i d a das melhores concentrações de reguladores "dé c r e s c i m e n t o (FIGURA 4a). Ja aos 60 dias de cultura, as melhores t a x a s de multiplicação, foram obtidas nas concentrações de BAP a 0,5 mg/l nas dife-<
rentes combinações com AIA (FIGURA 4b).
Pelas TABELAS 6a e ób, o b s e r v o u - s e que, tanto aos 30 como aos 60 dias de cultura respect ivãmente, t o d o s os trata- mentos apresentaram uma alta p o r c e n t a g e m de brotações com altura inferior a í cm. Devido ao pouco c r e s c i m e n t o em altu- ra das brotaçoes, nao é recomendado a u t i l i z a ç ã o dessas bro- taçoes, para enraizamento, pelo que s e r i a n e c e s s á r i o , inocu-
lar as brotaçoes primeiramente em um meio de cultura para elongação e posteriormente t r a n s f e r i - l a s para e n r a i z a m e n t o .
Por outro lado, no segundo e x p e r i m e n t o , pelos gráfi- cos das FIGURAS 5a e 5b, observou-se que ocorreu o mesmo que no primeiro experimento, as maiores t a x a s de multiplicação foram obtidas nas concentrações de BAP a 0 , 5 mg/l, nas dife- rentes combinações com ANA. Esse fato de BAP a 0,5 mg/l, ser
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o fator mais importante que influi na obtenção das maiores taxas cie multiplicação, foi confirmado pela testemunha, que na sua composição c o n t i n h a (3 AP a 0,5 mg/l , a qual também, apresentou um taxa de m u l t i p l i c a ç ã o entre as maiores obti- das .
Como testemunha do segundo experimento, foi utiliza- do, o tratamento que a p r e s e n t o u a maior taxa de multiplica- ção no primeiro experimento. A média da taxa de multiplica- ção desse tratamento no p r i m e i r o experimento foi de 2,62 brotaçoes/explante e, quando foi utilizado como testemunha no segundo experimento, a média da taxa de multiplicação au- mentou para 5,0 b r o t a ç o e s / e x p l a n t e . Esse aumento da taxa de multiplicação, da testemunha é inexplicável, ja que as con- dições de incubação e os c o n s t i t u i n t e s dos meios de cultura foram os mesmos.
Pela análise das TABELAS 7a e 7b, observou-se que tanto aos 30 como aos 60 dias de cultura respectivamente, as brotações apresentaram pouco crescimento em altura. Ainda, pelas FIGURAS 3 e 6, o b s e r v o u - s e que a altura das brotações multiplicadas de £'aca Iyptus-teret icorn i s foi inferior ao do Eucalyptus c itr iodara , por essa razão, é recomendável que as brotações multiplicadas de Eucalnptus toret icornis, primei- ramente. sejam s u b - c u l t i v a d a s para um meio de elongaçao, para posteriormente induzir o e n r a i z a m e n t o
FIGURA 4. E F E I T O S DE NÍVEIS DE 13AP E AIA, NA MULTIPLICACSO DAS BROTACoES DE £'. tsreticarnis, APÓS 30 DIAS DE CULTURA (GRÁFICO a ) E 60 DIAS DE CULTURA (GRAFICO b ) .
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