FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LETICIA ESPOSITO SEWAYBRICKER
AVALIAÇÃO DA DISFUNÇÃO HIPOTALÂMICA EM CRIANÇAS E ADOLESCENTES COM OBESIDADE
EVALUATION OF HYPOTHALAMIC DYSFUNCTION IN OBESE CHILDREN AND ADOLESCENTS
CAMPINAS 2016
AVALIAÇÃO DA DISFUNÇÃO HIPOTALÂMICA EM CRIANÇAS E ADOLESCENTES COM OBESIDADE
EVALUATION OF HYPOTHALAMIC DYSFUNCTION IN OBESE CHILDREN AND ADOLESCENTS
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências, área de concentração em Saúde da Criança e do Adolescente.
Thesis presented to the Faculty of Medical Sciences of the State University of Campinas as part of the requirements for obtaining the title of Doctor of Science, area of specialization in Children and Adolescents Health.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA LETÍCIA ESPÓSITO SEWAYBRICKER, ORIENTADA PELO
PROF. DR. GIL GUERRA-JUNIOR E COORIENTADA PELO PROF. DR. LÍCIO AUGUSTO VELLOSO.
CAMPINAS 2016
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Sewaybricker, Leticia Esposito, 1981-
Se88a SewAvaliação da disfunção hipotalâmica em crianças e adolescentes com obesidade / Letícia Espósito Sewaybricker. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
SewOrientador: Gil Guerra-Junior. SewCoorientador: Lício Augusto Velloso.
SewTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Sew1. Hipotálamo. 2. Obesidade. 3. Obesidade pediátrica. 4. Gliose. 5. Imagem por ressonância magnética. I. Guerra Junior, Gil,1960-. II. Velloso, Lício Augusto,1963-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Evaluation of hypothalamic dysfunction in obese children and adolescents Palavras-chave em inglês: Hypothalamus Obesity Childhood obesity Gliosis
Magnetic resonance imaging
Área de concentração: Saúde da Criança e do Adolescente Titulação: Doutora em Ciências Banca examinadora:
Gil Guerra Junior Bruno Geloneze Neto Li Li Min
Carlos Alberto Longui Ângela Maria Spinola Castro
Data de defesa: 28-09-2016
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
LETICIA ESPOSITO SEWAYBRICKER
ORIENTADOR: PROF. DR. GIL GUERRA-JUNIOR
COORIENTADOR: PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO
MEMBROS:
1. PROF. DR. Gil Guerra-Junior – FCM - UNICAMP
2. PROF. DR. Bruno Geloneze Neto – FCM - UNICAMP
3. PROF. DR. Li Li Min – FCM – UNICAMP
4. PROF. DR. Carlos Alberto Longui – FCM – Santa Casa de São Paulo
5. PROFA. DRA. Angela Maria Spinola e Castro – EPM - UNIFESP
Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico esta tese aos voluntários
desta pesquisa e suas famílias,
pela confiança que são capazes
de depositar e pela esperança de
contribuírem com as próximas
gerações.
Ao Dr. Gil Guerra-Junior, por seu apoio incondicional e sua presença constante. Por ser além da melhor definição que se possa imaginar de orientador. Por ser meu mentor.
Ao Dr. Lício Velloso, por ser um professor brilhante. Por dividir comigo seu
conhecimento em cada etapa e auxiliar no meu desenvolvimento. Por seu incentivo constante.
À Dra. Ellen Schur, por me dar um voto de confiança antes mesmo de me conhecer. Por ter uma forma de raciocínio incrível e ser capaz de ensinar isso.
À minha família, meu porto seguro. Ao meu pai Rubens e à minha mãe Suelena, sempre presentes na minha caminhada, clareando os rumos que escolho. Ao meu irmão Luciano, meu companheiro de todos os tipos e todos os lugares. Por seu estoque infinito de suporte.
Ao David por me ajudar a acreditar nos meus potenciais e a me conhecer melhor. Sem palavras para agradecer o bastante pela sua parceria – torna a vida com mais brilho.
À família que me foi presenteada, Carina e Rachel. Pela convivência de todos os dias, por me ajudarem a crescer na miudeza da rotina. À Mara, Lupe, Érika e
Luciana pelas visitas que nos fizeram. Por cada uma contribuir de forma especial em cada encontro.
Às amigas de longa data, Fernanda, Briana, Flávia e Fernanda Maria. Por serem minhas amigas-irmãs, e eu poder ser eu mesma. Por me permitirem contar com elas de olhos fechados.
À equipe de Seattle. À Susan, por ser tão paciente, generosa, e ter me presenteado com sua amizade. Por tudo que me ensinou e me ajudou a realizar neste trabalho. À Mary, por ter me recebido tão bem e por todas as conversas que tivemos. Pelo apoio que me deu para acreditar na importância deste trabalho.
À Simone Lee, por sua disponibilidade enorme em ajudar. Por ter desbravado vários caminhos envolvendo esta pesquisa e ter me mostrado por onde trilhar.
Ao Ezequiel, por sua ajuda nas dúvidas mais árduas e sua parceria no meu desenvolvimento como pesquisadora.
À Universidade Estadual de Campinas, pela grande importância na minha formação profissional.
Às equipes dos laboratórios de Crescimento e Desenvolvimento, de Sinalização Celular e de Neuroimagem da UNICAMP.
resposta inflamatória que altera a função de neurônios envolvidos na regulação da ingestão de calorias e do gasto energético. Em adultos obesos, estudos com ressonância magnética funcional (RNMf) mostraram a existência de uma resposta hipotalâmica alterada para nutrientes e exposição ao frio. Além disso, estudos revelaram por meio de análise de ressonância magnética estrutural a existência de gliose no núcleo médio-basal hipotalâmico (MBH) que aumenta em proporção direta ao índice de massa corporal (IMC). Portanto, avaliações por diferentes abordagens de neuroimagem demonstram a presença de anormalidades no hipotálamo de adultos obesos e em modelos animais. A obesidade infantil é um importante fator de risco para a obesidade e suas comorbidades na idade adulta. No entanto, nenhum estudo anterior avaliou a presença de alterações hipotalâmicas em crianças obesas. Aqui, foram utilizados métodos de neuroimagem funcional e estrutural para estudar o hipotálamo de doze crianças obesas e onze com peso normal. Também foram
avaliadas a composição corporal e as dosagens de hormônios da saciedade e marcadores inflamatórios. Nas crianças obesas o MBH apresentou sinais radiológicos sugestivos de gliose, que está diretamente correlacionada com a
adiposidade corporal e, particularmente, com a adiposidade visceral. Foi encontrada também correlação entre os sinais de gliose e os níveis séricos de leptina, porém não com os níveis de insulina. Além disso, em estudos funcionais, o hipotálamo das crianças obesas apresentou uma resposta diminuída à ingestão oral de glicose, além de uma menor conectividade entre o hipotálamo e o restante do cérebro, em
comparação com os indivíduos eutróficos. Foi encontrada correlação entre os
menores sinais funcionais do hipotálamo e a maior presença de gliose no MBH. Este é o primeiro estudo que demonstra que o hipotálamo pode ser funcionalmente e estruturalmente afetado na obesidade infantil.
Palavras-chave: hipotálamo, obesidade, obesidade pediátrica, gliose, imagem por ressonância magnética.
In experimental diet-induced obesity, the hypothalamus is affected by an inflammatory response that disturbs the function of key neurons involved in the regulation of caloric intake and energy expenditure. In adult obese humans, functional magnetic resonance imaging (fMRI) studies have shown a defective hypothalamic response to nutrients and to cold exposure; moreover, structural MRI analysis provide evidence for the existence of hypothalamic gliosis in the medium basal hypothalamus (MBH) that increases in direct proportion to body mass index. Therefore, hypothalamic abnormalities, as assessed by different approaches, are present in the hypothalamus of obese adults and experimental animals. Childhood obesity is a major risk factor for obesity and its comorbidities during adulthood. However, no previous study has evaluated such abnormalities among obese
children. Here, we employed functional and structural neuroimaging methods to study the hypothalamus of twelve obese and eleven lean children. Body composition and satiety hormones and inflammatory markers were also evaluated. Obese children presented radiological signs of hypothalamic gliosis, which is directly correlated with adiposity and particularly with visceral adiposity. Signs of gliosis in the MBH were correlated to plasma leptin concentration, but not to insulin. Moreover, in functional studies, the hypothalamus of obese children showed a decreased response to oral glucose intake, and a lower connectivity with the whole brain gray matter when compared to lean participants. In addition, the decreased hypothalamic functional response to glucose was correlated to increased signs of gliosis in the MBH. This is the first study demonstrating that the hypothalamus can be functionally and
structurally affected in childhood obesity.
Keywords: hypothalamus, obesity, childhood obesity, gliosis, magnetic resonance imaging.
FIGURA 1:CONTROLE DA HOMEOSTASE ENERGÉTICA PELOS NEURÔNIOS DO NÚCLEO
ARQUEADO HIPOTALÂMICO ... 18
FIGURA 2:FISIOLOGIA DA RESPOSTA HEMODINÂMICA DURANTE O AUMENTO DA ATIVIDADE NEURONAL ... 22
FIGURA 3:SELEÇÃO DOS VOLUNTÁRIOS DA PESQUISA. ... 28 FIGURA 4:MÁSCARA DO HIPOTÁLAMO PARA EXTRAÇÃO DO SINAL DA RNMF. ... 32
FIGURA 5:LINHA DO TEMPO UTILIZADA NO PROTOCOLO DE RNMF PARA O ESTUDO DA
FUNÇÃO DO HIPOTÁLAMO FRENTE À INGESTA DE GLICOSE. ... 33
FIGURA 6:METODOLOGIA DO MAPA PARAMÉTRICO T2:À ESQUERDA E AO CENTRO, CORTES SAGITAIS DE ALTA RESOLUÇÃO MOSTRANDO O POSICIONAMENTO DOS ROIS.À DIREITA,
ROIS TRANSFERIDOS AO MAPA PARAMÉTRICO. ... 36 FIGURA 7:MÉDIA DE VARIAÇÃO DO SINAL HIPOTALÂMICO APÓS A INGESTA DE SOLUÇÃO DE
GLICOSE PARA O GRUPO DE OBESOS E CONTROLES. ... 45 FIGURA 8:CONECTIVIDADE FUNCIONAL ENTRE O HIPOTÁLAMO E A MASSA CINZENTA TOTAL
DO CÉREBRO, PRÉ (A) E PÓS-GLICOSE (B), COMPARAÇÃO ENTRE GRUPO DE OBESOS E CONTROLES. ... 47
FIGURA 9:GLIOSE HIPOTALÂMICA EM CRIANÇAS E ADOLESCENTES OBESOS: FORTE INTERAÇÃO GRUPO*REGIÃO E DIFERENÇA NO TEMPO DE RELAXAMENTO T2 ENTRE OBESOS E CONTROLES PARA A REGIÃO DO NÚCLEO MÉDIO-BASAL DO HIPOTÁLAMO. .... 50
FIGURA 10:CORRELAÇÕES ENTRE O TEMPO DE RELAXAMENTO T2 NO NÚCLEO MÉDIO-BASAL HIPOTALÂMICO E OS VALORES DE Z-SCORE DE PESO E DE IMC, PORCENTAGEM DE GORDURA CORPORAL, ANDROIDE E VISCERAL E NÍVEIS SÉRICOS DE LEPTINA ... 52 FIGURA 11:CORRELAÇÃO ENTRE O TEMPO DE RELAXAMENTO T2 NO NÚCLEO MÉDIO-BASAL
HIPOTALÂMICO E A MÉDIA DE VARIAÇÃO DO SINAL BOLD DO HIPOTÁLAMO APÓS A
TABELA 1:CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PARTICIPANTES. ... 39
TABELA 2:PROPORÇÕES DE SEXO E DESENVOLVIMENTO PUBERAL DOS PARTICIPANTES.... 40 TABELA 3:AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL POR DXA DOS PARTICIPANTES. ... 42
TABELA 4:DADOS DA AVALIAÇÃO DE HORMÔNIOS DA SACIEDADE E MARCADORES
INFLAMATÓRIOS ENVOLVIDOS NA HOMEOSTASE ENERGÉTICA. ... 43
TABELA 5:MÉDIA DOS VALORES R OBTIDOS PRÉ E PÓS-INGESTA DE GLICOSE PARA A
CORRELAÇÃO ENTRE O HIPOTÁLAMO E O RESTANTE DA MASSA CINZENTA CEREBRAL. .. 46
TABELA 6:VALORES DE TEMPO DE RELAXAMENTO T2 DE TODOS OS PARTICIPANTES DA PESQUISA PARA AS REGIÕES DO NÚCLEO MÉDIO-BASAL HIPOTALÂMICO, PUTAMEN E AMÍGDALA. ... 48 TABELA 7:TEMPO DE RELAXAMENTO T2 DAS 3 REGIÕES AVALIADAS CONSIDERANDO OS
LADOS DOS HEMISFÉRIOS CEREBRAIS E A MÉDIA DE VALOR ENTRE OS LADOS PARA OS GRUPOS PARTICIPANTES. ... 49
AgRP Proteína Relacionada ao “Agouti”
BOLD Dependência no nível de oxigenação no sangue CART Transcritos relacionados à anfetamina e à cocaína CIPED Centro de investigação em pediatria
cm Centímetro
COF Córtex órbitofrontal
D2R Receptor D2 da dopamina DM2 Diabetes Mellitus tipo 2
DSM Manual diagnóstico e estatístico de transtornos mentais DXA Densitometria por absorção de raios-X de dupla energia ELISA Ensaio imunoenzimático
EPI Sequência de pulso eco planar ERS Estresse do retículo endoplasmático fMRI Ressonância magnética funcional FOV Campo de visão
FWHM Largura de uma gaussiana na metade de sua altura
g Grama
GLP-1 Peptídeo semelhante ao glucagon 1 HC Hospital de Clínicas
Hz Hertz
IC Intervalo de confiança
IKK Quinase do Inibidor do NF-κB IL-10 Interleucina-10
IL-1B Interleucina-1 beta IL-6 Interleucina-6
IMC Índice de Massa Corporal IR Receptor de insulina JNK Quinase c-jun N-terminal
kg Quilograma
LepR Receptor de leptina
MBH Núcleo médio-basal hipotalâmico MC3R Receptor 3 da Melanocortina MC4R Receptor 4 da Melanocortina mcU Microunidades
mL Mililitro
mm Milímetro
MNI Montreal Neurological Institute
ms Milissegundo
ng Nanograma
NPY Neuropeptídeo Y
OMS Organização Mundial da Saúde PET Tomografia por emissão de pósitron
pg Picograma
POMC Pro-opiomelanocortina
PTP1B Proteína Tirosina Fosfatase-1B RM Ressonância magnética
SOCS3 Supressor de Sinalização de Citocinas-3 SPM Statistical Parametric Map
TE Tempo de eco
TLR4 Receptor do tipo Toll 4
TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa TR Tempo de repetição
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas α-MSH Hormônio estimulador de Melanócitos α
INTRODUÇÃO ... 14
A problemática da obesidade ... 14
A obesidade e o sistema nervoso central ... 16
A função hipotalâmica na obesidade e os estudos de neuroimagem ... 20
OBJETIVOS ... 26 METODOLOGIA ... 27 Voluntários da pesquisa ... 27 Procedimentos ... 28 Análise estatística ... 37 RESULTADOS ... 39
Características dos voluntários ... 39
Dados de composição corporal por DXA ... 41
Avaliação laboratorial ... 43
RNMf ... 44
Gliose hipotalâmica ... 48
Correlação entre a função e a gliose hipotalâmica ... 53
DISCUSSÃO ... 54
CONCLUSÕES ... 64
REFERÊNCIAS ... 65
ANEXOS ... 78
Anexo 1: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ... 78
Anexo 2: Escala de Compulsão Alimentar Periódica ... 81
INTRODUÇÃO
A problemática da obesidade
A obesidade infantil é um dos principais desafios de saúde pública do século 21 (1). A prevalência de obesidade no mundo mais que dobrou desde 1980, porém, apesar de ser um problema global, ela vem afetando mais seriamente os países populosos de baixa e média renda (2). Dados mais recentes da Organização Mundial da Saúde (OMS) relataram a existência de mais de 600 milhões de obesos no mundo (3). O rápido crescimento destes números numa escala global é alarmante, contudo é ainda mais impactante quando se avaliam as estatísticas envolvendo os países subdesenvolvidos e em desenvolvimento e a faixa etária pediátrica. A OMS divulgou em 2013 que já havia no mundo 42 milhões de crianças menores de cinco anos com
sobrepeso, sendo que mais de 70% delas vivendo em países emergentes (4). O Brasil se destaca no cenário mundial como um país emergente, altamente populoso, e que sofreu uma importante transição socioeconômica e nutricional nas últimas três décadas (5). Essas mudanças na sociedade
envolveram um maior acesso à dieta hipercalórica, altamente palatável, e um estilo de vida sedentário. Por consequência, há também uma transformação no perfil epidemiológico da saúde da população. As causas mais importantes de morbimortalidade no país deixaram de ser as doenças infecciosas e a
desnutrição, passando os maiores desafios a ser as doenças crônicas, não transmissíveis, como a obesidade e suas complicações (2,6). Dados mais recentes mostram que mais da metade da população do país já apresenta sobrepeso. Destaca-se nessa realidade um aumento muito importante da prevalência da obesidade na infância e o acometimento cada vez maior de crianças mais novas (entre cinco e nove anos). O último levantamento revela que existem mais de 30% das crianças e adolescentes brasileiros com
sobrepeso ou obesidade (7,8).
A obesidade é definida pela OMS como um acúmulo excessivo de
gordura corporal que pode resultar em um prejuízo à saúde do indivíduo. Como a medida da quantidade de gordura corporal não é algo facilmente aplicável na prática clínica, o método mais comumente usado é o cálculo do índice de
massa corporal (IMC) (1). A definição de sobrepeso e de obesidade nas crianças e adolescentes é realizada baseando-se em pontos de cortes em curvas de IMC para sexo e idade. O sobrepeso é definido como IMC entre os percentis 85 e 94 e obesidade para valores acima do percentil 95 (9).
O importante aumento na frequência e na gravidade da obesidade na infância vem repercutindo no aumento de comorbidades outrora observadas somente em adultos (4). Tal fato sugere que um número crescente de pessoas passe a apresentar doenças relacionadas à obesidade numa idade muito inferior àquela observada no passado (10). De fato, estudos tem descrito o aumento da prevalência de: hipertensão arterial, dislipidemia, resistência insulínica, além de alterações esqueléticas, gastrointestinais e problemas respiratórios como a asma em crianças e adolescentes obesos (11,12). Soma-se a isso o fato de que a obesidade infantil também é associada à persistência da obesidade no adulto e ao aumento no risco de doenças cardiovasculares e de uma ampla gama de complicações metabólicas, entre elas o diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (11,12).
Ainda são discutíveis as razões pelas quais nem todos os indivíduos expostos a um estilo de vida sedentário e com consumo de dietas
hipercalóricas desenvolvam obesidade. Estudos com famílias com gêmeos e crianças adotivas revelaram que a variação da massa corporal sofre grande influência de múltiplos fatores genéticos (13). Estima-se que a hereditariedade do peso corporal varia entre 40 e 70% (14) e que múltiplos genes estão
envolvidos, com mais de 300 loci genéticos já descritos (15). Poucos casos de obesidade têm como etiologia uma doença de herança monogênica, sendo a maioria dos casos devidos a uma forte interação entre a predisposição genética individual somada aos fatores ambientais relacionados ao estilo de vida da sociedade contemporânea (16).
A obesidade e o sistema nervoso central
De uma maneira simples a obesidade pode ser entendida como o resultado de um desequilíbrio entre a ingestão calórica e o gasto energético (17). Apesar de parecer uma equação simples, as falhas frequentes das abordagens comportamentais reforçam o fato de que, na verdade, o equilíbrio energético corporal depende de um poderoso sistema de regulação que tende a defender a estabilidade da massa corporal. Tal sistema é coordenado por redes de neurônios localizados predominantemente no hipotálamo (18). Estudos iniciados a mais de 60 anos identificaram e mapearam as principais regiões do cérebro envolvidas no controle da ingestão calórica e do gasto energético (19). Tais estudos mostraram que ao longo do tempo o hipotálamo tende a manter o peso estável (19). Em circunstâncias fisiológicas, pequenos aumentos da massa corporal desencadeados, por exemplo, por um período de aumento na ingestão alimentar, são seguidos por um aumento do gasto
energético e redução da fome, resultando em retorno do peso aos níveis de base. Entretanto, fatores genéticos e ambientais podem afetar esta regulação, resultando em um progressivo aumento da adiposidade corporal (19).
Existem duas subpopulações de neurônios hipotalâmicos que
desempenham papel central na manutenção da homeostase energética do organismo (20). Foi através de estudos com animais na década de 1950 que se chegou ao entendimento de que neurônios localizados na região lateral do hipotálamo eram responsáveis por promover a fome, enquanto neurônios da região ventromedial promoviam a saciedade (21,22). Kennedy, em 1953, propôs que o hipotálamo deveria ser capaz de detectar metabólitos presentes na circulação e assim obter as informações sobre as reservas corporais e manter o equilíbrio entre a ingestão e o gasto calórico (23). De fato, o núcleo arqueado, importante área hipotalâmica envolvida no controle da homeostase energética, está localizado logo acima da eminência média, no assoalho do terceiro ventrículo, local em que a barreira hematoencefálica é semipermeável. Essa posição estratégica permite que os neurônios estejam facilmente
acessíveis a sinalizações de hormônios e a oscilações de níveis de nutrientes vindos da circulação (24,25).
Apesar dos importantes avanços promovidos por estudos de
neurofisiologia da fome entre 1950 e 1990, foi somente com a identificação da leptina em 1994 que o funcionamento dos neurocircuitos hipotalâmicos
relacionados à homeostase energética do organismo pode ser caracterizado (26,27). A leptina é um hormônio produzido pelo tecido adiposo branco em uma quantidade diretamente proporcional à massa desse tecido no indivíduo (28). Trata-se de um polipeptídeo capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e apesar de poder exercer efeito em diversos tecidos, seu principal local de ação é o hipotálamo (29). O receptor de leptina (LepR) é detectado em diferentes tecidos, mas sua isoforma longa, com todas as partes da proteína necessárias para a sinalização, é expressa predominantemente no núcleo arqueado do hipotálamo (30).
Os principais alvos de ação da leptina são as duas populações de neurônios no núcleo arqueado com funções opostas (31). A primeira
subpopulação é estimulada pela leptina e expressa a pró-ópiomelanocortina (POMC) que é metabolizada em neurotransmissor dos melanócitos alfa (α-MSH). O α-MSH vai exercer sua ação em neurônios de segunda ordem,
ligando-se aos receptores melanocortina-3 e -4 (MC3R e MC4R) localizados no núcleo paraventricular (32,33). Os neurônios nesse núcleo provocam a
redução do apetite e o aumento do gasto calórico através da expressão do hormônio liberador de corticotropina e do hormônio estimulante da tireóide, respectivamente (34). A leptina também vai exercer função essencialmente catabólica, de inibição da ingesta alimentar, em outros núcleos hipotalâmicos como: (1) o núcleo lateral, onde atua sobre neurônios que expressam as orexinas e o hormônio concentrador da melanina, e faz conexões com o sistema límbico dopaminérgico na área ventral tegmentar (35); e (2) o núcleo ventromedial, onde a leptina pode modular a expressão do fator
estereidogênico 1, influenciando o desenvolvimento da obesidade induzida por dieta e provocando alterações na termogênese (36,37).
A segunda subpopulação de neurônios no núcleo arqueado tem a ação suprimida pela leptina e produz os peptídeos orexigênicos: proteína
exercem suas ações em neurônios de segunda ordem, sendo o AgRP antagonista dos receptores MC3R e MC4R, enquanto o NPY atua em receptores Y estimulando a ingesta alimentar, além de funcionar como um importante comunicador entre o hipotálamo e o tecido adiposo (38) (Figura 1).
Figura 1:Controle da homeostase energética pelos neurônios do núcleo arqueado hipotalâmico. Retirado de: Barsh G e Schwartz M, 2002 (39).
A leptina é considerada o principal “sinal de adiposidade”. Entretanto, sua ação plena no controle da fome e do gasto energético ocorre em
combinação com a atividade hipotalâmica da insulina (34,40). A insulina é secretada pelas células β pancreáticas, de forma aguda de acordo com o nível de glicose sanguínea, e de forma crônica em proporção ao grau de
adiposidade corporal. Apesar de seus efeitos anabólicos sobre os tecidos periféricos, a insulina apresenta ação central catabólica, semelhante à leptina, inibindo a ingesta alimentar e diminuindo o peso corporal (41). Assim como a leptina, a insulina atravessa a barreira hematoencefálica e exerce sua ação através da ligação com seu receptor (IR). O IR também é expresso nas populações neuronais AgRP e POMC no núcleo arqueado hipotalâmico. Estudos revelaram a existência de uma inter-relação entre as vias de
sinalização da leptina e da insulina, na qual um hormônio modula a atividade do outro, contribuindo para o ajuste refinado do metabolismo lipídico, glicídico e, por fim, da homeostase energética (19,42).
A maioria dos indivíduos obesos apresenta concentrações plasmáticas elevadas de insulina e leptina, porém, em decorrência de defeitos moleculares nas respectivas vias de sinalização, a ação dos mesmos é comprometida afetando o controle da fome e do gasto energético (28). Sabe-se que a presença desses hormônios e a integridade de suas vias de sinalização são fundamentais para a homeostase energética. Por exemplo, mutações no gene da leptina, no LepR, da POMC e do MC4R causam quadros de hiperfagia e obesidade graves e, no caso da deficiência de leptina há reversão do quadro com o tratamento com leptina recombinante humana (13,14). Entretanto, a maioria das pessoas com obesidade apresenta hiperleptinemia, porém, o tratamento com leptina é ineficaz, sugerindo assim que exista uma resistência central à ação desse hormônio (18,43). Entretanto, devido às dificuldades técnicas para se estudar o SNC nos humanos, ainda não se sabe ao certo como essa resistência se desenvolve.
Estudos com animais experimentais resultaram em grande progresso na compreensão dos mecanismos envolvidos na resistência hipotalâmica às ações da insulina e da leptina (44). As descobertas envolveram a descrição de
um processo inflamatório local, com a ativação de receptores do sistema imune inato receptor do tipo Toll 4 (TLR4) e do estresse do sistema do retículo
endoplasmático (ERS) como consequência do consumo de uma dieta
hiperlipídica (45–47). Instalada essa inflamação, o que se vê inicialmente é um comprometimento da produção e secreção de neurotransmissores (20,48,49). Porém, com o passar do tempo, essa reação inflamatória evolui para um
quadro crônico com alteração tecidual no SNC, chamada de gliose, e perda por apoptose de neurônios no núcleo arqueado (50,51). O comprometimento
funcional do hipotálamo leva a um controle inadequado de sinais da fome somado a um gasto energético insuficiente para manter o adequado equilíbrio energético do organismo (52,53).
A maior parte dos estudos sobre a disfunção hipotalâmica na obesidade foi desenvolvida em modelos animais. E o que já se pode demonstrar é que, em roedores, a alimentação rica em lipídeos desencadeia inflamação e gliose no núcleo arqueado antes mesmo da instalação da obesidade e evolui inclusive para perda neuronal e redução de células POMC (50). Essas alterações vistas nos animais foram relacionadas tanto com o grau de obesidade, como com a alteração do metabolismo glicídico, e oferecem uma explicação para a
resistência hipotalâmica aos sinais da leptina e da insulina (20,54,55).
A função hipotalâmica na obesidade e os estudo s de neuroimagem
O hipotálamo é de difícil acesso nos humanos, mas o desenvolvimento de técnicas de neuroimagem tem permitido a avaliação dessa estrutura bem como a evolução do conhecimento acerca do comportamento alimentar nos humanos obesos (56). Com o auxílio da ressonância magnética (RM), por exemplo, tem-se conseguido investigar mais profundamente o processo inflamatório hipotalâmico na obesidade. Um exemplo é um estudo recente em adultos que demonstrou a presença de sinais de gliose hipotalâmica e sua relação com o IMC mais elevado e com a presença de resistência insulínica (57)
Indo além da capacidade de avaliar a estrutura tecidual, a evolução dos métodos de imagem, com destaque para a tomografia por emissão de pósitron (PET) e a ressonância magnética funcional (RNMf) têm permitido o estudo das alterações dinâmicas no funcionamento do SNC. A RNMf tem sido a mais comumente usada e apresenta a vantagem de não necessitar da administração de marcadores exógenos e não envolver a exposição à radiação ionizante (58). Ela é uma adaptação da técnica clássica da RM que permite avaliar a função do tecido e não só a sua estrutura isoladamente.
A RNMf faz a medida da intensidade de sinal em um voxel ou conjunto de voxels, sua unidade de medida (59). Ela utiliza-se de um contraste
endógeno, o contraste com dependência no nível de oxigenação no sangue (BOLD), baseado no fato de que o sangue oxigenado e desoxigenado possuem propriedades eletromagnéticas diferentes (60). O contraste BOLD reflete de forma indireta a atividade neuronal já que na realidade mede a resposta hemodinâmica decorrente de uma maior atividade dos neurônios (60). Frente ao aumento da atividade neuronal numa certa região cerebral há um aumento no fluxo e no volume sanguíneo para suprir a necessidade de oxigênio dos neurônios ativados. Porém, esse fluxo é geralmente maior do que a demanda, gerando uma maior concentração de oxi-hemoglobina quando comparada ao nível basal e, portanto, emitindo um sinal eletromagnético (uma maior
intensidade de sinal BOLD) capaz de ser detectado pelo aparelho de RM (61) (Figura 2).
Os estudos iniciais de RNMf foram utilizados para a avaliação de áreas cerebrais ativadas em resposta a alimentos palatáveis e aos estímulos visuais e olfatórios relacionados a eles (63). Além do sistema homeostático envolvido no controle do apetite e do balanço energético, existe outro sistema
participando do comportamento alimentar, que é o sistema hedônico ou de recompensa. Existem inúmeras áreas relacionadas à cognição e com os fatores emocionais ligados à ingestão alimentar, sendo as principais: a área límbica dopaminérgica e a pré-frontal de recompensa (64).
Estudos feitos com indivíduos de peso normal e utilizando a RNMf puderam identificar quais as principais áreas ativadas quando há exposição de imagens de alimentos em comparação a imagens não alimentares. As áreas chaves identificadas foram o córtex órbitofrontal (COF), a amígdala, a ínsula, o hipocampo e o estriado (65). Achados também confirmados na população pediátrica (66).
Vale salientar que apesar de haver sinais hormonais de saciedade, humanos parecem ser capazes de driblar facilmente esse controle quando confrontados com um alimento palatável associado a um alto valor de recompensa (67). Contudo, as repostas funcionais do sistema hedônico parecem diferir entre os indivíduos obesos e eutróficos (68). Os indivíduos
Figura 2:Fisiologia da resposta hemodinâmica durante o aumento da atividade neuronal. Retirado de: Lindauer U et al, 2010 (62).
obesos, quando expostos às imagens de alimentos altamente calóricos, apresentam maior ativação em diversas áreas do sistema de recompensa do que os eutróficos (69–71). Vários estudos já demonstraram também que essa hiperativação nos obesos persiste mesmo no estado alimentado (63).
Diante do fato de que indivíduos obesos parecem reagir diferentemente à saciedade quando comparados às pessoas de peso normal, levantou-se a hipótese de haver uma desregulação das regiões do SNC relacionadas à recompensa (72). Sugeriu-se que a alteração nos mecanismos de recompensa poderia contribuir para o comportamento de compulsão alimentar e a uma ingestão alimentar excessiva mesmo quando não existe necessidade metabólica, por consequência levando a um contínuo ganho de peso e agravamento da obesidade (65,73).
Nesse mesmo sentido, um estudo avaliou com RNMf a resposta de adolescentes femininas com relação a antecipação de receberem um alimento altamente calórico e palatável (milk-shake) e a resposta frente ao seu consumo (74). Comparou-se um grupo de adolescentes obesas com um grupo de peso normal e observou-se que na antecipação do alimento, como já era esperado, as garotas obesas apresentavam maior ativação das áreas do sistema
hedônico. Por outro lado, durante o consumo do alimento palatável as pacientes obesas apresentavam uma redução de sinal no estriado, área
sabidamente envolvida com recompensa, controle e motivação (74). Esse sinal ainda se mantinha reduzido, numa segunda avaliação depois de seis meses, naquelas pacientes que haviam ganhado peso (74). Esse e outros achados corroboram a hipótese de que o início e a perpetuação da ingesta excessiva de alimentos palatáveis poderiam tentar compensar a atividade neural alterada no sistema de recompensa, algo semelhante ao que é visto em resposta ao uso das drogas de abuso (75,76).
A dopamina é o neurotransmissor mais estudado e melhor caracterizado em seu papel fundamental no sistema de recompensa, tanto natural como pós uso de drogas (77). Nos humanos, sabe-se que a ingestão de alimentos palatáveis implica na liberação de dopamina no estriado e em quantidade proporcional ao nível de prazer relatado ao ingerir o alimento. Porém a sua
exposição repetida leva a uma resposta dopaminérgica habituada e sua
progressiva transferência para outros estímulos associados com a recompensa que o alimento traz (seu odor, por exemplo) (73). Um dos potenciais
mecanismos envolvidos nas alterações do sistema de recompensa e na alimentação relaciona o sistema dopaminérgico e o comprometimento da sinalização do D2R (receptor D2 da dopamina). Foi demonstrado que os
indivíduos obesos apresentam menor concentração de D2R estriatal do que os eutróficos (78), algo que talvez possa ser revertido com a perda de peso (79).
Sabe-se que existem conexões entre os sistemas hedônico e hormonal no controle da ingesta alimentar. Os efeitos do alimento no sistema de
recompensa são potencialmente modulados pelo estado interno (homeostático) do indivíduo (76). O melhor exemplo disso é quando os indivíduos estão com fome e estão frente ao estimulo visual de um alimento palatável, a ativação de áreas de recompensa, como a amígdala e o COF é significativamente maior (80). Por outro lado, após um período de superalimentação, pode haver uma resposta neuronal atenuada em regiões como a ínsula e o hipotálamo (81).
Esses achados sugerem que reguladores do metabolismo, como a leptina e a insulina, assim como agentes que refletem a disponibilidade de nutrientes, como o GLP-1 (peptídeo semelhante ao glucagon 1) e a grelina, podem modular a atividade dos neurônios do sistema hedônico (82). De fato, já foi demonstrada a presença de LepR e IR em neurônios dopaminérgicos, bem como a capacidade desses hormônios em ativar a sinalização celular e
modular a atividade elétrica na região mesolímbica (83). A leptina parece ter participação no sistema de recompensa, desde o nível mais periférico, ao ser capaz de inibir as células sensíveis ao sabor doce na língua (82), ao mesmo tempo em que parece ter uma função complexa no sistema mesolímbico (84). A administração aguda direta de leptina na área ventral tegmentar provoca a inibição da transmissão dopaminérgica e a diminuição da ingesta alimentar. Por outro lado, a leptina parece ser necessária cronicamente para que possa haver a adequada sinalização dopaminérgica do estriado (75,85). Como demonstrado em um estudo com humanos portadores de deficiência congênita de leptina, em que a presença de hiperativação do estriado frente a imagens de alimentos,
foi revertida após sete dias de tratamento com reposição de leptina recombinante (86).
Com relação à insulina acredita-se que seu papel no cérebro também vai além do controle do metabolismo glicídico e se estende aos processos
cognitivos, especialmente relacionados à formação da memória no hipocampo (41).
Outra prova da estreita ligação entre os sistemas homeostático e hedônico para o controle energético dá-se pela presença de inúmeras
projeções do hipotálamo lateral (“centro da fome”) para áreas corticolímbicas como: o córtex pré-frontal, a amígdala, o estriado e o hipocampo (83,84).
Comparado ao que se conhece dos mecanismos homeostáticos do apetite, muito menos é sabido sobre como o sistema de recompensa influencia a ingesta alimentar. Também é ainda inicial o conhecimento acerca de como o excesso de alimentos palatáveis pode causar neuromodulações no cérebro, comprometendo função e comportamento, contribuindo inclusive para o desenvolvimento da obesidade (76).
O maior entendimento desses mecanismos e suas possíveis interações, associado à maior compreensão do controle da homeostase energética desde as idades mais precoces, podem auxiliar no desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e de formas mais efetivas de prevenção da obesidade.
OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar a função hipotalâmica em crianças e adolescentes com obesidade.
Objetivos específicos
Avaliar a estrutura hipotalâmica por ressonância magnética quantitativa. Avaliar, por meio de ressonância magnética funcional, a atividade neuronal da região hipotalâmica após o estímulo de sobrecarga oral de glicose.
Avaliar a conectividade geral do hipotálamo com o restante do cérebro e a conectividade específica entre o hipotálamo e a amígdala e o córtex
órbitofrontal, utilizando a ressonância magnética funcional.
Avaliar a relação entre os dados quantitativos da estrutura do hipotálamo por ressonância magnética e as variáveis antropométricas, comportamentais e bioquímicas.
Avaliar a relação entre a estrutura e a função hipotalâmica por ressonância magnética.
METODOLOGIA
Voluntários da pesquisa
Os voluntários foram convidados a participar da pesquisa de forma aleatória de acordo com a presença no ambulatório no qual realizavam seguimento.
Foram selecionados 16 pacientes (sete do sexo feminino e nove do sexo masculino) do Ambulatório de Obesidade na Criança e no Adolescente do Hospital de Clínicas (HC) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), com idade entre nove e 17 anos e que preenchiam o critério de obesidade de acordo com a definição do Center of Disease Control (CDC), com valor de IMC acima do percentil 95 para a idade e sexo (9). Os critérios de exclusão foram: DM2, de acordo com as definições da American Diabetes Association (ADA) (87), doença neurológica, nefrológica ou hepática, doença inflamatória ou infecciosa, antecedente de prematuridade ou de restrição de crescimento intrauterino, doença psiquiátrica, peso corporal maior que 120 kg e implante metálico permanente. Esses últimos três são consequência das limitações da RM. Os pacientes se encontravam em tratamento comportamental, passando por consulta pediátrica, recebendo orientações nutricionais e de atividade física a cada 3 meses.
Foram selecionados, para o grupo controle, 14 pacientes (sete do sexo feminino e sete do sexo masculino) em acompanhamento de puericultura no Ambulatório Geral de Pediatria do HC da UNICAMP com idade entre nove e 17 anos e que apresentavam IMC normal para sexo e idade (9), sem nenhuma contraindicação para realizar as avaliações incluídas na pesquisa. Os critérios de exclusão foram os mesmos utilizados para o grupo de pacientes obesos. Quatro pacientes (dois do sexo feminino e dois do sexo masculino) e um sujeito do grupo controle (sexo masculino) desistiram da participação da pesquisa por não desejarem realizar o exame de RM. Dois participantes do grupo controle (um de cada sexo) precisaram ser posteriormente excluídos da pesquisa por possuírem aparelho ortodôntico não removível, o que não permitiu a avaliação adequada do exame de RM (Figura 2).
Figura 3: Seleção dos voluntários da pesquisa.
Todos os participantes e seus responsáveis legais assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexos 1 e 2), e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da UNICAMP (CAAE 15150613.3.0000.5404 e 27595514.1.0000.5404).
Procedimentos
Todos os participantes da pesquisa foram submetidos à mesma avaliação e questionamentos quanto a antecedentes pessoais e de acompanhamento médico. Os procedimentos do estudo incluíram: antropometria, avaliação de desenvolvimento puberal, questionário sobre compulsão alimentar, análise de amostra de sangue, exames de RM e de densitometria por absorção de raios-X de dupla energia (DXA).
Antropometria e avaliação puberal
As medidas de peso e altura foram obtidas utilizando-se as técnicas descritas por Cameron (88), a partir das quais se calculou o IMC. Foi também avaliado o desenvolvimento puberal de acordo com o estadiamento proposto por Tanner e Marshall (89,90). Foram classificados pré-púberes aqueles que estavam em estadio 1 ou 2 e púberes aqueles com estadio maior ou igual a 3. Z-score de
30 voluntários
16 Obesos
12 Obesos
4 desistências14 Controles
11 Controles
1 desistência 2 exames inadequadospeso, altura e IMC foram calculados à partir de dados de referência do CDC (9).
Questionário de compulsão alimentar (Anexo 3)
Pacientes e controles foram avaliados quanto à presença de compulsão
alimentar utilizando-se os critérios definidos no Manual diagnóstico e estatístico de transtornos mentais V (DSM V) (91). As informações foram obtidas pela própria pesquisadora durante a anamnese com o sujeito e o seu responsável legal. Foi também avaliada a gravidade de episódios de compulsão alimentar aplicando-se o questionário da Escala de Compulsão Alimentar Periódica, traduzido para o português e validado por Freitas (92). Quando o sujeito apresentava dificuldade de leitura e compreensão do texto, o seu responsável legal ou a própria pesquisadora auxiliava no entendimento do questionário.
Exames laboratoriais de sangue
A coleta da amostra de sangue foi feita por punção venosa antecubital após jejum de 12 horas. Foram realizados pelo Laboratório de Sinalização Celular da UNICAMP os seguintes exames, utilizando-se o método de Ensaio
imunoenzimático (ELISA) em sistemas automatizados e kits comercialmente disponíveis: dosagens séricas de leptina, adiponectina, fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), interleucinas 6 (IL-6) e 10 (IL-10) (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) e insulina (Merck Millipore, St. Charles, MO, EUA). Todos os cuidados para obtenção da amostra e realização dos ensaios foram seguidos de acordo com as recomendações dos fabricantes.
Estudos de imagem por RM
A aquisição das imagens de RM foi feita em um aparelho de 3 tesla Phillips Achieva (Phillips Medical Systems, Best, The Netherlands) utilizando um sistema de bobina de oito canais. Todos os exames foram realizados no
período da manhã (entre sete e 10 horas) após os sujeitos terem permanecido 12 horas em jejum. Foram utilizados três protocolos de imagem. O primeiro teve por objetivo adquirir dados estruturais do cérebro com imagens de alta resolução espacial. Foi utilizada uma sequência ponderada em T1 com voxels isotrópicos de 1 mm3, adquiridos em 180 cortes sagitais, sem intervalo entre cortes consecutivos, com os seguintes parâmetros: flip angle = 8°, Tempo de repetição (TR) = 7,0 ms, Tempo de eco (TE) = 3,2 ms e Campo de visão (FOV) = 240x240 mm2.
A segunda sequência de pulsos, chamada EPI (pulso eco planar) foi feita para obtenção de dados relacionados à funcionalidade e à dinâmica cerebrais. As EPIs foram ponderadas em T2* e possuíam voxel isotrópico de 3 mm³, TR = 2 s, TE = 30 ms, com 40 cortes axiais, sem intervalo e FOV = 240x240 mm2. Foram adquiridos 1050 volumes para cada participante, num total de 35 minutos de procedimento, de forma contínua e ininterrupta. Durante o
procedimento, os sujeitos permaneceram em posição supina, com imobilização da cabeça por uma fita macia de velcro e almofadas de espuma. Foi também posicionada na cavidade oral, antes do início do exame, a ponta de um canudo de PVC de 1,2 metros para permitir a ingesta da solução de dextroglicose, na dose de 1,75 g/kg de peso (até um máximo de 75 g) diluídos em 200 mL de água. Dez minutos após o início do exame de RM, um sinal era dado ao sujeito com um toque em sua perna esquerda para que iniciasse a ingesta da solução de glicose. O tempo total necessário para a ingesta foi monitorizado pela própria pesquisadora com um cronômetro.
Por fim, uma sequência quantitativa multi-slice/multi-echo ponderada em T2 foi adquirida. Essa terceira sequência foi composta de 16 ecos, TE/TR de
6,27/2000 ms. Os cortes foram obtidos do quiasma óptico até os corpos mamilares, sendo 11 cortes de 2 mm de espessura com intervalo entre os cortes de 0,071 mm, voxels de 1x1x2 mm³ e FOV = 256x240 mm². O tempo de relaxamento T2 foi calculado baseado na curva obtida com a queda de sinal dos 16 ecos pixel por pixel. Esses dados foram representados como um mapa paramétrico quantitativo de tempo de relaxamento T2, permitindo assim a avaliação dos valores T2 de uma região tecidual específica e de interesse.
Pré-processamento para estudo funcional
Todas as etapas do pré-processamento foram realizadas utilizando-se o programa SPM versão 12 (Statistical Parametric Mapping, Wellcome Trust Centre for Neuroimaging, London, UK).
Inicialmente as imagens foram reorientadas e três parâmetros de rotação e três de translação foram extraídos para se realizarem as correções de movimento da cabeça ao longo do exame (motion correction). Esses parâmetros foram obtidos utilizando-se o primeiro volume como referência. Em seguida foi feita a correção de deslocamento temporal de cada corte no volume (slice timing correction), por existir uma pequena diferença no tempo de aquisição entre os cortes de um mesmo volume, possíveis alterações de sinal foram corrigidas considerando o tempo real de aquisição do corte. Utilizou-se o corte 20 como referência. A próxima etapa baseou-se no corregistro (corregistration) entre as imagens estruturais (T1) e funcionais para cada sujeito, possibilitando
apresentar os resultados funcionais com sobreposição à imagem estrutural, seguido da segmentação da T1, ou seja, a separação dos diferentes tecidos (substância cinzenta, branca e líquor). Na próxima etapa as imagens foram normalizadas (normalization) para o mesmo espaço estereotáxico, MNI-152 (Montreal Neurological Institute template), permitindo assim a comparação entre dados de todos os sujeitos, uma vez que após este processo todas as estruturas cerebrais tornam-se sobreponíveis inter-sujeitos. Por fim, as
imagens foram suavizadas (smoothing) com FWHM (largura de uma gaussiana na metade de sua altura) de 6 mm³ para minimizar os ruídos de bordas e possíveis discrepâncias ruidosas entre voxels vizinhos.
Análise das imagens funcionais 1- BOLD bruto do Hipotálamo
Foi criada uma máscara para a região de interesse (ROI) baseada nas características e descrições anatômicas do hipotálamo feitas por Nauta e Haymaker (93) e Baroncini et al (94). O ROI resultante tinha volume total de 224 mm³ ou 112 mm³ para cada lado do hipotálamo. Esta máscara (Figura 2) foi utilizada para se extrair o sinal de variação do BOLD nas imagens funcionais pós-processadas.
Figura 4: Máscara do hipotálamo para extração do sinal da RNMf.
Para avaliar o impacto da ingesta de glicose na atividade hipotalâmica
comparou-se a média dos 10 primeiros minutos antes da ingesta com a média dos 10 minutos do período pós-ingestão de glicose. Foi removido o tempo que cada sujeito levou para ingerir a glicose, acrescido de 100 volumes (ou 200 s), devido aos movimentos de deglutição que os participantes continuavam
apresentando, mesmo após o término da solução de glicose. Optou-se por remover esse período adicional devido aos possíveis efeitos que o movimento causado pela deglutição poderia ter na interpretação do sinal BOLD do
hipotálamo (Figura 3). Este protocolo foi desenvolvido baseado em estudos anteriores com algumas adaptações (95,96).
Esses dados foram transferidos para uma tabela e usados para obter a média dos grupos e o estudo da variação do sinal frente à ingestão de glicose. Devido à variação do sinal da RM por conta de diversos fatores físicos, como: temperatura, pressão do magneto, entre outros, o sinal BOLD absoluto foi normalizado. A serie temporal de cada indivíduo foi dividida pelo valor do sinal no tempo 1 (primeiro volume), centralizando sua média em torno de 1. Essa normalização foi feita para o momento pré e também para o pós-ingestão. A fim de comparar a diferença entre os grupos quanto à influência da glicose no sinal absoluto do hipotálamo, optou-se por realizar uma segunda
normalização. Foi feita uma média do sinal do momento pré-glicose e esse foi considerado o sinal basal. Foi então subtraído esse sinal basal dos instantes pós-ingestão de glicose. Desta forma, obteve-se a variação do sinal
hipotalâmico frente ao estímulo da glicose. Adquiriu-se uma série temporal média para cada grupo (obesos e controles), corrigida para as variações de ganho da máquina (como descrito anteriormente) e para o estado basal de cada grupo.
Figura 5: Linha do tempo utilizada no protocolo de RNMf para o estudo da função do hipotálamo frente à ingesta de glicose.
O teste t de Student foi aplicado a fim de avaliar a diferença entre os grupos comparando a variação do sinal hipotalâmico consequente à ingestão de glicose.
2- Conectividade Funcional
Duas técnicas distintas de conectividade funcional foram aplicadas. Para ambas, o pré-processamento das imagens seguiu o mesmo protocolo. A análise de conectividade funcional foi feita utilizando o software UF2C toolbox (http://www.lni.hc.unicamp.br/app/uf2c/). O programa utiliza a plataforma MATLAB (MATLAB and Statistics Toolbox Release 2014b, The MathWorks, Inc., Natick, MA, USA) com o SPM versão 12. Foi feito o pré-processamento e análise estatística de acordo com o protocolo padrão do UF2C. O
pré-processamento para as EPIs é baseado em: realinhamento (utilizando a imagem média como referência), corregistro das imagens funcionais com a imagem T1, normalização para espaço padrão (MNI-152) e suavização (FWHM de 6x6x6 mm3). Com as imagens T1 foram feitas a segmentação e a
normalização (MNI-152). Adicionalmente, foi feita a regressão para seis parâmetros de movimento (três de rotação e três de translação) assim como regressão para a média temporal do sinal da substância branca e do líquor. Por fim, foram removidas tendências lineares e aplicado um filtro passa-banda de 0,008-0,1 Hz em todas a séries temporais.
a) Conectividade funcional baseada em semente única
Para esta técnica utilizaram-se as imagens funcionais, com a seleção de 280 volumes, optando-se por excluir os momentos iniciais, mais susceptíveis a fatores de interferência na aquisição de sinal, e reduzindo o tempo de
processamento, que para esta modalidade é muito dispendioso. Foi definida uma semente cúbica com 1x1x1 cm3 posicionada no hipotálamo de acordo com o WFU PickAtlas (Wellcome Trust Centre for Neuroimaging, London, UK). As séries temporais foram consistentemente extraídas do ROI. O programa UF2C estima a série temporal média de todos os voxels do ROI que atendem a dois
critérios: 1- estar o voxel incluído na máscara de substância cinzenta do
indivíduo; 2- ter a série temporal de cada voxel o valor de sua correlação dentro da média ± desvio padrão das correlações de todos os voxels incluídos no ROI (97).
A fim de avaliar a variação na conectividade ao longo do período pós-ingestão, dividiram-se as séries temporais em 20 blocos com 14 volumes (28 segundos) e avaliou-se a conectividade para cada bloco separadamente. Para cada bloco, foi utilizada a média final da série temporal para realizar testes de correlação de Pearson com todos os voxels da máscara de substância cinzenta. Geraram-se assim 20 mapas de correlação para cada voluntário. Posteriormente,
obteve-se a conectividade média para cada bloco, de cada sujeito.
Realizou-se o teste t de Student comparando os blocos de controles e de pacientes para os instantes pré e pós-ingesta.
b) Correlação cruzada entre sementes
Para esta técnica utilizaram-se as imagens funcionais íntegras, com 309 volumes de duração (618 s) referentes ao instante pós-ingestão de glicose e a modalidade adequada do programa UF²C foi utilizada para a análise. No primeiro nível de análise foram geradas matrizes individuais baseadas em correlações de Pearson entre séries temporais de seis ROIs posicionados em áreas relevantes ao estudo: hipotálamo, amígdala e COF, todos bilateralmente. Utilizou-se o WFU PickAtlas para localização dos ROIs.
Para avaliar possíveis diferenças entre os grupos nos índices de conectividade funcional dos ROIs descritos, realizou-se uma análise de segundo nível
(inferência de grupo). Para tanto, as matrizes individuais resultantes do primeiro nível estatístico foram convertidas para Z-score e, em seguida,
submetidas a testes t de Student ROI-a-ROI (com alfa definido em 0,001, com múltiplas correções). Conexões entre pares que diferiram entre os grupos foram apontadas graficamente.
3- Mapa paramétrico T2
Foi identificado para cada sujeito o corte coronal imediatamente posterior ao quiasma óptico. Neste protocolo foi necessária a exclusão de dois voluntários do grupo controle e de um do grupo de obesos devido à má qualidade das imagens. Portanto, para esta parte do estudo foram incluídos 11 participantes obesos e nove controles. Foi selecionado o ROI representativo do núcleo médio-basal hipotalâmico (MBH) (98) e também identificadas, no mesmo corte, duas regiões de referência/controle, o putamen e a amígdala. Os três ROIs foram identificados na imagem coronal de alta resolução e transferidos para o mapa paramétrico T2 seguindo metodologia descrita por Schur et al. (57) e representado na Figura 4. Os valores de média e desvio padrão do tempo de relaxamento T2 foram obtidos para cada um dos ROIs. Todo o método foi feito utilizando-se o programa OsiriX versão 5.6 (OsiriX Imaging Software, Pixmeo, Geneva, Switzerland).
Figura XXX –.
Figura 6: Metodologia do mapa paramétrico T2: À esquerda e ao centro, cortes sagitais de alta resolução mostrando o posicionamento dos ROIs. À direita, ROIs transferidos ao mapa paramétrico. Amígdala Núcleo arqueado Putamen Mapa paramétrico T2
Avaliação da composição corporal por DXA
Foi utilizado o equipamento modelo iDXA (GE Healthcare Lunar, Madison, WI, USA) com detectores do tipo feixe em leque localizado no Centro de
Investigação em Pediatria (CIPED) da FCM da UNICAMP. Foi realizada a medida do corpo total com o voluntário posicionado em decúbito dorsal (tempo de escaneamento de aproximadamente 7 minutos).
O equipamento faz a avaliação da composição corporal de forma total e segmentada por membros (cabeça, tronco, braços e pernas) e dividida pelos lados do corpo (direito e esquerdo), no qual são determinados as massas gorda e magra e o conteúdo mineral ósseo. Os dados foram analisados
utilizando o software enCore, versão 13.60 (GE Healthcare Lunar, Madison, WI, EUA). Todas as medidas e a calibração do aparelho foram realizadas de
acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante. Foram
calculados os índices de massa de gordura corporal e de massa magra que são obtidos pela divisão da respectiva massa pelo valor da altura em metros ao quadrado. Foram também calculados percentuais de gordura (androide, ginoide e visceral) em comparação à quantidade total da massa gorda.
Análise estatística
Todos os dados foram arquivados e analisados utilizando-se o programa SPSS versão 22.0 (IBM SPSS Statistics Inc., Somers, NY, USA). Inicialmente foi feita a análise descritiva e verificação da distribuição normal dos dados. Foram feitas a média e o desvio padrão de todos os parâmetros clínicos e laboratoriais para os grupos. Foram utilizados o teste t de Student e o teste U de Mann-Whitney para comparar as médias entre os grupos, dependendo de a
distribuição dos dados ser normal ou não, respectivamente. O teste exato de Fisher foi utilizado para as variáveis categóricas.
O coeficiente de Pearson e o ranking de Spearman foram aplicados para análise de correlação entre as variáveis. A análise foi seguida pela realização de regressão linear múltipla para avaliar possíveis associações. Foram criados modelos lineares mistos para avaliar diferenças entre os grupos e ajustar para covariáveis. Foram consideradas significativas as diferenças com p<0,05.
RESULTADOS
Características dos voluntários
Participaram do estudo 12 pacientes obesos (cinco do sexo feminino e sete do sexo masculino) e 11 controles eutróficos (seis do sexo feminino e cinco do sexo masculino). A média de idade dos grupos foi semelhante, de cerca de 12 anos (Tabela 1). Não foi encontrada diferença entre os grupos com relação à proporção de sexo masculino e feminino e de classificação de desenvolvimento puberal, pré-púbere e púbere (Tabela 2). Todas as participantes púberes já haviam apresentado menarca.
Tabela 1: Características gerais dos participantes.
Características gerais dos participantes
Grupos
Obesos (N=12) Controles (N=11) P
Média Desvio
padrão Mínimo Máximo Média
Desvio
padrão Mínimo Máximo Idade (anos) 12,90 2,59 10,11 17,38 12,57 1,98 9,87 16,40 0,738 Peso (kg)* 71,51 17,59 48,10 107,25 44,14 11,37 25,20 62,25 <0,001 Z-score Peso* 1,98 0,61 1,00 2,81 -0,13 0,95 -1,44 1,54 <0,001 Altura (cm) 155,23 11,90 136,00 175,60 153,76 11,36 131,00 169,80 0,767 Z-score Altura 0,29 1,17 -1,35 2,42 0,05 0,95 -0,97 1,69 0,589 IMC* 29,21 3,24 26,00 35,60 18,33 2,62 14,68 22,00 <0,001 Z-score IMC* 2,07 0,24 1,66 2,41 -0,17 0,85 -1,13 1,25 <0,001 Idade início obesidade (anos) 6,63 3,45 0,5 11,00 Tempo de obesidade (anos) 6,00 2,52 2,00 11,00 Tempo no ambulatório (meses) 10,75 5,79 2,00 21,00
Δ Z-score IMC -0,09 0,21 -0,41 0,39
N: número de sujeitos, ΔZ-score IMC: diferença entre Z-score IMC na avaliação da pesquisa e Z-score IMC na 1a
consulta no ambulatório, *p<0,05 na comparação das médias entre os grupos.
Como era de se esperar, o grupo de crianças obesas apresentou maiores valores de peso e z-score de peso, bem como de IMC e de z-score de IMC conforme apresentado na Tabela 1. Este grupo apresentava em média 6 anos de tempo de obesidade, com a média da idade de início do excesso de peso
aos 6,6 anos, de acordo com os dados referidos pelos responsáveis (Tabela 1). As famílias não possuíam registros médicos oficiais para comprovar essas informações.
As crianças e adolescentes com obesidade se encontravam em
acompanhamento ambulatorial, em média, há 10,7 meses quando foram avaliadas para a pesquisa. E, em média, quase não haviam modificado o z-score de IMC no intervalo de tempo entre a avaliação da pesquisa e a primeira consulta no ambulatório (Δ z-score de IMC= -0,09; Tabela 1).
Tabela 2: Proporções de sexo e desenvolvimento puberal dos participantes.
Grupos Obesos Controles P N % Grupo N % Grupo Sexo Feminino 5 41,7% 6 54,5% 0,537a Masculino 7 58,3% 5 45,5% Classificação Puberdade Pré-puberal 6 50,0% 4 36,4% 0,680b Púbere 6 50,0% 7 63,6%
N: número de sujeitos, a teste de chi-quadrado de Pearson, b teste exato de Fisher
Na avaliação comportamental, nenhum dos participantes apresentou os
critérios necessários para o diagnóstico de compulsão alimentar de acordo com a definição do DSM V. Na avaliação feita com o questionário de compulsão alimentar periódica, o grupo de obesos apresentou pontuação
significativamente maior que o grupo controle (13±8 pontos versus 5±4 pontos, t=-3,067, p=0,007). De acordo com a escala utilizada no questionário, quatro sujeitos do grupo obeso (33%) atingiram pontos para classificação de risco para compulsão alimentar periódica (maior ou igual a 17 pontos) enquanto nenhum do grupo controle atingiu tal pontuação, porém essa diferença não foi estatisticamente significativa entre os grupos (teste exato de Fisher p=0,093).
Dados de composição corporal por DXA
As características de composição corporal são apresentadas na Tabela 3. O grupo de obesos apresentou maior quantidade de massa gorda, índice de gordura corporal e percentual de gordura corporal. Não houve diferença entre os grupos na quantidade de massa magra, mas os obesos apresentaram maior índice de massa magra em comparação aos controles (16,18±3,03 versus 13,35±1,92, p=0,015). Os voluntários obesos apresentaram maior quantidade absoluta de gordura de distribuição ginoide (gluteofemoral) e androide
(abdominal e visceral). Porém, percentualmente, o grupo controle apresentou maior percentual de gordura ginoide (p=0,001). Enquanto os sujeitos obesos apresentaram maior percentual de gordura androide (p=0,019), bem como maior quantidade (p<0,001) e percentual de gordura visceral (p<0,001).
Tabela 3: Avaliação da composição corporal por DXA dos participantes.
Média Desvio
padrão Mínimo Máximo Média
Desvio
padrão Mínimo Máximo P
Massa gorda (kg)* 28,88 8,70 19,50 47,91 11,37 4,46 6,57 19,69 <0,001
Índice de gordura corporal* 11,85 2,42 7,09 15,54 4,79 1,76 2,84 8,03 <0,001
Massa magra (kg) 38,03 12,06 22,57 56,94 30,50 8,56 18,12 46,94 0,102
Índice de massa magra* 16,18 3,03 12,81 21,63 13,35 1,92 11,09 17,16 0,015
% gordura corporal* 42,42 6,50 25,29 51,57 25,89 7,39 14,19 39,75 <0,001 Gordura andróide (kg)* 5,23 1,76 3,12 8,62 2,59 0,71 1,41 3,69 <0,001 % gordura androide* 18,65 6,68 13,65 37,48 24,25 6,98 14,33 41,18 0,019 Gordura ginóide (kg)* 10,64 4,31 4,04 18,96 6,77 2,18 3,43 10,37 0,014 % gordura ginóide* 36,85 11,77 17,57 68,37 62,89 19,94 36,91 110,11 0,001 Gordural visceral (g)* 603,42 255,54 236,00 1069,00 98,27 52,10 30,00 235,00 <0,001 % gordura visceral* 2,05 0,53 1,19 2,62 0,89 0,35 0,37 1,44 <0,001 Grupos
N: número de sujeitos, %: percentual em relação ao total de massa gorda, *p<0,05
Avaliação laboratorial
Na avaliação do perfil laboratorial, não houve diferença entre os grupos com relação aos níveis séricos de insulina (6,19 µUI/mL versus 5,93 µUI/mL, obesos e controles respectivamente, p=0,928). O grupo de obesos apresentou
concentrações significativamente maiores de leptina (32,57 ng/mL versus 6,38 ng/mL, p<0,001) e menores de adiponectina (4300,84 ng/mL versus 6779,39 ng/mL, p=0,001). Os grupos não diferiram quantos às concentrações de IL-10 (obesos 0,63±0,13 pg/mL, controles 0,59±0,15 pg/mL, p=0,419), porém os obesos apresentaram concentrações mais elevadas das citocinas
pró-inflamatórias TNF-α (2,12±0,78 pg/mL versus 1,32±0,59 pg/mL, p=0,012) e IL-6 (2,85±1,61 pg/mL versus 1,61±0,52 pg/mL, p=0,002). Os dados são
apresentados na Tabela 4.
Tabela 4: Dados da avaliação de hormônios da saciedade e marcadores inflamatórios envolvidos na homeostase energética.
Grupos
Obesos (N=12) Controles (N=11) P
Média Desvio
padrão Mínimo Máximo Média
Desvio
padrão Mínimo Máximo Insulina (mcU/mL) 6,19 3,02 4,13 15,29 5,93 1,72 4,14 8,94 0,928 Leptina (ng/mL)* 32,57 15,01 4,066 55,41 6,38 6,07 0,75 18,16 <0,001 Adiponectina (ng/mL)* 4300,84 1648,04 1808,78 6904,08 6779,39 1234,10 5123,96 9742,75 0,001 IL-10 (pg/mL) 0,63 0,13 0,47 0,88 0,59 0,15 0,41 0,88 0,419 TNF-alfa (pg/mL)* 2,12 0,78 0,78 3,27 1,32 0,59 0,65 2,18 0,012 IL-6 (pg/mL)* 2,85 1,61 0,38 6,21 1,01 0,52 0,38 1,95 0,002 N: número de sujeitos, IL-6: interleucina 6, IL-10: interleucina 10, TNF-alfa: fator de necrose tumoral alfa, *p<0,05
RNMf
BOLD do hipotálamo
Foram avaliadas as imagens obtidas dos 23 participantes (12 obesos e 11 controles). Os participantes necessitaram em média de 3 minutos (desvio padrão de 1,52 minutos) para a ingestão da solução de glicose. Não houve diferença na média do tempo de ingestão quando se realizou a análise separada por grupos (obesos 3,22±1,60 minutos versus controles 2,78±1,38 minutos, p=0,509).
Os efeitos da ingestão de dextroglicose no sinal do hipotálamo foram avaliados entre 6,3 e 16,6 minutos após o início da deglutição da solução de glicose. Os sujeitos do grupo obeso apresentaram em média uma menor variação do sinal hipotalâmico do que os do grupo controle (Figura 5). A média de variação de sinal foi comparada entre os grupos e os obesos apresentaram valores significativamente menores do que os controles (p<0,001).
Conectividade hipotalâmica
Avaliou-se inicialmente a conectividade do hipotálamo com o restante do cérebro. Isso foi verificado através da correlação que havia entre o sinal obtido no ROI do hipotálamo e o sinal obtido em cada voxel da máscara da massa cinzenta cerebral. Optou-se por dividir a série temporal em 20 blocos, fazendo-se uma média dos valores de R obtidos para cada instante nesfazendo-ses blocos. Posteriormente, fez-se a média dos 20 blocos temporais para cada grupo. Os resultados encontram-se na Tabela 5.
Tabela 5: Média dos valores R obtidos pré e pós-ingesta de glicose para a correlação entre o hipotálamo e o restante da massa cinzenta cerebral.
Antes da ingestão de glicose não havia diferença entre os grupos na
conectividade estabelecida (Figura 6A, p=0,404). Após a ingestão de glicose, os controles apresentaram em média uma maior conectividade do hipotálamo com o restante do cérebro do que os pacientes obesos (Figura 6B, p=0,013)
Controles Valores de R Bloco de tempo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Pré-Glicose 0.37382 0.40048 0.39339 0.35895 0.35639 0.39926 0.37209 0.39075 0.39689 0.39204 Pós-Glicose 0.35669 0.39198 0.38006 0.38784 0.37321 0.39064 0.38603 0.4111 0.39394 0.4 Bloco de tempo 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Pré-Glicose 0.38684 0.38817 0.39604 0.38877 0.39052 0.39036 0.37649 0.37985 0.39146 0.37157 Pós-Glicose 0.36188 0.38922 0.40879 0.37567 0.38729 0.3704 0.37997 0.38451 0.40744 0.39475 Controles Média 0.38341 0.38715 Obesos Valores de R Bloco de tempo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Pré-Glicose 0.37165 0.4006 0.37652 0.38839 0.37284 0.35879 0.35904 0.37906 0.37379 0.37354 Pós-Glicose 0.42086 0.37496 0.37288 0.37156 0.3802 0.35757 0.37337 0.36384 0.38045 0.35356 Bloco de tempo 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Pré-Glicose 0.38634 0.37464 0.41265 0.38024 0.37978 0.3769 0.36227 0.37868 0.40061 0.41253 Pós-Glicose 0.37432 0.37923 0.38113 0.38522 0.37405 0.38159 0.34797 0.38868 0.35309 0.36838 Obesos Média 0.37542 0.37493
Ao se verificar a conectividade do hipotálamo com o COF, não houve diferença entre o grupo obeso e o controle, tanto antes como após o estímulo com a glicose. Também não foi vista diferença entre os grupos na conectividade do hipotálamo com a amígdala.
Figura 8: Conectividade funcional entre o hipotálamo e a massa cinzenta total do cérebro, pré (A) e pós-glicose (B), comparação entre grupo de obesos e controles.
A
Gliose hipotalâmica
Foram avaliados 20 exames, 11 pertencentes aos pacientes obesos e nove de controles.
Obtiveram-se os valores de tempo de relaxamento T2 para o núcleo arqueado do hipotálamo (MBH) direito e esquerdo, assim como para duas regiões de controle putamen e amígdala também bilateralmente (Tabela 6).
Tabela 6: Valores de tempo de relaxamento T2 de todos os participantes da pesquisa para as regiões do núcleo médio-basal hipotalâmico, putamen e amígdala. Média Desvio padrão Mínimo Máximo Putamen E 70,08 2,43 64,40 74,02 Putamen D 70,50 2,26 65,97 74,63 Amígdala E 87,88 4,07 79,95 95,52 Amígdala D 88,06 3,22 82,26 95,28 MBH E 99,61 4,71 91,90 110,08 MBH D* 106,42 7,09 92,86 126,24 Valores expressos em ms, MBH: núcleo médio-basal
hipotalâmico, E: esquerdo, D: direito, *p<0,05, teste T pareado comparando as médias entre os lados da mesma estrutura
Verificou-se se havia diferença nos dados obtidos para cada lado de cada estrutura de interesse. Somente o MBH direito apresentou valor de tempo de relaxamento T2 significativamente maior do que o lado esquerdo (p<0,001). Na avaliação dos dados para os grupos em separado (obesos e controles) pode-se notar que para ambos os grupos o valor do MBH direito era maior do que o esquerdo (obesos p=0,004, controles p=0,015). Não houve diferença entre os lados para a amígdala e o putamen, em nenhum dos grupos. Optou-se, portanto, em realizar uma média entre os lados para prosseguir com a análise e foi feito isso para os três ROIs (Tabela 7).
